Krooninen sairaus

tiivistelmä

vapautuminen ei-reseptori tyrosiinikinaasin ETK /BMX on raportoitu useissa kiinteitä kasvaimia. Tässä raportissa, osoitimme, että ETK ilmaisua asteittain kasvoi virtsarakon syövän etenemisessä. Huomasimme, että alas-säätely ETK virtsarakon syövän soluissa vaimennetaan STST3 ja AKT-vaikutusta taas eksogeeninen yliekspressio ETK oli päinvastaisia ​​vaikutuksia, mikä viittaa siihen, että vapauttaminen ETK voivat jakaa koholla toimintaa STAT3 ja AKT usein havaittu virtsarakon syöpään. Selviytyminen, muuttoliike ja invaasion virtsarakon syövän solut merkittävästi heikentynyt, kun ETK ilmentyminen oli kaatanut tietyn shRNA. Lisäksi osoitimme, että ETK paikantuu mitokondriot virtsarakon syöpäsolujen kautta vuorovaikutuksessa Bcl-XL ja säännellä ROS tuotanto ja huumeiden herkkyys. Siksi ETK voi olla tärkeä rooli säätelyssä selviytymisen, muuttoliikettä ja invaasiota säätelemällä useita signalointireittien virtsarakon syövän soluissa. Immunohistokemialla analyysi kudossiruina sisältävien 619 ihmisen virtsarakon kudosnäytteiden osoittaa, että ETK merkittävästi upregulated aikana virtsarakon syövän kehittymisen ja etenemisen sekä ETK ilmaisun taso ennustaa eloonjäämisaste potilaiden kanssa cystectomy. Yhdessä tuloksemme viittaavat siihen, että ETK saattavat olla uusi lääke kohteena virtsarakon syövän hoitoon sekä biologisten merkkiaineiden, jota voitaisiin käyttää tunnistamaan potilaita, joilla on korkeampi kuolleisuus riski, joka voi olla hyötyä terapeuttisia kohdistaminen ETK aktiivisuutta.

Citation: Guo S, Sun F, Guo Z, Li W, Alfano A, Chen H, et al. (2011) tyrosiinikinaasin ETK /BMX Is Up-säätelemä Virtsarakon syövän ja ennustaa huonon ennusteen potilailla, joilla Cystectomy. PLoS ONE 6 (3): e17778. doi: 10,1371 /journal.pone.0017778

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 tammikuu 2011; Hyväksytty: 09 helmikuu 2011; Julkaistu: 07 maaliskuu 2011

Copyright: © 2011 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH (CA106504) ja DOD (W81XWH-08-1-0174) avustuksia YQ, China National Natural Science Foundation (30872584) ja Guangdong Natural Science Foundation (8251008901000018) ja SQ Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on yksi yleisimmistä syövistä Yhdysvalloissa. On arvioitu, että siellä on 70530 uutta tapausta ja 14680 kuolemista johtuu virtsarakon syöpään vuonna 2010 [1], [2], [3]. Useita geneettisiä ja epigeneettisiä tekijöiden uskotaan vaikuttavan riskiä sairastua virtsarakon syöpään. Lisäksi hyvin tunnettuja riskitekijöitä kuten ikääntymistä, sukupuolten, tupakansavu ja teollisuuskemikaalien, useita geneettisiä muutoksia, jotka tarjoavat vihjeitä solutransformaatiota proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota virtsarakon syöpä on tunnistettu [4]. Näitä ovat mutaatioiden tai muutoksia p53, pRb, E-kadheriinin, COX2, BLCA-4, CXCL1, MMP-2/9 ja EGFR [5]. Kumulatiivinen kasvu näissä geenivirheitä myös ennustetekijöitä arviointi taudin lopputuloksen. Kuitenkin edelleen ymmärrystä virtsarakon tuumoribiologiassa on tarpeen kehittää tehokkaampia hoito. Näin ollen on olemassa tarve määrittämiseen ja soveltamiseen uusien terapeuttisia kohteita virtsarakon syöpään.

