Krooninen sairaus

tiivistelmä

seroosit munasarjasyöpä (SEOC) on tappavin gynecologic maligniteetti. MikroRNA (miRNA) ovat luokan pienen ei-koodaavaa RNA: iden, jotka säätelevät geenien ilmentymistä ja proteiinin translaation. MiRNA myös koodata viruksia tarkoituksenaan säännellä omia geenejä ja niitä infektoituneiden solujen. Tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa arvioidaan viruksen miRNA in SEOC. MiRNA sekvensointi tietoja 487 SEOC potilasta ladattavissa TCGA verkkosivuilla ja analysoitiin in-house sekvensointi putki. Rajat validoida TCGA analyysi, mittasimme ilmaus miR-H25 kvantitatiivisen immunofluoresenssilla ylimääräinen kohortin 161 SEOC potilaista. Gene, miRNA ilme, ja sytotoksisuusanalyysin tehtiin useita munasarjasyövän solulinjoissa transfektoitu miR-H25 ja miR-BART7. Tulos analyysi suoritettiin käyttäen Coxin monimuuttuja ja Kaplan-Meier-menetelmää. Viral miRNA on enemmän ilmaistaan ​​SEOC kuin normaaleissa kudoksissa. Lisäksi Herpetic viruksen miRNA (miR-BART7 EBV ja miR-H25 HSV-2) ovat merkittäviä ja ennakoivan biomarkkerit lopputuloksen Coxin monimuuttuja analyysiin. MiR-BART7 korreloi vastustuskyky ensivaiheen kemoterapian ja ennenaikaiseen kuolemaan, kun taas miR-H25 näyttää levittää suojaava vaikutus ja pitkän aikavälin elinkelpoisuuden. Integroitu analyysi geenin ja viruksen miRNA ilmaisu viittaa siihen, että miR-BART7 indusoi suoraan sisplatiini-vastus, kun taas miR-H25 muuttaa RNA käsittelyä ja vaikuttaa ilmaus haitallisten ihmisen miRNA kuten miR-143. Tämä on ensimmäinen tutkimus yhdistää viruksen miRNA ilmaus munasarjasyöpään lopputulokseen. Viral miRNA voi olla hyödyllistä kehittää biomarkkereita varhaista diagnosointia ja mahdollisena terapeuttinen keino vähentää SEOC kuolemaan.

Citation: Pandya D, Mariani M, McHugh M, Andreoli M, Sieber S, hän S, et al . (2014) herpesvirus MicroRNA Expression ja merkitys seroosit munasarjasyöpä. PLoS ONE 9 (12): e114750. doi: 10,1371 /journal.pone.0114750

Editor: Pierre Busson, Gustave Roussy, Ranska

vastaanotettu: 12 kesäkuu 2014; Hyväksytty 13 marraskuuta 2014; Julkaistu: 08 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Pandya et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Analyysi on suoritettava TCGA aineisto, joka on vapaasti saatavilla on TCGA tietojen portaaliin (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). Taso 3 tiedot ovat saatavissa ilman rajoituksia, kun taas tason 1 tietojen ja kliinisten tietojen pääsee, kun hakemus on jätetty kautta TCGA data portaalin. Ehdot TCGA tietojen saatavuutta selitykset ovat https://cancergenome.nih.gov/abouttcga/policies/policiesguidelines.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tukevat avustusta AIRC (Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, IG11975 ), Associazione OPPO e le sue stanze ONLUS, jota Ruth C. Donovan Cancer Research Program ja liberaali lahjoitus herra ja rouva Ruggles. Tämä työ on omistettu Monica DeFeo jotka menettivät hänen rohkeasta taistelussa syöpää at vuotiaana 53. Sponsorit Tutkimuksen ei ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelun ja hallinnan.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

seroosit munasarjasyöpä (SEOC) on kaikkein vaarallisin gynecologic maligniteetti. Koska sen kliinisen laiskuus, suurin osa potilaista diagnosoidaan myöhään, kun leikkaus ei yksinään riitä kokonaan poistaa kasvain. Tämän seurauksena, kemoterapia yleensä vaaditaan edelleen taudin. Ensilinjan kemoterapiaa munasarjasyövän sisältää tyypillisesti platinavalmiste (yleensä karboplatiini) ja taksaania (yleensä paklitakseli) [1]. Biomarkkerit jotka ovat takautuvasti ennustavan herkkyys tai resistenssi kemoterapiaa kaivataan kipeästi kunnolla yksilöllisiä hoitovaihtoehtojen ja vältetään myrkyllisten hoitoja niille potilaille, jotka ovat tulenkestäviä kemoterapiaa. Tehtävänä on kehittää tällaisia ​​biomarkkereita, ongelmallinen kaikille kiinteille pahanlaatuisten kasvainten, on erityisen kiusallinen munasarjasyövän jossa äärimmäinen klonaalinen heterogeenisuus on normi ja joille ei ajo mutaatioita on tunnistettu [2].

