Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kertyvät todisteet osoittavat, että MikroRNA (miRNA) ovat poikkeavasti ilmaistu ihmisen syövän ja edistää kasvainten synnyssä, mutta niiden rooli haimasyövän ovat vielä suurelta osin tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa tuloksemme osoittivat, että miR-130b oli merkittävästi vaimentua 52 paria haimasyövän kudosten ja viisi solulinjoissa. Lisäksi vapailla miR-130b korreloi huonompi ennuste, lisäsivät kasvainten kokoa, myöhään TNM, imusuonten invaasio ja etäpesäkkeiden. Monimuuttuja-analyysi osoitti, että miR-130b ilme oli merkittävä ja itsenäinen prognostisia ennustaja haimasyövän potilaille. Toiminnalliset tutkimukset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-130b dramaattisesti tukahdutti leviämisen haimasyövän soluja sekä in vitro että in vivo, mikä voisi johtua apoptoosin ja solusyklin pysähtymisen S-vaiheessa. Samaan aikaan, joka on yli-ilmentynyt miR-130b huomattavasti esti invasiivisen kyvyn haiman syöpäsoluja. Lisäksi kaksi lusiferaasianalyysissä paljasti, että STST3 oli suoraan kohdistettu miR-130b, joka vahvistettiin edelleen käänteinen ilmaus miR-130b ja STAT3 haimasyövän näytteissä. Meidän havainnot ehdotti, että miR-130b saattaa olla huomattava potentiaali ennusteen määrittämiseen ja soveltamiseen hoitoa haimasyövän.

Citation: Zhao G, Zhang Jg, Shi Y, Qin Q, Liu Y, Wang B, et al. (2013) MiR-130b Onko Prognostiset Marker ja estää solun lisääntymis- ja Invasion in Haimasyöpä kautta Targeting STST3. PLoS ONE 8 (9): e73803. doi: 10,1371 /journal.pone.0073803

Editor: Johannes Haybaeck, Medical University Graz, Itävalta

vastaanotettu: 31 joulukuu 2012; Hyväksytty: 24 heinäkuu 2013; Julkaistu 10 syyskuuta 2013

Copyright: © 2013 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta National Science Foundation komitea (NSFC) Kiinan (lupanumeroita 30972900 ja 30600594). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA ovat endogeenisia ei-koodaavat RNA: t koostuu noin 22 nukleotidin. MikroRNA voi säädellä negatiivisesti geenin ilmentymisen sitoutumalla osittain komplementaarinen sekvenssien erityisiä kohde-mRNA 3′-alue (UTR), joka voi johtaa joko mRNA: n hajoamisen tai translaation inhibition [1]. Kehittyvät todisteet osoittavat, että miRNA ovat poikkeavasti ilmaistu erilaisia ​​kasvaimia ja osallistuvat ihmisen kasvaimien syntyyn ja /tai etäpesäkkeiden suoraan kohdentamalla onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille [2] – [4].

Haimasyöpä on yksi kaikkein vaarallisin syöpäsairauksia. Vain 10-20%: lla potilaista haimasyöpä ovat kokoisen ja yleistä sen 5 vuoden pysyvyys on vain 5%, koska sen korkea uusiutumisriski huolimatta multimodaalisuus hoitojen [5], [6]. Kuten muiden syöpien, kehitystä haiman syöpä on monivaiheinen prosessi, jossa kertymistä geneettisten ja epigeneettisten muutoksia. Altered miRNA ilmaisuja, kuten miR-34a, miR-21 ja miR-20a, on tunnistettu modulaattoreina solujen kasvun, apoptoosin, kulkeutumista tai invaasio haimasyövän [7] – [9]. Siksi laajempia tutkimuksia tarvitaan roolista miRNA, jotka vapautettiin haimasyövän selventämiseksi toiminta miRNA haimasyövän.

Microarray tutkimuksissa on havaittu useita MikroRNA joka vapautui haiman syöpä, mukaan lukien miRNA-130b [10] – [12]. Tähän mennessä miR-130b on havaittu olevan vapautettu joidenkin syöpien mukaan lukien on yli-ilmentynyt mahasyövän [13], [14], gliooma [15] ja munuaissyövän syöpä [16], samalla vaimentua endometriumin syöpä [ ,,,0],17] ja papillaarinen kilpirauhassyövän [18]. Kuitenkaan mitään erityisiä tutkimuksia ei ole tehty paljastaa rooli miR-130b haimasyövän. Näin ollen meidän Tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa roolin miR-130b haimasyövän. Nykyisessä tutkimuksessa, ilmentymisen miR-130b välillä haimasyöpä ja viereisestä normaalista haiman kudosta analysoitiin. Lisäksi leviämisen ja invasiivisuus arvioitiin PANC-1 ja ASPC-1-soluissa jälkeen transfektoitu miR-130b.

