Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ex vivo

-expanded, allogeenisten luonnollisten tappajasolujen (NK-soluja) voidaan käyttää hoidettaessa erilaisia ​​syöpätyyppejä. Allogeenisilta NK-solujen hoidon, NK-soluja terveiltä luovuttajilta on laajennettava, jotta saadaan riittävä määrä erittäin hyvin puhdistettua, aktivoitua NK-soluja. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme perustaneet tehokkaan ja yksinkertaisen menetelmän laajamittaista kasvua ja NK-solujen aktivaation terveiltä luovuttajilta alle hyvän valmistustavan (GMP) olosuhteissa. Sen jälkeen, kun yhden vaiheen, jossa magneettinen vähenemistä CD3

+ T-solut, köyhdytettyä perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC: t) stimuloitiin ja laajennettiin säteilytettyjen autologisten PBMC: n läsnä ollessa OKT3 ja IL-2: 14 päivää, jolloin tuloksena on erittäin puhdas populaatio CD3

-CD16

+, CD56

+ NK-solujen, joka halutaan allogeenistä tarkoitukseen. Verrattuna juuri eristetty NK-soluissa, nämä laajennettu NK-solut osoittivat vahvaa sytokiinien tuotannon ja voimakas sytolyyttinen aktiivisuus eri syöpäsolulinjoja. Huomattavaa on, että laajennettu NK-solut valikoivasti tappoi syöpäsoluja osoittamatta sytotoksisuutta allogeenista ei-kasvainsoluihin in yhteisviljelmä määrityksissä. Anti-kasvain aktiivisuus laajennettu ihmisen NK-solujen tutkittiin SCID-hiirissä, joihin injektoitiin ihmisen lymfooma-soluja. Tässä mallissa laajennettu NK-soluja valvotaan tehokkaasti lymfooma etenemistä. Lopuksi allogeenisten NK-soluja tehokkaasti laajennettiin GMP-yhteensopiva laitos ja osoittivat voimakas antituumorivaikutus sekä

in vitro

ja

in vivo

.

Citation: Lim O, Lee Y, Chung H, Her JH, Kang SM, Jung My, et ai. (2013) GMP-yhteensopiva, Large-Scale laajennettu Allogeeninen Natural Killer Cells voimakkaita sytolyyttinen aktiivisuus syöpäsoluja vastaan ​​

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 8 (1): e53611. doi: 10,1371 /journal.pone.0053611

Editor: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Julkinen de la Santé (CRP-Santé), Luxemburg

vastaanotettu: 03 syyskuu 2012; Hyväksytty: 29 marraskuu 2012; Julkaistu: 11 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Lim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat myöntämisestä Korea Healthcare teknologian t Perhe-, Korean tasavalta (A062260). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Eui-Cheol Shin on PLoS One toimitusneuvosto jäsen, ja ymmärtää, että tämä ei ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: MJ ja HS työskentelee Green Cross LabCell Corp. Mogam Biotechnology Research Institute on voittoa tutkimussäätiö. Patent Number: KR2008-74069. Date Patent Annettu: 28. maaliskuuta 2012. nimi Patent: Growth menetelmä luonnollisten tappaja soluja. Patentin saaja: Green Cross LabCell Corp. ja Seoul National University Hospital. Keksijä: Mi-nuori Jung, Dae Seog Heo, ja Yu Kyeong Hwang. Patent Number: JP2011-521023. Date Patent Jätetty: 31. tammikuuta 2011. nimi Patent: Growth menetelmä luonnollisten tappaja soluja. Patentin saaja: Green Cross LabCell Corp. ja Seoul National University Hospital. Keksijä: Mi-nuori Jung, Dae Seog Heo, ja Yu Kyeong Hwang. Patent Number: CN200980130121.5. Date Patent Jätetty: 30. tammikuuta 2011. nimi Patent: Growth menetelmä luonnollisten tappaja soluja. Patentin saaja: Green Cross LabCell Corp. ja Seoul National University Hospital. Keksijä: Mi-nuori Jung, Dae Seog Heo, ja Yu Kyeong Hwang. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Toinen Kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole eturistiriitoja.

Johdanto

Natural Killer (NK) solut ovat erikoistuneet lymfosyyttejä, jotka tarjoavat ensimmäinen puolustuslinja virusinfektioiden ja syövän [1]. NK-solujen aktiivisuutta säätelee signaaleja aktivoimalla ja estävä reseptoreita [2]. NK aktivoiva signaali välittyy useita NK-reseptoreihin, kuten NKG2D ja luonnon sytotoksisuuden reseptorit (NCRs) [2], [3]. Sen sijaan, NK inhibitio on myönnetty tappajasolujen immunoglobuliinin kaltainen reseptorit (Kirs), jotka sitoutuvat MHC-luokan I molekyylien kohdesoluihin [2], [4]. MHC luokan I ilmentymisen taipumus kadota tai alassäädetty syöpäsoluissa [5] ja sen seurauksena NK inhibitiosignaalia on kumottu, jolloin NK-solut aktivoituvat ja tappaa pahanlaatuiset tavoitteita.

