Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja tavoitteet

Eturauhasen syöpä (PCA) on yksi yleisimmistä syövistä ja yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien miehillä. Mass seulonta on tehty 1990-luvulta lähtien käyttäen eturauhasen antigeenin (PSA) tasot seerumissa kuin PCA biomarkkereiden. Vaikka PSA on erinomainen elin-markkeri, se ei ole syöpä-markkeri. Siksi Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli löytää uusia biomarkkereita diagnosoimiseksi PCa.

Materiaalit ja menetelmät

keskittyneet virtsanäytteistä mitätöity seuraavat eturauhasen hieronta (eturauhasen [DRE]) ja teki peptidomic analyysi näistä näytteistä käyttäen matrix laserdesorptio /ionisaatio-of-lennon (MALDI-TOF /MS

n). Virtsan biomateriaalit konsentroitiin ja suolat käyttäen CM-Sepharose ennen seuraavan analyysit suoritetaan MALDI-TOF /MS

n: 1) ero analyysit massaspektrit; 2) määritetään aminohapposekvenssin; ja 3) määrälliset analyysit käyttäen vakaa isotooppi-merkittyä sisäistä standardia.

Tulokset

monimuuttuja-analyysi MALDI-TOF /MS massaspektri virtsan otteita paljasti 2331 Da peptidi virtsanäytteistä seuraavissa DRE. Tämä peptidi tunnistettiin C-pään PSA fragmentin, joka koostuu 19 aminohappotähteestä. Lisäksi kvantitatiivinen analyysi suhdetta isotooppileimattua synteettisiä ja ehjät peptidejä käyttäen MALDI-TOF /MS osoitti, että tämä peptidi voi olla uusi patognomisia biomarkkereiden ehdokas jotka voivat erilaistua PCa potilaita kuin syöpäpotilailla.

Johtopäätös

tulokset tämän tutkimuksen osoittavat, että 2331 Da peptidifragmentin PSA voi tulla uusi patognomisia biomarkkeri diagnoosia PCa. Lisäksi laajamittainen tutkimus on parhaillaan käynnissä arvioimaan mahdollisuutta käyttää tätä peptidin varhaisessa havaitsemisessa Eturauhassyövän.

Citation: Nakayama K, Inoue T, Sekiya S, Terada N, Miyazaki Y, Goto T, et ai. (2014) C-terminaalin fragmentti Prostate-Specific Antigen, joka on 2331 Da Peptide, uutena Virtsan patognomisia biomarkkereiden Asiaan diagnosoimiseksi eturauhassyövän. PLoS ONE 9 (9): e107234. doi: 10,1371 /journal.pone.0107234

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 12 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 08 elokuu 2014; Julkaistu: 18 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Nakayama et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus myönsi Japanin Society for Promotion of Science kautta ”rahoitusohjelma maailman johtava Innovatiivinen R so PCa potilaat ja ei-syöpä aiheista. Uudistettuun diagnoosi Eturauhassyövän tehtiin histologinen diagnoosi eturauhasen kudosnäytteistä tai eturauhanen rauhaset poistetaan leikkauksen jälkeen, kun ne on tehty. Viisikymmentä kerättiin PCa potilaista, ja niiden kliiniset ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. kliininen ominaisuudet kuin syöpäpotilailla on esitetty taulukossa 2. Kaikki virtsanäytteistä ei-syöpä ryhmä oli kerätty ennen holmium laser enucleation n eturauhasen (HoLEP), höyläysleikkaus eturauhasen (TURP), ja neulabiopsiaan eturauhanen, kun suoritetaan. Diagnoosit kuin syöpäpotilailla määriteltiin hyvänlaatuisen histologiset diagnoosit eturauhasen rauhaset poistetaan HoLEP ja TURP ja eturauhasnäytteissä saatu neulabiopsiaan, paitsi kahdessa tapauksessa (nro 14 ja 15), jotka eivät saaneet neulakoepala takia erittäin alhaiset seerumin PSA ja normaali DRE. Yhdeksäntoista kuin syöpä kerättiin. Kaikki histologiset diagnoosit varmistettiin urogenitaalinen patologia meidän sairaalassa.

