Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

On kasvava kysyntä tarkka biomarkkereita varhaisen ei-invasiivisia peräsuolen syövän havaitsemiseen. Käytimme genomin mittakaavan merkki löytömenetelmän tunnistaa ja tarkistaa ehdokkaan DNA: n metylaatio biomarkkereita veren perustuva tunnistus paksusuolisyövän.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käytimme DNA: n metylaatio dataa 711 peräsuolen kasvaimet, 53 sovitettu viereisen normaalissa paksusuolen kudosnäytteistä, 286 tervettä verinäytteitä ja 4201 kasvain näytteitä 15 eri syöpätyyppien. DNA: n metylaatio tietoja tuottamat Illumina Infinium HumanMethylation27 ja HumanMethylation450 alustoja, jotka määrittävät metylaatiostatuksen 27578 ja 482421 CpG-kohtiin. Ensin tehdään monivaiheisessa merkki valinta tunnistaa ehdokas merkkiaineiden korkean metyloinnin kaikissa Kolorektaalituumorien samalla kätkeminen alhainen metylaatio terveillä näytteet ja muut syöpätyyppeihin. Sitten käytetään ennalta terapeuttinen plasma- ja seeruminäytteiden 107 peräsuolen syöpäpotilaiden ja 98 tarkastukset ilman peräsuolen syöpä, vahvistettu kolonoskopia, tarkistaa ehdokas markkereita. Valitsimme kaksi markkereita lisäarviointia: metyloitu

Ensimmäisen osatyön

(Ensimmäisen osatyön-M) ja metyloituja

C9orf50

(C9orf50-M). Testattaessa kliinisten plasma- ja seeruminäytteiden näiden merkintöjen päihitti karsinoembryonaalisesta antigeeni (CEA) seerumin mittaus- ja johti suureen herkkä ja tietyn testin suorituskyky varhaisen peräsuolen syövän havaitsemiseen.

Johtopäätökset /merkitys

järjestelmällinen merkki löytö ja todentaminen tutkimuksen veripohjaisten DNA metylaatio markkereita johti kaksi uutta peräsuolen syöpä biomarkkereita Ensimmäisen osatyön-M ja C9orf50-M. Ensimmäisen osatyön-M erityisesti osoitti lupaavia suorituskyky kliinisissä näytteissä, joissa perustellaan sen optimoimaan ja kliinistä testausta.

Citation: Lange CPE, Campan M, Hinoue T, Schmitz RF, van der Meulen-de Jong AE, Slingerland H , et ai. (2012) Genome-Scale Discovery DNA-metylaatio biomarkkereita veripohjaisten havaitseminen peräsuolen syövän. PLoS ONE 7 (11): e50266. doi: 10,1371 /journal.pone.0050266

Toimittaja: Carmen J. Marsit, Dartmouth Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 elokuu 2012; Hyväksytty 17. lokakuuta 2012 Julkaistu: 28 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Lange et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Tekijät haluavat toteamaan PW Laird on laatinut seuraavat antoi patentit MethyLightT teknologiaan ( ”Process for High Throughput DNA Metylointi Analysis”; US Patent # 6331393; Date Jätetty: May 14, 1999 Julkaisupäivämäärä: 18. joulukuuta 2001. ”Process for High Throughput DNA Metylointi Analysis ”; US Patent # 7112404; Date Jätetty: 10 joulukuu 2001, Julkaisupäivämäärä: 26. syyskuuta 2006.” Process for High Throughput DNA metylointianalyysi ”Date Filed: 10 joulukuu 2001, Julkaisupäivämäärä: 30. kesäkuuta 2009), joka on lisensoitu Epigenomics AG. Lisäksi P.W. Laird, DJ WEISENBERGER, ja M. Campan on nimetty keksijät seuraaviin vireillä patenttihakemuksen Digital MethyLight tekniikka ( ”DNA metylointianalyysi Digital bisulfiittimodifiointi Genominen sekvensointi ja Digital MethyLight” Pub App nro: 20080254474, Date Jätetty: 14 huhtikuu 2008) . D. J. WEISENBERGER on konsultti Zymo Research. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta kirjoittajat, noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yleinen sairaus, jonka arvioitu 143460 uutta tapausta USA vuonna 2012 [1]. CRC on kolmanneksi eniten diagnosoitu syöpä miehillä ja naisilla länsimaissa ja merkittävä osa potilaista, joilla esiintyy CRC on etäispesäkkeitä (vaihe IV) diagnoosi, joka on usein parantumaton. On selvää, että paikallinen syöpä (vaihe I /II) havaitaan varhaisessa vaiheessa on sopivampi parantavaa hoitoa, joka tarjoaa erinomaisen ennuste [2], [3]. Niinpä diagnostisia menetelmiä, jotka johtavat varhaisen havaitsemisen pahanlaatuinen tai jopa premaligni sairaus voi olla merkittäviä kliinisiä etuja, kuolleisuuden ja sairastavuuden vähentämiseen potilailla, joilla on peräsuolen syöpä. Mahdolliset säästöt seulonta tekniikoita CRC sisältää ulosteen piilevän veren testi, kaksinkertainen kontrasti barium peräruiske, endoskopia, annettava etusija pancolonoscopy, ja virtuaalinen kolonoskopia [4], [5]. Mittaus seerumin karsinoembryonisen antigeeni (CEA) on myös ehdotettu mahdolliseksi seulonta toimintatavat mutta se ei ole riittävän herkkä havaitsemaan CRC varhaisessa vaiheessa, ja sen taso on myös kohonnut ei-pahanlaatuiset sairaudet (esim divertikuliitti, gastriitti, diabetes) [6].

