Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

esiintyvyys kilpirauhasen kyhmyt kasvaa iän myötä, keskimäärin 4-7% varten USA aikuisväestöstä, mutta se on paljon suurempi (19-67%), kun piileväoireisen kyhmyt katsotaan. Noin 90% näistä leesiot ovat hyvänlaatuisia ja luotettava lähestymistapaa niiden preoperative luonnehdinta on tarpeen. Valitettavasti tavanomainen kilpirauhasen gammakuvaus ei salli erottelu hyvän- ja pahanlaatuiset kilpirauhasen planktonin kasvu, mutta se tarjoaa vain toiminnallisia tietoja (

kylmää tai kuumaa kyhmyt

).

ilmentyminen apoptoosin vastaisen molekyylin galectin- 3 rajoittuu syöpäsolujen ja tämä ominaisuus on potentiaalia diagnostisia ja terapeuttisia vaikutuksia. Osoitamme tässä mahdollisuus saada kilpirauhassyöpä kuvantamisen

in vivo

kohdistamalla galektiini-3.

Methods

galektiini-3 pohjainen kilpirauhasen immunologiseen skintigrafialla käyttöä radioaktiivisella erityiset

99m-radioaktiivisella leimalla mAb. Aseman herkkä korkean resoluution mini-gamma-kameraa käytettiin kuvantamisen kaappauslaitetta. Ihmisen galektiini-3 positiivista kilpirauhassyöpä ksenograftien (ARO) ja galektiini-3 tyrmäyksellä kasvaimet käytettiin kohteina eri kokeissa

in vivo

. 38-hiirten kasvaimen massa on noin 1 g, injektoitiin häntälaskimoon 100 uCi

99mTc-leimatun mAb galektiini-3 (30 ug proteiinia /100 ui suolaliuosta). Kasvaimen kuvat hankittiin 1 tunti, 3 tuntia, 6 tuntia, 9 tuntia ja 24 tuntia injektion jälkeen käyttämällä mini-gamma kamera.

Havainnot

Tulokset eri peräkkäisen kokeet osoittavat optimaalinen visualisointi kilpirauhassyövän ksenograftien välillä 6 ja 9 tuntia injektion merkkiaine. Galektiini-3 syöpäkasvain ei havaittu lainkaan. 6 tuntia injektion galektiini-3 ilmentäviä kasvaimia oikein visualisoitu, kun taas koko kehon aktiivisuus oli olennaisesti selvitetty.

Johtopäätökset

Nämä tulokset osoittavat mahdollisuuden erottaa ennen leikkausta hyvänlaatuista pahanlaatuiset kilpirauhasen kyhmyt käyttämällä tiettyä galektiini-3 radio-immunotargeting.

In vivo

kuvantamiseen kilpirauhassyöpä saattavat helpottaa valinnan tarkoitetut potilaat leikkaukseen. Mahdollisuus soveltaa tätä menetelmää kuvantamiseen ja hoitoon muiden galektiini-3 ilmentävien kasvainten on myös keskusteltu.

Citation: Bartolazzi A, D’Alessandria C, Parisella MG, Signore A, Del Prete F, Lavra L, et ai. (2008) kilpirauhassyöpä Imaging

In vivo

kohdistamalla antiapoptoottinen Molecule galektiini-3. PLoS ONE 3 (11): e3768. doi: 10,1371 /journal.pone.0003768

Toimittaja: Andrew Boswell, Genentech, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 kesäkuu 2008; Hyväksytty: 02 marraskuu 2008; Julkaistu: 20 marraskuu 2008

Copyright: © 2008 Bartolazzi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana AIRC (Italian Association for Cancer Research). Mikään muu sponsorit ollut merkitystä tässä asiakirjassa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

korkea levinneisyys hyvänlaatuinen kilpirauhasen kyhmyt aikuisväestöstä tekee ennen leikkausta havaitseminen kilpirauhassyövän verrattavissa ”etsisi neulaa heinäsuovasta”. Esiintyvyys kilpirauhasen kyhmyt kasvaa iän, keskimäärin 4-7%, että USA aikuisväestön [1], mutta se on paljon suurempi (19-67%), kun piileväoireisen kyhmyt pidetään myös [2]. Onneksi noin 90% näistä leesiot ovat hyvänlaatuisia ja tästä syystä luotettava ja järjestelmällistä lähestymistapaa niiden preoperative luonnehdinta on tarpeen [1], [3].