Kemikaalit ja reagenssit

Tris [hydroksimetyyli] aminometaani (Tris), Triton X-100, ja urea olivat Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Molecular biology grade 3 – [(kolamidopropyyli) dimetyyliammo-] -1-propaanisulfonaattia (CHAPS) hankittiin Calbiochem (San Diego, CA, USA). Kaikki vesi käytetään tässä kokeessa, lukuun ottamatta HPLC-systeemiä, valmistettiin käyttäen Milli-Q-järjestelmä (Millipore, Bedford, MA, USA). Asetonitriili (ACN), ja ilman 0,1% muurahaishappoa (FA), ja veden kanssa ja ilman 0,1% FA LC-MS Chromasolv ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaikki muut reagenssit olivat korkealaatuisia kaupallisesti saatavilla.

Virtsanäyte kokoelma

Virtsa kerättiin seuraavasti: urologin suorittaa DRE varovaisesti tahnaa kummallakin puolella eturauhanen kolme kertaa, joka kannustanut liike ja vapauttaa eturauhasen nesteitä virtsaputkeen. Nämä eturauhasen nesteet kerättiin kun aiheet mitätöity virtsaan hieronta. Virtsanäytteet kerättiin suodatettiin 100 um: n nylon solun- (BD Falcon, San Jose, CA, USA) ja sentrifugoitiin 2000 x g: ssä 10 minuutin ajan 20 ° C: ssa jättää virtsan roskia. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantit suodatettiin jälleen solun-. Suodatettu supernatantti virtsanäytteistä säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes myöhemmin analyysit.

Virtsanäyte valmisteen

Esillä olevassa tutkimuksessa, virtsan peptidien ja proteiinien fragmentit vangiksi ioninvaihto-Sepharose-hartsi analysoitiin käyttämällä MALDI-TOF /MS

n. CM-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) käytettiin ioninvaihtohartsin kaapata ja keskittää peptidien ja proteiinien fragmentteja virtsanäyte, sekä suolan poistamiseksi väkevää näytteitä. In-house rakennettu MALDI digitaalinen ioniloukku (DI) TOF /MS

n valmistaja Shimadzu Corporation (Kioto, Japani) käytettiin massa spektrianalyysilaitteisiin. Differential analysoi virtsan massaspektri dataa 2 aineryhmän (ei-syöpä ja PCA) suoritettiin käyttäen ioni-ansa reflektoritoimintatilaa MALDI-DIT-TOF /MS. Peak tunnistuksiin tehtiin myös reflektronia ioni-ansa tilassa. Peak luettelot saatu MS

2 spektrit käytettiin tunnistamaan aminohapposekvenssin kanssa Mascot MS

2 hakukoneen (Matrix Science, London, UK).

Jäädytetyt virtsanäytteistä (1,0 ml) sulatettiin sentrifugoimalla 1000 x g: ssä 15 minuutin ajan 20 ° C: ssa. Neljäsataa ui lyysipuskuria (9 M ureaa, 2% CHAPS, 50 mM Tris, pH 9) lisättiin kuhunkin virtsanäyte ja seoksia inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa rotaatiossa. Denaturoitu virtsanäytteet lisättiin 3,6 ml sitovia puskureita (100 mM ammoniumasetaatti, pH 4, 0,05% Triton-X). Yhdeksänkymmentä ui 30% aktivoitua CM-Sepharose lisättiin kuhunkin edellä sidospuskuria seokset, ja seosta vorteksoitiin hyvin. Putkia inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa rotaatiossa. Sen jälkeen, kun sitä inkuboitiin putkia sentrifugoitiin 1000 x g 10 minuutin ajan 20 ° C: ssa. Supernatantit heitettiin pois käyttäen 5 ml Finnpipette F1 (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Suomi). Sakat, CM-Sepharose-kiinni peptidien ja proteiinien fragmentit, siirrettiin 1,5 ml: n mikroputkiin.

