Krooninen sairaus

tiivistelmä

estäjät Wnt signalointi on osoitettu olevan osallisena eturauhassyöpä (PC) etäpesäke; kuitenkin rooli Sclerostin (Sost) ei ole vielä tutkittu. Tässä osoitamme, että kohonnut Wnt signalointi johdettu Sost puutteellinen osteoblastien edistää PC invaasio, kun taas rhSOST on estävää vaikutusta. Sen sijaan, rhDKK1 edistää PC venymä ja filopodia muodostumista, morfologiset muutokset ominaisuus invasiivisen fenotyypin. Lisäksi rhDKK1 todettiin aktivoida kanoninen Wnt signalointia PC3-soluissa, mikä viittaa siihen, että SOST ja DKK1 ovat vastakkaiset roolit Wnt signalointia tässä yhteydessä. Geeniekspressioanalyysiä PC3-soluja viljeltiin yhdessä OB, joilla on vaihtelevia määriä Wnt signaloinnin tunnistettu CRIM1 yhtenä transkriptien ilmentyminen lisääntyy mukaisesti erittäin invasiivinen olosuhteissa. Löysimme CRIM1 yliekspression myös edistää solujen invaasiota. Nämä havainnot viittaavat siihen, että luusta peräisin Wnt signalointi voi parantaa tietokoneen tropismista edistämällä CRIM1 ilmaisua ja helpottaa syöpäsoluinvaasiota ja kiinnittyminen luuhun. Olemme päätellä, että SOST ja DKK1 on vastakkainen vaikutus PC3 soluinvaasiota ja että luusta peräisin Wnt signalointia positiivisesti edistää invasiivisia fenotyypit PC3-solujen aktivoimalla CRIM1 ilmaisua ja helpottaa PC-OB fyysinen vuorovaikutus. Sinänsä tutkimme vaikutuksia korkeat pitoisuudet SOST

in vivo

. Olemme havainneet, että PC3-soluja, jotka yli-ilmentävät SOST injektoitiin häntälaskimoon NSG hiiret eivät helposti etäispesäkkeitä, ja niitä injektoitiin intrafemorally oli alentanut merkittävästi osteolyysiä, mikä viittaa siihen, että kohdistaminen molekyyli- luun ympäristö voi vaikuttaa luun metastaattisen ennusteen kliinisissä.

Citation: Hudson BD, Hum NR, Thomas CB, Kohlgruber A, Sebastian A, Collette NM, et al. (2015) SOST Estää Eturauhassyöpä Invasion. PLoS ONE 10 (11): e0142058. doi: 10,1371 /journal.pone.0142058

Toimittaja: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 21. 2015 Hyväksytty 17. lokakuuta 2015 Julkaistu: 06 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Hudson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Microarray tietoja julkisesti saatavilla NCBI by hakunumero GSE56582.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institute of Health Grant nro DK075730 ja P41MI03483 Lawrence Livermore National Laboratory Grant No. LDRD-10-ERD-020. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PC) on yleisimmin diagnosoitu syöpä ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien miesten Yhdysvalloissa. Jos havaitaan varhaisessa vaiheessa ennuste on varsin suotuisa; kuitenkin, aggressiiviset muodot metastaattisen PC leviää pääasiassa luuranko [1]. Luukasvaimet aiheuttaa suurta kipua, edistää murtumia, ja lopulta muodostavat pääsyy sairastavuuden potilailla, jotka kärsivät kehittynyt PC, jossa on 70% ilmaantuvuus dokumentoitu ruumiinavauksia [2]. Useimmat potilaat, joilla on edennyt PC kokee merkittäviä komplikaatioita luuetäpesäkkeistä ominaista sekoitus osteoblastien ja osteolyyttisiä vaurioita, jossa osteoblastisolulinjaa komponentti useimmiten hallitsee. On oletettu, että luu microenvironment on merkittävä tekijä PC metastaattisen prosessin kautta eritystä paracrine tekijöitä jotka kiinnostavat, moduloivat, säilyttää ja edistää leviämisen PC solujen luuta. Siksi osaa paikallista luun mikroympäristössä on tärkeää tietää ymmärtääkseen mahdollisia keinoja muodostumisen estämiseksi toissijaisten luukasvaimet PC potilailla [3].