Ilmaisu natriumjodidia Symporter (NIS) on kalvo kilpirauhasen solujen avulla kilpirauhasen keskittyä jodidi seerumista. NIS välittämä jodidi otto tarvitaan myöhemmin organifikaatiota ja hapetus vaiheet, jotka ovat keskeisiä tapahtumia kilpirauhashormonien tuotanto. Tämä erikoinen ominaisuus rauhanen tukee perinteisen kilpirauhasen gammakuvaus, jossa käytetään radiojodia määrittelyssä kilpirauhasessa sekä fysiologisten ja patologisten tilojen, [4]. Kuitenkin tämä laajasti käytetty tekniikka ei salli erottelu hyvän- ja pahanlaatuiset kilpirauhasen planktonin kasvu. Itse vaikka syöpä on epätavallinen kilpirauhasen kyhmyt tehokkaiden jodidi oton (muotoiltu

kuuma kyhmyjä

), suurin osa kilpirauhasen proliferaatiot, jotka eivät keskittää jodidia (

kylmä kyhmyt

) ovat biologisesti hyvänlaatuisia [ ,,,0],4].

Normaalisti kilpirauhasen solut eivät ilmaista galektiini-3. Pako- ilmentyminen galektiini-3

kautta

cDNA-transfektiolla tuottaa transformoidun fenotyypin, estää apoptoottinen ohjelma, joka on ominaisuus, joka suosii syövän kehittymiseen [5] – [9]. Mielenkiintoista, kuten aiemmin raportoitu suuressa monikeskustutkimuksessa retrospektiivinen tutkimus histologinen materiaalia, hyvin erilaistunut kilpirauhasen karsinoomat lähes poikkeuksetta ilmaista galektiini-3 ( 94% kaikista kilpirauhassyöpä tyyppejä, jossa syrjäytyminen medullaarikarsinoomaan), kun taas hyvänlaatuinen kilpirauhasen planktonin kasvu do ei (vain 2%: n hyvänlaatuinen kyhmyjä, enimmäkseen edustaa adenoomia, olivat galektiini-3 positiivinen) [10]. Tämä havainto vahvistettiin useissa tutkimuksissa raportoitu kirjallisuudessa [11] – [14] ja galektiini-3 immunovärjäys on jo käytetty kliinisessä käytännössä, at immunologiseen Sytologisten tason, paremman valikoiman tarkoitetut potilaat kilpirauhanen [10], [15] – [17]. Tässä tutkimuksessa käyttämällä

in vivo

ja

ex vivo

kokeellisissa malleissa kilpirauhassyövän osoitamme mahdollisuus saada luotettavaa kilpirauhassyövän kuvantamisessa

in vivo

kohdistamalla galektiini-3 lektiini-molekyylin. Tämä diagnostinen lähestymistapa voidaan myös käyttää kuvantamisen eri galektiini-3 ilmentävien kasvainten

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja galektiini-3 mRNA häiriö

Kilpirauhasen sinoomasolulinjoja ARO, toimitti ystävällisesti Dr. Silvia Soddu (National Cancer Institute Regina Elena Rooma, Italia) on aiemmin kuvattu [18] – [19]. Vaikka kilpirauhasen alkuperä ARO solujen on hiljattain kyseenalaiseksi [20], tämä galektiini-3 positiivisen solulinjan kasvaa hyvin tehokkaasti

in vivo

ja tarjoaa käyttökelpoisen mallin asettaa kokeilut galektiini-3 immunotargeting kanssa ja ilman galektiini -3 mRNA häiriöitä. Soluja viljeltiin vakio-olosuhteissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 ilmakehässä RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 2 mM glutamiinia, 10% FCS: ää, penisilliiniä ja streptomysiiniä (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD).

galektiini-3 mRNA häiriö kolmea eri sekvenssit tunnistettiin ja testattiin raportoitu aiemmin [21]. Seuraavat kaksi sekvenssit, jotka voimakkaasti ja vastaavasti säädeltiin galektiini-3: n ekspressio ARO soluja subkloonattiin pSUPER vektoriin ja käytetään keskenään (konservoituneet motiivit on alleviivattu): 5′-GATCCCCCAACAGGAGAGTCATTGTTTTCAAGAGAAACAATGACTCTCCTGTTGTTTTTGGAAA-3 ’(Gal3-551, sense); 5’-AGCTTTTCCAAAAA CAACAGGAGAGT-CATTGTTTCTCTTGAAAACAATGACTCTCCTGTTGGGG-3 ’(Gal3-551, antisense); GATCCCCACCTTACATGTGTAAAGGTTTCAAGAGAACCTTTACACATGTAA-GGTTTTTTGGAAA-3 ’(Gal3-845, sense); ja 5’-AGCTTTTCCAAAAAACCTTAC-ATGTG TAAAGGTTCTCTTGAAACCTTTACACATGTAAGGTGGG-3 ’(gal3-845, antisense).

kokeessa on esitetty kuviossa 1 (paneeli B) ARO-solut transfektoitiin stabiilisti pSUPER-Gal3-551 (ArO- Gal-3i) vektori ja valetransfektoidut kanssa pSUPER vektorilla kontrollina (ARO-ctr). Valinta stabiilisti transfektoitujen solujen suoritettiin käsittelemällä puromysiini 2 ug /ml (Sigma) 72 tuntia transfektion jälkeen.