optimaalinen seulontatesti odotetaan olevan erittäin herkkä ja spesifinen, eivät aiheuta vaaraa potilaille, ja on korkea potilaiden hyväksyntä. Lisäksi olisi kustannustehokas ja helppo suorittaa. Koska nykyinen seulontamenetelmiä ole riittäviä positiivinen ennustearvo, vaativat epämiellyttävää valmiste tai aiheuttaa epämukavuutta, on tarpeen kehittää uusia non-invasiivisia testeistä CRC vaiheessa riittävän ajoissa hoitoon onnistuisi. DNA: n metylaatio markkereita ovat lupaavia välineitä, jotka voivat olla hyödyllisiä varhaisen syövän havaitsemiseen. Viime vuosikymmenen aikana on tullut selväksi, että syöpäsolut ovat poikkeava kuviot DNA: n metylaation ja että nämä poikkeavuudet voidaan havaita kasvain- DNA löydetty plasmasta tai seerumista syöpäpotilailla [7], [8]. Useat tutkimukset ovat dokumentoineet vapaana oleva DNA on saatu kiinteistä kasvaimista verenkiertoon syöpäpotilaita, joka nostaa esiin mahdollisuuden havaita näiden syöpää molekyylejä potilailla, joilla olemassa olevan sairauden [9] – [22].

Useat tutkimukset ovat jo raportoitu DNA: n käytön metylaation merkkiaineita veripohjaisten havaitsemiseen CRC vaihtelevalla menestyksellä [9] – [22]. Kuitenkin useimmat näistä tutkimuksista ovat luottaneet testaus rajalliseen määrään ennalta valitun geenin ja muiden kuin kvantitatiivinen osoitusmenetelmät, kuten geeli-pohjainen metylaatiospesifinen PCR. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tunnistaa veripohjaisten DNA metylaatio biomarkkereita CRC käyttäen genomin mittakaavan DNA: n metylaatio lähestymistapa merkki löytö ja testata valittu merkkiaineiden ennen leikkausta kliinisistä verinäytteistä potilailta, joille suoritetaan parantava leikkaus CRC.

Methods

Ihmisen Näytteet ja eettinen lausunto

paikalliset ja alueelliset institutionaaliset tarkastuslautakunta hyväksyi tutkimuksen. Tietoinen suostumus saatiin kaikkien osallistuvien potilaiden ja verrokkien. Pre-terapeuttinen plasma- ja seeruminäytteet saatiin CRC potilaista poliklinikalla kautta flebotomiasta mediaanista cubital suoneen huhtikuusta 2008 joulukuuhun 2011. Plasma ja seerumi erotettiin 30 minuutin kuluessa venapuncture kuten aikaisemmin on kuvattu [22]. Kukin plasma tai seerumi näyte jaettiin edelleen kahteen erilliseen putkiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes käsittely. Seerumi CEA mitattiin kussakin venapuncture CRC potilailla.

Controls määriteltiin aiheita ilman CRC tai syöpään viimeisen viiden vuoden aikana ja oli mukana tässä tutkimuksessa on tähystykseen osastolla. Yksilöt, joille tehdään kolonoskopia, joka ei havaittu merkkejä peräsuolen maligniteetti, olivat oikeutettuja osallistumaan. Indikaatiot kolonoskopia näille potilaille olivat valvonta colonoscopies takia tulehduksellinen suolistosairaus (IBD; Crohnin tauti tai haavainen paksusuolitulehdus), positiivinen suvussa CRC, ruoansulatuskanavan valitukset tai peräsuolen verenhukka. Kokenut gastroenterologist esiintynyt colonoscopies. Lievää, ohjattu IBD sisällytettiin niin kauan kuin se oli mahdollista luotettavasti tarkastaa paksusuolen limakalvon at kolonoskopia

ja

jos tarkkailu koepaloja että rutiininomaisesti otettu pitkin koko peräsuolen suolikanavan oli patologisesti normaali (näkyvissä mitään merkkejä dysplasia). Plasma ja seerumi näytteitä eristettiin nämä henkilöt käyttävät samaa protokollaa kuin CRC potilaille.