Äskettäin antituumorivaikutus NK-solujen on osoitettu asettaminen allogeenisten Luuytimensiirto (HSCT) [6]. T-solujen-köyhdytettyä HSCT, luovuttajan NK-solut ovat suuria efektorisolujen tehtävänä on valvoa jäljellä syöpäsoluja [7]. Siirteen-versus-kasvain (GVT) aktiivisuus luovuttajan NK-solujen on merkittävästi parantunut, kun Kirs ja MHC-luokan I ovat ristiriidassa luovuttajan ja vastaanottajan välillä, kuten estävä signaalit ovat poissa [8], [9]. Siksi lisääntynyt GVT aktiivisuus NK-solujen kanssa KIR-MHC yhteensopimattomuudesta on pohjana olevia periaatteita kehittämiseksi allogeenisen NK soluterapian.

allogeeninen NK soluterapia, NK-solut terveiden luovuttajien valmistetaan

ex vivo

laajennus ja aktivointi, ja annetaan sitten syöpäpotilaille [10]. Allogeeninen NK-solut terveiden luovuttajien ovat parempia autologisia NK-solujen syöpäpotilaista, jotka tulevat toiminnallisesti heikentynyt aikana syövän etenemistä [11], [12]. Lisäksi antituumoritehoon allogeenisten NK-solujen on parannettava luovuttaja-vastaanottaja yhteensopimattomuus Kirs ja MHC-luokan I ligandien [13].

Jotta sallittaisiin terapeuttiseen allogeenisten NK solujen hoitopaikassa riittävä määrä korkeasti rikastetun NK-solut on saatu. Erilaisia ​​menetelmiä

ex vivo

NK-solujen kasvua, joka kliinisen laadun on raportoitu [14]. Vaikka NK-solut erottuvat napanuoran verestä [15], tai NK-92-solujen [16] on käytetty terapiassa, perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC: t) kerättiin kokoverta tai leukafereesiin hyödynnetään yleisesti lähteistä NK-solujen [17], [18]. Koska etu aseptisten kokoelma suljetussa järjestelmässä, PBMC kokoelman leukafereesejä on yleisesti käytetty hyvän valmistustavan (GMP) -yhteensopiva laajennus NK-solujen [14]. Yleinen paisuttaminen Allogeenisiin sovellus alkaa kahdella peräkkäiset vaiheet magneettisten ehtymiseen CD3

+ T-solujen ja rikastaminen CD56

+ NK-solujen [19] – [21]. Jotta stimuloida NK-solujen lisääntymistä, säteilytettyjä syöttösoluja kuten PBMC [19], Epstein-Barrin virus-transformoitujen lymfoblastoidisolulinjat (EBV-LCL) [20] tai rakennettua leukemiasolulinjoilla [21] käytetään usein. Säteilytetyt tukisoluja stimuloida NK-solujen kautta sekä humoraalisia tekijöitä ja suora solusta soluun kontakti [22].

Tässä tutkimuksessa olemme perustaneet tehokkaan ja yksinkertaisen menetelmän laajamittaista kasvua ja aktivointi NK soluja terveillä vapaaehtoisilla GMP-olosuhteissa. Sen jälkeen, kun yhden vaiheen, jossa magneettinen vähenemistä CD3

+ T-solut, köyhdytettyä PBMC: t stimuloitiin ja laajennettiin säteilytettyjen autologisten PBMC: n läsnä ollessa OKT3 ja IL-2: 14 päivää, mikä johtaa erittäin puhtaan populaation CD3

-CD16

+, CD56

+ NK-solujen, joka halutaan allogeenistä tarkoitukseen. Nämä solut osoittivat voimakasta sytotoksisuutta tuumorisoluja vastaan ​​

in vitro

, säästäen allogeeninen ei-kasvainsoluja. Ne valvotaan tehokkaasti syövän etenemisen SCID hiirimallissa ihmisen lymfooma. Yhdessä allogeenisten NK-soluja tehokkaasti laajennettiin GMP-yhteensopiva laitos ja osoittivat voimakas antituumorivaikutus sekä

in vitro

ja

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki tutkittavat näytteet saatiin hankintaa seuraavan tutkimuksen osallistujien kirjallinen lupa, mukaisesti Helsingin julistuksen. Tämä tutkimus protokolla tarkasteli ja hyväksynyt Institutional Review Board of Seoul National University Hospital (Luvan numero: H-1004-027-315).