A) Kuvaa hankittu korkean resoluution mini gamma kamera hiiren joissa ARO (Gal3 +) -ksenografti kuluttua 6 tuntia päässä iv injektio 100 uCi

99m-leimattua mAb galektiini-3. Nuoli osoittaa kasvain massa paljasti vasemman jalan. Johdonmukainen kertyminen radio merkkiaineen havaitaan maksassa mukaan puhdistuma eksogeenisen mAb (paneeli 1A); Morfologiset ja immunohistokemiallinen arviointi irrotettiin -tuumoriksenografti osoittavat huonosti eriytetty kilpirauhassyöpä on vaihteleva ilmentyminen galektiini-3, koska kävi ilmi jonka galektiini-3 erityinen mAb ja suoran immunoperoksidaasivärjäystä menetelmä (paneeli 2A); Taulukossa on esitetty kineettinen kasvaimen /normaali lihas suhde radio- merkkiaineen eri ajankohtina (paneeli 3A). B) Image hankittu korkearesoluutioinen mini gamma kameraa hiiren laakeri galektiini-3 häirinnyt ARO ksenografti (Gal3-) jälkeen 6 tuntia päässä i.v. injektio 100 uCi

99m-leimattua mAb galektiini-3 (paneeli 1 B); Immunohistokemiallinen arviointi poistetun kasvaimen esittää johdonmukainen alas-säätely galektiini-3 lauseke (paneeli 2B); Tehokkuus vakaa galektiini-3 RNA häiriöitä alas säännellä galektiini-3 ilmentyminen on osoitettu immunoblottauksella. ARO solut valetransfektoidun kanssa pSUPER vektorilla, käytettiin kontrollina (Ctr); galektiini-3 häirinnyt ARO solut transfektoitu stabiilisti pSUPER-Gal3-551 vektorin (Gal3i); α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. Densitometrian analyysi molekyylilajien visualisoitiin geelissä on myös esitetty (paneeli 3B). Tulokset ilmaistaan ​​suhteellinen densitometriayksikköä (RDU), mitattuna normalisoi Gal-3-signaalin kanssa vastaavan α-tubuliinin kaistan intensiteetin.

Down-regulation of galektiini-3 ilmentyminen tarkastettiin western blot analyysissä eri ajankohtina (12-72 tuntia transfektion jälkeen ja kasvaimen soluihin injektio hiirillä).

monoklonaalisia vasta-aineita ja immunohistokemia

puhdistettu piparjuuriperoksidaasi konjugoitu (HRP-konjugoitua) rotan monoklonaalinen vasta-aine galektiini -3 (SPACE srl, Milano, Italia) käytettiin immunohistokemiallisella-sytokemian mukaan valmistajan ohjeiden aiemmin raportoidun [13]. Lyhyesti, antigeeni-haku mikroaaltouuni hoito kudosten diat 0,01 mol /l sitraattipuskuria pH 6,0 pantiin kolme sykliä 3 minuuttia kulloinkin 750 W. Puhdistettu rotan mAb kohdistuu galektiini-3 käytettiin pitoisuusalueella 5-10 ug /ml. Entsymaattinen aktiivisuus visualisoitiin 3, 3′-diamino-bentsidiiniä (Dako, Glostrup, Tanska).

Western Blot-analyysi

Yhteensä solu-uutteita (TCE) saatiin käyttäen lyysipuskuria, joka koostuu by: Tris HCI 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 1%, PMSF 1 mM ja 1 tabletti täydellistä proteiinia inhibiittoricocktailia (Roche). Alikvootti TCE (30-70 ug) erotettiin 10% SDS-PAGE, sitten blotattiin nitroselluloosamembraanille (BIO-RAD). Seuraavia vasta-aineita käytettiin immunoblottauksessa: puhdistettu rotan mAb galektiini-3 (Mabtech AB, Nacka Strand, Ruotsi), hiiren mAb anti-α-tubuliinin (TU-02, Santa Cruz Biotechnology) ja HRP-konjugoitu anti-hiiri- IgG ja anti-rotta-IgG-spesifisten antiseerumien kanssa (Sigma). Immunoreaktiivisuus havaittiin käyttämällä kemiallis-luminesenssi analyysi (ECL kit, Amersham Corporation). Molekyylilaji ratkaista western blotting lopuksi analysoitiin densitometrisesti käyttämällä dedikoidun ohjelmiston (NIH ImageJ, versio 1.32j).