CRC kudos saatiin aikana kirurginen resektio kasvain ja välittömästi lähetetään patologi. Patologi dissektoitujen edustava osa kasvain ja tallennetaan makean pakastetut näytettä -80 ° C: ssa tunnin kuluessa kirurgisen resektion. Lisäksi patologisesti normaali paksusuoli näyte otettiin vähintään 10 cm: n päähän reunasta kasvain ja varastoida samalla tavalla.

Marker Discovery: Technologies ja Tietoaineistot

markkeri löytö vaihe tässä tutkimuksessa käytettiin DNA: n metylaatio tuottamat tiedot Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip® (HM27) ja HumanMethylation450 BeadChip® (HM450) alustoille. Infinium määritys määrällisesti DNA metylaatiotasoilla tiettyihin sytosiinitähteiden vieressä guaniini jäämiä (CpG loci), laskemalla suhde (β-arvo) intensiteettien välillä lokuksen erityisiä metyloitu ja metyloitumaton helmi-sidottu antureista. Β-arvo on jatkuva muuttuja, jotka vaihtelevat 0 (metyloitumaton) 1 (täysin metyloitu) [23]. HM27 BeadChip® arvioidaan DNA: n metylaation tason 27578 CpG sivustoja sijaitsee promoottorialueet 14495 proteiinia koodaavan geenejä. HM450 BeadChip® arvioi DNA metylaatiostatuksen 482421 CpG loci ja kattaa 99% RefSeq geenien ja 96% UCSC CpG-saarekkeiden (www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq, www.illumina.com).

Käytimme käytettävissä Infinium HM27 ja HM450 tietoja 711 Kolorektaalituumorien, 53 sovitettu viereisen normaalissa paksusuolen kudosnäytteistä ja 10 ääreisverenkierron lymfosyyttien (PBL) näytteet terveiden ihmisten tunnistaa ja todentaa ehdokas DNA: n metylaatio kasvain markkereita. Lisäksi käytimme Infinium tietoja julkisesti saatavilla aineistoja (GEO ja TCGA) edustaa 274 tervettä PBL-näytteen ja 4201 pahanlaatuisen kudosnäytteiden 15 eri syöpätyyppejä maksimoida CRC spesifisyyttä (katso taulukko 1). Β-arvot 611 CRC kasvaimia ja 24 sovitettu viereisen normaalissa paksusuolen kudosnäytteitä haettiin DNA metylaatio aineisto varten CRC lähetetty Cancer Genome Atlas (TCGA) Data Portal (http: //tcga-data.nci.nih. gov /TCGA /tcgaHome2.jsp). Tiedot muista 100 CRC kasvaimia ja 29 sovitettu viereisen normaalissa paksusuolen kudosnäytteet syntyy USC Epigenome Centerin aiemmassa tutkimuksessa [24]. Infinium data 274 PBL näytteitä ladata Gene Expression Omnibus (GEO) tietokantaan National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, hakunumero GSE 19711). Tiedot 10 jäljellä PBL näytteet on luotu käyttäen HM27 alustan aiemman merkki löytö tutkimus USC Epigenome Centerin [25]. Asiakirja S1 yhteenveto arkisto numerot kaikkia yleisesti saatavilla GEO ja TCGA aineistot Tässä tutkimuksessa käytetyt. DNA: n metylaatio tila arvioitiin käyttämällä HM27 BeadChip 336 CRC näytteitä, 29 normaalin paksusuolen näytteet ja 274 PBL-näytteen (taulukko 1). Jäljellä 375 CRC-kasvaimia ja 24 normaalin paksusuolen näytteet, DNA metylaatiostatus arvioitiin kanssa HM450 BeadChip (taulukko 1). Olemme myös tuotettu HM450 tietoja kahden PBL-näytteen kokoelmasta 10 opiskellut HM27 alustalla. Niistä 375 CRC, dataa vain 40 näytteet olivat saatavilla silloin suoritimme merkin löytö. DNA: n metylaatio tietoja muiden 335 CRC-kasvaimia ei käytetty merkkiaineen valinta-algoritmin. Emme kuitenkaan käytä näitä tietoja tarkistaa viimeiset kaksi markkereita valittu.