Wnt signalointia on osoitettu olevan monia tärkeitä rooleja alkionkehityksen aikana, urut ja kudosten homeostaasin, ja luun biologiassa. Aktivointi Wnt /β-kateniinin signalointi tapahtuu sitoutumisen Wnt-ligandien 7-transmembraanidomeeni ulottuu frizzled-reseptori yhdessä LDL-reseptoriin liittyvä proteiini 5 ja 6 (LRP5: stä /6) co-reseptoreihin. Solunsisäiset generoidaan kautta proteiini monimutkainen, joka sisältää epäsiisti, ak- siini ja Frat-1, joka häiritä GSK3 riippuvan proteiinikompleksi, joka normaalisti estää β-kateniinin toiminto kohdistamalla sen hajoamista. Stabiloidut β-kateniinin sitten vapautuu tumaan, jossa se on vuorovaikutuksessa muiden transkription aktivaattoreita, kuten T-solu tekijä /lymfaattisen tehostajana sitova tekijä (TCF /LEF) transkription aktivoimiseksi. Sitoutuminen β-kateniinin myöhemmin syrjäyttää transkription yhteistyötä repressors sitoutuneen TCF /LEF ja rekrytoi transkription yhteistyössä aktivaattorit kuten p300 ja cAMP vaste-elementti sitova proteiini [P300 /CBP]) [4]. Wnt signalointia säädeltyä. Yksi taso säätö saavutetaan vuorovaikutuksen kautta erittyvien estäjien kanssa ligandeja tai reseptoreita estää ligandi-reseptori-vuorovaikutuksen. Ligandi esto proteiineihin kuuluvat Wnt estävä tekijä 1 (WIF1) ja erittävät frizzled-sukuiset proteiinit (SFRP). Samaan aikaan, reseptorin esto saavutetaan antamalla jäsenten sclerostin (SOST) ja Dickkopf (DKK) perheet [4, 5], pääasiassa sitoutumalla LRP5: stä /6 co-reseptoreihin.

Wnt toimintahäiriö on liitetty eri luuston dysplasia ja rappeuttavia sairauksia. Esimerkiksi tappiota ja saada-funktion mutaatiot LRP5: stä aiheuttaa joko pieni tai suuri luumassa [6, 7] ja inaktivaation SOST aiheuttaa kaksi hyperosteoses häiriöt: sclerosteosis [8, 9] ja van Buchemin tauti [10, 11]. Menetys-of-function mutaation LRP6 liittyy perinnöllinen sairaus ominaista osteoporoosi, sepelvaltimotauti, ja metabolinen oireyhtymä [12]. Lisäksi mutaatiot solunsisäinen säädin β-kateniinin vakautta, WTX, aiheuttaa osteopathia striata kraniaalisen skleroosi [13, 14], ja mutaatioita Wnt co-reseptorin, FZD9, aiheuttaa Williams-Beuren, oireyhtymä osittain tunnusomaista alhainen luun tiheys [15]. Lisäksi useat genomin laajuinen yhdistys tutkimuksissa on todettu polymorfismit Wnt-signalointi liittyvien geenien liittyvät muutokset luun mineraalitiheys [16-18]. Siten jopa hienoisia muutoksia intensiteetti, amplitudi ja kesto Wnt signalointi voi häiritä luuston kehitykseen, luun, ja luun uusiutumista.

Aberrant Wnt signalointia on myös yleisesti havaittu syöpä ja merkitys tämän reitin johtuu ensimmäisen huomion, että kasvain vaimennin adenomatoottisen polypoosin coli (APC) downregulates β-kateniinin. Vaikka lakkaa toimimasta mutaatioiden Wnt-signalointireitin geenit ovat yhteisiä useille syövistä [19], aktivointi Wnt signalointia kertyy ydin- β-kateniinin on myös dokumentoitu PC [5, 20]. Lisäksi aktivaattorit Wnt signalointi on erittäin sekaantuneet invasiivisia potentiaalia metastaattinen: Wnt5a [21], Wnt3a [22] ja Wnt11 [23] kaikilla on osoitettu muuttavan syövän invaasio ja muuttoliike. Inhibiittorit Wnt signalointia myös on tutkittu paljon. Frzb (PC [24], fibrosarkooma [25]) ja WIF1 (PC [26] ja virtsarakon syöpä [27]), jotka moduloivat Wnt signalointia sitoutumalla suoraan Wnt-ligandien, ovat molemmat tunnettuja inhibiittoreita syövän invaasio ja siirtoa. Pisimmälle tutkittu (ja kiistanalainen) vaikutus Wnt signaloinnin estäjä syövän invaasio /metastaattinen potentiaali on, että reseptori-sitovan proteiinin, DKK1. DKK1 on osoitettu lisäävän invasiivisia potentiaalia ruokatorven syöpä [28] ja DKK1 vasta-aineita on käytetty kliinisesti kohteena passiivisessa immunoterapiassa [29]. Kuitenkin DKK1 on myös osoitettu estävän hyökkäyksen ja muuttoliike paksusuolensyöpä [30], rintasyövän [31], ja PC3-solut [32], mikä osoittaa monimutkaisuutta tutkimalla tämän järjestelmän

in vitro

. Mielenkiintoista, vaikutus SOST syövän invaasio /etäpesäkkeitä ei ole koskaan tutkittu. Siksi nykyisessä paperin olemme keskittyneet roolista SOST PC hyökkäystä. Erityisesti tutkimme vaikutuksia osteoblastien johdettujen Wnt signalointia PC selvittää, onko suora toiminta osteoblastien tarvitaan modulointiin PC käyttäytymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

Kaikki eläin työ hyväksyttiin Lawrence Livermore National Laboratory (LLNL) IACUC komitea. LLNL on AAALAC MBA.