Tulokset ilmaistaan ​​suhteellisena densitometria (RDU) normalisoinnin jälkeen, jossa densitometrisesti arvojen kaistan saatu α-tubuliinin.

Hiirimallit kilpirauhassyövän ksenograftien

Patogeenittomia 4-5 viikkoa vanhoja nude

(nu /nu) B hiiret (Charles River , USA) käytettiin perustamisesta kilpirauhassyöpä ksenograftien

in vivo

. Hiiret pidettiin häkeissä 4 eläimen kunkin vedellä ja ruoka

halun

. Galektiini-3 ilmentävät ja erittäin tuumorigeenisiä huonosti eriytetty follikulaarisen kilpirauhassyövän solulinja (ARO) ja johdettu galektiini-3 knockout ARO soluja (ARO-Gal3 negatiivinen) otettiin huomioon näissä kokeissa.

Villityypin ja puuttui ARO soluja ylläpidettiin vakiona viljelyolosuhteissa kuten edellä on mainittu, irrotettiin kudosviljelylevyiltä trypsiini 0,05% -EDTA- 0,02% (Gibco), pestiin steriilissä PBS: ssä, ja injektoidaan subkutaanisesti nude-hiiriin, jonka pitoisuus vaihtelee välillä 7 x 10

6-10

7 solua /0.2 ml suolaliuosta, riippuen kokeesta. Solujen injektion suoritettiin käyttämällä tavanomaista insuliinia neula.

o anestesian oli tarpeen. Viisikymmentä eläintä käytettiin kolmessa eri sarjaa kokeita perustamiseen kasvain xenografs. Hiiriä tutkittiin kolme kertaa viikossa merkkien mitattavissa kasvaimen kasvua.

hiiriä valittu

in vivo

kuvantaminen kokeissa, kun kasvaimen paino oli noin 0,5-1 g. Määrittää

in vivo

ilmentymisen galektiini-3 kasvaimen ksenografteja, joitakin kasvaimia kirurgisesti leikattiin ja käytettiin galektiini-3: n ekspressio analyysi kuten on raportoitu edellä. Tämä työ suoritettiin erityisiä ohjeita, jotka Italian terveysministeriön varten eläinkokeiden. Tämä tutkimus on hyväksynyt institutionaalisten eettisen komitean eläinkokeiden National Cancer Institute Regina Elena Rooman. Eläin laitokseen NCI Rooman on sertifioitu Italian terveysministeriön.

Radio merkintöjä monoklonaalinen vasta galektiini-3

Affinity puhdistettu ja erittäin keskittyneet (5 mg /ml) monoklonaalinen vasta-aine ihmisen galektiini-3 (Mabtech, Nacka, Ruotsi) on radio- leimattiin käyttäen menetelmää aiemmin raportoitu [22]. Lyhyesti, vasta-aineen disulfidisidosten pelkistettiin käyttäen molaarinen ylimäärä 2-merkaptoetanolia (Sigma-Aldrich) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen puhdistus, jossa on Sephadex G-25-pylvään (Amersham Biosciences GmbH, UK) ja typpeä puhallettiin kylmää fosfaattipuskuria pH 7,4 eluenttina. Alennetun vasta-aine varastoitiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Aktivoitu galektiini-3-mAb (400 ug /200 ui) leimattiin lisäämällä 7 ui metyleeni-diposphonate (MDP) luukuvaus kit (Medrotec®, Amersham Health, UK), kuten aiemmin on raportoitu [22], ja 10 mCi (370 MBq) of

99mTcO

4

– juuri eluoidaan (

99Mo /

99mTc) generaattori (GE-Healthcare, UK). Leimaus tehokkuus (LE) arvioitiin käyttämällä Instant ohutkerroskromatografialla (ITLC-SG, VWR, Italia), jossa 0,9% NaCl liikkuvana faasina.

liuskat analysoitiin tietokoneistetun mini-radio skanneri (Bioscan System , Italia). LE, oli 95%: n lopullinen spesifinen aktiivisuus 70 uCi /ug (Fig. S1 verkossa).