Marker Discovery: Filter Criteria

Meillä työskentelee monivaiheinen suodatus prosessi löytö vaiheessa selvitettiin. DNA: n metylaatio tuottamaa tietoa kahden eri BeadChips (HM27 ja HM450) analysoitiin erikseen, mutta käyttämällä samaa suodatuksen vaiheet (kuvio 1 ja 2). Aloitimme pois kaikki Infinium koettimia, jotka eivät missään näytteistä. HM27 antureista, joita ei yksikäsitteisesti kohdistettu ihmisen genomin (hg19, GRCh37), tai jotka liittyivät yhden emäksen monimuotoisuus (SNP: t) 10 emäsparin tavoitteesta CpG (tunnistettu käyttäen NCBI dbSNP rakentaa 126 ja 128), tai koettimia, jotka katettu toistuvia elementtejä (tunnistetaan RepeatMasker) on myös suljettu pois. Selvitimme korkein β-arvon jokaiselle koetin 10 tervettä PBL-näytteen (β-PBL

H) ja 10

persentiili CRC kasvain β-arvot (β-CRC

10) (kuva 2A). Me ulkopuolelle kaikki koettimet kanssa β-PBL

H suurempi kuin 0,2 tai suurempi kuin siihen liittyvä β-CRC

10. Sitten suodatettu jäljellä antureista vastaan ​​normaalissa paksusuolen kudoksessa ja 15 muuta syöpätyyppeihin. Yksityiskohtaisesti, päätimme keskiarvo β-arvo kunkin koetin normaalissa paksusuolen kudoksessa (β-NC

M) ja poistaa kaikki antureista, jotka oli β-NC

M-arvo suurempi kuin 0,2 tai suurempi kuin siihen liittyvän β -CRC

10-arvo (kuvio 2B). Valitsimme top 25 markkereita sekä aineistoja jälkeen ranking anturit perustuvat eroa β-CRC

10 ja β-PBL

H (kuvio 2C). Sillä suodatus toisia syöpätyyppeihin, päätimme keskiarvo β-arvo (β-OC

M) jäljellä koettimet kussakin syöpätyypin ja poistanut kaikki antureista, jotka oli β-OC

M suurempi kuin keskimääräinen CRC β-arvo (β-CRC

M). Loput koettimet valittiin MethyLightTM reaktio suunnittelu ja edelleen arviointiin.

Käytimme DNA: n metylaatio tietoja Infinium HumanMethylation27 BeadChip (HM27) ja HumanMethylation450 BeadChip (HM450) Infinium alustoja seuloa 27578 (HM27) ja 482421 (HM450 ) CpG loci niiden metylaatiostatuksen CRC näytteissä, PBL näytteitä Terveillä pariksi normaali peräsuolen kudosnäytteistä (NC) ja 15 muiden syöpien (OC). Käytimme vaiheittain poistaa antureista että epäonnistuneet missään näytteissä, antureista, jotka sisälsivät SNP tai toista sekvenssit, antureista, joissa on eniten PBL β-arvo (β-PBL

H) tai keskimääräinen normaali paksusuolikudos β-arvo ( β-NC

M) on suurempi kuin niihin liittyvien 10. prosenttipiste CRC kasvaimen β-arvot (β-CRC

10) tai suurempi kuin 0,2 missään PBL tai NC-näytteet (Infinium paneeli). Loput Koettimet paremmuusjärjestykseen perustuvat eroa β-CRC

10 ja β-PBL

H ja top 25 valittiin molemmista aineistot (HM27 ja HM450) suodatus vastaan ​​OC näytteitä. Koettimet, joiden keskimääräinen OC β-arvo on suurempi kuin siihen liittyvä keskimääräinen CRC β-arvo (β-CRC

M) on eliminoitu. Yhteensä 15 MethyLightTM reaktioita (markkereita) suunniteltiin 10 antureista ja testattiin sekvenssin vahvistusvaiheet (MethyLightTM paneeli). Markkereita eliminoitu, jos niiden suorituskyky ei ollut paras kontrolleissa kuten

in vitro

metyloitu

Sss

1 DNA, PBL ja plasma näytteitä terveiden verrokkien ja CRC tuumorikudoksia. Markkereita myös poistaa, jos he eivät havaita CRC metyloidut DNA yhdistettiin plasmaa ja seerumia CRC potilaista. Kaksi markkereita täytti kaikki valintakriteerit ja aikaistettiin valmisteilla lisätarkastuksia yksittäisten potilaiden näytteistä. (* Probes, että ei ole millään näytteistä, samoin kuin ne, jotka sisältyvät SNP: ja toista sekvenssejä; ** Muita syöpätyyppejä, joita käytetään tässä tutkimuksessa on esitetty yhteenvetona taulukossa 1, *** M.

Sss

I käsitelty DNA).