epiteeli- ja endoteelisolujen tyrosiinikinaasi (ETK), joka tunnetaan myös luuytimenluovuttajien X kinaasi (BMX), on jäsen Tec-perheen ei-reseptorityrosiinikinaasia. ETK sisältää NH2-terminaalisen Pleckstrin homologiadomeeni, Src-homologia 3 domain, Src-homologia 2 domeeni ja COOH-terminaalin tyrosiinikinaasidomeeniin [6]. ETK voidaan aktivoida useita solunulkoisen ärsykkeet, mukaan lukien kasvutekijät, sytokiinit, soluväliaineen ja hormonit [7]. ETK proteiini on läsnä solulimassa vahvojen perinuclear värjäytymistä soluissa, kun tutkittiin käyttäen immunofluoresenssimikroskoopilla [8], [9], [10]. Aktivointi ETK kinaasiaktiivisuutta voidaan saavuttaa vuorovaikutuksella sen pleckstrin homologiadomeeni joko fosfatidyyli-3-kinaasi tuote fosfatidyyli 3,4,5-trifosfaatti tai FERM-domeenin FAK, mikä johtaa solukalvon translokaatio ETK [6], [8]. ETK on osoitettu rooli solujen eri prosesseissa kuten solujen lisääntymisen, transformaatio, erilaistumisen, muuttoliike ja etäpesäke. Eläketurvakeskus voi vuorovaikutuksessa FAK ja p130

Cas säännellä aktiinisytoskeletonille ja soluliikkuvuus [8], [11]. On myös osoitettu, että ETK suoraan vuorovaikutuksessa kasvaimen tukahduttaa p53 ja estävät sen tumaansiirtymiseen, mikä edistää chemoresistance syöpäsoluissa [9]. Olemme aiemmin osoittaneet, että ETK asteittain upregulated aikana ihmisen eturauhassyövän kehitykseen ja etenemiseen [12], [13]. Kuitenkin rooli ETK virtsarakon syövän soluissa on edelleen tuntematon.

Tässä raportissa, osoitimme, että ETK ilmaisua asteittain kasvoi virtsarakon syövän etenemisessä. ETK on tärkeä rooli säätelyssä selviytymisen, muuttoliikettä ja invaasiota säätelemällä useita signalointireittien virtsarakon syövän soluissa. Olemme lisäksi osoittaneet, että ETK sijaitsee myös mitokondrioita läpi suoraan vuorovaikutuksessa Bcl-XL ja säännellä ROS tuotanto hoitovaste kemoterapeuttisten lääkkeiden. Lisäksi ETK ilmaisu positiivisesti korreloi kasvaimen ja ennustaa potilaiden hoitotuloksiin. Tuloksemme viittaavat siihen, että ETK saattavat toimia huumeiden kohteena sekä varoituksia merkkiaine virtsarakon syöpään.

Tulokset

Funktionaalinen ETK yli-ilmennetään virtsarakon syövän

Tutkimme ETK ilmaisun paneeli ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa ja totesi, että ETK ilmentymistaso vaihdeltiin näissä soluissa. Mielenkiintoista, huomattavasti korkeampi ETK proteiinia ei havaittu UM-UC-3 ja T24 soluja, jotka ovat peräisin korkealaatuisesta ja invasiivisia virtsarakon kasvaimet (Fig. 1A). Sitten tutki ETK on toiminnallinen näissä invasiivisia soluissa. Ensin testataan onko kasvutekijä voi aktivoida ETK kinaasiaktiivisuutta käyttäen fosforylaatiota tyrosiinin 40 (Y40), autofosforylaatiokohta ETK kun sen aktivoitumisen [8], kun lukema. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, EGF indusoi Y40 fosforylaation, mikä viittaa siihen, että ETK on aktiivinen virtsarakon syöpäsoluja. Yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten mukaan ETK on ylävirtaan STAT3 ja AKT reittejä [15], [16], löysimme fosforylaation taso sekä STAT3 ja AKT oli vaarantunut kun ETK ilmentyminen oli kaatanut tietyllä shRNA (Fig. 1 C, Vasen ). Käänteisesti, kun yli-ilmentynyt ETK vuonna 5637 soluissa suhteellisen alhaisempi endogeenisen ETK, me havaitsi lisääntynyt aktiivisuus sekä STAT3 ja AKT (Fig. 1 C, oikea). Nämä tiedot yhdessä osoittivat, että ETK ilmentyy voimakkaasti invasiivinen virtsarakon syövän solulinjoissa ja mukana säätelyssä STST3 ja AKT-vaikutusta.