Jotta mahdollisimman tehokkaasti vasta-aineen merkintöjä useita kokeita suoritettiin vaihtelemalla moolisuhde 2-merkaptoetanolia /mAb (alue: 1.000:1 on 4.000:1) ja suhde mAb /

99mTc merkintöjä (alue 250.000:1 on 4.500.000:1).

alentaminen disulfidisiltojen klo moolisuhde 2145:1 (2-merkaptoetanolia /mAb), ja moolisuhteessa 1,500,000:1 varten Ab /

99m tuotti korkeimman LE

99m-anti-galektiini-3 ja käytettiin kaikkiin muihin kokeisiin (Fig. S1 verkossa).

erityisiä vakauden tutkimukset suoritettiin inkuboimalla tuoretta radio leimattua vasta-ainetta suolaliuoksessa tai ihmisen plasmassa 37 ° C: ssa 24 tuntia ja arvioida radiofarmaseuttisen puhtaus ITLC-SG eri ajankohtina (1 h, 3 h, 6 h ja 24 h). Vakauden suolaliuoksella ja plasman oli korkea ensimmäisten 6 tunnin kuluessa ( 90% ja 80% suolaisen ja plasma, vastaavasti) väheten 24 h (Fig. S1 verkossa).

high Resolution gamma Camera

high Resolution gamma kamera (HRC) (Li-tech Srl, Italia), kuvassa S2 verkossa on säveltänyt crystal-kollimaattori rakenne kytketty Hamamatsu H8500 (Hamamatsu, Japani) Position Sensitive Photo Multiplier Tube (PSPMT), lataa lukuelektroniikkaa ja tiedonkeruujärjestelmä.

patentoitu yhdensuuntainen reikä kollimaattori, on jo kuvattu [24] – [25] on valmistettu puhtaasta Tungsten 200 um septaa. Se koostuu 24 mm: n kollimaattori järjestetty yli liitännäishoitona 6 mm kollimaattorin rakenne, jossa kiteet on integroitu reikiin. Tuike- rakenne koostuu 20 × 20 CSI (Tl) kiteitä array (Spectra Physics-Hilger, UK), jossa näkökenttä (FOV) 49,0 x 49,0 mm

2. Kide mitat ovat 2,05 x 2,05 x 5,0 mm

3 ja kukin kide kuuluu by100 um valkoinen heijastava epoksi hänen viisi sokea pintoja. Kide-kollimaattori rakenne on kytketty PSPMT optisella rasvalla.

H8500 PSPMT on ulkoinen koko 52,0 x 52,0 x 18,0 mm

3, jonka aktiivinen alue 49,0 x 49,0 mm

2. Valokatodi on bi-alkali ja moninkertaistuminen järjestelmä, joka koostuu 12 metalli kanava dynodes, tarjoaa noustessa 3 x 10

6 @ -1000 V.

Kerrottu maksu kerätään joukko 8 x 8 anodit.

lukema on pienoiskoossa (52,0 x 52,0 x 5,0 mm

3) front-end elektroniikka, ja signaalit näytteistetään omistettu kompakti USB ADC aluksella. Yritysosto tarjoaa 4 kanavaa 20 M Näytteet /sek. Tietojen hankinta ja käsittely suoritetaan Linux Embedded System varustettu ARM CPU PXA255 kanssa 10 ”kosketusnäytöllä. Järjestelmän ohjaus ja tietojenkäsittely ohjelmistot ovat patentoituja sovelluksia kehitetään C ++ kielellä. Järjestelmä mahdollistaa suorittaa reaaliaikainen hankinta joiden virkistystaajuus 0,5 sekuntia. Järjestelmä on suunniteltu olevan akkukäyttöinen kannettavaan laitteeseen; seurauksena ilmaisin pää painaa noin 2 kg, kun kokonaispaino on noin 4,5 kg.

HRC energia resoluutio on noin 20% FWHM @ 140 keV (

99m) koko FOV. Herkkyys on 210 cps /MBq ja tasaisuus on ± 5%, kun se tarjoaa 2,2 mm luontainen spatiaalinen resoluutio sopiva meidän kuvantaminen kokeita

in vivo

kasvaimen ksenosiirrettyjä hiirillä, ja

ex-vivo

kirurgiset näytteet on johdettu ihmisen potilaista.

ex-vivo kuvantamiseen ihmisen kilpirauhassyövän

Koska todiste siitä kuvantamisen kilpirauhassyöpäpotilailla ihmisen teimme

ex-vivo

sitova tutkimukset käyttäen kohdistaa tuore metastasoitunut kohdunkaulan imusolmuke leikattiin irti potilaasta varustetun papillaarinen kilpirauhassyövän. Heti kirurgisen poiston jälkeen imusolmuke leikattiin pituussuunnassa puoliksi läpi syöpä vaurion ja kaksi kudosleikkeet inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 tunnin ajan 50 ml liuosta, joka sisälsi 2 pCi

99m-anti-Gal-3 ( 0,1 ug proteiinia) suolaliuoksessa 1% HSA: ta läsnä ollessa tai ilman 100 ug leimaamatonta anti-Gal-3-vasta-aine

tulokset

jotta voitaisiin arvioida sitoutumisen spesifisyys

99mTc-leimatun mAb galektiini-3

in vivo

, kuusi sisältämiin eläimiin galektiini-3 positiivinen ksenografteja (ARO-Gal-3

+) katsottiin alustavassa kokeessa.