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pieni, ei-koodaavaa RNA: t, jotka säätelevät geenien ilmentymistä ja proteiinien käännös ja vaikuttavat kaikilla solun fysiologiaa. Kertyvät todisteet osoittavat, että monet miRNA ovat poikkeavasti ilmaistu ihmisen syövissä, ja miRNA ekspressioprofiileja vauhdittavat prognostista tietojen mukaan perinteiset luokittelujärjestelmät liittyvät vaiheeseen ja alatyyppi [3], [4], [5]. Virukset myös koodata miRNA ja vaikuttaa siten toimivan tartunnan saaneiden solujen. Nisäkkäillä, virusinfektio on voimakas käynnistyminen interferonivastetta joka estää viruksen replikaatiota ja lievennetään virus vaurioita. Infektio nisäkässolujen RNA-viruksia, paitsi retrovirukset, johtaa sukupolven pitkä dsRNA: iden aikana viruksen elinkaaren. DNA-virukset tuottaa dsRNA mukaan yhtenevät transkription niiden kompakti virusgenomien. Viral dsRNA on voimakas käynnistyminen interferonivastetta joka fosforyloi käännöksen tekijä eIF2a ja johtaa maailmanlaajuiseen translaation pysähtymiseen ja apoptoosiin [6], [7], [8]. Koska adaptiivisen strategia, virukset ovat kehittyneet monipuolisista vastatoimia estää interferoni tuotannon, ja jotkut näistä luottaa viruksen miRNA efektoreina solujen valvontaa. Kaikki herpesvirukset tällä hetkellä tiedossa (ihmisen ja ei-ihmisen) koodata useita miRNA [9]. Esimerkiksi hCMV miR-UL112-1 estää paitsi virusperäisen IE1 ulkonäön lisäksi myös solujen MICB ilmaisun edistää viruksen latenssin ja välttää hävittämiseen luonnollisten tappajasolujen [10]. Näin ollen näyttää siltä, ​​että herpes virukset pystyvät kaappaamaan solunsisäisen ohjaus geenin /proteiinin ilmentymisen kautta virus miRNA.

Herpetic infektiot ovat itsepintaisesti yhteisiä ja läpitunkevaa ihmisillä. EBV [11] ja CMV [12] infektiot ovat läsnä vähintään 80% väestöstä. Worldwide hinnat Herpes simplex -virus (HSV) infektion, laskemaan sekä yskänrokko (HSV-1) ja sukupuolielinten herpes (HSV-2), ovat välillä 65% ja 90% [13]. Nämä epidemiologiset tiedot merkitsevät suuri todennäköisyys, että munasarjasyöpä potilaat ovat kantajia ainakin yhden tai useamman herpetic infektioita. Koska niiden laajaa esiintyvyyttä ja pysyvyys ja kyky vaikuttaa transkription ja translaation infektoituneissa soluissa oletamme, että herpes virus miRNA ovat kliinisesti tärkeitä välittäjiä SEOC biologian merkittävät mahdollisuudet biomarkkereina ja huumeiden tavoitteet.

Tulokset

ilmentäminen viruksen miRNA on suurempi SEOC kuin normaaleissa kudoksissa

Cancer Genome Atlas (TCGA) hanke [14] analysoidaan ja luetteloitu lähetti-RNA ilmaisun miRNA lauseke (Illumina Hiseq), promoottori metylaatio ja DNA kopio numero 489 kehittyneitä serous munasarjan adenokarsinooman ja DNA-sekvenssit eksonien koodaamisesta geenien 316 näistä kasvaimista. Tämä uraauurtava työ on erinomainen resurssi uusien ja innovatiivisten strategioiden munasarjasyövän hoitoon. TCGA miRNA julkaistut tutkimukset toistaiseksi käytetä ainoastaan ​​tason 3 datan, joka edustaa kartoitettiin miRNA käyttämällä vain ihmisen (ei virus) miRNAome viitteenä. Jotta päästäisiin eroon tämä rajoitus, me ladattu taso 1 raakadataa, ja suoritimme miRNA-seuraavissa kartoitusta 487 potilasta löytymistä sekä ihmisen