Tutkimuksemme edelleen tunnistaa mahdollisia suoraan kohde, jolla miR-130b kohdistetaan sen toiminta haiman syöpäsoluja. MicroRNA ennuste ohjelmisto osoitti, että signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (STST3) voisi olla alavirran kohde miR-130b. STAT3 on keskeinen sytoplasminen transkriptiotekijä, joka aktivoituu tyrosiinikinaasin kasvun ja sytokiinin reseptoreihin. STAT3 on tärkeä rooli välittämisessä erilaisissa biologisissa prosesseissa, mukaan lukien: solujen proliferaatiota, apoptoosin ja erilaistumisen [19]. STAT3 on tunnistettu keskeiseksi kasvaimia synnyttävän tekijä useiden pahanlaatuisten kasvainten ja tarvitaan oncogenesis ihossa ja syöpien [20], [21]. Haimasyövän, aktivointi STAT3 edistää kasvainsolujen kasvua ja invaasiota, joka johti huono potilaan eloonjäämisen [22]. Lisäksi STAT3 Knockdown esti solujen kasvua ja invasiivisuus haimasyövän sekä

in vitro

ja

in vivo

, ja selvästi vähentynyt VEGF ja MMP-2 ilmaisuja [23], [24]. Siksi kaksi lusiferaasianalyysissä levitettiin sen selvittämiseksi STST3 oli suoraan kohdistettu miR-130b. Lisäksi korrelaatio ilmaus miR-130b ja STAT3 haimasyövän näytteistä tutkittiin edelleen.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kasvaimen kudokset

Yhteensä 52 ihmisen haimasyövän kudokset (PC) ja vastaaviin normaaleihin viereisten haiman kudoksista (NP) saatiin aikana kirurgian haiman Disease Institute, Union Hospital (Wuhan, Kiina) tammi 2007 joulukuuta 2009. diagnoosi perustui patologisia havaintoja ja yksilöt olivat välittömästi snap-jäädytetty. Ne varastoitiin -80 ° C: ssa tulevaa miR-130b ja STAT3 uuttamalla. Kukaan potilaista ei saanut kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen kirurginen. Kaikki 52 potilasta edellyttäen kirjallinen lupa käyttöön kudoksiin ja tutkimussuunnitelman hyväksyi eettinen komitea Huazhong tiede ja teknologia, ja määrä eettistä hyväksyntää oli S214.

Quantitative Reaaliaikainen Käänteinen transkriptio-polymeraasi Chain Reaction (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA eristettiin haimasyöpä kudoksista tai soluista käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, USA). MiR-130b ja U6 olivat polyadenyloitu käyttäen poly-A-polymeraasi pohjainen First-Strand Synthesis Kit (Takara Bio, Japani) seuraten valmistajan protokollaa. Määrällisesti STAT3 ja GAPDH-mRNA: n tasot, 1 ug kokonais-RNA: ta suoritettiin ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi 15 min 37 ° C: ssa ja 5 s 85 ° C: ssa käyttäen PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa). QPCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green PCR Master Mix (Takara) ABI 7500HT System. U6 tai GAPDH käytettiin endogeenista kontrolli. Suhteellinen kertainen ilmaisuja laskettiin 2

-ΔΔCT menetelmällä. Kaikki qRT-PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Luettelo käytetyt alukkeet reaktiot on esitetty taulukossa S1.

Cell Lines and Cultures

Ihmisen haimasyövän PANC-1, ASPC-1, MiaPaca-2, BXPC-3 ja SW1990 solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) ja pidettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja antibiootteja (100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia). Soluja kasvatettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO2.