Hiiret kasvaimen massa on noin 1 g, injektoitiin häntälaskimoon (iv) 100 uCi

99mTc-leimatun mAb galektiini-3 (30 ug proteiinia /100 ui suolaliuosta). Kuvat otettiin 1 tunti, 3 tuntia, 6 tuntia, 9 tuntia ja 24 tuntia injektion avulla mini-gamma-kameraa. Galektiini-3 immunotargeting ARO kasvainten oli erittäin tehokas ksenosiirrettyjä hiirillä. Keskeinen alue tuumorinekroositekijän (histologisesti vahvistettu), joilla on heikentynyt sitoutuminen merkkiaine oli oikein kuvattu jossakin tapauksissa (kuva S2 verkossa). Alustavat kokeilee erilaisia ​​galektiini-3 kasvain kuten ihosyövän, lymfooma ja rintasyövät katsottiin myös tähän tarkoitukseen päällekkäisiä tuloksia (tuloksia ei ole esitetty). Kuten odotettua, suurin osa galektiini-3 on radioaktiivisesti leimattu vasta-aine konsentroitiin maksassa mukaan puhdistuma eksogeenisen mAb: iden verestä [26] (kuva S2 verkossa). Jotta voidaan optimoida kuvantamisen talteenoton ja osoittamaan sitoutumisen spesifisyyttä galektiini-3 mAb suuremman

in vivo

kokeessa (toistuva kolmena kappaleena) pidettiin.

Kokeilu mukana 12 ksenosiirrettyjä hiiret kaksi kuuden eläimen ryhmää kussakin. Ensimmäinen ryhmä, joihin on siirretty galektiini-3 positiivisia ARO soluja pitoisuutena 5-8 x 10

6 solua /0,2 ml suolaliuosta /hiiri; toinen ryhmä hiiriä, joihin on siirretty galektiini-3 knockout ARO soluja (ARO-Gal3 negatiivinen), joka on saatu käyttämällä erityistä galektiini-3 RNA-interferenssi (iRNA) [20].

ARO-Gal3 negatiivisia soluja ruiskutetaan ihon alle, pitoisuus 10

7cells /0,2 ml suolaliuosta /hiiri, jotta voidaan edistää nopeaa kasvaimen kasvua

in vivo

noin 4 päivää.

Tätä ylläpitoon tarvittavat tehokas säätely alaspäin galektiini-3 ilmentymisen vakaa puuttunut ARO solut, kasvavat

in vivo

puuttuessa puromycine valikoivaksi antibiootti. Galektiini-3 alassäätöä vakaissa puuttunut ARO solut tarkastettiin western blot eri ajankohtina (12-72 tuntia). 4 päivän kuluttua solujen injektion kaikki hiirille kehittyi näkyvä ihonalainen kasvain mediaanihalkaisija koko 0,5 cm. Sitten eläimet injektoitiin häntälaskimoon 100 uCi

99m-leimattua mAb galektiini-3 (30 ug proteiinia) ja koko kehon kuvat hankittiin 1 tunti, 3 tuntia, 6 tuntia, 9 tuntia ja 24 tuntia käyttämällä korkean resoluution gamma kamera.

kuvat analysoitiin piirtämällä kiinnostavat alueet (ROI) yli istutettu kasvain ja tiskin sivusuunnassa lihas otetaan tausta. Kuten odotettua optimaalinen visualisointi Aro-Gal-3

+ ksenograftit saatiin välillä 6 ja 9 tuntia injektion merkkiaine, kun taas galektiini-3 negatiivisia kasvaimia ei havaittu lainkaan (Fig. 1 paneelit A ja B) . Kasvaimet lopulta irrotetut histologista arviointia ja immunologiseen fenotyypin analyysi kuten on esitetty kuviossa 1.

eri joukko kokeita, 20 ARO ksenosiirrettyjä hiiriin injisoitiin 100 uCi

99m-leimattua mAb galektiini -3 (30 ug proteiinia) ja 5 ryhmät 4 eläintä kussakin tapettiin 3 tuntia, 6 tuntia, 9 tuntia, 12 tuntia ja 24 tuntia injektion jälkeen, vastaavasti.

Kudosnäytteet verestä, maksasta, pernassa, munuaisissa, ohutsuolessa, paksusuolessa, lihas- ja ARO tuumoriksenografteja poistettiin, punnittiin ja laskettiin läsnäolo radioaktiivisuudesta. Kaikki eläimet olivat kuvattiin ennen tappamista toistettavia tuloksia (tuloksia ei ole esitetty).

in vivo

bio-radio- leimatun galektiini-3 mAb ilmaistuna prosenttiosuutena injektoidusta annoksesta grammaa kudosta (% ID /g), osoitti nopeaa veren puhdistuma radiofarmaseuttisen 3 tunnin kuluessa injektion. Suurin osa radioaktiivisuudesta havaittiin maksassa ja munuaisissa osoittaa nopea puhdistuma merkkiaineen

kautta

maksan ja virtsateiden (taulukko 1).