Sost

KO

ja

LRP5: stä

KO

kuvattu aikaisemmin [33, 34]. KO ja C57BL /6J (WT) hiiriä asutettiin standardiolosuhteissa ja kaikki eläinkokeet mukaisesti toteutettiin NIH suuntaviivat eläinten käyttöön hyväksyttyjen IACUC protokollien jonka Lawrence Livermore National Laboratory.

Solulinjat ja transfektio ehdot

PC3, DU145, C4-2Bm, LNCaP saatiin ATCC: stä viljeltiin DMEM; HPrEC saatiin Lifeline Cell Technology ja viljeltiin Lifeline n ProstaLife Medium. Ekspressioplasmidien (pCMV-DKK1, pCMV-SOST, pCMV-CRIM1) muodostettiin korvaamalla reportteri geeni pmKate2-N (Evrogen, Moskova, Venäjä) kanssa täyspitkän cDNA (kuva kloonien 3508222, 40009485, 8322423). Vakaa PC3 transfektiosta pCMV-DKK1, pCMV-SOST, pmKate2-vektori suoritettiin käyttämällä Fugene 6 (Promega Corp., Madison, Wi). Kohti valmistajan ohjeiden; positiiviset kloonit varmistettiin qPCR tai fluoresenssi. Hiiri ensisijainen osteoblasteihin (OB) kerättiin entsymaattisesti calvaria 4-5 päivän ikäisten pentujen samanlainen Bellows et al. 1986 [35]. Leikataan calvaria vapaa luukalvon pestiin peräkkäin pilkottiin 5x 37 ° C: ssa 4 ml: ssa kollagenaasin liuosta (kollagenaasi 1, 0,625 mg /ml; kollagenaasi B, 1,875 mg /ml; CaCl

2, 25 mM; in DDH

20 jäillä) sekoitettiin 1: 2,5 media-liuosta (DMEM /F-12, 0,1% BSA, 25 mM Hepes, 37 ° C), ja fraktiot 2-5 kerättiin. Eristetty OB viljeltiin DMEM /F-12, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 1% pen /strep.

Kanoninen Wnt signalointia määrityksessä

TOPFlash (0,9 ug) Wnt reportteriplasmidilla (M50 Super 8x TOPFlash ) ja Renilla lusiferaasin ohjaus plasmidia (0,1 ug) (RLTK) transfektoitiin käyttäen 3 ui Fugene HD (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN) mukaan valmistajan protokollaa. 24 tunnin kuluttua, median viljelmät vaihdettiin tuoreeseen media tai median täydennetty rekombinanttiproteiini. Co-viljelmistä eristetty mouse osteoblastien viljelty 3 um huokosia insertit (BD Falcon, kissa # 3181) otettiin myös käyttöön PC3 soluihin tällä hetkellä. Lusiferaasiaktiivisuudet sekä Super 8x TOPFlash ja RLTK toimittajat mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Assay Kit (Promega Corp.).

Co-kulttuuri invaasiomääritys

Invasion analyysit suoritettiin käyttäen modifioitua Boyden kammion (BD biotieteiden). Matrigel (BD biotieteiden) laimennettiin 1: 2,5 jääkylmällä DMEM (seerumitonta) ja 100 pl siirrettiin ylempään kammiossa 8 um huokoskoko insert (BD Falcon, kissa # 3182) ja annetaan jähmettyä inkubaattorissa 2 h 37 ° C: ssa. PC-solut maljattiin insertit klo 2.5X10

4, ja OB 12-kuoppalevyille 5×10

4; Solujen annettiin siemeniä. Jälkeen 4h inkuboimalla seerumittomassa alustassa, insertit siirrettiin 12-kuoppalevylle, joka sisälsi OBt. Solut laskettiin 20X Zeiss mikroskoopilla sen jälkeen, kun 48 tuntia. DU145, C4-2Bm, LNCaP ja HPrEC solut laskettiin seuraavan värjäytymisen 1% Crystal Violet (Sigma) (30 min), jota seurasi PBS pesua. Invasion tutkimukset suoritettiin käyttäen kasvutekijöitä [rhSOST (R rhDKK1 (R TGF (R PTH (R AGCATAACCCTCGATCAGAACA (rev) CRIM 1 alukkeiden].

mikrosirut

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit, mukaan valmistajan ohjeita (QIAGEN). Näytteitä biotiinileimattua ja hybridisoitiin on Human Genome U133 Plus 2.0 oligonukleotidisirujen (PC3) mukaan valmistajan suositusten (Affymetrix, Santa Clara, CA. USA). Data-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [36].