hartsit pestiin kolme kertaa sitoutumispuskurilla ja tislattua vettä LC-MS: llä. Pesu tehdään sentrifugointi (3000 x g 3 minuutin ajan 20 ° C: ssa sitomispuskurilla ja 5000 x g 3 minuutin ajan 20 ° C: ssa tislattua vettä), poistetaan supernatantit ja lisäämällä pesuliuokset. Viimeisessä pesuvaiheessa, putkia sentrifugoitiin 10000 x g: ssä 5 minuutin ajan 20 ° C: ssa ja jopa pesu tislattua vettä kuin mahdollista poistettiin. Kaksikymmentäviisi ui 1% trifluorietikkahappoa (TFA) lisättiin CM-Sepharose-hartsia eluoimiseksi kiinni peptidien ja proteiinien fragmentteja, ja pipetoitiin hyvin 2 min. Putkia sentrifugoitiin 12000 x g: ssä 5 minuutin ajan 20 ° C: ssa. Vain supernatantit poistettiin ja siirrettiin muihin mikroputkea. Putkia sentrifugoitiin 14000 x g: ssä 5 minuutin ajan 20 ° C: ssa ja supernatantit siirretään muihin mikroputkea. Nämä supernatantit toimi virtsanäyte uutteet.

kohdennettuja ehjä peptidien ja proteiinien fragmentit välillä 1000 ja 5000 Da, että virtsanäytteistä, koska niiden aminohapposekvenssit voitaisiin suoraan vahvistaa MALDI-DI-TOF /MS

2 tässä molekyylipainoalueella.

DHB matriisi ja MALDI levy

DHB (2,5-dihydroksibentsoehapolla) matriisi valmistettiin liuottamalla 5 mg DHB (LaserBio Labs, Sophia- Antipolis Cedex, Ranska) 500 ul: aan 50% asetonitriili /0,1% TFA: ta. Vuonna DHB matriisi analyysi, 0,5 ui alikvootti eluaatti sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen DHB matriisin liuosta. Esisekoitut Näytteet täplittäin seuraavat levyt ja ilmakuivattiin huoneenlämpötilassa; μFocus MALDI levy 900 um (384 ympyrät, HST, Inc., Newark, NJ, USA) varten ero analyysejä massaspektrit tai 384-asemassa ruostumaton tähyslevyä (Shimadzu Biotech, Kioto, Japani) ja kvantitatiivisia analyyseja a potentiaali biomarkkeri diagnoosin Eturauhassyövän.

massaspektrometrisia Mittaukset

MALDI-DIT-TOF /MS

n, argon kaasua käytettiin törmäyksen aiheuttama dissosiaation pirstoutuminen, ja helium kaasun käytettiin ioni jäähdytykseen. MS ja MS

n analyysit tehtiin positiivisessa ioniekstraktio- tilassa. Kaikki analyysit suoritettiin suurtyhjössä ehdon (5 x 10

-5 Pa tai vähemmän).

Massaspektrit kalibroitiin ulkoisesti käsin valmistettu 7-peptidin taso, joka koostuu angiotensiini II ([M + H]

1046,54), angiotensiini I ([M + H]

1296,69), Glu-fibrinopeptidi B ([M + H]

1570,68), N-asetyyli reniinisubstraatti ([M + H]

1800,94), ACTH (1-17) ([M + H]

2093,09), ACTH (18-39) ([M + H]

2465,20), ja ACTH ( 7-38) ([M + H]

3657,93).

mittaus olosuhteet ero analyysit massaspektrit vahvistettu seuraavasti: 1) μFocus levyä käytettiin tähtäintaulu, 2 ) laser säteilytys-asemissa oli tarkentaa käsin näytteen-matriisi-seoksella jokaisen hyvin, 3) määrä säteilytys pistettä oli 100, 4) määrä säteilytys laukauksia oli 64, ja 5) laserin teho oli asetettu 85 mielivaltaisina yksikköinä. Kaikkiaan 6400-spektrit mitattiin kuoppaa kohti. Analyysit tehtiin kahtena kappaleena ja uutettiin alikvootti laitettiin 2 kuoppiin. Näin ollen dataa yhdestä virtsanäytteen koostuivat 4 raakadataa pistettä 6400 spektrit. Variaatiokerroin koskevat intensiteetit useita suuria piikkejä, varsinkin biomarkkereiden ehdokas huippu, tuli vähemmän kuin 10% näissä analyyttinen olosuhteissa (tuloksia ei ole esitetty).

