Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä (CRC) on johtava syy syövän liittyvän kuoleman Euroopassa ja USA: ssa. Ei ole yleisesti hyväksyttyä tehokasta ei-invasiivisia seulonta testi CRC. Guaiac pohjainen verta ulosteessa (gFOB) testaus on paljolti korvattu Ulosteen immunokemiallinen testaus (FIT), mutta herkkyys on edelleen huono. Käyttöönoton väestöpohjainen FOBT testaus Britanniassa on myös alhainen eli noin 50%. Havaitseminen haihtuvien orgaanisten yhdisteiden (VOC) allekirjoitus (t) monille syöpä alatyyppien kiinnitetään yhä enemmän kiinnostusta käyttämällä erilaisia ​​kaasufaasin analyyttisiä välineitä. Yksi tällainen esimerkki on FAIMS (Kenttä Epäsymmetrinen ioniliikkuvuusspektrometriä). FAIMS pystyy tunnistamaan tulehduksellinen suolistosairaus (IBD) potilailla analysoimalla muutoksia haihtuvien orgaanisten yhdisteiden malleja sekä virtsan ja ulosteen. Tämä tutkimus ulottuu tätä käsitettä sen määrittämiseksi, onko CRC potilaat voidaan tunnistaa ei-invasiivisia analyysi virtsasta, käyttäen FAIMS. 133 potilasta rekrytoitiin; 83 CRC potilaiden ja 50 tervettä verrokkia. Virtsa kerättiin aikaan CRC diagnoosi ja headspace analyyseihin käyttäen FAIMS väline (Owlstone, Lonestar, UK). Aineisto käsitellään käyttäen Fisher Diskriminanttianalyysi (FDA) jälkeen ominaisuus uuttamalla raakatietoja. FAIMS analyysit osoittivat, että VOC-profiilit CRC potilaista oli tiukasti yhteen ja voidaan erottaa terveiden verrokkien. Herkkyys ja spesifisyys CRC havaitsemiseksi kanssa FAIMS olivat 88% ja 60% vastaavasti. Tämä tutkimus viittaa siihen, että VOC allekirjoitukset peräisin virtsasta voidaan havaita potilailla, joilla on CRC käyttämällä ionin liikkuvuutta spektroskopia tekniikka (FAIMS) mahdollisia uutena seulonta työkalu.

Citation: Arasaradnam RP, McFarlane MJ, Ryan-Fisher C , Westenbrink E, Hodges P, Thomas MG, et al. (2014) havaitseminen peräsuolen syövän (CRC) by Virtsan haihtuvia orgaanisia yhdisteitä Analysis. PLoS ONE 9 (9): e108750. doi: 10,1371 /journal.pone.0108750

Editor: Keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 25 elokuu 2014; Julkaistu: 30 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Arasaradnam et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki oleelliset tiedot sisältyvät paperin.

Rahoitus: tuettiin Bardhan Tutkimus ja koulutus Charity (BRET) hyväntekeväisyyteen, Warwickshire yksityinen sairaala hyväntekeväisyyteen, Eveson luottamus – rahoittanut materiaaleja. BRET perustettiin professori Bardhan mutta hänellä ei ollut panosta rahoitukseen tekemä päätös avustuksen pätevyyslautakunnan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi johtavista syistä syövän liittyvät kuolemat Euroopassa ja USA: ssa [1], [2]. Tällä hetkellä ei ole olemassa tehokkaita, ei-invasiivisia seulontatestejä varten CRC. Nykyiset menetelmät hyödyntävät guaiac perustuu verta ulosteessa (gFOB) testaus, mutta tämä on nyt suurelta osin korvattu ulosteen immunokemiallinen Testing (FIT). Vaikka tämä on parannus, FIT näkyy edelleen suhteellisen alhainen herkkyys CRC, 66-88%, riippuen katkaista arvot hemoglobiinin (50-200 ng /ml), jossa on spesifisyys 87-96% [3] – [ ,,,0],5]. Herkkyys kokeneille adenooma on vieläkin pienempi 27-41%, joiden spesifisyys 91-97% [5]. Käyttöönoton seulonta käyttäen ulostenäytteitä on myös kysymys, jossa noin 50% kutsuttujen osallistujien ei hyväksy väestöpohjainen FOBT seulonta meidän paikkakunnalla.