ja

viruksen miRNAomes. Onnistuimme kartoitus 88,2% of lukee. Keskimäärin kartoitettu lukee kullekin potilaalle oli 9,2 miljoonaa. Kuten odotettiinkin, pääosa lukee kartoitettiin päälle ihmisen miRNAome. Kuitenkin havaittavan ja melko melkoinen määrä lukee (n = 184618) kartoitettiin päälle virus- miRNAome, mikä osoittaa läsnäolo viruksen miRNA in SEOC potilailla. Tulokset normalisoitiin ottaa huomioon, että kokonaismäärä lukee kunkin potilaan ei ollut sama ja että ilman normalisointia, vaihtelut määrä lukee yksittäisten miRNA voi johtua sekvensointi syvyyteen. Siksi normalisoida datan TPM (selostukset miljoonasosaa) lukee. Keskimäärin virus miRNA lukee kullekin potilaalle oli 45,6 TPM. Runsain virus miRNA kartoitettiin vuonna HSV-1 (n = 128701) ja HSV-2 genomin (n = 51709). HH6VB ja EBV osuus 986 ja 1260 lukee, vastaavasti. CMV (sytomegalovirus) ja KSHV (Kaposin sarkooma herpesvirus) oli läsnä 96 ja 178 lukee vastaavasti. TCGA ei sisällä normaalia munasarjakudoksen ohjauslaitteet miRNA-kohdat. Jotta on vaihteluvälin ilmentymistä viruksen miRNA in noncancerous kudoksissa, me ladattu 607 normaaleissa kudoksissa päässä TCGA, mukaan lukien virtsarakon, rinnan pää kaula, munuaisen, maksan, keuhkon, istukan, kilpirauhasen, eturauhasen ja kohdun yhteensä 7,7 miljardia sekvenssit. Näytteet analysoitiin noudattaen samaa menettelyä edellä kuvatulla tavalla. Vuonna noncancerous kudoksissa, viruksen miRNA tasot keskimäärin merkittävästi alhaisempi (TPM 11,8), verrattuna TPM keskiarvo 45,6, että SEOC (Fig. 1). Nämä havainnot osoittavat, että ekspressio viruksen miRNA on suurempi SEOC kuin noncancerous kudoksissa.

Double Tähdet osoittavat merkitsevää eroa (p 0,0001, t-testi) välillä ilmentymistä viruksen miRNA in SEOC verrattuna noncancerous kudoksiin. Tiedot ilmaistaan ​​summaan kaikkia viruksen miRNA. Tiedot ilmaistaan ​​TPM ja baari kaavion vastaa keskiarvoa noncancerous kudosten (11,8) ja SEOC (45,6).

Tämän jälkeen teimme vertaileva analyysi ekspressiotasoja sekä miR -H25 ja miR-BART7 ja joidenkin ihmisten miRNA ilmaistaan ​​tyypillisesti epiteelin komponentin SEOC (miR-21) [15], [16] ja punasolujen (miR-16) [17] (Fig. 2). MiR-21 ekspressiotasot olivat merkittävästi korkeammat kuin miR-16 (p 0,001, pariksi t-testi). Samanlainen kuvio havaittiin myös sekä miR-H25 ja miR-BART7, jotka ilmentyvät merkittävästi alhaisempi verrattuna miR-21 (p 0,001, pariksi t-testi). Verrattuna miR-16, jälleen molemmat viruksen miRNA merkittävästi ilmaistiin alemmilla tasoilla (p 0,001, pariksi t-testi), vaikka tässä tapauksessa eroa ilmaisun oli vähemmän johdonmukaista kuin huomannut miR-21.

Naiset luokiteltiin negatiiviseksi tai positiiviseksi miR-BART7 ja miR-H25 jos TPM 0 tai TPM = 0, tässä järjestyksessä. Kussakin juoni vaakasuora viiva vastaa keskimääräistä, laatikossa 25

th-75

persentiili ja linjojen luottamusväli (5

th-95

persentiili).

Prognostic rooli viruksen miRNA vuonna SEOC

sen arvioimiseksi, onko ilmaus viruksen miRNA oli ennustetekijöiden, analysoimme kunkin yksittäisen viruksen miRNA on Coxin regressiomallin. Analyysi tehtiin yhden ja usean analyysi kuten ikä ja vaihe, koska nämä muuttujat olivat merkittäviä yksiulotteista ennustajia. Päätepisteen oli kokonaiselossaoloaika (OS) kuukausina mitattuna. Riskisuhde (HR) 1 osoitti haitallinen vaikutus OS, kun HR 1 merkitsi suojaava vaikutus. Analyysi suoritettiin käyttäen ilmaisua viruksen miRNA (TPM) jatkuvana muuttujana. Yhteenlaskettu yhdistetty analyysi kullekin virus ei antanut merkittävää ennustavaa kykyä Coxin monimuuttuja malli (

p

0,05). Vain HSV-1 tiettyjä kehityssuuntia kohti merkittävä suojaava vaikutus, jossa on

p

-arvo monimuuttuja analyysiin 0,053 (HR = 0,33; CI 0,03-1,01). Kun rajoitetaan altaan kuitenkin sisällyttää vain ne HSV-2 viruksen miRNA tyypillisesti ilmaistiin tuottava infektio (miR-H9, miR-H11, miR-H12, miR-H13, miR-H19, miR-H20, miR-H21, miR-H22, miR-H23 ja miR-H25 [9]), suojaava vaikutus oli tilastollisesti merkitsevä (HR = 0,2, CI 0,04-0,89,