Kuten odotettua kasvain ottoa galektiini-3 erityinen

99m-leimattua mAb nousi 3-9 tuntia injektion jälkeen. 6 tuntia injektion kohteena kasvaimet olivat selvästi nähtävissä, kun koko kehon aktiivisuus oli olennaisesti selvitetty (taulukko 1 ja kuva S2 verkossa).

Vaikka käännös näistä havainnoista hoitopaikassa käyttö vaatii humanisoidun mAb: iden liittyvät eri radionuklideja ja laajempia prekliinisissä tutkimuksissa, yritimme simuloida galektiini-3-kuvantaminen ihmisen kilpirauhassyövän

ex-vivo

. Tässä tehtävässä tuore kohdunkaulan imusolmuke kirurgisesti leikattiin irti potilaasta varustetun papillaarinen kilpirauhassyövän etäpesäke (histologisesti varmennettu), käytettiin kohteena tutkimiseen sitoutumisen tehokkuutta Gal-3 erityinen radiotracer.

Heti kirurgisen poisto imusolmuke leikattiin puoli läpi syöpä vaurion ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 tuntia 50 ml: ssa suolaliuosta, joka sisälsi 2 pCi

99m-mAb galektiini-3 (0,1 ug proteiinia) ja 1% ihmisen seerumin albumiini, läsnä ollessa tai poissa ollessa 100 ug merkitsemätöntä (kylmä) ja anti-galektiini-3-mAb (tilavuus määritys).

pesemisen jälkeen suolaliuokseen vertaileva kuvantamisen kahden kudoksen valmisteet tehtiin. Tämän kokeen tulokset on esitetty kuvassa 2.

Kuvassa imusolmuke näyte leikataan kahtia pitkittäin ja kuvattiin käyttämällä mini gamma-kameraa jälkeen 1 tunnin ja 2 tunnin inkubaation 2 uCi

99mTc-leimatun mAb galektiini-3 (0,1 ug proteiinia) suolaliuokseen, läsnä (paneeli B) tai ei (paneeli A) ylimäärän (100 ug) leimaamatonta galektiini-3-spesifinen mAb. Paneeli A esittää kasvain havaitseminen radiomerkkiaineen jälkeen 1 h ja 2 h inkuboinnin. Paneeli B esittää johdonmukaisesti pienempi otto merkkiaine läsnä on ylimäärä leimaamatonta anti-gal3- mAb, koska tietyn siirtymän vaikutus.

mini-gamma-kameraa välittömästi havaita kilpirauhasen syövän etäpesäkkeiden (paneeli A), kun taas niukka kasvain otto merkkiaine näkyi ohjaus, johtuen siirtymävaikutus kylmän mAb ylimäärin (paneeli B).

keskustelu

Kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen mahdollisuus havaita kilpirauhassyöpä ja muut galektiini-3 ilmentävien kasvainten

in vivo

käyttämällä galektiini-3 erityinen radio-immunoskintigrafia. Käyttö galektiini-3 radiomerkkiaineena havaitsemiseksi kilpirauhassyövän

in vivo

tukee vankka molekyyli- perustelut [5], [7] – [10]. Lisäksi olemme hiljattain osoittaneet, että galektiini-3 immunotargeting edustaa hyödyllinen diagnostinen väline tunnistaa ennen leikkausta pahanlaatuinen kilpirauhasen planktonin kasvu on immunologiseen Sytologisten emäkset, vaikka jotkut kilpirauhasen karsinoomat (noin 10-15% riippuen mukaan tutkimukset) eivät ilmaise galektiini-3 [10] – [14], [17]. Galektiini-3 pohjainen radio-immunoskintigrafia tässä ehdotetaan, tarjoaa biologiset tietoa kilpirauhasen kyhmyt ja edustaa hyödyllinen opas oikein tunnistaa ne kilpirauhasen planktonin kasvu, joka olisi sytologisesti arvioida ja /tai nopeasti poistettu.