A (ylempi kuva: HM27, pohja kuva: HM450), scatterplots korkeimman PBL β-arvo (β-PBL

H) 10 (HM27) ja 2 (HM450) terveiden kontrollinäytteitä (X-akseli) vastaan ​​niihin liittyvien 10. prosenttipiste CRC kasvaimen β-arvot (β-CRC

10) Y-akselilla. Siniset pisteet edustavat eliminoitu antureista (HM27: n = 23049; HM450: n = 367833) ja punaiset pisteet (HM27: n = 695; HM450: n = 30207) edustaa säilytti koettimet kanssa β-CRC

10 p-PBL

H tai β-PBL

H 0,2. B, scatterplots keskimääräisen normaalin paksusuolikudos β-arvo (β-NC

M) varten säilytti koettimia Panel A (X-akseli) vastaan ​​liittyy β-CRC

10 (Y-akseli). Punaisia ​​pisteitä (HM27: n = 512; HM450: n = 28428) edustaa eliminoitu antureista, vihreät pisteet edustavat säilytti antureista (HM27: n = 183; HM450: n = 1779), jossa β-CRC

10 p-NC

M tai β-NC

M 0,2. C, scatterplots kertyneiden koettimia Paneeli B (vihreä) näyttää eroa β-CRC

10 ja β-PBL

H (X-akseli) vastaan ​​liittyy β-CRC

10 (Y akselilla). Pisteet sisällä keltainen neliö ovat koettimia valittu Lisäsuodatusta vastaan ​​muiden syöpien. Valkoiset nuolet huomauttavat antureista kahden ehdokkaan markkereita. D, ROC käyrät koettimien käytetään multiplex reaktio perustuu metylaatio β-arvot 335 itsenäistä peräsuolen syövän näytteitä ja 23 riippumatonta vastaaviin normaaleihin peräsuolen kudosnäytteet (DNA metylaatio tiedot näistä näytteistä ei käytetty merkki löytö putki). Tummanharmaa väri on AUC.

DNA Extraction ja bisulfiittimodifikaatio

DNA kaksi tervettä PBL-näytteen ja 25 CRC kasvainnäytteet uutetaan mukaisesti aiemmin kuvattu protokolla [25]. DNA plasmasta ja seeruminäytteistä eristettiin käyttäen QIAamp® Kiertävä Nucleic Acid Kit (Qiagen), jotka on erityisesti suunniteltu palauttamaan mahdollisimman paljon kiertävän soluttoman DNA seerumista tai verestä. Zymo® EZ DNA: n metylaatio kit (Zymo Research) käytettiin vetysulfiitilla muuntaa uutettua DNA: ta. Kaikki uuttoa ja muunnokset suoritettiin mukaan valmistajan ohjeiden. Laatu ja määrä bisulfiitti-muunnettu DNA, sekä täydellisyyttä bisulfiittikonversion, arvioitiin käyttäen paneelia laadunvalvonta reaktioita kuten aikaisemmin on kuvattu [26].

MethyLightTM Analysis

MethyLight määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [27]. Sekvenssi MethyLightT alukkeita ja koettimia, joita käytetään näissä analyyseissä on kuvattu taulukossa S1. MethyLightT reaktioita arvioitiin neljässä vaiheessa. Ensimmäinen, M.

Sss

I (New England Biolabs) käsiteltiin PBL-DNA (Promega) käytettiin määrittämään, onko reaktio monistettu

in vitro

metyloituja kontrolli-DNA [28]. Reaktiot sykli kynnys [C (t)] suurempi kuin 35 jätettiin pois. Toiseksi, reaktiot seulotaan 50 ng PBL-DNA: ta kaksi tervettä yksilöä. Reaktiot C (t) arvot ovat alle 40 jätettiin pois. Loput reaktiot testattiin 25 CRC DNA-näytteitä, käyttäen ALU-pohjainen MethyLightTM reaktio ja M.

Sss

1 DNA standardikäyrän laskea Suhteellinen Metyloidut Reference (PMR), kuten aiemmin on kuvattu [27], [29]. Reaktiot PMR 10 useammassa kuin yhdessä CRC kasvaimia eliminoitu. Lopuksi, reaktiot testattiin 10 plasmanäytteistä terveiltä luovuttajilta (vastaa 100 ui plasmaa) ja paremmuusjärjestykseen C (t) arvoja. Reaktiot C (t) arvot olivat alle 50 yhdessä tai useammassa näistä näytteistä poistettiin.

Digital MethyLight Analyysi

yhdistetyt kliinisissä näytteissä.

Digital MethyLight on kvantitatiivinen PCR-tekniikkaa, jossa bisulfiitti-muunnettu DNA analysoidaan käyttäen MethyLightT PCR-määritys on jakelu tavalla yli 96 reaktiokammioita jokaisesta näytteestä. Tämä tekniikka on tehokas ja toimiva tapa saada DNA: n metylaatio tietoa näytteiden pieniä määriä DNA: ta, ja suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [25], [30]. Valmistimme neljä erillistä plasmapoolin ja neljä allasta seerumin DNA testata ehdokkaan markkereita (Pool 1 = 16 ohjaa (ilman IBD), Pool 2 = 16 lievää IBD, allas 3 = 16 potilasta osuuksilla I /II CRC ja Pool 4 = 16 potilaalla on vaiheiden III /IV CRC). Kukin näistä altaat sisälsivät DNA 190 ui plasmaa tai seerumia kustakin 16 henkilöä altaassa. Kutakin reaktiota me testattiin ensin DNA: 50 ui plasmaa tai seerumia kunkin altaan. Sillä reaktiot, jotka eivät johda mihinkään PCR-monistukset (osumat) ja 50 ui tilavuus nostettiin 150 ui vastaava. Lopuksi reaktiot, jotka eivät johda mihinkään osumia CRC altaat tai antoi osumia kontrollien kanssa tai ilman IBD suljettiin pois.