p

= 0,032). Erityisesti ilmaisu viruksen miR-H25 (HSV-2) löydettiin 233/487 (48% TPM 0) yksilöiden. Monimuuttuja-analyysi hyödyntäen Coxin malli osoitti, että korkea ilmentyminen tämän viruksen miRNA liittyi parempaan tulokseen (HR = 0,1, CI +0,01-+0,55;

p

= 0,006). Lisäksi ilmaus miR-H25 oli suurempi potilailla, joilla täydellinen kemoterapiaa vaste ja pienempi potilailla, joilla on etenevä sairaus (Fig. 3). Vaikka mekanismia ei tunneta, tuottava infektio HSV-2 ja siihen liittyvät korkeat ekspressio miR-H25 voi inhiboida syöpäsolujen replikaatiota suoraan tai lisäys tappamisen HSV-2-tartunnan syöpäsolujen immuunijärjestelmää.

Tähdellä merkitä huomattavia pienentää ilmentymisen miR-H25 potilailla, joilla on sekä PD ja SD verrattuna potilailla, joilla on CR. Tämä havainto tukee suojaava rooli miR-H25 ilme.

Sen jälkeen olemme analysoineet ilmentymisen miR-H25 ylimääräiseen kohortin 161 SEOC potilailla, joiden kliiniset piirteet on koottu taulukkoon 1. Jokaisen potilas, jopa 12 kudoksen ytimet otettiin eri alueilla kunkin syöpä (933 ydintä yhteensä), ja nämä kuulusteltiin kudoksessa micro array (TMA) muotoon. Ilmaisu Mir-H25 (värjätään mittatilaustyönä Exiqon koetin) kussakin ytimessä analysoitiin AQUA ohjelmisto, joka käyttää ennalta algoritmeja ja ilman valvontaa tapa arvioida tavoitetasot eri solun osa-osastoja (tai ”maskeja”). Sytokeratiinia ja vimentiinista vasta värjäämällä mikäli kasvain ja strooman naamarit vastaavasti ja DAPI palveli määritellä ydinaseiden maskin. Yhteenveto tuloksista AQUA pisteytys on raportoitu kuvassa. 4. Kaiken intensiteetti miR-H25 oli suurempi sytoplasmassa syöpäsolujen ja pienempi strooman maskin. Negatiiviset ja positiiviset kontrollit saatiin käyttämällä oligonukleotidia ei kohdistettu mitään aluetta ihmisen genomin (SiC) ja U6 pieni RNA, vastaavasti. SiC koetin ei näkynyt värjäytymistä (kuviot. 5 6A). Kuten odotettua, U6 koetin osoitettu ydin- ilmentyminen lähes 100% soluista (Fig. 6B). Expression of U6 oli suurempi epiteelisyöpäsolujen verrattuna tasot huomannut stroomasolut (Fig. 6B). MiR-H25 koetin havaittiin kaksi kuviota ilmaisun. Eräässä koetin värjäytyminen rajoittui tumaan tuumorisolujen (Fig. 6C). Toisessa oli hajanainen sytoplasmista värjäytymistä sekä kasvaimen ja stroomasolut (Fig. 6D). Muihin luvut kuvaavat suuremmalla suurennoksella värjäyskuvio tarjotaan S1, S2, S3, S4 ja S5 kuvioissa. Coxin monimuuttuja-analyysi mukaan lukien ikä ja paljasti, että ilmaus ydinvoiman miR-H25 ei ennusta lopputulosta (HR 0,91, CI 0,65-1,24), kun taas ilmaisutapoja sytoplasminen värjäys malli oli merkitsevästi yhteydessä hyvään lopputulokseen (HR 0,56; CI 0,39-0,79;

p

= 0,0008). Tämä AQUA analyysi tukee täysin meidän löytö TCGA aineisto eli tuottava HSV-2-infektio (jos samanaikaisesti sytoplasminen miR-H25 over-lauseke) tarjoaa suojaa SEOC potilaille.

Jokainen piste vastaa arvoa yksittäisen kudoksen ydin. AQUA tulokset laskettiin strooman maskin (siniset pisteet), ydinvoiman maskin (punaiset pisteet), kasvaimen sytoplasman maskin (vihreät pisteet) ja kasvaimen maskin (keltaiset pisteet). Vastaavat rivit viittaavat tasoitetaan keskimäärin kunkin potilaan ja väritys on sama pisteiden.