NK-solun valmistelu ja laajentaminen

PBMC eristettiin terveiltä luovuttajilta leukafereesin. CD3

+ T-solut vähenevät VarioMACS (Miltenyi Biotec, Saksa). T-solu-köyhdytettyä PBMC laajentui kylvö pitoisuutena 2 x 10

5 solua /ml Cellgro SCGM seerumivapaassa väliaineessa (CellGenix, Saksa) 1% auto-plasma, 1 x 10

6 solua /ml säteilytettyjä (2000 rad) autologisia PBMC: itä, 10 ng /ml anti-CD3-monoklonaalinen vasta-aine OKT3 (Orthoclon, Sveitsi) ja 500 IU /ml IL-2 (Proleukin, Sveitsi) on a-350N kulttuuri pussi (Nipro, Japani). OKT3 täydennettiin vain kerran alussa laajennus stimuloida T-solupopulaatio säteilytettyjen tukisolujen. NK-solut ruokittiin tuoreella kasvualustalla, 500 IU /ml IL-2 kahden päivän välein ilman poisto ennestään viljelyalustaa ylläpitää solujen pitoisuus 1~2 x 10

6 solua /ml 14 päivää. Elinkelpoisuuden laajennettu NK-solujen arvioitiin värjäämällä propidiumjodidia. NK solujen laajennus suoritettiin olosuhteissa GMP Green Cross LabCell Corp. (Korea).

Ihmisen solulinjat

K562, Jurkat, SW480, Ramos ja Raji-solut saatiin American Tyyppi Culture Collection (ATCC). SNU398 solut saatiin Korean Cell Line Bank (KCLB). Soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (GIBCO), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (GIBCO). Kaikkia solulinjoja pidettiin logaritmisessa kasvuvaiheessa 37 ° C: ssa kosteutetussa atmosfäärissä, johon on lisätty 5% CO

2.

Immunovärjäys ja virtaussytometria-analyysi

NK-solut värjättiin sopivia monoklonaalisia vasta-aineita seuraavasti: anti-CD56-PE-Cy5 (B159), anti-CD3-FITC (UCHT1), anti-NKp30-PE (P30-15), anti-NKp44-PE (P44-8.1), anti- NKp46-PE (9E2 /NKp46), anti-DNAM-1-PE (DX11), anti-CD25-PE (M-A251), anti-CD158b-FITC (CH-L) (kaikki BD Biosciences), anti- NKG2A-PE (131411), anti-NKG2C-PE (134591), anti-NKG2D-PE (149810), anti-CD69-PE (298614) (kaikki R eBioscience). Näytteet hankittiin BD FACS Canto II tai LSR Fortessa ja tulokset analysoitiin käyttämällä FlowJo ohjelmistoa (TreeStar Inc., OR).

51Cr-release sytotoksisuusmääritys

Tavallisella 4 h

51Cr-release sytotoksisuusmääritys suoritettiin. Kohdesoluja leimattiin 100 uCi

51Cr natriumkromaattia (BMS), ja inkuboitiin NK-solujen kolmella eri E:T suhdeluvut U-pohjaisen 96-kuoppalevyille (Nunc, Tanska). Spontaani vapautuminen ja enintään vapautuminen määritettiin inkuboimalla kohdesoluja ilman efektoreja väliaineessa yksin tai 4% Triton X-100, vastaavasti. Määritys suoritettiin kolmena kappaleena. Radioaktiivisuus laskettiin gamma-laskurilla, sekä prosenttiosuus spesifinen lyysi määritettiin seuraavan kaavan mukaan:% spesifistä liukenemista = [(keskimääräinen kokeellinen cpm release keskiarvo spontaani cpm vapautuminen) /(keskiarvo maksimaalinen cpm vapautuminen keskiarvo spontaani cpm release)] × 100. Salpaamiskokeita varten, NK-soluja esi-inkuboitiin 10 ug /ml anti-hiiri-IgG1κ (MOPC-21, BD Biosciences), 10 ug /ml anti-DNAM-1 (DX11, BD Biosciences), 2 ug /ml anti- NKG2D (149810; R BioLegend) tai 10 ug /ml anti-NKp44 (P44-8, BioLegend) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja

51Cr-release koe suoritettiin vastaan ​​SW480 ja SNU398 klo E:T suhteessa 10:01. Esto tappamisen laskettiin prosentteina inhibition isotyypin kontrollivasta-ainetta.