Tietojenkäsittely MS spektritiedot ja monimuuttujamenetelmin

Massaspektri raakadataa vietiin läpi DIT-FP Console -ohjelmaa (Shimadzu Corporation, Kioto, Japani) MALDI-DIT-TOF /MS mzXML tiedostoja ja tuoda MATLAB ohjelmistoversio 7.11 (MathWorks Inc., Natick, MA, USA). MATLAB tukivat bioinformatiikan työkalut ja tilastot Toolbox. Seuraavat tietojenkäsittely suoritettiin käyttäen Toolbox toiminnot, jotta voidaan havaita ja kohdista huiput useista spektreistä. 1) Tasainen spektri saatiin käyttämällä paikallisesti painotettu parvikuvio tasoitus (mslowess toiminto [20]). 2) perustason vähennettiin spektristä käyttäen ura approksimaatio (msbackadj toiminto [21]). 3) spektri normalisoitiin jakamalla koko ionivirran. 4) Piikit havaittiin suodattamalla kohinan kanssa undecimated diskreetti aallokemuunnos (mspeaks toiminto [22]). 5) Peak luettelot kertyi useista spektreistä toistamalla käsittely 1) 4). 6) Peak luettelot linjattu vastaamaan huiput yli spektri (mspalign toiminto [23]). CSV-muotoinen huippu luetteloita sitten viety MATLAB ja tuodaan Monimuuttuja-analyysissä ohjelmisto, so SIMCA 13.0.3 (Umetrics AB, Uumaja, Ruotsi; [24], [25]). Kaikki tuodut tiedot olivat Pareto skaalataan ennen monimuuttujamenetelmin. Pääkomponenttianalyysi (PCA) käytettiin ilman valvontaa monimuuttuja analyyseja, ja ortogonaaliset osittainen pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (OPLS-DA) käytettiin valvotun monimuuttuja analyyseja. PCA ja OPLS-DA malleja kuvataan pisteet tontit (tärkein ainesosa [PC1, PC2]), joka näkyy mitään itsestään ryhmittely näytteiden perustuvan spektrin muunnelmia. Vuonna OPLS-DA analyysin potentiaali biomarkkerit valittiin perustuu S-juoni. Juoni kovarianssimatriisin vs. korrelaatio yhdessä muuttuva suuntaus tontteja johti helpommin visualisointi datan. Muuttujat, jotka muuttuneet eniten piirrettiin yläreunassa tai alareunassa ”S” muotoinen juoni, ja ne, jotka eivät vaihtele merkittävästi piirrettiin keskellä.

Peptidin puhdistus ja Edman-hajotuksella

vuonna Edman-hajotuksella analyysi N-päätteen aminohapposekvenssin

m /z

2332-peptidin, peptidin puhdistukselle käänteisfaasi-HPLC suoritettiin käyttäen Shimadzu LC-20AD sarjan HPLC-järjestelmää, jossa on SPD-M20A -diodirividetektoria (Shimadzu Corporation, Kioto, Japani). Luna C-18 -kolonnia (5 um partikkelikoko, 4,6 mm ID x 250 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) käytetään puhdistusprosessia. HPLC-olosuhteet olivat seuraavat: kolonnin uunin lämpötila oli 40 ° C, virtausnopeus oli 1,0 ml /min, vesi, jossa 0,1% FA ja ACN 0,1% FA käytettiin liuosta A ja B, vastaavasti, kaltevuus kunto pidettiin 10%, liuottimena B, 2 minuutin ajan sen jälkeen, kun 20 ui näyte injektio ja oli lineaarinen 10%: sta 80%: ssa 15 min. Eluoidut peptidit ovat seurattiin 276 nm: ssä. Peptidi eluoitui 6,6 min ja 6,9 min yhdistettiin mikroputkeen.

automaattisella Edman-hajotuksella ja N-terminaalinen aminohapposekvenssi suoritettiin RP-HPLC: llä puhdistettu peptidejä käyttäen Procise Model 491 sekvensseri (Applied Biosystems , Inc., Foster City, CA, USA).