Transfektio

MikroRNA suunniteltiin ja syntetisoitiin RiboBio (Ribobio Co, Guangzhou, Kiina). MicroRNA transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Haiman syöpä Solut siirrostettiin 12-kuoppalevyille ja kasvatettiin 40% konfluenssiin ennen transfektiota. RNA ja proteiinit uutettiin 48 h transfektion jälkeen. Lopullinen pitoisuus miR-130b matkivat ja anti-miR-130b oli 50 nM. Lentivirusvektorikonstruktit miR-130b (LV-miR-130b) ja tyhjät lentivirusvektorikirjastojen (LV-NC) konstruoitiin Genechem Company (Shanghai, Kiina) ja transfektoitiin haimasyöpäsoluissa mukaan valmistajan ohjeiden. Kaikki oligonukleotidisekvenssit käytettiin tässä kokeessa, on lueteltu taulukossa S2.

soluproliferaatiomääritykset

Solujen proliferaatio määritettiin MTT-määrityksissä. Lyhyesti, haimasyövän soluja (5 x 10

3 per kuoppa) maljattiin 96-kuoppaisille levyille RPMI 1640 ja 10% FBS: ää. Kun oli kulunut 24 h ollessa viljelyn jälkeen solut transfektoitiin 50 nM miR-130b jäljittelee, anti-miR-130b ja niiden ohjaus käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Soluja viljeltiin sitten väliaine vielä 48 tuntia ja arvioitiin kolorimetrisellä määrityksellä käyttäen MTT-liuosta (5 mg /ml) 570 nm: ssä. Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa viisi rinnakkaisnäytettä.

arviointi Apoptosis and Cell Cycle Distribution

Apoptoosi hinnan ja solusyklin vaihe määritettiin FACS virtaussytometrialla, kuten aiemmin on raportoitu [25]. Apoptoosin analyysi, solut kerättiin, pestiin kahdesti kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja suspendoitiin uudelleen sitomispuskuriin solutiheyteen 1 x 10

6 /ml. Sitten solut värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja propodium jodidi mukaan valmistajan protokollaa. Signaali osti FACS Calibur virtaussytometrillä (BD Biosciences) ja analysoitiin CellQuest ohjelmisto. Sillä solusyklin analyysi, solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin 70% etanolissa yön yli -20 ° C: ssa. Sitten soluja käsiteltiin DNA-värjäys, joka sisälsi 3,4 mM Tris-CI (pH 7,4), propodium jodidia, 0,1% Triton X-100-puskuria, ja 100 ug /ml RNaasi A Cell cycle analyysi suoritettiin FACS virtaussytometrialla.

Matrigel Invasion Pitoisuus

Matrigel invaasio kammion käytettiin arvioimaan soluinvaasion kyky (24-kuoppalevyille, 8 mm: n huokoskoko, Corning), kuten aiemmin on kuvattu [26]. Lyhyesti, soluja (5 x 10

4) ympättiin ylemmässä kammiossa 37 ° C: ssa kanssa väliaineessa, joka sisälsi 0,1% naudan seerumin albumiinia, kun taas väliainetta, joka sisälsi 20% naudan sikiön seerumia pantiin alempaan hyvin. 48. tunnin noninvading solut poistettiin vanutupoilla. Invasiivinen solut alareunassa kalvon värjättiin 0,1% kristallivioletilla ja laskettiin mikroskoopin avulla seuraten. Määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa.

Western blot -analyysi

haimasyöpä solut kerättiin 48 tunnin kuluttua hoidon 50 nM miR-130b matkivat tai anti-miR-130b ja vastaava valvonta. Proteiini uuttamalla, SDS-PAGE-geelielektroforeesi ja blottaus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [27]. Useita erilaisia ​​ensisijainen vasta-aineita käytettiin myös: STAT3 (Cell Signaling Technology, Danvers, USA) ja GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). Sekundaarinen vasta-aine inkuboinnit suoritettiin 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja Proteiinivyöhykkeet visualisoidaan röntgenfilmille käyttäen tehostettua kemiluminesenssia ECL alustaan.

Dual Luciferase Assay

kotransfektiokokeissa oli suoritettiin 96-kuoppaisilla levyillä. Yhteensä 1 x 10

4 solua ympättiin per kuoppa 200 ui väliaineessa. Yhteensä 100 ng villityypin (WT) tai mutantti (MUT) reportteri-konstruktit transfektoitiin yhdessä Lipofectamine 2000 transfektioreagenssin osaksi haimasyöpäsoluissa 50 nM miR-130b tai miR-NC mukaan valmistajan ohjeita. 48 h jälkeen lusiferaasiaktiivisuus mitattiin Dual-lusiferaasireporttiterilla määritys (Promega). Tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus oli normalisoidaan sitten vastaavaksi Renilla lusiferaasiaktiivisuus.

haimasyövän ksenograftimallissa

neljä-viikkoisen naaras-nude-hiirten (BALB /c-nude) käytettiin tutkimaan tuumorigeenisyyden . Yhteensä 100 ui solujen liuokset (joka sisälsi 1,5 x 10

7 PANC-1-solut) injektoitiin subkutaanisti oikeaan kylkeen hiirten. Tuumorin koko mitattiin työntömitalla joka neljäs päivä ja tuumorin tilavuudet laskettiin käyttäen kaavaa: pituus x leveys

2 x 0,5 [28]. Käyttö nude-hiirten noudattanut Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals ja hyväksyi tutkimuksen Animal Care ja käyttö komitean Tongji Medical College of Huazhong tiede ja teknologia.