Kaksi ehdokasta markkereita, jotka selvisivät tämä eliminointiprosessi leimattiin eri fluoroforeilla. Tämä mahdollisti reaktio erityinen värillinen PCR tuloksia joka antoi meille mahdollisuuden erottaa osumia kustakin näistä merkeistä, kun ne ajettiin yhdessä (multiplex). Kaikki koettimet ja alukkeet syntetisoitiin Biosearch Technology, Inc., Novota, Kalifornia, USA.

Yksittäiset kliinisissä näytteissä.

Kaksi-merkki multiplex testattiin plasman ja seerumin näytteitä 75 itsenäistä CRC potilaiden ja 70 säätimet testi 1 ml. Taulukossa 2 on yhteenveto kliinisistä ominaisuuksista CRC potilaiden ja verrokkien käytetään kliiniseen merkki testaus Tässä tutkimuksessa.

Tilastollinen analyysi

laskenta luottamusvälin alueilla käyrä (AUC) ja tilastolliset testit tehtiin R (versio 2.14.0), jossa R paketti Proc [31]. Menetelmä ehdottama DeLong ja työtovereiden [32] käytettiin testissä.

Tulokset

Marker Discovery in Genome-Scale DNA Metylointi tietojoukoiksi

suoritetaan vaiheittain merkki löytö analyysi käyttäen saatavilla DNA: n metylaatio tietokokonaisuuksista useita CRC kasvaimia, 15 erilaista muita syöpätyyppejä, ja kontrolli näytteitä plasmasta, PBL ja sovitettu viereisen normaalin paksusuolen kudokset (kuviot 1 ja 2, taulukko 1) tunnistaa CRC DNA metylaatio markkereita. Käytimme data generoidaan käyttäen kahta eri Illumina Infinium HumanMethylation BeadChip alustoja, HM27 ja HM450 (katso Methods kohta). Poistamisen jälkeen mahdollisesti ongelmallisia antureista, koetin sekvenssit, jotka päällekkäin SNP tai toistuvia elementtejä, ja koettimet että epäonnistuneet suorittaa kaikissa näytteissä oli 23049 HM27 antureista ja 367254 HM450 antureista. Näistä antureista, 695 jäi HM27 ryhmässä ja 29640 vuonna HM450 ryhmässä, kun poistaa ne oli korkeammat DNA metylaatiotasoilla terveillä PBL-näytteen kuin CRC kasvaimia. Lisäksi olemme poistaneet kaikki antureilla korkeampi DNA: n metylaation normaalissa paksusuolen kudoksessa kuin CRC ja sijoittui jäljellä koettimia, jotka perustuvat eroa terveen PBL ja CRC kasvaimen DNA: n metylaatio. DNA metylaatiostatuksen yhdistetyn top 50 antureista (paremmuusjärjestykseen suurin ero terveen PBL ja CRC DNA: n metylaatio) vertailtiin CRC ja 15 muiden syöpien. Koettimet, joilla on korkeampi keskimääräinen DNA: n metylaation tason muulla syöpätyyppi kuin CRC jätettiin pois. Kymmenen CRC-ehdokkaan koettimia (liittyy kymmenen ainutlaatuinen geeni promoottorit) pysyi, joka osoitti korkeampia tarkoittaa DNA: n metylaation arvot CRC kuin keskimääräinen vastaava DNA metylaatio kaikkien käytettyjen muiden syöpien.

Candidate Marker MethyLightTM Assay kehittäminen ja Tarkastus

suunniteltu ja testattu yhteensä 15 reaaliaikainen PCR-tekniikkaan perustuva MethyLightTM määritykset (markkereita) kymmenelle jäljellä antureista. MethyLight-tekniikat ovat erittäin herkkiä menetelmiä havaitsemiseksi metyloitua DNA-molekyylien [27]. Alukkeen ja koettimen sekvenssit näitä reaktioita on kuvattu taulukossa S1. Sekvenssi tarkastuksen testeissä nämä merkit on esitetty oikeanpuoleisessa paneelissa kuvion 1. Kolme MethyLightTM reaktiot eivät täydentää

in vitro

metyloituja (M.