Noninvasiiviset testaus syöpiä, käytetään haihtuvia orgaanisia yhdisteitä (VOC) ja kaasut, jotka ovat peräisin virtsasta, hengitys, ulosteen ja veri, on saanut kasvavaa huomiota ja sitä on laajeneva tutkimusala viime vuosina. Tämä työ alunperin alkoi käytöstä kulmahampaat havaitsemaan syöpä, joka osoitti selvästi erotuskykynsä syöpäpotilaiden terveistä yksilöistä [6], [7], [8]. Kuitenkin viime aikoina useat ryhmät ovat osoittaneet, että on mahdollista käyttää kaasufaasissa analyyttisiä välineitä, erityisesti kaasukromatografialla ja massaspektrometrialla (GC-MS), selektiivinen-ioni virtauksen massaspektrometri (SEULOA) ja elektronisen nenän (e-nenä ), havaitsemiseksi keuhko-, rinta-, virtsarakko- ja eturauhassyövät [9], [10], [11], [12]. Yksityiskohtainen arvio kaasufaasissa biomarkkereita gastroenterologiassa katso Arasaradnam et al [13].

suorassa suhteessa peräsuolen syöpä (CRC), viimeaikainen työ on osoittanut, että on mahdollista erottaa syövän ei- syöpäpotilaita, mutta voidaan myös käyttää erottelun keuhko-, rinta-, eturauhas- ja paksusuolen ja peräsuolen syövän toisistaan ​​analysoimalla puhallusnäytettä [14]. Tätä tukee lisäksi viime työtä, joka on myös osoittanut, että CRC voidaan erottaa valvonta yli 75% tarkkuudella käyttäen GC-MS, jälleen käyttämällä hengityksen analyysi [15]. VOC-yhdisteiden läsnä virtsassa on myös osoitettu erottaa CRC potilaita kontrolliryhmiin ja muiden syöpien (leukemia ja lymfooma), GC-MS: [16]. Elektroninen nenä (Cyrano 320, Sensigent, USA) on myös osoitettu syrjiä CRC ja terveillä verrokeilla, kun VOC-yhdisteet profiilin ulosteeseen analysoidaan (85% herkkyys ja 87% tarkkuus). Lisäksi E-nenä pystyi erottelemaan kehittyneitä adenoomien ja terveiden verrokkien kanssa 62% herkkyys ja 86% tarkkuus [5]. Nämä tutkimukset tukevat olemassa otaksutun kaasufaasissa biologiset merkkiaineet biologisissa tulostusmateriaalin havaitsemiseksi CRC ja täten voisi olla perustana pikaseulontatesti työkalu.

VOC-yhdisteet voivat esiintyä kaasufaasissa ja ovat läsnä uloshengitysilman , hiki, virtsan ja ulosteiden [17], [18]. Mekanismi sukupolven VOC-yhdisteiden on aiheena nykyinen tutkimus mutta niitä häiritään monissa fysiologisissa ja patologisissa tiloissa – kärsivät ruokavalio ja tautitilojen. Uskotaan, että sukupolvi haihtuvien orgaanisten yhdisteiden sisällä suolen ovat seurausta paksusuolen bakteerien meneillään käymisestä polysakkarideja kuin tärkkelystä – kuitu kuluttaa isäntä. Sellaisenaan ne edustavat monimutkainen vuorovaikutus paksusuolen solujen, ihmisen suoliston mikroflooran ja tunkeutuvat taudinaiheuttajia [19], [20]. Tutkimuksen tuloksena tuotteiden käyminen jotka olemme kutsutaan jäljempänä fermentome ”[17], [18], [21], [22] voidaan mitata virtsasta. Jälkimmäinen oletetaan mahdollista johtuen muuttuneesta suolen läpäisevyyttä tuotti tietyissä suolistosairauksien [23]. Uskomme, että VOC-yhdisteet edustavat bio-allekirjoituksen, joka edustaa summa monitekijäinen vaikutteita (genetiikka, ympäristötekijät kuten ruokavalio ja tautitilojen), jotka vaikuttavat yksilön. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia potentiaalin testaamiseksi FAIMS – uusi erittäin herkkä tekniikka erotella CRC ja terveillä verrokeilla käyttämällä vain virtsanäytteitä.