Tilastollinen analyysi

miR-130b ilmentymistä verrattiin haimasyövän kudosten ja solujen, joita parittomia Studentin t-testiä. Väliset suhteet miR-130b ja ennusteeseen viittaavia parametreja arvioitiin χ

2 testiä. Selviytymisen hinnat miR-130b ilmentyminen arvioitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmä ja ero eloonjäämiskäyrien testattiin log-rank-testi. Eloonjääntitulokset arvioitiin käyttämällä Coxin monimuuttuja regressioanalyysi. Suhde miR-130b ja STAT3 ilmentyminen selvittävät Spearmanin korrelaatiota. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS13.0 ohjelmistojen ja tiedot esitettiin keskiarvoina ± keskihajonta (SD). A s pienempi kuin 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

ennusteeseen viittaavia merkitys miR-130b in Haimasyöpä Potilaat

Käyttämällä qRT-PCR-menetelmän, miR-130b havaittiin kaikki 52 paria haimasyövän kudosten ja niiden yhteensovitettujen noncancerous haiman kudoksista, sekä haimasyövän solulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, 45 PC kudoksissa osoitti alhainen ilmentyminen miR-130b verrattuna kuin NP kudosten ja mediaani kertainen muutos oli 1,86 (P 0,01). Samaan aikaan miR-130b ekspressio väheni huomattavasti kaikissa viidessä haimasyövän solulinjoissa tutkittiin verrattuna, että normaalin haiman näytettä (Fig. 1 B).

(A) suhteellinen ilmentymistaso miR-130b ihmisen haimasyövän kudosten (n = 52) ja sovitettu viereisten noncancerous haiman kudoksista (n = 52). PC: haimasyövän kudoksia; NP: viereisten noncancerous haiman kudoksista. (B) ekspressiotaso miR-130b viisi haimasyövän solulinjoissa (PANC-1, ASPC-1, MiaPaca-2, BXPC-3 ja SW1990). Tiedot esitetään haimasyövän solulinjoissa suhteessa kontrolliin. Ei ollut normaalia haiman solulinja, joten satunnaisesti valitsimme kolme normaalia haiman kudoksista kontrollina. U6 käytettiin kontrollina RNA kuormaus- ja miRNA runsaasti normalisoitiin kuin U6-RNA. (C) Kaplan-Meier käyrät yleistä jäänteitä 52 haimasyövän potilasta sai niin alhainen ekspressiotason (alle keskimääräisen arvon, n = 26) ja korkea ilmentymistaso (yli keskimääräisen arvon, n = 26) mukaan miR -130b ilme. MIR-130b downregulation korreloi merkitsevästi yleisen lyhyempi selviytymistä. P-arvot näkyvät käyttämällä log-rank-testi. (D) χ

2 analyysi suhdetta miR-130b ja invaasio /etäpesäke haimasyövän potilaille. *. P 0,05; **. P 0,01.

Lisäksi korrelaatio miR-130b downregulation korreloi haimasyöpä ennuste tutkittiin. Sitten tutki korrelaatio miR-130b ilmaisun ja kliinisiä patologisia ominaispiirteitä haimasyöpä. Alhainen miR-130b ilmentymisen ryhmässä esiintyi enemmän lisääntyneen kasvaimen kokoa (P = 0,001), myöhäinen TNM (P = 0,005), lymfaattinen invaasio (P = 0,012) ja etäpesäkkeiden (P = 0,012). Ei kuitenkaan ole merkittäviä eroja ei havaittu suhteessa sukupuoleen, ikään, kasvaimen sijainti, histologinen tai alus tunkeutuminen haimasyövän (taulukko 1). Lisäksi Kapan-Meier selviytymisen analyysi paljasti, että potilaat, joilla on alhainen miR-130b ilme oli huomattavasti huonompi ennuste kuin ne, joilla on korkea ilme (Fig. 1 C). Kuten on esitetty kuviossa. 1D χ