yhdistäminen galektiini-3 imaging kilpirauhasen FNA-sytologia, itse asiassa, voi sallia erottavien preoperatively hyvänlaatuista pahanlaatuiset kilpirauhasen planktonin kasvu korkea hyötysuhde. Tämän seurauksena monta turhaa thyroidectomies voitaisiin välttää ja kliinisen tavanomaisten kilpirauhasen gammakuvaus radio jodidi, joka ainoastaan ​​tarjoaa käytännöllistä tietoa tietyistä kilpirauhasen olosuhteissa voitaisiin rajoittaa enemmän valittuun kliinisiin kysymyksiin. Lisätutkimukset jotka käyttävät humanisoitu galektiini-3 erityinen mAb: t konjugoitu eri radionuklideja on tarpeen vahvistaa ja vahvistaa nämä havainnot. Jos ehdotettu diagnostinen lähestymistapa osoittautuu sopivaksi kohdennetusti radio-ablaatio galektiini-3 ilmentäviä kasvaimia voi myös tutkia käyttämällä galektiini-3 erityinen mAb: t konjugoitu eri radio aineita (ts

186Re,

177Lu tai

90Y,

64Cu,

67Cu). Galektiini-3 ’säteily täsmähoitoihin ”toimittaa säteilyannos nimenomaan galektiini-3 positiivinen kasvain Vähäistä altistusta normaalien kudosten. Tunkeutuminen beta- säteiden elävissä kudoksissa on useiden millimetrien ja terapeuttinen vaikutus voidaan saada myös syöpäsolut eivät vie suoraan radioaktiivista lääkettä (ristituleen vaikutus). Tämä lähestymistapa voisi olla hyödyllinen sekä havaitsemiseen ja hoitoon mikro papillaarisen kilpirauhasen karsinoomat (vauriot pienempi kuin 1 cm, yleisesti muotoiltu ”

okkultistisen PTC

), jotka ovat tällä hetkellä havaita ennen leikkausta.

Lisäksi mahdollisuus hoitaa primaarinen ja metastaattinen kilpirauhasen pahanlaatuisia kasvaimia, jotka ovat galektiini-3 positiivinen, mutta ei-jodi innokas ja tästä syystä ne eivät reagoi tavanomaisiin radio-aineenvaihdunnan -hoidon

131Iodine, on tärkeä saavutus onkologiaan, joka on tarkemmin.

Alustavat tiedot

in vivo

kuvantamiseen galektiini-3 positiivista lymfoomat ja rintasyövät ovat myös saatu avaamalla mielenkiintoisia mahdollisuuksia tulevaisuuden käyttävät radiota leimatun mAb: t galectin- 3

in vivo

kuvantaminen ja hoito erilaisten ihmisen maligniteettien [27] – [31].

tukeminen Information

Kuva S1.

Vakaus ja merkintöjen tehokkuus galektiini-3 radiomerkkiaineen. Vakautta merkkiaine arvioitiin inkuboimalla näyte on radioaktiivisesti leimattu mAb suolaliuoksella ja seerumissa 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Prosenttiosuus teknetiumin sitoutuneen mAb arvioitiin Instant Thin Layer Chromatography- Silica Gel perusteella (ITLC-SG) liuskoja eri ajankohtina. Kuvaaja osoittaa säilyttäminen teknetium vaihtelee välillä 100% ja 85% ensimmäisten kuuden tunnin (noin 360 minuuttia) väheten 6-24 tuntia (ylempi paneeli). Aktiivisuus on radioaktiivinen merkkiaine mAb anti galektiini-3 on arvioitu titraus kokeessa. Paras mAb /Tc-suhde on laskettu vaihtelemalla toimintaa 99mTc lisätä stabiiliin tilavuuteen vähentynyt vasta. Merkinnöissä tehokkuus (LE) arvioitiin ITLC-SG. Optimaalinen mAb /Tc suhde todettiin 1.200.000 /1 vastaa 30-40 mCi aktiivisuus ja merkintöjä hyötysuhde jopa 95%. Toimintaa ylittää tätä arvoa ei lisännyt LE (alempi paneeli B).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0003768.s001

(8,52 MB DOC) B Kuva S2.

Kasvain kuvantaminen in vivo käyttämällä 99mTc-leimattua mAb galektiini-3 ja korkearesoluutioinen kannettava mini gamma kamera. A) Korkean resoluution kannettava mini Gammakameran Tässä tutkimuksessa käytettiin. B) Image vangiksi korkean resoluution gamma kamera hiiri varustettujen galektiini-3 positiivista kilpirauhasen -ksenograftia ARO, kun 6 tuntia päässä i.v. injektio 100 uCi 99mTc-leimatun mAb galektiini-3. Kasvain vahvistettiin histologia oli 1,2 cm halkaisijaltaan ja osoitti suuri keskeinen nekroottista alue vastaa aukon joka epäonnistui korjata merkkiaine (nuoli).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0003768.s002

(10,39 MB DOC) B

Kiitokset

Kiitämme Marco Paolo Martegani varten teknistä apua käsikirjoitus valmisteilla.