, Expression profiili ETK virtsarakon syövän solulinjoissa. ETK ilmentymistaso kokosoluliuotteissa virtsarakon syövän solulinjoista tutkittiin immunoblottauksella anti-ETK. Tubuliinia käytettiin latauskontrollina. B, aktivointi ETK virtsarakon syövän soluissa, joita käsiteltiin EGF. UM-UC-3, ja T24-soluja seerumia 24 tunnin ajan, sitten käsiteltiin 20 ng /ml EGF: ää 15 tai 30 min. Taso aktivoituu EGFR ja ETK seurattiin immunoblottauksella anti-pEGFR (Y1175) ja anti-pETK (Y40) vastaavasti. Taso koko EGFR ja ETK solulysaateissa havaittiin myös anti-EGFR ja anti-ETK vastaavasti. C, asetus STAT3 ja AKT-vaikutusta ETK virtsarakon syövän soluissa. UM-UC-3, ja T24-solut infektoitiin lentiviruksen koodaa shRNA spesifinen ETK tai vektorisäätö. 24 h infektion jälkeen, solut seerumia yli yön ja sitten hajotettiin. Vaikuttavien aineiden pitoisuus STAT3 ja AKT tutkittiin immunoblottauksella anti-pSTAT3 (Y705) ja anti-Pakt (S473) vastaavasti (vasen paneeli). Vaikutus ETK ilmentymisen vaikutus STST3 ja AKT-vaikutusta tutkittiin myös virtsarakon syövän 5637 soluja (oikea paneeli).

ETK on läsnä mitokondrioita ja liittyvät Bcl-XL

Kun tutkimme sijainti solun ETK virtsarakon syövän soluissa, havaitsimme puncate jakautuminen ETK sytoplasmassa. Mielenkiintoista, ETK värjäytyminen osittain limittäin Mitotracker merkintöjä näissä soluissa (kuvio. 2A). Olemme myös havainneet huomattavan määrän ETK proteiinin mitokondriofraktiosta, yhdessä muiden tunnettujen mitokondrioiden proteiinien Bcl-XL ja VDAC (Fig. 2B). Kuten ETK puuttuu mitokondrioita kohdistaminen signaali, mietimme voisiko se paikallistaa ja mitokondrioita läpi proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, endogeeninen Bcl-XL oli kerasaostuvat ETK molemmissa virtsarakon syövän solulinjoissa tutkittiin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös 293T-soluissa, jotka yliekspressoivat sekä T7-merkityt ETK ja GFP-merkityn Bcl-XL. Nämä tiedot osoittivat, että ETK voi muodostaa kompleksin Bcl-XL ja paikantaa mitokondrioihin. Johtuen Bcl-XL: n apoptoosin vastaisen toiminnan, tutkimme rooli ETK apoptoosin säätelyyn näissä soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, knock-down ETK ilmentymisen tiettyyn shRNA merkittävästi lisäsi apoptoottisten solujen UM-UC-3 ja T24 soluja. Lisäksi esto ETK aktiivisuuden parannettu ROS tuotanto ja sytotoksisuuden virtsarakon syövän soluissa vasteena hoitoon doksorubisiinin, kun taas yli-ilmentyminen ETK oli suojaava vaikutus (Fig. 3B 3C). Kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden säädellään osittain kyvystä kasvainsolujen hajoaminen ympäröivään matriisiin kudosta ja vaeltavat. Sen testaamiseksi, ETK säätelyä voi aiheuttaa tällaisen fenotyypin, me tutki vielä vaikutuksia ETK knock-alas virtsarakon syöpä solujen vaeltamiseen ja invaasion käyttämällä Boyden kammion määrityksissä. Kuva. 3D osoittaa, että migraation ETK-pudotus UM-UC-3, ja T24-solujen väheni 40% ja 60% verrattuna kontrolliin shRNA käsiteltyjen solujen. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös, kun tutkitaan niiden kyky tunkeutua läpi matrigeeliä. Nämä tiedot osoittivat, että esto ETK ilmentymisen virtsarakon syövän soluissa heikentynyt sekä muuttoliikettä ja invaasiota.

, ETK paikantuu mitokondrioiden UM-UC-3 ja T24 soluja. Solut leimattiin rodamiini Mitotracker, minkä jälkeen immunofluoresenssivärjäyksen anti-ETK. Tumat vastavärjättiin käyttäen DAPI. Lokalisointia ETK määritettiin konfokaalimikroskopialla. Keltainen osoittaa rinnakkaispaikantumisen ETK ja Mitotracker. B, ETK proteiini havaitaan mitokondriofraktiosta. Mitokondrioiden ja sytosolisia fraktioita valmistettiin, kuten on kuvattu menetelmät. Fraktioitu uutteet altistettiin immunoblottauksella anti-ETK tai mainituilla vasta-aineilla fraktiointiin markkereita. ERK käytettiin sytosolin markkeri, kun taas Bcl-XL ja VDAC kuten mitokondrioiden markkereita. C, ETK liittyy Bcl-XL. Yhteensä solu otteita UM-UC-3 ja T24-solujen immunosaostettiin anti-ETK tai IgG-ohjaus, jota seurasi immunoblottaus vasta-aineiden kuten (vasen paneeli). 293T-solut ko-transfektoitiin T7-ETK ja GFP-Bcl-XL, immunosaostus suoritettiin käyttäen anti-T7 (keskus paneeli) tai anti-GFP (oikea paneeli), mitä seurasi immunoblottaus vasta-aineiden kanssa, kuten on ilmoitettu.