virtaussytometrinen sytotoksisuusmääritys

sytotoksisuus laajennettu NK-solujen allogeenisiä PBMC: arvioitiin virtaussytometrianalyysillä sytotoksisuusmääritys. K562 kasvainkohdesoluja leimattiin 100 nM kalseiini-AM: n (Molecular Probes, Eugene, OR), ja allogeenisiä tai autologisia PBMC-kohdesoluja leimattiin anti-HLA-luokan I laajennettu NK-solujen, jotka on merkitty K562 kohdesoluja, ja leimattu PBMC- kohdesoluja viljeltiin yhdessä on suhde 03:01:01 2 tuntia. Kuolleet solut värjättiin 7-AAD (BD Biosciences). Prosenttiosuus spesifinen lyysi määritettiin seuraavan kaavan mukaan:% spesifistä liukenemista = (keskiarvo% 7-AAD

+ solut kuopissa, joissa NK yhteisviljelmä) – (keskimäärin% 7-AAD

+ värjätään solut kuoppiin tavoite vain) B

in vivo

tutkimuksessa SCID-hiirissä

CB-17-Prkdc

SCID-hiirten (Animal Resources Centre, Australia) käytettiin 7 viikon ikäisiä. SCID-hiiriä sijoitettu mikroisolaattorihäkkeihin häkeissä, ja kaikki ruoan, veden, ja vuodevaatteet autoklavoitiin ennen käyttöä. Laajennettu NK-solut leimattiin 5 uM CFSE (Sigma), ja 2 x 10

7 CFSE-leimattuja soluja injektoitiin suonensisäisesti kunkin hiiren. Hiiret lopetettiin 2, 24, 48, 72 ja 168 tuntia yleisanestesiassa. Yksisolususpensiot valmistettiin tärkeimpien elinten, kuten keuhkoissa, pernassa, perifeerisen veren, maksan, imusolmukkeet, luuydin, munuaiset, munasarjat, kivekset ja aivot. Prosenttiosuus CFSE

+ solut analysoitiin lymphogating virtaussytometrisellä analyysit yksisolususpensioi- valmistusnumerosta näytteistä. Arvioida antituumoriteholla paisutettua NK-solujen, CB-17-Prkdc

scid-hiiriin ruiskutettiin laskimonsisäisesti häntälaskimoon 1 x 10

5 Raji-soluja ja 1 x 10

7 laajennettu NK-solujen 400 ui PBS: ää päivänä 0. Kolme lisäannos laajennetun NK-solujen (1 x 10

7cells /hiiri) annettiin yhdeksän päivää. Monoklonaalinen anti-CD20-vasta-ainetta, rituksimabia (0,01 ug /hiiri) injektoitiin ihonalaisesti aikaan ensimmäisen annon laajennetun NK-solujen. Yksittäiset hiiriä seurattiin päivittäin kasvaimeen liittyvien sairastuvuutta ja kuolleisuutta. Erityisesti epänormaali asento takaraajojen johtuvat kyvyttömyydestä laajentaa takaraajojen todettiin. Kun hiiriä näkyvissä merkkejä kasvaimeen liittyvien sairastuvuus kuten liiallinen laihtuminen, uneliaisuus ja /tai ahdistusta, ne lopetettiin mukaan institutionaalisten eläinten hoito ohjeita. Yleinen indusoitiin lihakseen 100 mg /kg ketamiinia (Yuhan, Korea) ja 12,5 mg /kg ksylatsiinia (Rompun®, Bayer). Animal sijoitukseen, käsittelyyn, ja kaikki toimenpiteet, joissa hiiret hyväksynyt toimielinkomitea Mogam Biotechnology Research Institute (Luvan numero: MG-10-111A), ja kaikki kokeet suoritettiin mukaisesti kansallisen ohjeen säännellään eläinten hoito Koreassa.

tilastollinen

parittomia Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan sytotoksisuuteen ja sytokiinien erityksen NK-solujen ennen ja jälkeen laajentumista. Pariksi Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan pintamarkkerin ilmentymisen NK-solujen ennen ja jälkeen laajentumista. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen GraphPad Prism ohjelmistoa (GraphPad Software Inc., CA).

Tulokset

Ominaisuudet laajamittainen, GMP-laajennettu NK-solujen

Tässä tutkimus, me tehokkaasti laajennettu NK-solujen terveiltä luovuttajilta viljelemällä T-solu-köyhdytettyä PBMC ja säteilytettyjen autologisten PBMC: n läsnä ollessa IL-2 ja OKT3 14 päivää GMP-yhteensopiva laitokseen. Päivänä 14, tuotteet, nimeltään MG4101, kuului erittäin rikastettua CD3

-CD56

+ (98,10 ± 0,88%) tai CD56

+ CD16

+ (97,43 ± 1,66%) NK-solut pienellä saastumisen CD3

+ T-solut (0,06 ± 0,14%), CD14

+ monosyyteissä (0,09 ± 0,14%) tai CD19

+ B-solujen (0,04 ± 0,07%) (Fig. 1A-B ). Kasvatuksen aikana, NK-solut laajennettiin 691,4 ± 170,2 kertaiseksi (Fig. 1 C) kanssa 95,2 ± 1,9% elinkelpoisuutta (Fig. 1 D). Sytotoksisuusmäärityksiin vastaan ​​eri kasvainsoluja, laajennettu NK-solujen kohdistama kohonnut sytolyyttinen aktiivisuus verrattuna juuri eristettyjä NK-solut (Fig. 1 E). Voimakas aktiivisuus laajennettu NK-solujen osoitettiin myös degranulaatio markkeri CD107a, ja IFN-γ: n ja TNF-α aikana yhteisviljelmä K562-solut (Fig. 1 F).