Ylhäällä SiC koetin ja alareunassa miR-H25 anturi. Sininen signaali = DAPI. Keltainen = sytokeratiinivasta. Vihreä = vimentiinista. Pink = miR-H25 anturi. Bar koko on 100 uM.

ylhäältä alas: sulautettu kuva, tumavärjäystä (DAPI), kasvain maskin (sytokeratiini- immunostain), strooman maskin (vimentiinista immunostain) ja RNA-koetin. Probes ovat SiC (salattu häiritsevää kontrolli) (A), U6 (positiivinen kontrolli) (B), ja miR-H25 (C 0) tunnistettiin vain 7,9% näytteistä yleistä, se yliedustettuina potilailla Refraktorista tai resistenttejä verrattuna kemiallis-riskiryhmän (Fig. 7A ja 7B) . Niinpä miR-BART7 positiiviset potilaat osoittivat lyhentää yleisen eloonjäämisen Kaplan Meier (Fig. 7C) ja Cox monimuuttujamenetelmin (HR 3,4, CI 2,2-6,6,

p

= 0,002).

Potilaat leimattiin mukaan PFI tulenkestoisina (PFI 6 kuukautta), kestävät (PFI 6-12 kuukautta) ja herkkä (PFI 12 kk). Expression of miR-BART7 on huomattavasti alhaisempi herkkä verrattuna tulenkestävä ja kestävä ryhmät (Kahdella asteriskilla p 0,001, t-testi). B: ennakoimattomia analyysi (mosaiikki tontti) potilaista ryhmitelty ekspressoimiseksi miR-BART7 (TPM 0 on positiivinen (n = 38), siniset palkit; TPM = 0 (n = 449) on negatiivinen, punaiset palkit) ja mukaan vastauksena kemoterapiaa kuvatun A. Double tähdellä osoittavat, että osuus herkkien potilaiden on suurempi miR-BART7 negatiivinen ryhmä (Fisherin tarkka testi, p 0,001, kaksinkertainen tähdellä). C: Kaplan-Meier-analyysi TCGA potilailla (n = 487), mukaan ilmentymisen miR-BART7. Varhainen kuolleisuus on huomattavasti korkeampi miR-BART7 positiivisilla potilailla (Wilcoxonin testi, p = 0,01). OS (X-akseli) edustaa kokonaiselossaoloaikaa ilmaistaan ​​kuukausina.

tunnistaminen muokkaaja mekanismien SEOC biologian

Yksi eduista TCGA aineisto on sen sisällyttäminen molempien miRNA-seq ja geenien ilmentyminen tietoja. Tämä ominaisuus mahdollistaa suorituskyvyn integroitujen analyysien pyritään tunnistamaan kandidaattigeenit säätelee viruksen miRNA kuten on aikaisemmin kuvattu ihmisen miRNA [18]. Olimme keskittäneet analyysejä kahden yksittäisen viruksen miRNA (miR-H25 ja miR-BART7), joka osoitti merkitys kliiniseen tulokseen tutkimuksissa edellä kuvatulla tavalla. Me ladannut taso 2 raportointijärjestelmän geeniekspressiota analyysit hyödyntäen Affymetrix U133 pelimerkkejä. For 414 potilasta (jotka satunnaistettiin joko koulutukseen tai testaus sarja), me menestyksekkäästi analysoidaan sekä geenin ja viruksen miRNA ilme. Ryhmittelimme potilaat mukaan ekspressiotasoja kahden viruksen miRNA kohteisiin (positiivinen = TPM 0 vs. negatiivinen = TPM = 0). Geenit merkitsevää eroa näiden kahden ryhmän todettiin luottamustasolla on

p

0,05 toistuvassa hypoteesi korjauksen kanssa Benjamini-Hochberg menetelmällä. Tätä lähestymistapaa käyttäen löysimme 262 geenit ilmentyvät differentiaalisesti Mir-H25. Mukaan DAVID bioinformatiikan resurssi [19], ne ryhmittyneet 12 itsenäistä toiminnallisia ryhmiä, joissa RNA-käsittely, liitos ja liikenteen merkittävimpänä (Fig. 8). Vaikutus RNA käsittelyä seurasi merkittävä modulaatio ilmentymisen joidenkin ihmisen miRNA. Esimerkiksi naiset, joilla on korkea miR-H25 (Fig. 9A), mutta ei miR-BART7 (Fig. 9B) osoittivat merkittävää vähenemistä ilmentymisen miR-143. MiR-143 on voimakas miRNA, joka siinä TCGA tutkimuksessa liittyi huonoon lopputulokseen monimuuttujakalibrointiin Cox-malli (HR 14,8, CI 5,9-37,9,

p

0,001) ja Kaplan-Maier-analyysi (Fig. 9C). Vaikutus miR-H25 on miR-143 näyttää liity epäspesifisen alas-säätely miRNA käsittelyn, koska mitään merkittävää eroa miR-H25 negatiivisten ja positiivisten potilaiden ilmaisee yleisesti ei-koodaavan RNA havaittiin (Fig. 9D). Vaikutus miR-H25 on miR-143 ilmentyminen voi itse asiassa olla erityinen ja suora; pystyimme toistamaan saman ilmiön vitro käyttämällä kahta SEOC solulinjoista (A2780 ja Skov-3) transfektoidaan synteettinen miR-H25. Yli-ilmentyminen miR-H25 kokeiltiin kolmessa pitoisuuksina (0,1, 1 ja 10 nM) käyttäen transfektoidaan välineellä salatun oligo ei kohdistettu mitään aluetta ihmisen genomin (SiC) ja virusperäisen miRNA ei ilmaistu SEOC (asennuspalveli- UL112) negatiivisina kontrolleina. Vain miR-H25 tuotti merkittävän alas-säätely miR-143 lauseke (Fig. 10).