A Down-säätely ETK ilmentymisen aiheuttaman apoptoosin virtsarakon syövän soluissa. UM-UC-3, ja T24-solut infektoitiin lentiviruksen, joka koodaa tiettyä shRNA ETK 96 tuntia ja apoptoosi arvioitiin TUNEL määrityksissä. Apoptoottisia soluja kvantitoitiin laskemalla TUNEL-positiivisten solujen viideltä satunnaisesti itsenäistä kenttiä. B, ETK säätelee ROS aktiivisuuden ja sytotoksisuuden virtsarakon syövän solujen vastauksena doksorubisiinin (DOX) käsittely. Solut infektoitiin lentiviruksen koodittaa shRNA spesifinen ETK, ETK T7-merkittyjä ETK tai vektorisäätö. 48 h infektion jälkeen soluja käsiteltiin DOX (UM-UC-3, 0,5 ug /ml; T24-soluja, 2,5 ug /ml) 20 tuntia, ja sitten inkuboitiin 10 nM 5 (6) -CDCFDA 30 min. ROS-positiiviset solut laskettiin alle fluoresenssimikroskopiaan. Tulokset ilmaistiin prosentteina kontrolliin. C, ETK säätelee sytotoksisuuden virtsarakon syövän solujen vastauksena DOX hoitoon. -Solut infektoitiin, kuten on kuvattu B ja käsiteltiin DOX (T24, 5 ug /ml; UM-UC-3, 0,5 ug /ml) 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin WST-1 määrityksissä (Ylälevy). Taso ETK ilmentymistä seurattiin immunoblottauksella anti-ETK (Pohjalevy). *, P 0,05 kontrolliin verrattuna; **, P 0,01 kontrolliin verrattuna. D, knockdovvn ETK esti muuttoliikkeen ja invaasion in vitro. Solujen migraation ja invaasiomääritys kuvattiin menetelmät. Tulokset ilmaistiin prosentteina kontrolliin. *, P 0,05 kontrolliin verrattuna; **, P 0,01 verrattuna kontrolliryhmään.

ETK ylössäädellään ihmisen virtsarakon syövän kudosta ja ennustaa potilaan selviytymistä

tarkastella ETK ilmentymistä ihmisen virtsarakon kasvain kudosten, suoritimme immunohistokemia-analyysi ihmisen virtsarakon kudossiruina sisältävän 619 kudosnäytteitä 233 potilasta. ETK värjäys näytti olevan sekä soluliman ja ydinvoiman positiivinen (Fig. 4A) ja ETK ekspressio lisääntyi merkittävästi virtsarakon kasvaimen kudokset verrattuna niiden hyvänlaatuinen kollegansa (taulukko 1). Lisäksi, ETK ilmentymisen taso oli merkitsevästi korkeampi invasiivisia T1-T4 kasvaimia kuin ei-invasiivisia ti /Ta kollegansa (p 0,001); kuitenkin, ETK ilmaisu ei poikennut merkittävästi sisällä T1-T4 kasvaimia (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi ETK ilmentyminen lisääntyi kasvaimen (p 0,001). ETK ilmentyminen CIS oli merkittävä poikkeus, joiden keskimääräinen 12% sytoplasmassa, mikä on vähemmän kuin G1-G3 tulokset (taulukko 1), mikä viittaa yhdistys ETK overepression virtsarakon papillaarinen kasvaimia. Sen arvioimiseksi, onko ETK voitaisiin käyttää mahdollisena prognostinen markkeri, kliinisistä tuloksista analyysi suoritettiin 118 potilaalla kystektomia joka seurattiin keskimäärin 92,3 kuukautta. Olemme tunnistaneet cutoff pisteen 15% optimaalinen aliositusperusteet näistä potilaista mukaan ETK sytoplasmista ilme. Oli 75 kasvaimia (64%) alhaisen ilmentymisen (≤15%) ja 43 kasvaimet (36%) korkea ilme ( 15%). Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että potilailla, joilla oli korkeammat sytoplasmista värjäytymistä ETK (värjäys pisteet 15%) oli huonompi yleistä eloonjäämistä (Fig. 4B, log-rank testi p = 0,0028). Lisäksi monimuuttuja Cox Regressioanalyysi osoitti, että ETK on merkittävä ennustaja selviytymisen oikaisun jälkeen muita tärkeitä kliinis tekijöistä kuten ikä, kasvaimen, vaihe ja positiivinen imusolmuke tila (taulukko 2). Kuten mallissa ETK oli ainoa itsenäinen ennustetekijöiden ennustaja yleisen selviytymisen riskisuhde 1,7 (95% CI: 1,1-2,7, p = 0,0159). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että ETK ilmentyminen lisääntyy virtsarakon syöpään ja liittyy kasvaimen etenemiseen ja huono ennuste.