Materiaalit ja menetelmät

2,1 aiheet

Satakolmekymmentäkaksi kolme henkilöä rekrytoitiin takautuvasti tämän tutkimuksen. Kahdeksankymmentä-kolme näistä potilaista oli histologisesti varmennettu peräsuolen syövän ja viisikymmentä olivat terveitä henkilöitä, jotka oli äskettäin normaali kolonoskopia. Keskimääräinen ikä CRC potilaiden oli 60 vuotta (SD 17 vuotta), 53 (64%) oli miehiä. Väestörakenne aiheista on esitetty taulukossa 1.

2.2 Tutkimusasetelma

Tämä oli tapaus ohjaus jossa potilaiden rekrytoitiin poliklinikat at yliopistollisen sairaalan Coventry Warwickshire, UK. Virtsa otettiin sitten talteen standardissa universaali Sterilin näytesäiliöt (Newport, Iso-Britannia) ja jäädytettiin välittömästi -80 ° C, myöhempää erän analyysiin.

2.3 Analyysi

Näytteet sulatettiin huoneenlämmössä yön yli , jaettiin asianmukaisia ​​näytepulloja ja analysoiduista käyttäen FAIMS kokeellisia menetelmiä kuvataan alla.

2.3.1 FAIMS.

FAIMS analyysiä, kaupallista väline hyödynnettiin (Lonestar, Owlstone, UK, työllistää kartasto keräysjärjestelmän ja split virtaus laatikko). Tämä järjestelmä saavuttaa erottaminen kemiallisten komponenttien perusteella erojen sähkökentän riippuvuus ionisoidun kemiallisten vaihtopaikkaa. FAIMS sallii kaasun molekyylit voidaan erottaa ja analysoida ilmakehän paineessa ja huoneen lämpötilassa, toisin kuin samanlainen perinteinen analyyttiset tekniikat. Sen jälkeen, kun näyte on ionisoitu, se koostuu ioneja eri kokoja ja tyyppejä. Nämä otetaan käyttöön kahden metallilevyn väliin ja epäsymmetrinen korkean jännitteen aaltomuodon syötetään nämä levyt, altistamalla ionisoituneen molekyylit korkean sähkökentän. Ero liikkeen näiden molekyylien tämän suuren sähkökentän voidaan mitata, mikä johtaa erottaminen monimutkainen seos.

näyte 5 ml virtsaa jaetaan eriin 20 ml: n lasipulloon ja sijoitetaan ATLAS sampleri. Näytteenottajan kuumentaa näytteen (tässä tapauksessa) 40 ± 0,1 ° C, kun näyte saavuttaa oikean lämpötilan (tyypillisesti 10 min), puhdas synteettinen ilma johdetaan näytteen päälle ja osaksi Lonestar FAIMS väline. Virtausnopeus näytettä on 500 ml /min ja nousi 2 L /min ylimääräisillä puhdasta ilmaa ennen sen johdetaan laitteeseen. Lonestar on perustettu skannaamaan välillä 0 ja 90% dispersio kenttä (hajonta kenttä edustaa suuruus sähkökentän) 51 vaiheita ja korvauksia jännite välillä -6 V ja +6 V 512 vaiheet. Korvaus jännite käytetään poistamaan vaikutus drift tuottaman suuren sähkökentän, jolloin vain molekyylejä, joilla on tietty liikkuvuus exit levyjä tässä vaiheessa. Kuvio 1 esittää tyypillistä FAIMS ”töyhtö”, joka on valmistettu CRC potilaan virtsanäytettä piirrettiin log mittakaavassa.

intensiteetti on mielivaltaisina yksikköinä ioni count.