Immunovärjäys ja aktiinivärjäyksen

Immunofluoresoivat ja phalloidin-TRITC värjäys suoritettiin solujen kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan ja tehtiin läpäiseviksi 0,1 % Triton X-100: ssa 5 min [anti-CRIM1 (HPA000556, Sigma) 1: 100; anti-Active-β-kateniinin (05-665, Millipore) 1: 1000]. Värjäytyä F-aktiini, soluja inkuboitiin 50 ug /ml phalloidin-TRITC (Sigma) 40 min. Imaging tehtiin Leica DM50000B ja Zeiss LSM 510 Meta konfokaalimikroskoopit. Enimmäisintensiteetti ennusteet kootaan ImageJ (NCBI).

Pyyhkäisyelektronimikroskooppeja-mikroskopia

PC3-solut (1×10

5) ympättiin 13 mm lasipeitinlevyille, viljeltiin sitten 48 tuntia seerumista vapaan median kanssa tai ilman rekombinanttiproteiinia. Sitten solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja käsitellään kuten aikaisemmin on kuvattu [37].

Vieraslajisiirteen

PC3,

PC3

DKK1

ja

PC3

SOST

solua injektoitiin häntälaskimoon (IV) tai intrafemorally (IF), kuten aiemmin on kuvattu [38]. NSG (NOD.Cg-

Prkdc

scid

Il2rg

tm1Wjl Twitter /SzJ) hiirtä sai PC soluja IV (1×10

6) tapettiin 10 viikkoa injektion jälkeen ja kudoksia (keuhko-, luu-, sydän, maksa, munuainen, perna, ja aivot) kerättiin ja tutkittiin läsnäolo mikro-kasvaimia. Hiiret, jotka saivat PC-solujen IF (1×10

5) tapettiin 4 viikon injektion jälkeen, reisiluut leikeltiin (N = 6), röntgenkuvattiin ja luun tilavuutta proksimaalisen puoli kunkin reisiluun kvantifioitiin mikro-lasketaan tomografia (μCT 35, SCANCO, Bruttisellen, Sveitsi: energia 55 kVp, intensiteetti 114 mA, integrointiaika 900 ms, 10 pm nimellinen vokseli koko).

tilastollinen analyysi

Merkittäviä eroja koetettiin käyttäen ANOVA ja pariksi t-testiä.

Post hoc

vertailut tehtiin käyttämällä Tukeyn [39]. Todennäköisyys arvot 0,05 otettiin merkittävä. Todennäköisyys arvot kuvioissa vastaavat *

p

0,05; **

p

0,01; ***

p

0,001.

Tulokset ja keskustelu

SOST estää eturauhassyövän invasiivisuus

vaikutusten tutkiminen Wnt estäjän Sclerostin (Sost ) on invasiivisia potentiaalia PC soluja, me viljellä PC3 solut yhdistelmä SOST (rhSOST) ja mitataan niiden invasiivisuus osaksi Matrigel (kuvio 1A) suhteessa Wnt3a [32], lisäkilpirauhasen liittyvä proteiini (PTHrP) [40], ja muuntaminen kasvutekijä beeta (TGFP) [41, 42], käsiteltiin PC3s. Tutkimme myös Wnt antagonisti DKK1, jonka tiedetään joko edistää tai estää syövän invaasio [28, 32, 43] on kontekstisidonnaisia ​​tavalla. Wnt3a, PTHrP ja TGFp lisääntynyt PC3 invasiivisia potentiaalia ~ 3-kertaiseksi (kuvio 1 B) ja DKK1 lisääntyi hyökkäystä 7-kertaisesti suhteessa PC3 yksin ja 3,5-kertaisesti suhteessa Wnt3a (kuva 1 B ja 1I). Sen sijaan rhSOST esti PC3 soluinvaasiota by ~ 8-kertaiseksi (kuvio 1 B ja 1J). Lisääntynyt invasiivisuus seuraavat WNT3a ja DKK1 inkubointi oli yhdenmukainen kaikissa kolmessa PC-solulinjojen tutkitaan [(1) erittäin invasiivisia osteolyyttisiä vaurion indusoiva PC3; (2) erittäin invasiivisia osteoblastisolulinjaa vaurion aiheuttavia DU-145; (3) invasiivisia sekoitettu fenotyyppi C4-2Bm eturauhassyöpäsolulinjoissa]. Lisäksi rhSOST estivät merkittävästi invasiivisen potentiaalia PC3-solujen ja tylpät Wnt3a-välitteisen invasiivisuuden DU145 ja C4-2Bm-soluissa (kuvio 1C).