AQUA peptidejä ja määrällisiä analyysejä

saadaan ei-leimatun synteettisiä peptidejä ja vakaa isotooppi-leimatun synteettisiä peptidejä, Sigma-Aldrich Japan (Ishikari , Japani). Mukautetun AQUA peptidi asetettu massaspektrometriaa syntetisoitiin Sigma-Aldrich Japani yli 95%: n puhtaudella, on annosteltu 1,0 nmol, ja varastoitiin kylmäkuivattuna jauheena -30 ° C: ssa käyttöön asti. Aminohapposekvenssi on AQUA isotooppileimattua peptidi oli YTKVVHY [R-

13C

6, –

15N

4] KWIKDT [I-

13C

6, –

15N] VANP. Myöhemmin molekyylipaino lisäys isotoopin-leimattua peptidiä (verrattuna ei-leimatun peptidi) oli 17 Da. Tämä peptidi käytettiin sisäisenä standardina (istD) varten kvantitatiivisia analyyseja mahdollisen biomarkkerina ehdokas diagnoosia PCa. AQUA peptidejä liuotettiin 1,0 pmol /ul käyttäen 1000 ui 10% (v /v) etikkahappoa LC-MS luokan (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA). Kantaliuosta oli (100 ui) pantiin 500 ui mikroputkille ja varastoitiin -30 ° C: ssa käyttöön asti.

Kaksikymmentä pikomoolia (20 pmol) ja istD peptidin (20 ui liuosta) piikkeinä osaksi seos liuosta, jossa virtsanäyte ja hajotuspuskuria, ja sitten inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa rotaatiossa. Seuraavat menettelyt suoritettiin virtsanäyte valmistusmenetelmä. Kvantitatiiviset analyysit suoritettiin käyttäen MALDI-DI-TOF /MS: llä. Määrällisesti analyysit käyttäen MALDI-DIT-TOF /MS, mittaus ehdot vahvistettu seuraavasti: 1) ruostumatonta terästä tähyslevyä käytettiin, 2) laser säteilytyspositiot oli tarkentaa käsin näytteen-matriisi-seoksella jokaisen hyvin, 3) määrä säteilytys pistettä oli 200, 4) määrä säteilytys laukauksia oli 16, ja 5) laserin teho oli vahvistettu 85 mielivaltaista yksikköä. Kaikkiaan 3200-spektrit mitattiin kuoppaa kohti. Analyysit tehtiin kahtena kappaleena ja uutettiin alikvootti laitettiin 2 kuoppiin. Näin ollen dataa yhdestä virtsanäytteen koostuivat 12800 spektrit. Tämä menetelmä on tarkoitettu, ja modifioitu menetelmistä raportoitu Sogawa K., et ai. [26] ja Tyan YC., Et ai. [27]. Pitoisuuksien biomarkkereiden ehdokas laskettiin suhteen perusteella, huippu-alue

m /z

2332 vastaan, että

m /z

2349.

tilastot

Kaikki tilastolliset analyysit esillä olevassa tutkimuksessa suoritettiin käyttäen JMP 10.0.2 tilasto-ohjelmalla (SAS Institute Japan Inc., Tokio, Japani). Mann-Whitney-Wilcoxon, jota kutsutaan myös Mann-Whitneyn U-testi käytettiin tunnistamaan ei-parametriset merkittävää eroa kahden ryhmän välillä. Erot

p

arvot alle 0,05 pidettiin merkittävänä. Vastaanotin toimii (ROC) käyrät arvioi tilasto-ohjelmalla arviointiin käytettiin tarkkuuden vianmääritystesteistä tuottanut jatkuva testitulokset. Lisäksi ROC käyrät käytettiin arvioimaan ennakoivan valtaa patognomisia biomarkkereiden tunnistettu tässä tutkimuksessa [28].

Tulokset

ikä ja seerumin PSA-arvot eivät ole merkittävästi erilaiset kuin syöpä aiheista ja PCa potilaat käyttää löytö asettaa

sen arvioimiseksi massaspektri eroja virtsanäytteet 12 kuin syöpäpotilailla ja 15 PCa potilaita, seuraavat analyysit suoritettiin kuten löytö asetettu. Kuten kuviossa 1 a ja b, mitään merkittäviä eroja ei havaittu iästä tai seerumin PSA jakaumien välillä ei-syöpä ja PCa ryhmiä. Nämä tulokset osoittivat, että samanikäisiin virtsanäytteitä voidaan käyttää myöhemmissä analyyseissä.