Sss

I-käsitelty) kontrolli-DNA ja olivat siksi poistettava. Viisi markkereita, jotka olivat positiivisia terveillä PBL-näytteen ja kolme markkereita, jotka oli PMR 10 useammassa kuin yhdessä 25 CRC kasvainten testattu MethyLightTM myös eliminoitu. Neljä jäljellä markkereita testattiin plasmanäytteistä kymmenen terveiltä luovuttajilta ja yksikään niistä havaittiin näissä näytteissä (tuloksia ei ole esitetty). Kaikki neljä markkereita ensi analysoitiin Digital MethyLightTM yhdistetyssä seerumista ja plasmasta näytteitä valvontaa tai ilman IBD ja CRC potilaita. Kaksi markkereita, joita ei voitu havaita yhdistetyssä CRC näytteet poistettiin (tuloksia ei ole esitetty). Kaksi viimeistä ehdokasta DNA: n metylaatio biomarkkerit, jotka täyttivät kaikki tiukat valintakriteerit olivat:

Ensimmäisen osatyön

(Ensimmäisen osatyön-M) ja

C9orf50

(C9orf50-M).

Alustavat suorituskyky arviointi

Ensimmäisen osatyön

ja

C9orf50

arvioida suorituskykyä

Ensimmäisen osatyön

(Infinium koetin numero cg24562819) ja

C9orf50

( Infinium koetin numero cg14015706) in erotteleva CRC kudosten ja viereisen normaali peräsuolen kudos riippumattomalla tietojen joukko 335 CRC kasvainten (taulukko 1).

Ensimmäisen osatyön

ja

C9orf50

oli β-arvot 0,4 95% ja 100% kaikista analysoitiin CRC kasvaimet vastaavasti. Kuvio 2 esittää vastaanotin toimii (ROC) käyrät

Ensimmäisen osatyön

ja

C9orf50

että syrjintä CRC kasvainnäytteestä ja normaalissa paksusuolen kudoksessa. AUC on

Ensimmäisen osatyön

ja

C9orf50

olivat 0,97 ja 1,0, vastaavasti. Tärkeää on, molemmat markkerit paljasti alempi DNA: n metylaation tasoilla kaikissa muissa syöpätyypeissä, mukaan lukien rinta-, keuhko-, eturauhas-, kilpirauhasen, kohdun, munuais-, munasarja-, maha-, haima- ja virtsarakon syövät, sekä melanooma, akuutti myelooinen leukemia, glioblastooma multiforme ja pään ja kaula okasolusyöpä (kuva 3).

Jitter tontteja edustavat Infinium-pohjainen DNA metylaatio β-arvot

Ensimmäisen osatyön

(vasen paneeli) ja

C9orf50

(oikea paneeli) 335 riippumatonta CRC kasvaimia, vastaaviin normaaleihin paksusuolen kudoksiin, useita muita syövän tyypit ja PBL terveistä yksilöistä. Tietty määrä näytettä kutakin kudostyypin on kuvattu taulukossa 1.

Testaus suorituskykyä Ensimmäisen osatyön-M ja C9orf50-M yksittäisissä kliinisissä näytteissä

Olemme kehittäneet multiplex reaktio kahden markkereita käyttämällä eri reportteri värejä kullekin reaktioita. Ensimmäisen osatyön-M koetin leimattiin QUASAR fluoroforin, joka johtaa punainen fluoresoiva signaali ja C9orf50-M-koetin leimattiin sininen FAM fluorofori. Alukkeet ja koettimet kahden merkin testattiin häiriöitä yhdistämällä ne yhden ratkaisun eri konsentraatioina käyttäen M.

Sss

I käsitelty kontrolli-DNA ja MethyLight ja Digital MethyLight määrityksissä (tuloksia ei ole esitetty). Koska multiplex reaktio kahden merkin suoritetaan sekä yksittäiset reaktiot käytimme entinen edelleen kliiniseen testaukseen.

Kaikkiaan 106 CRC potilaista ja 98 valvonta ilman CRC, tarkastettava kolonoskopia, kuuluivat tähän ennakoiva tutkimus. Pariseeruminäytteitä ja plasmanäytteet olivat käytettävissä kaikki tarkastukset ja 103 CRC potilaille, kun taas vain plasmaa saatiin kolmelta CRC potilasta. Vaikka vaihe IV CRC oli poissulkuun tässä tutkimuksessa, spesifinen poikkeavuuksia nähtiin ennen leikkausta kuvantamisen diagnostiikka kolmella potilaalla (esim. Pieni keuhkonoduluksia TT-rintakehän), joka myöhemmin, mutta ennen leikkausta, osoittautui kaukainen etäpesäke. Nämä potilaat myöhemmin upstaged vaiheeseen IV CRC. Kolmekymmentäkaksi plasma- ja seeruminäytteistä valvontaa ja CRC potilasta aiemmin käytetty yhdistetyssä analyysissä, kuten edellä mainittiin.