, kaavamainen esitys invaasiomääritys. B, invasiivisia potentiaali PC3-soluissa 48 tunnin rinnakkaisviljelemällä rekombinanttiproteiineja. C, vaikutus rWNT3a, rDKK1 ja rSOST on hyökkäys PC3, DU145, ja C4-2Bm. D-E, annos-vaste-käyrä PC3-solujen rSOST tai rDKK1. F-G, Annosvastekäyrät PC3 soluinvaasion, kun joko rDKK1 tai rSOST pidettiin vakiona ja toinen on asteittain kasvanut. H-K, edustavat kuvat PC3-mKate soluissa yhdessä viljelyolosuhteissa. Tulokset ilmaistaan ​​kertainen muutos ± SEM. * P 0,5, ** P 0,1, *** P 0,01.

Määritä rhSOST annosvaste ja valikoimia kilpaileva esto me altistuvat PC3 solut kasvavia pitoisuuksia rhSOST ja rhDKK1 ja mitataan invaasio. Kasvavia pitoisuuksia rhSOST johti annoksesta riippuva väheneminen invaasio, joilla on merkittävää inhibitiota esiintyy niinkin alhainen kuin 2,5 ng /ml ja kylläisyyttä 25 ng /ml (kuvio 1 D). Samoin, rhDKK1 myös muuttaa hyökkäyksen annoksesta riippuvaisella tavalla; maksimaalinen invasiivisuus havaittiin 50 ng /ml (kuvio 1 E). Sen tutkimiseksi, onko rhSOST voi moduloida rhDKK1 aiheuttama invasiivisuus yhteisrahoittaisimme viljeltiin PC3-solujen 100 ng /ml rhDKK1 yhdessä kasvavia määriä rhSOST. Tämä data osoitti, että rhSOST pilaa rhDKK1 aiheuttama hyökkäys edes pieninä annoksina (kuvio 1 F). Low-end rhSOST pitoisuuksia käytettiin sisällä odotettua fysiologisella alueella seerumin SOST tasolla [44]. Sen sijaan lisäämällä rhDKK1 pitoisuus oli vain pystyi voittamaan rhSOST inhibitiota pitoisuuksina 200 ng /ml (kuvio 1G), viittaa siihen, että SOST on erittäin voimakas estäjä PC3 hyökkäystä. Nämä rhSOST estäviä vaikutuksia myös visualisoida viljelmissä PC3 ilmentävät solut punainen fluoresoiva proteiini, pmKate2 (kuvio 1J ja 1K), jossa rhSOST dramaattisesti estetty DKK1 välittämää PC3 invaasiota (kuvio 1 I ja 1K).

PC3-soluissa viljeltiin yhdessä

Sost

KO

osteoblastien osoittavat lisääntynyt invasiivisuus

Seuraavaksi tutkittiin, ensisijainen osteoblasteihin (OB) eritasoisia Wnt toiminta voisi moduloida PC3 invaasio . Näitä kokeita, osteoblastien eristettiin calvaria on

Sost

Knockout (KO) (OB

SostKO

),

LRP5: stä

KO (OB

Lrp5KO

) tai C57BL /6N verrokkihiirten (OB

WT

) olivat yhdessä viljeltiin ilman fyysistä kosketusta PC3-soluissa (kuvio 2A) ja invaasio arvioitiin sekä määrällisesti ja visuaalisesti. Yhdenmukaisia ​​aiempien tulosten, OB

WT

yhdessä viljelemisen indusoi 2-kertainen nousu PC3 hyökkäystä. OBt puuttuu

Sost

kasvoi PC3 hyökkäystä 6-kertaiseksi, kun taas OBt puuttuu

LRP5: stä

reseptorin kumottu em vähenee invaasio tasolle PC3 Monoviljelmiä. Nämä tulokset osoittavat, että alhainen OB-johdettu Wnt signalointi yksinään riittää tylppä kykyä OB

WT

edistää PC3 hyökkäystä,

in vitro

(kuvio 2B-2F). Samanlaisia ​​PC3 soluihin, DU145 ja C4-2Bm soluja myös suosi OB

WT

microenvironment ja helpommin tunkeutunut osaksi Matrigel kun viljeltiin yhdessä OB

SostKO

( kuvio 2G ja 2H). Lisäksi OB

Lrp5KO

esti invasiivisuus on C4-2Bm, mutta vain hieman pyöristettyjä invasiivisuus on DU145 soluja, mikä viittaa siihen, että osana tämän yhteistyön kulttuuri invasiivista potentiaalia DU145 soluja ei saa täysin luottaa Wnt signalointi ja voi käyttää muita molekyyli- väyliä (kuvio 2G ja 2H). Kumpikaan suhteellisen ei-invasiivisia LNCaP-solulinjasta imusuonten etäpesäke peräisin eikä eturauhasen epiteelisolujen (HPrEC) esiintyi rinnakkaisviljelemällä OBt (kuvio 2 I ja 2J). Nämä tiedot osoittavat, että osteophilic PC solulinjat ovat helposti moduloidaan luun mikroympäristössä, ja että pienet muutokset määrä OB-johdettujen Wnt signalointi voi muuttaa niiden invasiivisia potentiaali,

in vitro

. Sen sijaan, LNCaP-solut, jotka eivät ole helposti etäispesäkkeitä luun ei vaikuta moduloidun tasot Wnt signaloinnin viereisen osteoblastien, viittaa siihen, että eturauhassyövän etäpesäkkeiden luun edellyttää molemminpuolista vasteen edistää luun syövän vuorovaikutusta.