miR-H25 verkko näyttää 35 geenien RNA käsittelyyn, silmukointi ja liikenne. Kattavuus verkon DAVID tietokannassa on 15/35 (42%, mustat ympyrät).

Box-whisker juoni kuvaava ilmaus miR-143 (TPM) mukaan ilmaus asennuspalveli- H25 (A) ja miR-BART7 (B). Potilaat määriteltiin positiiviseksi viruksen miRNA ilmaisun jos TPM-arvo oli 0 (n = 233). Potilaat, joilla on TPM = 0 määriteltiin negatiivinen (n = 254). Kaavio osoittaa merkittävän downregulation miR-143 naisilla positiivinen miR-H25 (p 0,001, t-testi), mutta ei potilailla positiivinen miR-BART7. Kaplan-Meier-analyysi potilaille, mukaan ilmentymisen miR-143 (C). Potilaat, joilla on korkea ilmentymisen miR-143 omaavat merkittävästi huonompi tulos verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen miR-143 lauseke (P 0,001, Wilcoxonin testi). D: analyysi ilmaus ei-koodaavan RNA: ta (kuten TPM) potilailla ryhmitelty miR-H25 ilme. Green linjat ja timantteja kuvaavat keinoja ja luottamusvälit keinot kahden ryhmän. Ero ei ole tilastollisesti merkitsevä (

p

0,05, t-testi).

In A-C ja B-D ilmentymistä miR-H25 ja miR-143, vastaavasti. A-B ja C-D, A2780 ja Skov-3-soluissa, vastaavasti. Sininen: ohjaus transfektoimalla väliaineessa; Red: Salatut ohjaus synteettinen anturi (SiC); Green: miR-UL112 synteettinen; Musta: miR-H25 synteettinen. Tiedot osoittavat, että ekspressio miR-H25 (10 nM) estää miR-143 ilmentyminen molemmissa solulinjoissa.

, joka koskee miR-BART7, teimme saman geenin verkon analyysi on kuvattu edellä miR -H25. MiR-BART7 ilmaisu ryhmittyneet 221 geenien 6 toiminnallisia ryhmiä, näkyvin joka on T-solujen aktivaation koulutusjakso (Fig. 11). Lisäksi olemme tunnistaneet merkittävä ylössäätely ADH1B geenin. Tämä geeni koodaa alkoholidehydrogenaasi 1B, avain entsyymi muunnettaessa etanolin asetaldehydiksi, aine, joka häiritsee DNA: n korjaukseen [20]. ADH1B oli merkittävästi lisääntynyt naisilla ilmentävät miR-BART7 (Fig. 12A), kun se pysyi muuttumattomana naisilla ilmentävät miR-H25 (Fig. 12B). Tukeminen miR-BART7 ennustetekijöiden data esitetty kuvassa. 5, naiset, joilla on suuri ilmaus ADH1B oli suhteellisen yliedustettuina potilaiden tai resistentti ensilinjan kemoterapiaa (Fig. 12C). Jotta tutkia yhteys miR-BART7 ilmaisun ja kestävyys kemoterapiaa, transfektoimme A2780 ja Hey soluja (kaksi solulinjaa sisplatiini-herkkä) synteettisellä miR-BART7 (10 nM, Fig. 13) tai salattu ohjaus (SiC ). Transfektion tehokkuus varmistettiin qPCR (Fig. 13A). Vaikutukset miR-BART7 arvioitiin myös suhteen ADH1B induktion proteiinitasolla Länsi blot tekniikkaa (Fig. 13B). MiR-BART7 tuotti merkittävän voimistunutta ilmentymistä ADH1B sekä solujen malleissa. Lisäys määrä määritettiin Densitometrinen analyysin kolmen erillisen kokeen ja oli 4,5 ja 3,2 A2780 ja Hey soluja, tässä järjestyksessä (