, edustaja ihmis- virtsarakon syövän TMA värjätään anti-ETK vasta-aine. B, Kaplan-Meier analyysi assosiaatiosta ETK sytoplasmista värjäytymistä eloonjäämisaste potilaiden kanssa cystectomy.

Keskustelu

yli-ilmentyminen ETK on raportoitu useita syöpiä, kuten eturauhas-, rinta- ja keuhkosyöpää [8], [13], [17], [18]. Tämä on ensimmäinen raportti vapautuminen ETK ilmentymistä virtsarakon syöpä. Usein koholla ETK ilmentymistä virtsarakon syövän soluissa ehdotti, että ETK voi olla syy rooli taudin kehittymistä ja etenemistä. Tätä tukivat myös havainto, että ETK toiminta voisi stimuloida EGF, joka oli aikaisemmin osoitettu aiheuttavan kasvua ja parantaa hyökkäystä virtsarakon syövän solujen säätelemällä on AKT-vaikutusta [19], [20]. EGF-reseptorin on raportoitu erittäin ilmaistu virtsarakon syövän solujen ja liittyy syövän etenemiseen ja huonon ennusteen potilailla, [21], [22], [23]. Siksi ETK voi todennäköisesti toimia alavirtavaikuttajainhibiittorit EGF /EGFR edistää virtsarakon kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. On osoitettu, että ETK yliekspressio voi lisätä lisääntymistä hiiren eturauhasen epiteelin ja johtaa kehittämiseen eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasia (PIN) osittain lisäämällä AKT ja STAT3 toimintaa [13]. Huomasimme, että alas-säätely ETK virtsarakon syövän soluissa vaimennetaan STST3 ja AKT-vaikutusta taas eksogeeninen yliekspressio ETK oli päinvastaisia ​​vaikutuksia. Vapauttaminen STAT3 ja PI3K /AKT reitit on osoitettu olevan tärkeä rooli kehitettäessä urothelial karsinooma ja korreloi kasvaimen etenemiseen [24], [25]. On mahdollista, että ETK voi aiheuttaa sen rooli virtsarakon syöpä säännellään näitä reittejä. Kasvaimen metastaasi on riippuvainen kyvystä kasvainsolujen hyökätä normaaleissa kudoksissa. Osoitimme, että virtsarakon syövän solut voisivat tehokkaasti hyökätä matriisin este in vitro, ja tämä kyky oli merkittävästi hylättiin kun ETK ilmentyminen oli kaatanut tietyn shRNA. Knockdown ETK johtaa vähentynyt aktivoituminen STAT3, joka on rooli virtsarakon syövän invaasio, osittain selitti mahdollinen mekanismi hyökkäyksen eston. Vaikutus ETK solujen maahanmuuttoa voidaan selittää perusteella vakiintuneen aseman ETK vuonna soluvaelluksen eturauhas- ja rintasyövän solujen kautta FAK välittämää integriinin signalointia [8].

Lisäksi STAT3 ja AKT reittejä, jotka tiedetään aktivoida ETK, myös osoitti, ensimmäistä kertaa, että ETK paikantuu mitokondriot virtsarakon syövän soluissa ja siten säätelee ROS tuotanto ja huumeiden herkkyys. Muut tyrosiinikinaasit, mukaan lukien Src ja EGFR, on osoitettu olevan läsnä mitokondrioissa. Salvi