A, kaavamainen esitys, joka esittää OBt kasvatettu pohjalle kammioon. B, invasiivisia potentiaali PC3-solujen kohti ohjaus OB, OB koholla Wnt signalointia, ja OB puuttuu Wnt signalointia. C-F, edustavat kuvat PC3-mKate soluissa yhdessä viljelyolosuhteissa. G-J, invasiivisia potentiaali Eturauhassyövän soluja erilaisilla osteolyyttisiä potentiaalia kohti kunkin OB. Tulokset ilmaistaan ​​kertainen muutos ± SEM. * P 0,5, ** P 0,1, *** P 0,01.

rhDKK1 aktivoi Wnt signalointia PC3-soluissa

DKK1 ja SOST ovat tunnettuja estäjiä Wnt signaloinnin luu [45], mutta niillä on vastakkaiset vaikutukset PC invaasio (kuvio 1 B). Me tutkimme seuraavaksi tilasta Wnt signalointia tässä yhteistyössä kulttuurin invaasio malli. TopFlash toimittaja ilmentävät erittyvän Luciferase transfektoitiin PC3 soluihin (PC3

CLucTF

). Wnt3a parannettu suhteellinen luminesenssi annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (S1 Kuva). Co-kulttuuri PC3

CLucTF

kanssa OB

WT

tai OB

SostKO

huomattavasti reportteriaktiivisuutta, vaikutus estää rhSOST ( kuvio 3A). Rinnakkaisviljelemällä OB

LRP5KO

ei ollut merkittävää vaikutusta Wnt signalointia. Nämä tiedot viittaavat siihen, että PC-solut voivat tukeutua Wnt signalointia aktiivisuutta ympäröivään luuhun miljöö ja lasku tai nousu Wnt signalointia luussa voi olla syvällisiä vaikutuksia Wnt signalointia toimintaa lähialueiden /hyökkääviä syöpäsoluja. Vaikka aluksi rhDKK1 hoito tukahdutettu Wnt reportteriaktiivisuutta, se lisäsi merkittävästi PC3

CLucTF

lusiferaasivaikutusta 24 tunnin kuluttua rhDKK1 hallinnon ja myöhempinä ajankohtina (kuvio 3B).

, TopFlash toimittaja lusiferaasianalyysissä PC3-soluissa viljeltiin yhdessä OBt. B, TopFlash toimittaja määritystä PC3-soluja viljeltiin yhdessä DKK1. C-J, aktivoitu β-kateniinin (ABC) immunohistokemia PC3 soluja useita ehtoja; vihreä (ABC), sininen (DAPI). Tulokset ilmaistaan ​​kertainen muutos ± SEM. * P 0,5, ** P 0,1, *** P 0,01.

vahvistavan mekanismeja rhDKK1 Wnt agonistivaikutus on TopFlash reportterisiirtogeenillä, tutkimme seuraavaksi tasoja aktivoitua β kateniinin (ABC) PC3-soluissa 48 tunnin co-kulttuuri, kautta immunosytokemian. PC3-solut yksinään ilmaistuna vähäisiä ABC (kuvio 3C). Anto rhWnt3a tehostetun ABC signaaliin sekä sytoplasmassa ja tumassa PC3-soluissa (kuvio 3D) ja tämä vaikutus oli tuntuva inhiboitui rhSOST samanaikainen (kuvio 3E). Yhdenmukainen PC3

CLucTF

tiedot, rhDKK1 lisääntynyt ABC PC3-soluissa (kuvio 3F). PC3-solut viljeltiin yhdessä OB

WT

lisääntyi myös ABC tasoja (kuvio 3G), vaikutus voimakkaasti parannettu OB

SostKO

co-viljelmät (kuvio 3H) ja vähentynyt OB

LrpKO

co-viljelmät (Kuva 3I). Lisäksi samanaikainen Sekä Wnt3A ja DKK1 että PC3 soluihin johti hyper aktivointi ABC osajoukko PC3-solujen, mikä viittaa synergistiseen ja additiivinen vaikutus aktivointi kanoninen Wnt signalointia näissä soluissa. Nämä tulokset korostavat luun microenvironment on hyökkääviä syöpäsolujen, ja kyky luusta peräisin Wnt signalointia aktivoida Wnt signalointia näissä soluissa. Korrelaatio korkea DKK1 tasojen ja lisääntynyt β-kateniinin tasoilla on sopusoinnussa aikaisempien tietojen kanssa, joissa potilaasta peräisin kasvaimiin koholla DKK1, β-kateniinin tai molemmilla oli olivat todennäköisemmin olla huono maksasolukarsinoomat ennusteen [46].