(A-B) T- soluköyhiä PBMC laajennettiin GMP olosuhteissa kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Prosenttiosuus CD3

-CD56

+, CD56

+ CD16

+, CD3

+, CD14

+ ja CD19

+ solut analysoitiin virtaussytometrialla rianalyysit ( B, n = 8). Edustavia FACS pistekuvioita esitetään (A). (C) Kansi laajennus NK-solujen määritettiin ennen (D0) ja sen jälkeen (D14) NK-solujen laajentamiseen (n = 8). (D) elinkelpoisuus laajennettu NK-solujen arvioitiin värjäämällä propidiumjodidia. (E) Sytotoksisuus NK-solujen vastaan ​​eri tuumorisoluja verrattiin ennen (D0) ja sen jälkeen (D14) NK-solujen laajentamiseen (n = 4). Effector:target suhde oli 10:01. (F) NK-solut viljellään K562 solujen 1:01 suhde 4 h, ja värjäys solunsisäisen sytokiinien (IFN-γ: n ja TNF-α) ja CD107a suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tiedot verrattiin ennen (D0) ja jälkeen (D14) laajennus. Mean ja SD esitetään. *

p

0,05; **

p

0,01; ***

p

0,001.

Expression NK-solun reseptorien laajamittaista, GMP-laajennettu NK-solujen

Surface ilmentymisen aktivoimiseksi tai estävän NK-reseptoreihin analysoitiin ennen ja jälkeen laajamittaista kasvua. Joukossa aktivoivat reseptoreita, NKG2C, NKp30 ja NKp44 huomattavasti laajentumisen aikana, kun NKG2D, NKp46 ja DNAM-1 ei (Fig. 2A). Expression of estävää reseptorien NKG2A ja KIR pysyivät tammi upon kulttuuriaan mittasuhteet CD158a

+ b

+ e

+, CD158a

+ e

+ ja CD158b

+ e

+ NK-solut vähenivät (Fig. 2B). Aktivointi tila NK-solujen arvioitiin värjäämällä CD25, CD62L ja CD69, jotka kaikki havaittiin lisätään pinnalla laajennetun NK-solujen (Fig. 2C). Expression kemokiinireseptoreiden kuten CXCR3 ja CXCR4 arvioitiin myös. Taajuus CXCR4

+ NK-solujen määrä oli lisääntynyt aikana NK-solujen laajenemisen taas taajuus CXCR3

+ NK-solujen ei muuttunut (Fig. 2D).

Surface ilmaus aktivoimaan reseptoreita (A ), inhiboiva reseptorit (B), aktivaatiomarkkereiden (C) ja kemokiinireseptorien (D) analysoitiin virtaussytometrialla ennen (D0) ja sen jälkeen (D14) NK-solujen laajentamiseen (n = 10~12). Yksittäiset tai -parin Kirs (CD158a, CD158b tai CD158e) laskettiin Boolen portit käyttämällä FlowJo ohjelmistoa (B). *

p

0,05; **

p

0,01; ***

p

0,001.

Sytotoksinen vaikutus erilaisia ​​kasvainsolulinjoja

Seuraavaksi sytotoksinen aktiivisuus laajennetun NK-solujen populaation arvioitiin. Eri kasvainsolulinjoja näkyvissä eriasteisesti herkkyys laajennetun NK-solujen (kuvio. 3A). Tämän ymmärtämiseksi monipuolinen alttius, ilmaus ligandeja NK-reseptoreihin analysoitiin tuumorisolulinjoissa. Niistä analysoitiin ilmaisun, tärkeimmät ligandit olivat HLA-luokan I NKG2D ligandeja; ULBP-1, ULBP-2 ja MIC-A /B ja DNAM-1 ligandeja; CD112 (Nectin-2) ja CD155 (Necl5). Kaikkein herkin, K562, ilmaistuna NKG2D ligandeja, mutta ei KIR ligandi, HLA-luokan I (Fig. 3B). Jurkat, SW480 ja SNU398 solut ilmensivät paitsi NKG2D ligandeja, mutta myös HLA-luokan I ja olivat kohtalaisen herkkiä laajentunut NK-solujen. NK-herkkä kohdesoluja (K562, Jurkat, SW480 ja SNU398) taipumus over-express CD112 ja CD155 verrattuna NK-resistenttejä kohdesoluja (Ramos, Raji ja PBMC: t). Huomattavaa on, että NK-solut eivät tappaa allogeenisten PBMC, joka ilmaisi HLA-luokan I ilman NKG2D ja DNAM-1 ligandien (Fig. 3A ja B).