et al

raportoitu, että Src sijaitsee mitokondrioissa rotan aivoissa [26]. EGFR ja Src voi translokoituvat että mitokondriot sitomalla alayksikköä mitokondrion sytokromi coxidase (Coxα) käytettäessä EGR riippuvaisella tavalla sekä porrastaa mitokondrioiden toimintaa läpi fosforyloivaan Coxα [27]. Kuitenkin tarkka toiminta ETK mitokondrioita on vielä vahvistettu. Olemme havainneet, että ETK liittyy Bcl-2-perheen jäsen Bcl-XL virtsarakon syövän soluissa. Knockdown ETK ilmaisun lisäisi ROS tuotannon ja herkistymistä virtsarakon Caner solun kemoterapeuttisten. On osoitettu, että DNA-vaurioita, säteilytys ja hypoksia voi aiheuttaa ROS syöpäsoluja [28], [29]. Olemme aiemmin osoittaneet, että Eläketurvakeskus voi antaa lääkeresistenssin eturauhassyövän soluissa vuorovaikutuksessa p53 ja estämällä sen ydin- transduktion toiminto. On mahdollista, että ETK voi myös edistää lääkeresistensseihin kautta suojaava vaikutus mitokondrioiden toimintaan. Tuloksemme siis osoitettu, että ETK tarjoaa pahanlaatuinen ja invasiivinen fenotyyppi virtsarakon syövän soluihin säätelemällä useita signalointireittejä (Fig. 5).

On osoitettu, että STAT3 aktiivisuus ja ilmentyminen lisääntyy virtsarakon syöpä kasvain ja ennustaa kasvaimen uusiutumisen ja potilaan eloonjääminen [30], [31]. Meidän IHC analyysi virtsarakon syöpä TMA osoitti, että ETK ilmentyminen lisääntyy virtsarakon syövän kudoksissa verrattuna niiden hyvänlaatuinen kollegansa. Ottaen huomioon, että kohdennetut ilmentymistä ETK hiiren eturauhasen johtaa kehitystä PIN [13], on mahdollista, että ETK voi myös olla rooli syövän syntyyn rakon urothelial soluissa. Vielä tärkeämpää on, ETK ilme on suurempi invasiivisia (T1-T4) kuin ei-invasiivisia virtsarakon kasvaimet (Tis /Ta), mikä viittaa siihen, että ETK voi myös olla rooli syövän leviämisen ja etäpesäkkeiden. Tätä mahdollisuutta tukee havaintomme, että knockdovvn ETK ilmentymisen virtsarakon syövän soluissa estävät niiden toiminnan

in vitro

hyökkäystä määrityksiä. Lisäksi olemme havainneet, että ETK ekspressiotaso voi myös ennustaa eloonjäämistä potilailla, joilla cystectomy hoidossa riippumaton muista tärkeitä kliinis tekijöistä kuten ikä, kasvaimen, vaihe ja positiivinen imusolmuke tila. Siksi ETK saattavat olla uusi lääke kohteena virtsarakon syövän hoitoon sekä biomerkkiaine jota voitaisiin käyttää ositusta potilaille, joilla on suurempi kuolleisuusriski. Nämä potilaat voivat olla hyödyllisiä alkaen terapeuttisia kohdistaminen ETK aktiivisuutta.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, transfektio ja lentivirus- infektio

Ihmisen virtsarakon syövän solulinja T24, 5637, J82, RT-4 ja UM-UC-3, sekä 293T hankittiin American Type Culture Collection (ATCC). UM-UC-3, T24 ja 293T-soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa. 5637, J82 ja RT-4-soluja ylläpidettiin RPMI 1640: ssä, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia ja 1% (v /v), penisilliiniä ja streptomysiiniä (100 ug /ml) ja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehässä. Solut transfektoitiin HD FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals) seuraten valmistajan ohjeita. Lentivirus infektio suoritettiin kuten aikaisemmin [9].

immunosaostus ja Western Blot

Solut lyysattiin lyysipuskurissa (20 mM Tris /HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 mM Na

3Vo

4, 1 mg /ml aprotiniinia, 1 mg /ml leupeptiiniä ja 1 mM fenyylimetyyli-sulfonyylifluoridi). Liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoimalla, ja vasta-aineita lisättiin lysaatin yön yli 4 ° C: ssa. Vasta-aineet kerättiin proteiini A tai proteiini G-Sepharose-helmiä, ja proteiini kompleksit pestiin kolme kertaa 4 ° C: n hajotuspuskuria. Immunoblottaus tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [9]. Lyhyesti, yhtä suuret määrät näytettä eroteltiin SDS-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo. Blotteja inkuboitiin osoitetun primaaristen vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa, ja sen jälkeen havaitseminen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Monoklonaalinen anti-BMX-vasta-ainetta (BD Transduction Laboratories) käytettiin 1:2000, kun taas anti-pSTAT3 (Y705), AKT, Pakt (S473), EGFR, pEGFR (Y1175) ja pETK (Y40) (Cell Signaling Technology, Danvers , MA) käytettiin 1:1,000. Anti-Bcl-XL, anti-tubuliinin, ERK, VDAC ja anti-signaalimuunta- ja aktivaattoreita transkription 3 (STAT3) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) käytettiin 1:2,000.