Filopodia muodostuminen lisääntyy DKK1 ja CRIM1 käsiteltyjä soluja

Todettuaan, että Sost puutosta OB tai OB käsitelty rhDKK1 lisätä PC3 invasiivisuus me tutkia edelleen jaetun molekyylitason muutoksia näiden samanaikaisesti viljellyt PC3-solujen avulla transkriptio analyysi. Vertasimme geeniekspression muutoksia PC3-soluissa viljeltiin yhdessä (1) OB

SostKO

, (2) OB

WT

+ rhDKK1, ja (3) OB

WT

+ rhSOST (kuvio 4A). Löysimme 132 voimistunut geenejä ja 30 vaimentua geenejä sekä OB

SostKO

ja OB

WT

+ rhDKK1 viljeltiin yhdessä PC3-solujen (S1 taulukko). Näistä selostukset 21 oli voimistunut ja 25 vaimentua OB

WT

+ rhSOST PC3 co-viljelmät (S2 taulukko). Ilmen- tymisen lisääntymisen transkriptien erittäin invasiivisia PC3-soluja rikastettiin molekyylejä, joiden on osoitettu olevan osallisena säätelyssä solussa kunnossa, solujen vaeltaminen /motiliteettia, ja soluadheesion. Voimistunut geenit sisältyvät:

sept7

[47],

myo10

[48],

PKP4

[49],

cnn3

[50],

Fgfr2

[51], ja

crim1

[52] (Kuva 4B). Erityisen kiinnostavia, kysteiinirikas liikehermosolusairaudet proteiinia 1 tai Crim1 on single-pass (tyyppi 1) transmembraani- proteiini, joka on äskettäin osoitettu kompleksin β-kateniinin ja kadheriineja. Crim1 lakkaa toimimasta kokeiluja

Xenopus

paljasti Crim1 olevan kriittinen solu-soluadheesion aikana hermoston kehittymistä [52]. Kohonneita β-kateniinin (kuvio 3H) mukana kohonneet Crim1 (S1 taulukko) yhteistyössä viljellyissä PC3-soluissa johti meidät oletuksen, että Crim1 voi voimistuvan luusta peräisin Wnt signalointia ja se voidaan mukana edistämässä soluinvaasiota ja tai soluadheesiota.

, mikrosiru analyysit PC3-solujen viljeltiin yhdessä OB

SostKO

, OB

WT

+ rhDKK1, ja OB

WT

+ rhSOST verrattuna monokulttuurien; overlay edustus ilmen- tymisen lisääntymisen (vihreä) ja vaimentua (punainen) geenejä. B, edustava luettelo voimistunut selostukset. C, edustavat kuvat CRIM1 proteiinin ilmentymisen modulaatiota rhDKK1 ja rhSOST; vihreä (CRIM1), sininen (DAPI). Tulokset ilmaistaan ​​kertainen muutos ± SEM. * P 0,5, ** P 0,1, *** P 0,01. D, PC3 transfektoitu CMV-Crim1 ekspressiovektoriin olivat merkitsevästi invasiivisia sitten PC3-solut (

p

-arvo 0,006).

Voit selvittää CRIM1 proteiinin ilmentymistä moduloidaan rhDKK1 ja rhSOST, sopusoinnussa geeniekspression data, me määrällisesti suhteellisen fluoresenssin voimakkuus CRIM1 PC3 käsitelty solu rhDKK1 ja rhSOST. Löysimme rhDKK1 käsiteltyjen solujen olevan 20% kirkkaampi [0,345 (PC3 + ​​hrDKK1) vs 0,285 (PC3) keskifluoresenssi /solu] kun rhSOST käsitelty PC3 solut olivat 85% himmennin [0,038 (PC3 + ​​hrSOST) vs 0,285 (PC3) keskifluoresenssi /solu] kuin käsittelemätön PC3-soluissa (kuvio 4C). Lisäksi yli-ilmentyminen CRIM1 proteiini [ 12 kertainen yliekspressio määritettynä qPCR], PC3 transfektoitu CMV-Crim1 rakennettu osoitti merkittävää kasvua invaasio (

p

-arvo = 0,006), että transwell määrityksessä (kuvio 4D).

tutkimiseksi, voitaisiinko DKK1 ja CRIM1 päälle syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden liittyvät aktiinisäikeiden, tarkastelimme morfologisia muutoksia PC3-soluissa käsitelty rhDKK1 ja rhSOST.