2,3.2 GC -MS.

GC-MS-analyysi, erilliset alikvootit 5 ml kustakin näytteestä läpi Bruker Scion SQ GC-MS väline. Kukin näyte sekoitettiin ja kuumennettiin 60 ° C: ssa 5 minuutin ajan, ennen kuin sisällön sen headspace uutetaan käyttäen Combi-PAL ITEX automatisoitu pre-keskittimen järjestelmä. Haihtuvat aineet sisältyvät ITEX sitten vapautettiin kuumentamalla 250 ° C: seen, ja ruiskutetaan välineen jaetun 1:20 heliumia kantokaasun. Restek RxI-624Sil pylväs (20 m pitkä, 0,18 mm ID, 1,0 um df) asennettu GC pidettiin vakiona 50 ° C: ssa 1 minuutti, ennen kuin se nousee arvoon 280 ° C: seen nopeudella 20 ° C /min, erottaa erilleen osatekijän VOC-yhdisteiden suhteen molekyylipainon ja polaarisuuden. Alun havaitsemisen tuottaa kromatogrammin, VOC molekyylit pirstoutunut massaspektrometrin ja havaitaan tuottaa vastaavan massaspektrit. Nämä korreloivat GC kromatogrammin huiput, ja tarkistetaan National Institute of Standards and Technology kirjasto (NIST 2013) kemiallisten yhdisteiden. Tämä perfrimed saadakseen lisänäyttöä erityisiä kemiallisia ryhmiä, jotka muodostavat haihtuva kaasutilaan virtsanäytteiden näiden kanssa CRC.

2.4 tilastolliset menetelmät

Tietojen analysointi varten FAIMS tuloksia on suoritettiin käyttäen Fisher erotteluanalyysiä. Tämä mahdollistaa yksinkertaisen tulkintaa monimutkaisia ​​tietoja määrittääkseen, jos erot ryhmiä voidaan havaita. Aineisto käsiteltiin Matlab (Mathworks Inc., USA, R2013b). Analyysiä, sekä positiivisia että negatiivisia ioni määrä matriiseja kustakin näytteestä ketjuttaa yhdeksi 52224 elementti vektorin (tai 1D array). Sitten ne wavelet transformoitiin käyttäen Daubechies D4 wavelet, tekniikkaa käytetään yleisesti tiedon pakkaus ja on kyky erottaa hienovarainen signaaleja sisällä aineisto. Data pisteissä 52224 elementit soveltuvat syrjintä jälkeen määritellään. Tämä saavutetaan laskemalla sisällä luokan scatter (Σσ

i) ja välillä luokan scatter [(σ

μ)

2 /(Σσ

i)

2] kullekin pisteeseen vektori (siis sama tietopisteiden (tai muuttuva) kaikilta näytteestä aineistot tutkitaan ja sisällä luokan välillä sekä luokan scatter lasketaan kaikissa näytteissä), tuottaa kaksi muuta 1D paneelit, jälleen muodostettu 52224 datapistettä. Eri kynnykset sitten asetettu sisällä luokassa ja välillä luokka hajonta ja muuttujia, jotka ovat nämä kynnykset ovat sitten käytetään tietojen käsittelyyn kalastaja erotteluanalyysi (FDA, ennalta luokiteltu lineaarinen tekniikka). Voit testata pätevyyden FDA, viisi näytettä kustakin ryhmästä (CRC ja kontrollit) poistettiin ennen FDA suoritettiin. Sitten, joka perustuu FDA tuloksista jäännöksen, ennuste tehdään ryhmä tuntemattoman näytteen. Tämä ennustus perustuu KNN (k-lähimmän naapurin) menetelmällä. Tämä prosessi toistetaan kymmenen kertaa kullekin parille raja-arvot, kunnes optimaalinen kynnysarvoja, ja siten asettaa muuttujat, on tunnistettu. Tämä muuttuja ryhmä käytetään sitten jäljellä analyysin laskennassa, herkkyys ja spesifisyys. Lisätietoja analyyseihin kuvattu yksityiskohtaisesti, katso Covington et al [23].