2-analyysi osoitti, että potilailla, joilla on alempi miR-130b ilmentyminen useammin liittyvän kasvaimen invaasion ja metastaasin. Lisäksi potilailla, joilla on kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden oli huomattavasti alhaisempi miR-130b ilme. Samaan aikaan, Cox monimuuttuja-analyysi osoitti, että miR-130b ilme, TNM, ja kaukainen etäpesäke olivat merkitsevästi yhteydessä eloonjäämisaste haimasyövän potilaille itsenäisinä ennustavat tekijät (taulukko 2). Nämä tulokset osoittivat, että miR-130 vapauttaminen korreloi huonompi ennuste ja oli mukana invaasio /etäpesäke haimasyövän.

MiR-130b Tukahdetut Cell Proliferation sekä

in

vitro

ja

in vivo

jotta voitaisiin tunnistaa vaikutukset miR-130b haiman syöpäsoluja, transfektoimme PANC-1 ja ASPC-1-solujen kanssa 50 nM miR-130b jäljittelee, anti-miR-130b ja niiden NCS. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, MIR-130b jäljittelee aiheutti 63.32 ja 28.75-kertaiseksi miR-130b ilmentymisen PANC-1 ja ASPC-1-soluissa, vastaavasti. Samaan aikaan anti-miR-130b vähensi miR-130b ilmentyminen 2,34 ja 2,88 taittuu PANC-1 ja ASPC-1-soluissa, vastaavasti. Transfektion jälkeen miR-130b jäljittelee, leviämisen estyi merkittävästi PANC-1 ja ASPC-1-soluissa 30,35 ± 2,90% ja 22,03 ± 7,64%, vastaavasti (P ​​ 0,01). Kuitenkin anti-miR-130b edistänyt kasvua PANC-1 ja ASPC-1- soluissa 15,23 ± 7,40% ja 16,70 ± 3,56%: lla (P 0,01; Fig. 2B).

(A) ilmentymisen taso miR-130b testattiin 48 h haimasyövän transfektoiduissa soluissa miR-130b jäljittelee (miR-130b), anti-miR-130b ja niiden NCS (50 nM), jonka qRT-PCR: llä. (B) vaikutus ohimenevä transfektion miR-130b tai anti-miR-130b (50 nM) 48 h tutkittiin kasvuun PANC-1 ja ASPC-1-solujen MTT: llä. (C) MIR-130b esti tumourigenicity nude hiirillä ksenograftimallissa. LV-miR-130b tai LV-NC transfektoitiin PANC-1-soluissa, kun läsnä on viruksella infektiokertoimella (MOI) 20. tartunnan PANC-1 solut ihon alle injektoitiin nude-hiiriin. Kasvaimen kasvun käyrät ja valokuvia leikattiin kasvaimia 32 päivää implantaation jälkeinen esitetään kuten on osoitettu. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD 10 hiirillä. (D) MIR-130b ekspressiotasoja analysoitiin leikattiin kasvainten qRT-PCR: llä ja normalisoitiin endogeenisen ohjaus (U6-RNA). Tiedot esitetään keskiarvona ± SD 10 hiirtä. *. P 0,05; **. P 0,01 verrattuna kontrolliin.

edelleen varmistamiseksi edellä havainnoista, joka on

in vivo

tuumorimallissa rakennettiin istuttamalla PANC-1 transfektoitujen solujen LV-miRNA -130b tai negatiivinen kontrolli. Koko kasvaimia aikana, kasvainten miR-130b transfektoidut solut kasvoivat huomattavasti hitaampi (Fig. 2C). MIR-130b ilmentymisen ksenograftikasvaimissa LV-miR-130b ryhmässä oli ilmeisesti suurempi kuin kontrolliryhmän (Fig. 2D). Nämä tulokset osoittivat, että miR-130b inhiboivat haimasyöpäsoluissa sekä

in vitro

ja

in vivo

.

MiR-130b aiheuttaman apoptoosin ja solukierron pysähtymisen haiman syöpäsolut

tutkimiseksi mekanismeja miR-130b estoa haimasyöpä soluproliferaatioon, olemme analysoineet apoptoosin ja solusyklin transfektoiduissa PANC-1 ja ASPC-1-soluissa käyttämällä virtaussytometria. MIR-130b jäljittelee lisäsi merkittävästi apoptoosin korko PANC-1 (3,57 ± 0,83%

vs.

11,17 ± 1,96%) ja ASPC-1-soluissa (6,17 ± 1,66%

vs.