(A) Sytotoksisuus paisutettua NK-solujen vastaan ​​eri tuumorisolulinjoissa analysoitiin

51Cr-release assay, jossa on valittu effector:target (E:T) suhde kolmena kappaleena. Sytotoksisuus vastaan ​​normaali PBMC analysoitiin myös. Testi suoritettiin kaksi kertaa laajennetun NK-solujen eri luovuttajilta, ja edustavia tietoja esitettiin. Kukin kuvaaja edustaa keskiarvo ± SD. (B) Expression of HLA-luokan I, ULBP-1, ULBP-2, MIC-A /B, CD112 ja CD155 analysoitiin virtaussytometrialla erilaisissa kasvainsolulinjoissa ja normaalin PBMC: t (yhtenäiset viivat). Harmaa histogrammit esittävät isotyyppikontrolleja. (C) Laajennettu NK-soluja esi-inkuboitiin estäviä vasta-aineita varten DNAM-1, NKG2D, NKp30 ja /tai NKp44, ja sytotoksisuus analysoitiin vastaan ​​SW480 tai SNU398 soluja

51Cr-release assay kolmena kappaleena. E:T suhde oli 10:01. Inhibitioprosentti sytotoksisuuden laskettiin prosentteina inhibition isotyypin kontrollivasta-ainetta. Testi suoritettiin kaksi kertaa laajennetun NK-solujen eri luovuttajilta, ja edustavia tiedot esitetään. Kukin pylväsdiagrammi edustaa keskiarvoa + SD.

arvioimiseksi rooli aktivoivat NK-reseptoreihin, joka on sytotoksisuusmääritys laajennettu NK-solujen suoritettiin, kun läsnä oli estää spesifisiä vasta-aineita NKG2D, DNAM-1, NKp30 ja NKp44. Estäen samalla yhden reseptorin yksin vaikuttavat hieman sytotoksisuutta, estämällä useita reseptorit johtanut huomattavaan vähenemiseen sytotoksisuuteen. Erityisesti, estää kaikki neljä reseptorien inhiboi sytotoksisuutta yli 85% (Fig. 3C). Näin ollen, sytotoksisuutta laajennetun NK-solujen populaation on synergistisesti kasvanut samanaikaisen aktivaation läpi useita aktivoimalla NK-reseptoreihin.

puuttuminen sytotoksinen vaikutus allogeenisten ei-kasvainsoluja

kliininen käyttö laajentunut NK-soluja jotka eivät liity terveiltä luovuttajilta voi aiheuttaa toksisuutta takia sytotoksinen vaikutus allogeenisten transformoimattomien vastaanottajan soluja. Arvioitava mahdollisuudet sytotoksisuus normaaleja vastaanottajan soluja, laajennettu NK-soluja viljellään samanaikaisesti K562 kasvainsoluja ja normaaleja allogeenisten PBMC sekä sytotoksisuutta vastaavat maalit arvioitiin. Sytotoksisuutta vastaan ​​allogeenisten PBMC: n havaittiin olevan vähäinen (0,43 ± 0,27%) (Fig. 4A) ja verrattavissa sytotoksisuus autologisen PBMC: t (0,40 ± 0,40%) (Fig. 4B). Tämä vähäinen sytotoksisuus ei vaikuta läsnäolo tai puuttuminen K562 syöpäsoluja. Samaan aikaan, laajennettu NK-soluja tehokkaasti tapettu K562 kasvainsoluja riippumatta läsnä allogeenisen tai autologisen PBMC: (Fig. 4A-B). Siksi laajennettu NK-soluja tehokkaasti syrjitty syöpäsolujen allogeenisten normaalista PBMC ja valikoivasti tappoi transformoituja soluja. Kasvain-spesifisen sytotoksisuuden tappamatta allogeenisten kuin kasvainsoluihin meille mahdollisuuden soveltaa laajentunut NK-solut ulkopuoliselta terve luovuttajien allogeenisen ympäristössä.

valikoiva sytotoksisuutta laajennetun NK-solujen vastaan ​​sekoitettu tavoitteet normaalia PBMC ja K562-solut analysoitiin virtaussytomet- sytotoksisuusanalyysin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. K562 kasvainkohdesoluja leimattiin kalseiini-AM, ja joko allogeeninen (A) tai autologisia (B) PBMC-kohdesoluja leimattiin anti-HLA-luokan I laajennettu NK-soluissa, leimattu K562 kohdesoluja, ja leimattu PBMC- kohdesoluja viljeltiin yhdessä on suhde 03:01:01 2 tuntia. Kuolleet solut värjättiin 7-AAD, ja spesifisen hajotuksen prosenttiosuus laskettiin. Sytotoksisuus vastaan ​​PBMC (vasen kunkin paneelin) ja K562-solut (oikea kunkin paneelin) on esitetty erikseen. Määritys suoritettiin päällekkäisiä. Kukin pylväsdiagrammi edustaa keskimääräistä + SD.