Testasimme multipleksoidun digitaalisen MethyLightT määrityksissä Ensimmäisen osatyön-M ja C9orf50-M markkereita yksittäisiä plasmanäytteistä 75 CRC ja 66 valvontaa ja yksittäisistä seeruminäytteistä 72 CRC ja 66 valvontaa. Kuvio 4 esittää molekyylien lukumäärä (summa kahden markkereita) ei havaittu 1 ml plasmaa (paneeli A) ja seerumia (paneeli D) eri vaiheissa CRC verrattuna kontrolleihin. ROC käyrät kuvaavat suoritettavasta testistä multiplex reaktiota kohden taudin vaiheessa (paneeli B) ja molempien merkkiaineiden erikseen plasmassa (paneeli C) ja seerumin (paneeli E ja F). AUC tautia kohden vaihetta on kuvattu kuviossa 4. kaikissa vaiheissa, oli rajatapaus merkittävästi parantunut kokeen aikana seerumin verrattuna plasmassa testiväliaineen (p = 0,06 kaikkia vaiheita varten CRC). Ensimmäisen osatyön-M suoritetaan huomattavasti parempi kuin C9orf50-M sekä plasmassa että seerumissa (p 0,001). Lisäämällä C9orf50-M Ensimmäisen osatyön-M havaitsemiseen CRC ei parantunut kokeen aikana. AUC vaihetta kohti, kunkin markkerin erikseen ja multiplex reaktio, on esitetty yhteenvetona taulukossa S2.

Digital MethyLight suoritettiin 1 ml plasmaa (A) ja seerumin (D) havaitsemiseksi Ensimmäisen osatyön-M ja C9orf50- M CRC ja kontrollinäytteiden. Absoluuttinen määrä molekyylien tunnistama multiplex (summa kahden merkin) reaktio on tallennettu y-akselilla. CRC Näytteet järjestää vaiheessa. Tähdellä (*) osoittaa näytettä yli 25 molekyylejä havaitaan (jopa 153 molekyylejä plasmassa ja 157 molekyylit seerumissa). ROC käyrät ja AUC (95% luottamusvälit) eri CRC vaiheissa plasmassa (B) ja seerumi (E), joka perustuu havaittujen molekyylejä. ROC-analyysi ja AUC (95% luottamusvälit) varten Ensimmäisen osatyön-M, C9orf50-M yksittäisinä reaktioita ja multiplex reaktio plasmassa (C) ja seerumi (F).

Myös määritti CEA tasot ennen leikkausta seeruminäytteistä 107 CRC potilaista. Kohonnut seerumin CEA (≥5.0 ng /ml) havaittiin 35/107 (33%) potilaalla. Vaiheen I CRC seerumin CEA kohosi 14%, II vaiheessa 33%, vaiheen III 39% ja vaiheen IV 67%. Taulukossa S3 yhteenveto preoperative CEA seerumin kaikilla potilailla siihen liittyvä havaittujen Ensimmäisen osatyön-M ja C9orf50-M molekyylit kohti 1 ml plasmaa ja seerumia.

Keskustelu

Yksi tärkeä puutteita julkaistussa CRC biomarkkereiden tutkimuksissa on riippuvuus ehdokas geeni lähestymistapa markkeri löytö. Tämä lähestymistapa perustuu usein nonsystematic valikoima ehdokkaan markkerigeeni, joita testataan terveillä ja syöpä- kudoksiin ja sitten validoitu potilasryhmässä [9] – [22]. Vaikka jotkin näistä tutkimuksista ovat johtaneet lupaavia biomarkkereiden varhaisen CRC havaitsemiseksi, puute perusteellisen biomarkkereiden löytö strategia pohtii ylivoimainen markkereita saattanut jäädä huomaamatta. Kanssa enemmän kehittynyttä teknologiaa tällä hetkellä käytettävissä, on mahdollista saada genomin mittakaavan DNA metylaatio tietoja, jotka voivat olla hyödyllisiä biomarkkereiden löytö. Suoritimme genomin mittakaavan monivaiheisessa merkki löytö tunnistaa CRC biomarkkereiden avulla HM27 ja HM450 BeadChip alusta; Jälkimmäisessä arvioi DNA metylaatiostatuksen yli 482000 CpG loci ja kattaa 96% kaikista UCSC CpG saaria. Olemme hiljattain tehty samanlainen merkki-putki strategia munasarjasyöpä ja tunnistettu uusi herkkä toistumisen biomarkkereiden IFFO1-M [25]. Toistaiseksi tutkimus paransimme löytö strategia käyttämällä DNA: n metylaatio tietoja 4201 syöpänäytteissä eri alkuperää optimoimiseksi CRC spesifisyyden. Tuloksemme osoittavat, että tämä löytö strategia toimii onnistuneesti CRC, jolloin kaksi uutta biomarkkereita: Ensimmäisen osatyön-M ja C9orf50-M. Jossa AUC-arvot 0,97 ja 1,0 vastaavasti sen Infinium määrityksen, nämä kaksi markkereita on erinomainen kyky erottaa CRC kasvainten ja vastaaviin normaaleihin paksusuolen kudosta.