12,30 ± 1,30%) verrattuna kuin miR-NC (Fig. 3A ja 3C). Lisäksi miR-130b jäljittelee vähensi osuutta G0 /G1 ja G2 /M vaiheessa. Lisäksi ne kasvattanut S vaihe PANC-1 (24.13 ± 4,10%

vs.

41.54 ± 3,80%) ja ASPC-1-soluissa (23,52 ± 3,33%

vs.

47.66 ± 2,04%) verrattuna kontrollien (Fig. 3B ja 3D).

(A) PANC-1 ja ASPC-1-solut transfektoitiin miR-130b tai miR-NC (50 nM) 48 tuntia ja apoptoosi mitattiin anneksiini V värjäys ja virtaussytometria. (B) toinen PANC-1 ja ASPC-1-solut käsiteltiin kuten edellä on mainittu, ja solusyklin jakautumisen mitattiin PI-värjäyksellä ja virtaussytometrialla. Virtaussytometrinen analyysi vaikutuksia miR-130b: n indusoiman apoptoosin (C) ja solukierron pysähtymisen (D). Tiedot esitetään keskiarvona ± SD tuloksista 3 erilliselle kokeelle. **. P 0,01 verrattuna kontrolliin.

MiR-130b esti Haimasyöpä Cell invasiivisuus

The effect of miR-130b haiman syöpäsolun invasiivisuus tutkittiin Matrigel invaasio määrityksiä. Huomasimme, että määrä hyökkääviä PANC-1-solut transfektoitu miR-130b matkii (57 ± 5 solua /HP, HP: korkea teho suurennus kenttä) oli huomattavasti pienempi kuin määrä niille transfektoitu miR-NC (122 ± 9 solua /HP, Fig. 4A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös invasiivisuus on ASPC-1-soluja, jotka on transfektoitu miR-130b jäljittelee (Fig. 4B). Se paljasti, että miR-130b välitteisen haiman syöpäsolun invasiivisuus.

(EN) PANC-1-solut transfektoitiin miR-130b tai miR-NC (50 nM) 48 tuntia ja solun hyökkäys kyky oli mitattuna matrigeeliin invaasio määrityksiä. (B) toinen ASPC-1-solut käsiteltiin kuten edellä ja solujen invaasiota kyky mitattiin matrigeeliä invaasio määrityksissä. Kvantifiointi suoritettiin laskemalla värjätään PANC-1 ja ASPC-1-solut, jotka tunkeutuneet alempaan kammioon alla valomikroskoopilla. Kaikki tulokset olivat toistettavissa kolmessa riippumattomassa kokeessa. **. P 0,01 verrattuna kontrolliin.

STAT3 voisi olla välittömänä kohteena miR-130b

tutkia mahdollinen kohde, jonka kautta miR-130b estää proliferaatiota ja hyökkäys haimasyövän soluja, me käytti bioinformatiikan ennustaa otaksuttu miR-130b tavoitteet käyttämällä TargetScan, Miranda ja PicTar algoritmeja. Analyysimme tunnistettu STAT3, avain onkogeeni, yhtenä potentiaalisia miR-130b. Lisäksi tavoite sekvenssit STAT3 3’UTR (villityyppi, WT) tai mutantin sekvenssin (mutantti tyyppi, MUT) kloonattiin lusiferaasireportteri- vektori, vastaavasti (Fig. 5A). Tuloksemme osoittivat, että miR-130b vähensi tulikärpäsen lusiferaasin aktiivisuus reportteri villityypin 3’UTR, mutta aktiivisuus mutantti 3’UTR vektorin pysyivät muuttumattomina (kuvio. 5B). PANC-1-solut edelleen transfektoitu miR-130b ja tutkittiin STST3 ilmentymisen qRT-PCR ja western blot. Kuten on esitetty kuviossa. 5C, MIR-130b transfektio johti selvä lasku STST3 mRNA ja proteiinin ilmentymisen. Päinvastoin, transfektio anti-miR-130b tuloksena säätelyyn ylöspäin on STAT3 ilmaisua.