p

0,001 t-testi). 12 tunnin kuluttua transfektiosta soluja inkuboitiin sisplatiinin kanssa 72 tunnin ajan ja sitten laskettiin. Jotta määrällisesti tuloksia käytimme sisplatiinin aktiivisen alueen (%) kuten äskettäin kuvanneet Barretina ja coll. [21]. Transfektion miR-BART7 tuotti merkittävän kasvun sisplatiini-resistenssin molemmissa solulinjoissa (Fig. 13C ja kuvio. 13D). Kuten huomannut potilaille geenin tasolla, miR-BART7 indusoi merkittävää lisäystä ADH1B ilmaisun molemmissa solulinjoissa. Lisäksi testasimme vaikutus fomepitsoli, joka on tunnettu spesifinen inhibiittori ADH1B toimintaa [22]. Fomepitsoli kumosi kokonaan vaikutuksen miR-BART7 sisplatiinilla myrkyllisyys (Fig. 13E, 13F ja 13G), mikä osoittaa, että miR-BART7 vähentää sisplatiinin tehoa lisäämällä ADH1B aktiivisuutta.

miR-BART7 verkko näyttää 67 geenejä osaa T-solujen aktivaation. Kattavuus verkon DAVID tietokannassa on 47/67 (70%, mustat ympyrät).

Box-whisker juoni kuvaava ilmaus ADH1B mukaan ilmentymisen miR-BART7 (A) ja miR-H25 (B). Tähti osoittaa merkittävää yliekspressio ADH1B in miR-BART7 positiivisilla potilailla (

p

= 0,02, t-testi), mutta ei miR-H25 positiivisilla potilailla. Ennakoimattomia analyysi (C) (mosaiikki tontti) potilaista ryhmiteltynä ADH1B ilmaisun (sininen ja punainen ovat korkean ja matalan ilme, vastaavasti) ja herkkyys kemoterapia (tulenkestävä, kestävä ja herkkä, kuten on kuvattu kuviossa. 5A). ADH1B ilme on huomattavasti korkeampi tulenkestävä ja resistenttien potilaiden (

p

0,05, Fisherin eksakti testi) verrattuna riskiryhmän (samanlainen miR-BART7).

edustaja qPCR analyysi A2780-soluja, jotka on transfektoitu synteettisen miR (10 nM), joka vastaa sekvenssin miR-BART7 (vihreä linja) (A). Kontrollit edustivat solut käsiteltiin vain transfektoidaan väliaineen (sininen viiva) ja sekvenssin ole kohdistettu ihmisen genomin (SiC, punainen viiva). Tyypillisen western blot käsitellyissä soluissa kuin (A). Hoidon synteettisen miR-BART7 indusoidun ilmentymisen ADH1B on proteiinin tasolla molemmissa solulinjoissa. GAPDH toimi latauskontrollina (B). Viivakaavio, joka osoittaa sisplatiinin A2780 (C) ja Hey (D), jotka on transfektoitu kuten on kuvattu (A). Viivakaavio, joka osoittaa sisplatiinin plus fomepitsoli (10 uM) A2780 (E) ja Hey (F), jotka on transfektoitu kuten on kuvattu (A). Pylväsdiagrammi (G), jotka osoittavat aktiivisen alueen sisplatiinin A2780 ja Hey soluja. Soluja käsiteltiin kuten (D-E). Sisplatiini vaikutuksia tarkkailtiin 72 tunnin viljelyn läsnäollessa (vai ei) on fomepitsoli 10gM. Baarit ja virhepalkkeja vastaavat keskiarvo ja SD kolmesta näytteestä suoritettiin kaksinkertaisina. Double tähdellä ovat merkittävä vaikutus, jonka

p

0,001 taso (t-testi).

Keskustelu

SEOC on tappavin gynecologic maligniteetti. Potilaat hyötyvät tunnistamiseen biomarkkereita hyödyllisiä diagnosointiin varhaisen (enemmän hoidettavissa) sairaus, ja kehittämisestä täsmähoitoihin. Tämä tutkimus on, että tietomme, ensimmäinen yksityiskohtaisen tutkimuksen roolin viruksen miRNA ilmentymisen munasarjasyöpä. Ensimmäinen, me osoitamme, että ilmentyminen koko viruksen miRNA on suurempi SEOC verrattuna normaaleihin kudoksiin. Osana strategioiden hyväksymien munasarjasyöpäsoluja paeta tunnustaa immuunijärjestelmää, on esto endogeenisen interferonivastetta [23], [24], [25]. Riittämätön interferonivastetta luo solu, joka tukee viruksen kasvuun ja replikaatioon [8], mikä selittää kohonneeseen viruksen miRNA in SEOC kudoksissa. Koska miRNA ovat resistenttejä hajoamiselle, ja voidaan havaita perifeerisen veren [26], oletamme, että kiertävä yhteensä viruksen miRNA on suurempi munasarjasyöpä väestön kontrolleihin verrattuna. Rajoituksena tutkimuksemme on, että TCGA aineisto ei ole terveillä lähtöisin munasarjojen kudoksiin. Kuitenkin, teimme huomioon normaalin ekspressiotasot saatiin suuri paneeli kudoksissa. Kaikilla näillä noncancerous kudoksista ei ollut merkittävää eroa ilmaisun viruksen miRNA. Siksi uskomme erittäin epätodennäköistä, että munasarjan normaalia kudosta jostain syystä on lisääntynyt ilmentymä viruksen miRNA.