In vivo

antituumorivaikutuksen laajennettujen NK-solujen SCID-hiirissä

in vivo

tutkimus laajeni NK-solujen, me annettiin CFSE leimatun laajensi ihmisen NK solujen SCID ja seurataan kinetiikasta niiden jakelua. Merkityt NK-solujen ilmestyi ensimmäisen kerran vuonna keuhkoihin, missä he asuivat 48 tuntia, sitten vähitellen katosi (Kuva. 5A). Pernassa, perifeerisen veren ja maksan, taajuus annetaan NK-solut saavuttivat huippunsa 48 tuntia ja sitten vähitellen laski (Fig. 5A). Luuytimessä, imusolmukkeet, aivot, munuaiset, munasarjat ja kivekset, infusoitu CFSE

+ NK-solut minimaalisesti havaita (≤1.1%) (taulukko S1). Kaikki NK-annettuna hiirillä näytti terveen samanlainen kuin kontrolliryhmän aikana tutkimuksen.

(A) CFSE-leimattua NK-solut (2 x 10

7 solua /hiiri) injektoitiin suonensisäisesti SCID-hiiriin. Hiiret lopetettiin 2, 24, 48, 72 ja 168 h, ja prosenttiosuus CFSE

+ solujen keuhkoissa, pernassa, perifeerisen veren ja maksan analysoitiin lymphogating virtaussytometrialla (n = 4). Kukin kuvaaja edustaa keskiarvo ± SEM. (B-C) SCID-hiiriin injektoitiin suonensisäisesti häntälaskimoon 1 x 10

5 Raji-soluja ja 1 x 10

7 laajennettu NK-solujen 400 ul: aan PBS: ää päivänä 0 (n = 10 /ryhmä) . Kolme lisäannos laajennetun NK-solujen (1 x 10

7cells /hiiri) annettiin yhdeksän päivää. Monoklonaalinen anti-CD20-vasta-ainetta, rituksimabia (0,01 ug /hiiri) injektoitiin ihonalaisesti aikaan ensimmäisen annon laajennetun NK-solujen. Kasvaimeen liittyvä halvaus (B) ja eloonjääminen (C) seurattiin. Teho Testi vahvisti ylimääräinen kokeen käyttämällä 10 hiirtä kussakin ryhmässä, ja edustava joukko tiedot esitetään.

Seuraavaksi antituumorivaikutuksen paisutettua NK-solujen tarkasteltiin SCID-hiiriin injektoitiin suonensisäisesti Raji ihmisen B-solulymfooma-soluja. Sairastuvuuden arvioitiin takajalan jalan halvaus, koska Raji-soluja on selkäytimen tropismista, ja kuolleisuus määritettiin. Anto laajennetaan ihmisen NK-solujen merkittävästi kumottu syövän etenemiseen, mikä näkyy vähentynyt sairastuvuus (Fig. 5B) ja kuolleisuutta (kuvio. 5C). Teho laajennetun ihmisen NK-solujen entisestään samanaikainen anto pieniannoksisen rituksimabi (0,01 ug /hiiri), kun taas sama annos rituksimabia ilman NK-solujen ei parantunut sairaus lopputulokseen. Tämä annos rituksimabia pidetään erittäin alhainen, ja on verrattavissa 1 /25.000 normaali annos ihmisellä [29]. Yhteenvetona voidaan todeta, laajennettu NK-soluja osoitti

in vivo

kasvaimen vastaisen aktiivisuuden hiiren tuumorin malli, ja lisäksi kasvain-spesifistä vasta-ainetta paransi merkittävästi niiden tehokkuutta, oletettavasti käynnistää vasta-aineesta riippuvainen soluvälitteinen sytotoksisuus (ADCC).