(A) (Ylälevy) Ihmisen STAT3 3’UTR fragmentti, joka sisältää villin tyypin tai mutantit miR-130b- sitovan sekvenssin. (Pohja paneeli) MIR-130b ja miR-130b-sitoutumiskohta 3’UTR of STAT3. (B) lusiferaasireporttiterilla määrityksessä kotransfektiolla villityypin tai mutantti-3′-UTR (100 ng) ja miR-130b tai miR-NC (50 nM) PANC-1-soluissa. Tulikärpäsen lusiferaasi kunkin näytteen aktiivisuus normalisoitiin vastaan ​​Renilla lusiferaasiaktiivisuus. (C) vaikutukset miR-130b tai anti-miR-130b on endogeenistä STAT3. QRT-PCR (vasen paneeli) ja Western blot (oikea paneeli) käytettiin seurantaan STST3 ilmentymistä PANC-1-soluissa 48 tunnin kuluttua transfektion miR-130b tai anti-miR-130b (50 nM). Kaikki tiedot kolmesta erillisestä kokeesta esitetään keskiarvona ± SD. *. P 0,05; **. P 0,01.

STST3 oli yläreguloituja Haiman kudoksia ja sen korreloi käänteisesti miR-130b tasot

STST3 mRNA-tasot mitattiin PC kudoksissa ja viereisten noncancerous kudoksiin. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, keskimääräistä tasoa STAT3 ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi PC kudoksissa verrattuna NP kudosten (P 0,01). Merkittävä käänteinen korrelaatio ei havaittu STST3 ja miR-130b ilmaisuja haimasyövän kudoksissa (Spearmanin korrelaatio, r = -0,4903; P 0,01) ja viereisten noncancerous kudoksiin (r = -0,4026; P 0,001) (Kuva. 6B).

(A) STAT3 havaittiin qRT-PCR 52 haimasyövän (PC) kudoksiin ja sen sovitettu viereisen noncancerous haiman kudoksista (NP). STAT3 runsaus normalisoitui vastaan ​​GAPDH. (B) välinen suhde STST3 ja miR-130b ilmentyminen selvittävät Spearmanin korrelaatiota 52 pariksi PC kudosten ja viereisten NP kudoksiin. Kaikki tiedot kolmesta erillisestä kokeesta esitetään keskiarvona ± SD. *. P 0,05; **. P 0,01.

Keskustelu

miRNA profiilit on perustettu erilaisia ​​kiinteitä ja hematologisia syöpiä [29], [30]. Viime vuosina, löydettiin miRNA on läpikäynyt merkittäviä edistysaskeleita ymmärrystä syövän biologian antamalla lisää mekanismeja geneettisiä vapauttamiseen. Kuitenkin tiedetään vähän molekyylitason mekanismit, joilla on miRNA modulaatio prosessissa kasvaimen ja käyttäytymistä haimasyövän soluja. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-130b oli usein alassäädetty sekä haimasyövän kudoksissa ja solulinjoissa. Paljastui myös, että miR-130b tukahdutti haimasyöpäsoluissa lisääntymistä sekä

in vitro

ja

in vivo

indusoimalla apoptoosin ja solukierron pysähtymisen sekä esti invasiivisuus

vuonna vitro

. Lisäksi myös STST3 luonnehdittiin toiminnallinen kohde miR-130b.

miRNA on raportoitu olevan tärkeitä haimasyöpä, kun taas yhdistysten kanssa selviytymisen ja kliinisiin tuloksiin ovat pitkälti epäselviä. Selviytyminen analyysi läsnä Tutkimus osoitti, että miR-130b vapauttaminen korreloi lyhyempi elinaika haimasyövän potilaille. Samaan aikaan kliiniset tiedot osoittivat, että miR-130b sääntelyn purkamista merkitsevästi yhteydessä suuri kasvaimen kokoa, myöhään TNM, imusuonten invaasio ja etäpesäkkeiden. Lisäksi monimuuttuja-analyysi osoitti, että matalan miR-130b ilme, kehittyneet TNM ja etäpesäkkeiden olivat merkittäviä ennustavat tekijät huono yleinen eloonjäämisaste haimasyövän potilaille. Niinpä ehdotamme, että havaintomme tarjoavat oivalluksia tärkeyttä miR-130b, joka voisi olla uusi biomerkkiaine ennustaa ennustetta ja etenemistä potilailla, joilla on haimasyöpä.