Toiseksi, me raportoimme että kaksi yksittäistä viruksen miRNA miR-H25 ja miR-BART7, toimivat modulaattorit SEOC biologia. HSV-2 tuottava infektio indusoi korkeatasoisen miR-H25 [27], joka korreloi parempaan tulokseen. Me dokumentoida tämä näennäinen suojaava vaikutus kahden riippumattoman kliinisessä ikäluokat käyttämällä kahta riippumatonta lähestymistapaa, miRNA-sekvensointi (TCGA) ja määrälliset immunofluoresenssilla (AQUA). AQUA mahdollistaa solujen subcompartment analyysi, ja tämä menetelmä osoittaa, että suojaava vaikutus miR-H25 on ilmenevät vain sen ilme on soluliman (ja ominaisuus tuottavan HSV-2-infektio) eikä ydin- (mikä piilevä HSV-2-infektio). MiR-H25 voi aiheuttaa sen vaikutuksia mukaan kaappauksen isännän RNA käsittely ja alaspäin säätäminen ihmisen miR-143, joka on voimakas miRNA ihmisen solujen toimintaa [28]. Todellakin, tarjoamme suoraa näyttöä tämän ilmiön transfektoiduissa soluissa synteettinen miR-H25. Vaikka käyttö onkolyyttisten HSV-kantojen kuten munasarjojen syöpää sairastavilla potilailla on aikaisemmin raportoitu [29], [30], [31], strategian aiheutuvat rokotuksen tarkoituksena rajoittaa tuottavan HSV-infektio. Meidän havainnot viittaavat sen sijaan, että tuottava HSV-2-infektio on mahdollisesti edullinen ja voidaan hyödyntää tehokkuuden lisäämiseksi onkolyyttisten HSV kannoista.

katsoo miR-H25 tarjoaa näennäinen suojaava vaikutus, miR-BART7 liittyy korkea varhainen kuolleisuus. Noudattaen viimeaikaiset tutkimustulokset nenänielun karsinooma [32], osoitamme rooli miR-BART7 asiakkuutta lyhentää platina tauko (PFI) pienessä potilasryhmässä, joille tämä miRNA ilmaistaan. Transfektiotutkimuksissa synteettisen miR-BART7 tuotti merkittävän kasvun sisplatiini-resistentit solut, jotka on täysin palautuneet käyttämällä fomepitsoli, tunnettu inhibiittori ADH1B. Meidän analyysi, sekä miR-BART7 ja ADH1B ovat koholla potilailla tai resistentti ensivaiheen kemoterapia. Suhde miR-BART7 ja ADH1B on kiinnostava, koska raportin ADH1B mahdollisena lähteenä chemoresistance munasarjasyövän [33]. Fomepitsoli on nykyisin hyväksytty hoitoon metanolin ja etyleeniglykolin myrkytysten, jonka näennäinen erinomaisen toksikologisen [22]. Siten se näyttää uskottavalta, että potilailla, joilla on korkea miR-BART7, ADH1B esto voi vastata paremmin sisplatiinia.

Tutkimuksemme on ensimmäinen raportti osoittaa mahdollisen osallistumisen viruksen miRNA kuljettajina munasarjasyöpä biologia. Voimme selittää havaintomme kolme yksinomaisen patogeneettisiin mallia. Ensimmäisessä, virusinfektio esiintyy munasarjasyöpäsoluja samanaikaisesti virusten tuotantoon, miRNA. Uskomme, että tämä mahdollisuus epätodennäköistä, että suuret erot ekspressiotasot viruksen miRNA verrattuna ihmisen miRNA ilmaistu syöpäsoluissa kuten miR-21. Toisessa, infektio esiintyy munasarjojen kudoksen strooman soluissa, joissa tiedetään, että virus voi replikoitua, kuten B ja hermoston solujen EBV: n ja HSV-2, vastaavasti. Kolmas malli on, että infektio ei esiintyviä munasarjakudoksen mutta syrjäisillä päällä ja viruksen miRNA tehdään syöpä kautta verenkiertoon.

Yhteenvetona tarjoamme vakuuttavia todisteita rooli herpesvirukset koodatun miRNA in SEOC. Meidän havaintojen yhteensä viruksen miRNA ja ainakin kaksi erityistä viruksen miRNA ovat lisääntyneet munasarjasyöpää sairastavilla potilailla saattaa auttaa kehittämään biomarkkerit varhain taudin ja muotoiluun uusia syövän vastaisia ​​strategioita.

Materiaalit ja menetelmät