2.5 Ethics

Tieteellinen ja eettinen hyväksyntä saatiin paikallisilta Research Kehitysosasto ja Warwickshiren eettisen komitean 09 /H1211 /38. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta, jotka osallistuivat tutkimukseen.

Tulokset

väestötiedot syöpä ja ei-syöpä ryhmä on kuvattu taulukossa 1. Mitään tilastollisesti merkittävää eroa ryhmiä Todettiin kuitenkin, odotetusti oli miessukupuoli valta. Tiedot tuumorin pysähdyspaikkojen että 83 CRC-potilailla on esitetty taulukossa 2.

analyysi FAIMS tietojen CRC potilaiden ja verrokkien suoritettiin käyttäen Fisher Diskriminanttianalyysi, kuten edellä on kuvattu, ja tulokset tunnistetut muuttujat esitetään kuvassa 2. luokittelun muutoksen CRC oli oikeassa 74%: ssa tapauksista (p 0,001). Herkkyys ja spesifisyys FAIMS analyysin havaitsemiseksi CRC olivat 88% ja 60% vastaavasti.

CRC potilaiden virtsa analysoitiin myös GC-MS, tulokset löytyvät taulukosta 3, sekä luettelo vastaavista kemikaaleja National Institute of Standards and Technology (NIST) tietokantaan. Ei ainutlaatuinen kemiallinen tunnistettiin joilla CRC verrattuna kontrolleihin.

Keskustelu

Tämä tutkimus on ensimmäinen tietojemme ilmoittaa apuohjelman FAIMS analyysit CRC havaitsemiseksi virtsassa ja tukee edellinen työ muiden käyttämällä sähköisiä nenä [5] ja GGMS [16]. Tämä on saavutettu tutkimalla miten kaasujen ja höyryjen (VOC) peräisin virtsanäytteistä ovat erilaisia ​​niissä CRC verrattuna kontrolleihin. Tuloksista käy tukevat aikaisempia työtä missä, VOC allekirjoitus eroja havaittiin CRC-potilaista eri biologisten materiaalien (ulosteiden, hengityksen ja virtsan) [5], [15], [16]. Meidän CRC kohortti oli miessukupuoli valta, koska voidaan odottaa asukkaan CRC potilaista, kun taas meidän kontrolliryhmä oli lievä tytöillä esiintyi. Tämä voisi nostaa mahdollisuus sukupuoleen bias saman kohortin kuitenkin taas kuvio VOC-yhdisteiden ja yhdistymisvapaus, fermentome, voitaisiin teoriassa vaikuttaa sukupuolen ja iän, tiedot aikaisemmista julkaistuista tutkimuksista IBD, sappihappojen imeytymishäiriö, lantion syöpä ja keliakia ei ole havaittu taipumus iän ja sukupuolen vaikuttavat VOC signaalit [23], [24], [25], [26], [27].

De Meij et al osoitti, että e -nenä voisi syrjiä CRC terveiden verrokkien kanssa 85% herkkyys ja 87% tarkkuus, ja se voisi myös erottaa kehittyneiden adenoomia terveiltä säätimet 62% herkkyys ja 86% tarkkuus [5]. Tutkimuksemme ovat osoittaneet, käyttäen virtsanäytteitä sijaan ulosteesta – kanssa FAIMS osoittavat herkkyys on 88% ja spesifisyys 60%. Tällä on merkitystä varsinkin meidän paikallisen väestön levinneisyys seulonta on heikko johtuen vaatimatta ulostenäytteestä.