Äskettäin modulaatio miRNA uskotaan omistavat huomattavia kliinistä potentiaalia syövän hoidossa [31]. Yip et ai. paljasti, että vaimentua miR-130b korreloi voimakkaasti aggressiivinen fenotyyppi papillaarisen kilpirauhaskarsinoomaa [18]. Yang et ai. osoittivat, että miR-130b downregulation edistänyt moniresistenttien munasarjasyövän osittain kohdistamalla 3′-UTR CSF-1, kun taas miR-130b hiljentäminen saattaa välittyä DNA: n metylaatio [32]. Kuitenkin muut tulokset osoittivat, että miR-130b oli merkittävästi voimistunut ja toimi kasvaimen promoottori. Lai et ai. osoittivat, että miR-130b oli ilmeisesti yli-ilmennetään mahasyövän ja sen yliekspressio lisääntynyt solujen elinkelpoisuutta ja vähentää solukuolemaa [13]. Liu et ai. osoittivat, että miR-130b yliekspressoitui maksan syöpä ja voi olla seerumin biomarkkereiden kliinisiä arvot maksan solujen syövän seulontaa [33]. Koska vaikutus miR-130b haimasyövän oli kaukana määritelty, tämän tutkimuksen tavoitteena oli tunnistaa toiminta miR-130b haimasyövän. Palauttaminen miR-130b havaittiin merkittävästi tukahduttaa leviämisen PANC-1 ja ASPC-1 soluissa apoptoosin induktio ja solukierron pysähtymisen S vaiheessa. Lisäksi kasvua ksenograftikasvaimissa inhiboitui merkittävästi sen jälkeen, kun on transfektoitu LV-miR-130b. Nämä tulokset ymmärtää, että miR-130b voisi toimia inhibiittorina edistymistä haiman syövän synnyn. Lisäksi nämä tulokset osoittivat heterogeenisyys toiminta miR-130b, joka oli riippuvainen syöpätyypin ja solujen yhteydessä.

Invasion ja etäpesäkkeiden olivat tärkeimmät syyt huonon ennusteen potilailla, joilla on haimasyöpä. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että oli läheinen korrelaatio invaasio /etäpesäke haimasyövän ja miRNA, kuten miR-20 ja miR-146a [9], [34]. Siksi purkautuu monimutkainen roolia miRNA prosessissa haimasyövän etäpesäkkeiden voisi tarjota uusia näkökulmia terapeuttisten seurauksia. Kliiniset tulokset osoittivat, että miR-130b oli merkittävästi vähentynyt potilailla, joilla invaasio /etäpesäkkeitä. Lisäksi potilaat, joilla on korkeampi ilmaus miR-130b olivat harvemmin liittyy invaasio /etäpesäkkeitä. Olemme edelleen osoitettu rooli miR-130b haiman syöpäsolun invasiivisuus. Sen jälkeen palauttamisen miR-130b, invasiivisuus on PANC-1 ja ASPC-1-soluissa selvästi estyy. Nämä tulokset intensiivisesti ymmärtää, että miR-130b voisi olla mukana haimasyövän etäpesäkkeiden etenemistä. Siksi lähestymistavat käyttöön miR-130b syöpäsoluiksi ehkä potentiaalisesti toteutettavissa kliinisessä hoidossa haimasyöpä, erityisesti niille, joilla on alhaisempi miR-130b ilmentyminen kasvaimen kudoksissa.

STAT3, jäsen signaalitransduktion ja transkriptiotekijöiden (STAT) perhe, on usein yli-ilmentynyt useissa erilaisissa ihmisen kasvaimissa, kuten haimasyövän [35] – [37]. STAT3 osallistuu aloittamisen ja kehittämisen syöpien edistämällä solujen lisääntymistä, vähentää solujen apoptoosin edistämiseen angiogeneesiä, invaasio ja etäpesäkkeiden [38], [39]. Tässä tutkimuksessa tärkeä molekyylisidoksia välillä miR-130b ja STAT3 osoitettiin. Bioinformatiikan analyysi osoitti, että STAT3 saattaa olla yksi mahdollisista tavoitteet miR-130b. Lusiferaasiaktiivisuus tiedot osoittivat, että miR-130b pystyi suoraan kohdistaa 3’UTR STAT3. QRT-PCR ja western blot tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-130b vaimentua ilmentymistä STAT3 haiman syöpäsoluissa sekä häiritsevät ja hajottavat mRNA, kun taas anti-miR-130b voimistunut STAT3 ilmaisua. Lopuksi käänteinen korrelaatio miR-130b ja STAT3 ilmaisun PC ja NP kudosten Lisäksi vahvistettiin, että miR-130b downregulation johti STST3 yli-ilmentymiseen. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että miR-130b voi estää solujen kasvua ja invaasiota haimasyövän suuntaamalla STST3.

Yhteenvetona tämänhetkisiin Tutkimus osoitti, että vapailla ilmentymistä miR-130b liittyi huonoon ennusteeseen ja aggressiivinen fenotyyppiä haimasyöpä.