Ikä (a) ja seerumin PSA (b) jakaumat välillä kuin syöpäpotilailla ja eturauhassyöpä (PCA) potilasta on esitetty. Merkittäviä eroja ei havaittu iästä tai seerumin PSA välillä ei-syöpä (n = 12) ja PCa potilailla (n = 15). Heidän

p

arvot olivat 0,255 ja 0,464, tässä järjestyksessä.

Massaspektrit käyttäen MALDI-DIT-TOF /MS-analyysit

korkean resoluution ja herkkä MALDI -DIT-TOF /MS

n käytettiin analysoimaan virtsan peptidien ja proteiinien fragmentit esillä olevassa tutkimuksessa. Tyypillinen massaspektrit virtsan peptidien ja proteiinien fragmentit analysoitiin käyttämällä ioni-ansa reflektoritoimintatilaa MALDI-DI-TOF /MS on esitetty kuviossa 2. Kun pitoisuus suolanpoistoon virtsanäytteiden CM-Sepharose, eluentti uutettiin 1,0% TFA ratkaisu. DHB käytettiin MALDI matriisi. Massaspektrit on uutettu näytteiden a) ei-syöpä aiheita ja b) PCa potilaita verrattiin. Useita eroja havaittiin näiden massaspektrit näiden kahden ryhmän välillä. Voimakkain huippu havaittiin

m /z

2332,3.

Kun keskittämällä suolanpoistoon virtsanäytteistä CM-Sepharose, eluentti uutettiin 1,0% TFA: ta. DHB käytettiin MALDI matriisi. Kuva 2a ja 2b esittävät analyysin tuloksiin virtsan otteita kuin syöpäpotilailla ja PCa potilaista.

monimuuttuja analyysit massaspektrit virtsan uutteiden avulla SIMCA ohjelmistoa

viedään huippu-matriisi tiedostoja MATLAB tuotiin monimuuttuja-analyysissä ohjelmisto, eli SIMCA 13.0.3. Kaikki tuodut tiedot olivat Pareto skaalata monimuuttuja analyyseja. Pääasiallinen komponenttien analyysi (PCA) alun perin suoritettiin spektrien virtsanäytteistä onko massaspektri välillä oli eroja ei-syöpä ja PCa ryhmiä. Ortogonaalinen osittainen pienimmän neliön erotteluanalyysi (OPLS-DA) käytettiin sitten maksimoida kovarianssi mitatun datan (piikkien paikat ja piikkien intensiteetit) ja sairauksien luokitus. S-juoni käytettiin valita ja ilmoittaa mahdollisista biomarkkereiden ehdokkaita merkittävistä biomateriaalien liittyy ryhmään erottaminen.

PCA pisteet tonteista PC1 (R

2 = 0,217) ja PC2 (R

2 = 0,148) osoitti epäselvä klusterit välissä ei-syöpä ja PCa ryhmiä (R

2X [cum]: 0,556 ja Q

2 [cum]: 0,271; Kuva 3a). Sen sijaan OPLS-DA pisteet tontteja erottaa PCA ryhmä ei-syöpä ryhmä (R

2X [cum]: 0,309, R

2Y [cum]: 0,722 ja Q

2 [cum] : 0,058; kuvio 3b). OPLS-DA oli riittävä malli erottamiseksi PCA ryhmä ei-syöpä ryhmä. S-käyräanalyysillä perustuu OPLS-DA malli suhteessa osuuden huippuintensiteeteillä massaspektrit koskevat PCa ja ei-syöpä on esitetty kuviossa 3c. Huippuintensiteetit noin

m /z

2332,3 eristettiin S-juoni kuin uusia mahdollisuuksia patognomisia biomarkkereita erottamiseksi toisistaan ​​ei-syöpä ja PCa ryhmiä.