WST -1, pesäkkeenmuodostus ja TUNEL-määritykset

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

3 solua /kuoppa ja infektoitiin lentivirus koodaa ETK shRNA tai verrokkina shRNA. Kullakin osoitetulla ajankohtana, solujen elinkyky mitattiin WST-1 (Roche) määritys seuraten valmistajan protokollaa. Pesäkkeiden muodostumista määrityksessä, soluja (1 x 10

4) ympättiin 6-kuoppalevyille ja infektoitiin lentivirus valvonta- shRNA tai ETK shRNA. Soluviljely pidettiin täydellisessä elatusaineessa 14 päivän ajan. Solupesäkkeet visualisoitiin sitten Coomassie blue -värjäyksellä. UM-UC-3, ja T24-solut infektoitiin lentivirus koodausta ETK shRNA tai ohjaus 96 tuntia ja apoptoottisia soluja havaittiin TUNEL-määritys noudattamalla valmistajan ohjeita (Roche). Apoptoottisia soluja kvantitoitiin laskemalla TUNEL-positiivisten solujen viideltä satunnaisesti itsenäistä kentät.

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset

Solun muuttoliikettä arvioitiin siirtokuoppaan määritys edellä kuvatulla [8]. Lyhyesti, infektoidut solut kerättiin, suspendoitiin uudelleen seerumia, ja sitten siirretään alkuun kammioiden (5 x 10

4 solua kuoppaa kohden), kun taas pohjalle kammiot, jotka sisältävät 0,5 ml väliaine NIH 3T3 fibroblasteissa. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut yläpinnalla kaavittiin ja pestä pois, kun taas solut vaelsivat alapintaan kiinnitettiin ja värjättiin 4 ’, 6-diamidino- 2-fenyyli (DAPI) 5 minuuttia ja sitten laskettiin alle fluoresenssi mikroskooppi, ja suhteellisen määrän vektorin kontrolli laskettiin. Soluinvaasion Määritys suoritettiin olosuhteissa samalla tavalla kuin edellä, paitsi transwell suodattimet esipäällystetty matrigeeliin (BD Biosciences) ja 1 x 10

5-soluja käytettiin kuoppaa kohti.

Immunofluorescence ja konfokaalimikroskoopilla analyysi

Soluja leimattiin tuoreeseen viljelyväliaineeseen 200 nM Mitotracker (Invitrogen) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ja sitten kiinnitettiin 3,75% formaliinilla 15 minuuttia, mitä seurasi inkubaatio blokkausliuoksella [10% aasi seerumin 0,5% naudan seerumin albumiinia, 0,3% triton X-100 PBS: ssä], ja käsiteltiin ETK vasta-aineella yön yli 4 ° C: ssa. Immunoreaktioita paljastettiin inkuboimalla soluja vuohen anti-hiiri-FITC 488-konjugoidun IgG (Jackson Immuno Research) ja DAPI (1:5000) 5 min. Lopuksi peitelasi sisältävä immunomerkatut solut asentaa anti-häipyminen kiinnitysväliaine (Biomeda geeli mount, Elektronimikroskopian Sciences). Solut arvioitiin käyttäen vesiupotukseen 40X objektiivin linssistä Zeiss 510 -konfokaalimikroskoopilla varustettu 347-, 488- ja 543-nm lasersäteitä.

Mitokondrioiden valmistelu ja reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) havaitseminen

Mitochondria jae puhdistettiin Mitochondria Isolation Kit Viljellyt solut (Pierce) mukaan valmistajan ohjeiden. Solunsisäinen ROS mitattiin käyttämällä väriaine 5 (6) -CDCFDA (Molecular Probes). Jälkeen läpi solukalvon, tämä lipofiilinen ja ei-fluoresoiva yhdiste on de-esteröidään, hydrofiilistä alkoholin (H2DCF), joka voidaan hapettaa fluoresoiva DCF menetelmällä yleensä katsotaan liittyvän kanssa ROS. Viljellyt solut ladattiin 10 uM 5 (6) -CDCFDA normaalissa väliaineessa 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Inkubaation jälkeen solut pestiin kolme kertaa, keskipitkän ja vasemmalla viimeinen pesu väline kuvantamismenetelmin. Imaging ottanut fluoresenssimikroskooppiin käyttämällä Nikon TE2000s -käänteismikroskoopissa 10x tavoitteen.