keskustelu

Syöpä immunoterapioiden ovat käyttäneet useita erilaisia ​​immuunijärjestelmän soluja, mukaan lukien dendriittisolut (DC), sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL), lymfokiiniaktivoiduiksi tappaja (LAK) soluihin, sytokiinien aiheuttaman killer (CIK) solujen ja NK-solujen [23] – [26]. Vaikka tilanne on viime aikoina edistymistä.Ehdotus DC terapiassa ja CTL hoito, kliininen sovellus on hieman rajoitettu, koska syöpäantigeenejä on ensin ominaista [23], [24]. Sen sijaan, LAK-solut, CIK solut ja NK-solut ovat antigeeniä riippumaton sytolyyttinen aktiivisuus kasvainsoluja vastaan. Usein, LAK-solut tai CIK soluja valmistetaan syöpäpotilaista ja autologously antamisen jälkeen

ex vivo

manipulointia [25], [26]. Siinä tapauksessa, NK-solujen, sekä allogeenisen että autologisen NK-soluja voidaan käyttää syövän hoidossa. Aiemmat työt ovat osoittaneet, että allogeeninen NK-solut voidaan turvallisesti antaa syöpäpotilaille [10]. Allogeeninen NK soluterapia on erityisen hyödyllistä, koska se lisää syövän tehoa NK-solujen kautta induktion luovuttajan ja vastaanottajan välinen yhteensopimattomuus Kirs luovuttajien NK-solujen ja MHC-luokan I ligandeina Vastaanottajaa kudoksissa [13].

aiemmissa tutkimuksissa, erilaisia ​​menetelmiä

ex vivo

NK-solujen laajentamiseen on kehitetty kliiniseen käyttöön [14]. PBMC: t kerättiin leukafereesi käytetään usein yleisenä lähteenä NK-solujen, joka on etu aseptista kokoelma suljetussa järjestelmässä [14]. Yleinen paisuttaminen Allogeenisiin sovellus alkaa kahdella peräkkäiset vaiheet magneettisten ehtymiseen CD3

+ T-solujen ja rikastaminen CD56

+ NK-solujen [19] – [21]. Esillä olevassa tutkimuksessa vain yksi askel magneettisia ehtymiseen CD3

+ T-solujen tyytyväinen tuotteen laadun suhteen puhtauden ja elinkelpoisuuden. On day14, lopullinen tuote koostuu erittäin puhtaasta CD3

-CD56

+ NK-solut (98,10 ± 0,88%) pienellä saastumisen CD3

+ T-solut (0,06 ± 0,14%), CD14

+ monosyyteissä (0,09 ± 0,14%) tai CD19

+ B-solujen (0,04 ± 0,07%). Niistä T-solu-köyhdytettyä PBMC, NK-solut selektiivisesti laajennettiin taas muut solut, kuten B-solujen ja monosyyttien tuli minimaalisesti havaittavissa. Jotta allogeenisen kliinisissä sovelluksissa, T-solujen vähenemistä lopputuotteessa halutaan välttää Käänteishyljintä [10].

aiemmissa tutkimuksissa, erilaisia ​​yrityksiä pyrittiin stimuloida NK-solujen proliferaatiota säteilytettyjen syöttösoluja kuten PBMC, EBV-LCL tai rakennettua leukemiasolulinjoilla [19] – [21]. Esillä oleva menetelmä sisältää säteilytettyä autologista PBMC: t toimitetaan OKT3 alussa laajennus. OKT3-stimuloitujen T-solujen joukossa säteilytettyjä syöttösoluja voi stimuloida NK-solujen proliferaation sekä humoraalisia tekijöitä ja suora solu-solu-kontakti. Lisätutkimukset ovat tutkittavana selventää toiminnallista roolia syöttösoluja.

Tässä tutkimuksessa, laajennettu NK-solut osoittivat vahvaa sytokiinien tuotannon ja voimakas sytolyyttinen vaikutus erilaisia ​​syöpäsolulinjoja verrattuna vastaeristettyjä NK-soluja. Nämä solut yli-ilmentävät NKG2C, NKp30, NKp44, ja aktivointi markkereita kuten CD25, CD62L ja CD69. Huomattavaa on, että laajennettu NK-solut valikoivasti tappoi syöpäsoluja sytotoksisuutta allogeenista ei-kasvainsoluihin in yhteisviljelmä määrityksissä. Tämä suunnattu sytotoksinen aktiivisuus laajeni NK-solujen ehdotti, että allogeeninen soveltaminen laajeni NK solujen syöpäpotilaille olisi turvallista. Mitään merkittäviä sivuvaikutuksia on havaittu jatkuvan faasin I tutkimuksessa käyttämällä laajentanut allogeenisten NK-solut (www.clinicaltrial.gov; NCT 01212341).

valvomiseksi kinetiikkaan

in vivo

jakelu, me annettiin CFSE leimatun laajensi ihmisen NK solujen SCID hiiriin. Merkityt NK-solujen ilmestyi ensimmäisen kerran vuonna keuhkoihin, missä he asuivat 48 tuntia, sitten vähitellen katosi (Kuva. 5A). Pernassa, perifeerisen veren ja maksan, taajuus annetaan NK-solut saavuttivat huippunsa 48 tuntia ja sitten vähitellen laski (Fig. 5A).