(a) PCA pisteet juoni ilmaisee erottelu ei-syövän ja PCA löytö asetettu. (B) OPLS-DA pisteet juoni selkeässä syrjiä ei-syövän ja PCa. (C) S-juoni vastaava OPLS-DA pisteet juoni kuvassa 3b. Mahdollinen virtsan biomarkkereiden ehdokas uutettiin huipussaan noin

m /z

2332,3 diagnosoimiseksi Eturauhassyövän potilaista.

tunnistaminen peptidifragmenttien m /z 2332,3

massaspektri virtsanäytteen peräisin PCa potilaan MALDI-DI-TOF /MS

2 analyysiä on esitetty kuviossa 4a. Maskotti MS

2 hakukoneen MS

2 massaspektri osoitti, että

m /z

2332 peptidi oli C-terminaalinen fragmentti PSA. Tämä tulos viittasi siihen, että PSA: n fragmentti, joka koostuu seuraavista 19 aminohappo- tähteet: YTKVVHYRKWIKDTIVANP. MALDI-DIT-TOF /MS

2 massaspektri syntetisoidun peptidin (Medical Biological Laboratories Co., Ltd, Nagoya, Japani) samaan aikaan kuin virtsan

m /z

2332 peptidi (kuvio 4b), mikä vahvisti, että molemmat peptidit koostuivat sama aminohapposekvenssi: YTKVVHYRKWIKDTIVANP. Lisäksi sen aminohapposekvenssi, joka määritettiin Edman-hajotuksella, vahvisti, että se oli C-terminaalinen fragmentti PSA, joka koostui 19 aminohappotähdettä (tuloksia ei ole esitetty). Esillä olevassa tutkimuksessa olemme keskittyneet virtsanäytteistä mitätöity seuraavat eturauhasen hieronta, ts eturauhasen (DRE). Alkuperä peptidin

m /z

2332 tutkittiin, ja massaspektrit verrattiin uutettu fraktiot virtsan näytteistä ennen ja jälkeen DRE (kuvio 5). Huippu at

m /z

2332 oli yksinomaan havaittiin jälkeen DRE. Nämä tulokset tukevat 2331 Da peptidifragmenttien ollessa erittää eturauhasen rauhasten DRE.

(a) aminohapposekvenssi

m /z

2332 tunnistettiin virtsanäytteistä Eturauhassyövän potilaiden ja arvioitu MS

2 analyysejä ja Mascot MS

2 hakukoneen. N-terminaaliset aminohapposekvenssit peptidin varmistettiin täysin tietojen perusteella saatu Edman-hajotuksella puhdistetun peptidin. Sekvenssi vahvistettiin seuraavasti: YTKVVHYRKWIKDTIVANP. (B) MS

2-spektri vertailuja

m /z

2332-peptidin välillä syntetisoidun materiaalin (1) ja uutettiin biomateriaalien virtsasta näytteistä PCa potilailla (2). Tuloksena 2 MS

2 spektrit

m /z

2332 peptidejä sovitettu kokonaan.

kvantitatiivinen analyysit mahdollisen uuden patognomisia biomarkkereiden käyttäen MALDI-DIT- TOF /MS

kuten aiemmin on esitetty, piikin intensiteetti

m /z

2332,3 eristettiin S-plot mahdollisena biomarkkeri ehdokas erottaa ei-syöpä ja PCa ryhmien . Siten virtsan 2331 Da peptidi arvioitiin kvantitatiivisesti käyttäen 50 virtsanäytteistä mitätöity PCA potilaista (taulukko 1) ja 19 ei-syöpäpotilailla (taulukko 2) seuraavat eturauhasen hieronta. Osa kunkin datasarjan oli myös käytetty löytö vaiheessa.

ikä ja PSA jakaumat kaikkien aineiden on esitetty kuvassa 6a ja b. Merkittäviä eroja ei havaittu iästä tai PSA jakautuminen ei-syöpä (n = 19) ja PCa (n = 50) ryhmät.

Ikä (a) ja seerumin PSA (b) jakaumat välillä ei-syöpä aiheista ja PCa potilasta validointi sarjoiksi. Merkittäviä eroja ei havaittu iästä tai seerumin PSA välillä ei-syöpä (n = 19) ja PCa potilailla (n = 50). Heidän

p

arvot olivat 0,364 ja 0,076, tässä järjestyksessä.