Tissue microarray, immunohistokemia ja Tilastollinen analyysi

kudossiruina (TMA) valmistettiin patologian osaston yliopistossa of California, Los Angeles (UCLA) Medical Center aikaisemmin kuvatulla [14]. Tutkijat olivat vain varustettu kliinisiä-patologinen tietoja, kuten kasvain vaiheessa ja arvosana. Kaikki potilaan tunnisteet poistetaan, niin että se ei ole mahdollista jäljittää tahansa kudokseen tietylle potilaalle. Siksi potilas luottamuksellisina. Pöytäkirjan mukaisesti hyväksymä IRB komitea UCLA potilaille ei suostumus tarvitaan tässä tutkimuksessa. TMA poistettiin parafiini ksyleenillä ja värjättiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [13]. Lyhyesti, dioja rehydratoitiin ja antigeenin haku saavutettiin mikroaalloilla 15 minuutin ajan sitraatti- puskurissa. Dioja inkuboitiin sitten 0,3% vetyperoksidia sammuttamiseksi endogeenisen piparjuuriperoksidaasiin (HRP) 30 minuutin ajan. Dioja esi-inkuboitiin normaalissa vuohen seerumissa PBS: ssä (01:20) 60 min ajan huoneenlämpötilassa. Dioja inkuboitiin sitten primaarisen vasta-aineen ETK (1:2000) 4 astetta yli yön. Sen jälkeen laseja inkuboitiin biotiinilla-leimatun anti-kanin IgG: tä ja inkuboitiin muotoon avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin. Lopuksi objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu ja kiinnitetty.

Objektilasit analysoitiin käyttämällä Ariol SL-50 automatisoitu dia skanneri (Applied Imaging, San Jose, Kalifornia), jolloin määrän kvantitoimiseksi positiivista värjäytymistä kullekin alueelle kohteita. Kynnysarvot kullekin kuvalle levitettiin käyttäen Ariol analyyttinen ohjelmisto perustuu useita parametreja: RGB algoritmi, muoto ja koko. Kaikki analyysit suoritettiin kanssa MultiStain kirjoitus. Kynnysharmaasävyosasten luokittimet räätälöitiin kunkin tahra.

arvioimiseksi tumavärjäystä, positiivinen DAB värjäytyminen on laskettu soveltamalla kahta väriä kynnysarvoja yhdellä tunnustaa sinisellä pohjalla (hematoksyliinillä värjätty) solujen ja toinen tunnustaa ruskea positiivisia soluja ja sininen, ei- positiivisia soluja (solujen kokonaismäärä). Yksittäiset solut syrjitty sisällyttämällä muodon ja koon kynnysarvot, jotka tarjoavat yhdessä väri kynnyksiä, varsinainen solujen määrää. Prosenttia positiivisuus määritettiin jakamalla solujen määrä havaitaan ruskea kynnyksen solujen kokonaismäärästä, havaitaan summa ruskea ja sininen kynnysarvot. Yhteensä kudos ala analysoitiin myös mukana kädessä (im

2).

arvioimiseksi sytoplasminen värjäys, alue positiivinen tahra on laskettu soveltamalla väri kynnysarvoja havaitsemaan positiivisen ruskea pikseliä. Prosenttia positiivisuus määritettiin jakamalla koko positiivinen tahra-alue (im

2), jonka koko kudoksen ala analysoitiin (im

2).

immunoreaktiivisia pisteet kulloinkin kvantifioitiin keskimääräistä neljä ydintä. Associations välillä ETK ilmaisun ja patologinen parametreja arvioitiin kanssa nonparametric Kruskal-Wallis testejä. Eri selviytymisen /toistumisen päätepisteitä arvioitiin potilailla, joille tehtiin TUR ja potilaat, jotka kystektomia. Kaplan-Meier -käyrät käytettiin arvioida eloonjäämisen /toistumisen-vapaa aika käyrät ja log rank testillä testata, onko käyrien erosivat ryhmien välillä. COX useita suhteellisten riskien mallia käytettiin arvioimaan, mitkä covariates vaikuttaa säilymiseen /toistumisen-vapaa-aikaa. Kunkin kovariaattina, suhteellinen vaara nopeus ja siihen liittyvä

P

arvo raportoitu. Kaikki analyysit suoritettiin ohjelmiston SAS version 9.2.

Kiitokset

Haluamme kiittää tohtori Allan J. Pantuck hänen neuvoja tietojen analysointi.