Ion liikkuvuus on useita etuja sekä GCMS ja e-nenä: esimerkiksi se on aloittanut fyysiseen mittaukseen molekyylien sijaan kemiallista vuorovaikutusta (kuten myös perinteinen e-nenä) ja toiseksi, herkkyys on paljon suurempi eli ppb osia kohti biljoonaa. Tämä tekee siitä ihanteellisen alustan tulevalle seulontatyökalun varsinkin kun herkkyys on korkea. Meidän havainnot laajentaa edelliseen tutkimukseen, jossa kuvataan, miten sekä sähköisen nenä ja FAIMS teknologioita voidaan käyttää erottamaan säteilyn lantion syövissä [25] ja tulehdustiloja esim Crohnin tauti ja haavainen paksusuolentulehdus [26], lisäksi Sappihappoja imeytymishäiriö ja Keliakia [23], [27].

Genetic ulosteesta markkereita ovat saaneet kiinnostusta mahdollisena ei-invasiivisia seulonta tavoite CRC. Lidgard ym [28] suoritetaan tutkimus automatisoitu ulosteesta DNA-analyysi β-aktiini, mutantti

Kras

, poikkeavasti metyloitua

BMP3

ja

NDRG4

, ja ulosteen hemoglobiini. Tämä osoitti herkkyys 98% ja 90% spesifisyys CRC ja 57-83% herkkyys pitkälle adenoomia koosta riippuen. Tutkimuksemme osoittaa samanlainen herkkyys tuloksia, mutta paljon pienemmillä kustannuksin, ja virtsan sijasta ulosteen näytteenottoa.

Ainutlaatuinen kemiallinen sormenjäljen tai ”bio-hajuste sormenjälki” tuotettu eri tautitilojen, ja terveillä yksilöillä , mikä osoittaa, että tämän teknologian seulomiseksi, ja tukea, diagnosoinnissa CRC. Se on myös mahdollista tukea lisätutkimuksia yksilöiden muiden ruoansulatuskanavan sairaudet. Kaasut ja höyryt, uskotaan valmistaa menetelmällä paksusuolen käymisen, johon liittyy kompleksin vuorovaikutusta colonocyte solujen, ihmisen ulosteen kasvien, limakalvojen eheyttä ja patogeenien [17], [18]. VOC-yhdisteiden lähtevä kehon nesteiden on siten valtavat mahdollisuudet otaksuttu biomarkkereita käytettäväksi arvioitaessa ruoansulatuskanavan sairaudet. Muutokset rakenteessa VOC-yhdisteiden uskotaan heijastavat muutoksia ruoansulatuskanavan ympäristössä. Tämä viittaa mahdolliseen rooli suolen mikroflooran dysbiosis patofysiologiassa CRC [29].

Johtopäätökset

Tämä tutkimus on osoittanut, että VOC allekirjoitus läsnä virtsassa sairastavien potilaiden CRC, voi olla erottaa terve ohjauksista FAIMS. Herkkyys ja spesifisyys FAIMS on 88% ja 60% vastaavasti CRC. Vaikka tämä on pienempi kuin kultakanta kolonoskopia on verrattavissa nykyiseen ulosteen ulosteesta testaus lukien guajakkireak- ja immunohistokemiallisia menetelmiä. Yhdistyneen kuningaskunnan otto seulontaan on alhainen; 62%, 57% ja 59% oton ensimmäisessä, toisessa ja kolmannessa kierrosta kansallisen seulontaohjelma [30], ja noin 50% tällä hetkellä paikallisen väestön. Yksi syy tähän on luonteeltaan biologisen näytteen tarvita. Tarjoaisi vaihtoehdon ja lievempiä vaihtoehto, kuten virtsaa sijasta ulosteeseen, on todennäköisesti huomattavasti enemmän potilaiden hyväksyttävissä, ja voidaan sisällyttää seulonta väyliä tulevaisuudessa.

Kiitokset

kiittää WPH, BRET ja Eveson Trust, joka rahoitti tätä tutkimusta.