Edustava virtsanäyte analysoitiin lisäämällä sisäistä standardia (istD) käytettiin arvioida suhde huipun alueiden osoitteessa

m /z

2332 ei-leimatun synteettisen peptidin ja

m /z

2348 vakaan isotooppi-leimatun synteettisen peptidin (YTKVVHY [R-

13C

6, –

15N

4] KWIKDT [I-

13C

6, –

15N] VANP), tässä järjestyksessä. Lisäys sisältö istD (vakaa isotooppi-leimatun 2348 Da peptidi määrä) kiinteään 20 pmol /1,0 ml virtsaa. Standardikäyrä ylimääräisiä määriä 2331 Da peptidi on esitetty kuvassa 7a. Vahva korrelaatiota ei havaittu piikin pinta-ala suhde

m /z

2332 ja 2349 ja lisäksi 2331 Da peptidin määriä, joiden regressio yhtälö y = 0.0243x + 0,0722 (x-akseli: lisämääriä 2331 Da peptidi, y-akseli, piikin pinta-alojen suhde on

m /z

2332 /

m /z

2349 [istD]; R

2 = 0,996). Lineaarinen standardikäyrä saatiin.

(a) välinen suhde piikkien pinta-suhde

m /z

2332 ja 2349 (stabiili isotooppi-leimatun synteettisen peptidin, sisäisen standardin [istD]), ja lisäksi 2331 Da (ei-leimatun synteettisen) peptidin määriä. Ylimääräinen sisältö istD kiinnitettiin 20 pmol /1,0 ml virtsaa. Standardikäyrä koskien lisämääriä 2331 Da peptidi on esitetty. Riittävä korrelaatioita havaittiin määrällisiä analyysejä 2331 Da peptidi käyttäen MALDI-DIT-TOF /MS. (B) vertailu patologinen luokkien ja virtsan 2331 Da peptidipitoisuudet. Merkittävä ero (

p = 0,0016

) välillä havaittiin ei-syöpä (n = 19) ja PCa (n = 50) ryhmät. (C) ROC-käyrät laskettiin määrällisten tulosten kaksi (eli ei-syöpä ja PCa) ryhmiä. AUC-arvot seerumin PSA ja virtsan 2331 Da peptidipitoisuutena olivat 0,639 ja 0,747, tässä järjestyksessä. Mitä seerumin PSA, cut-off tasoa 3,82 ng /ml herkkyys oli 100% ja spesifisyys 36,9%. Mitä virtsan 2331 Da peptidi, cut-off tasoa 40,6 ng /ml herkkyys oli 86,0% ja spesifisyys 57,9%.

Merkittävä ero havaittiin virtsan 2331 Da peptidipitoisuudet välillä ei-syöpä ja PCa ryhmät (kuvio 7b). Mediaanit 2331 Da peptidin pitoisuus ei-syöpä ja PCa ryhmät olivat 36,8 ja 117 ng /ml, tässä järjestyksessä. Tämä tulos osoitti, että se voisi olla mahdollista erottaa PCa potilaita kuin syöpäpotilailla.

ROC käyrät lasketaan näistä tuloksista kaksi ryhmää kuvassa 7c. Mitä seerumin PSA, alue käyrän alla (AUC) oli 0,639. Cut-off tasoa 3,82 ng /ml herkkyys oli 100% ja spesifisyys 36,9%. Toisaalta, AUC oli 0,747 koskevat virtsan 2331 Da peptidi. Cut-off tasoa 40,6 ng /ml herkkyys oli 86,0% ja spesifisyys 57,9%.

Ei korrelaatioita havaittu välillä 2331 Da peptidin pitoisuuden ja seerumin PSA-arvot tai PCa vaiheita tai Gleason tulokset potilaalla (tietoja ei esitetty).

keskustelu

syövän diagnoosi on suuri haaste tutkimukselle ja kliinisen hoidon; laaja genomista, transcriptomic, ja proteomiikka tutkimuksia käydään, jotta löytää ja tunnistaa biomarkkereiden ehdokkaita käytettäväksi suurikapasiteettisten, jotka pystyvät suuren väestön seulontaa [29].