PC3

soluja käsiteltiin DKK1 olivat pitkänomainen, näytetään fibroblastin kaltaisen morfologia paljon enemmän filopodia ennusteet verrattuna joko käsittelemättömään tai rhSOST käsiteltiin PC3-soluja (kuvio 5A-5C), jotka olivat pyöristetty ja oli vähemmän filopodia. Lisäksi sekä käsittelemätöntä ja rhSOST käsiteltiin PC3-solujen noudatetaan vähemmän voimakkaasti muovin pintaan ja yleensä olleet kokkareista yhdessä muodostavat aggregaatteja. Morfologiset ulkonäkö oli yhdenmukainen taustalla tukirangan organisaation phalloidin värjäys osoitti parannettu aktiini organisaatio rhDKK1 ja rhWNT3A käsiteltiin PC3-solut, suhteessa PC3 ja rhSOST käsiteltyjä soluja (kuvio 5D-5H). Vastaavasti eksogeenisen lisäämällä eritetyn muodon CRIM1 edistää myös muodostumista lamellipodioihin ja filopodia, kuten visualisoitiin phalloidin-värjättiin aktiini PC3-soluissa, joita käsiteltiin CRIM1. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että sekä DKK1 ja CRIM1 edistää filopodia muodostumista erittäin invasiivisia PC3-soluissa ja että tämä prosessi liittyy uudelleenjärjestely aktiinisäikeiden.

AC, edustaja Pyyhkäisyelektronimikroskooppilla (1500X) PC3 käsiteltyjen solujen rhDKK1 (b, b), tai rhSOST (C, c). D-H, immunofluoresenssi PC3-soluja käsiteltiin rhDKK1 (E), rhSOST (F), rhCRIM1 (G) ja rhWNT3A (H); anti-CRIM1 (vihreä) ja rodamiinikonjugoitu phalloidin (sininen).

SOST yliekspressio estää etäpesäkkeiden ja pilaa osteolyysiä

Voit selvittää SOST vaikutusten etäpesäke, NSG hiiret me injektoitiin suonensisäisesti PC3, PC3

DKK1

tai PC3

SOST

ja kudokset tutkittiin kasvaimien esiintymisen 10 viikkoa injektion jälkeen. Suonensisäinen toimitus PC3-solujen johti 80% kasvain korko (8/10 hiiret) keuhkojen ja munuaisten on yleisin sivustoja etäpesäke. PC3

DKK1

solujen käyttäytyivät hyvin samanlainen PC3 soluihin, kun taas PC3

SOST

: itä hiirillä oli merkitsevästi alhaisempi etäpesäkkeitä, vain 1/9 hiiriä (perna) näkyviä makroskooppinen etäpesäke 10-viikkoa injektion (taulukko 1). Nämä tiedot osoittivat, että SOST inhiboivan vaikutuksen Wnt signalointia vähentää merkittävästi PC3 invaasio ja etäpesäkkeiden,

in vivo

. Seuraavaksi tutkittiin, yliekspressio

SOST

PC3-soluissa vähentää osteolyyttisiä kasvainten muodostumista. Kymmenen NSG hiirtä per ryhmä sai 5×10

5 PC3, PC3

DKK1

tai PC3

SOST

soluja intrafemorally. Neljä viikkoa injektion luun tilavuus kvantifioitiin käyttäen mikro-CT. Vaikka kaikki kolme ryhmää osoitti luukatoa ja vaurioita etäisessä, jossa neula työnnettiin toimittamaan syöpäsoluja, skannaa osoitti dramaattisen luukatoa että reisiluun kaulan PC3 ja PC3

DKK1

, mutta huomattavasti vähemmän luukatoa PC3

SOST

pistetään reisiluu (Kuva 6A-6C). Arvioida luukato erot johtuvat osteolyysin me vähennetään luun tilavuus PC pistetään reisiluun contralateral injektoimattomat reisi ja löysi PC3

SOST solujen aiheuttamaan huomattavasti vähemmän luukatoa kuin PC3 tai PC3

DKK1

. Nämä havainnot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen SOST PC3-soluissa pilaa osteolyysiä ja vähentää kasvaimen muodostumista korko.

edustaja reisiluun mikro-TT päässä

PC3

(A),

PC3

DKK1

(B) ja

PC3

SOST

(C) ruiskutettiin NSG hiiriä (N = 6 /ryhmä). Bone tilavuus määrällisesti sekä PC pistetään ja injektoimattomat kontralateraalista reisiluut, ja suhteellinen luukato johtuu osteolyysiä laskettiin kullekin ryhmälle vähentämällä pistetään (L) päässä injektoimattomat (R) (D).

PC

SOST

pistetään reisiluu kokivat merkitsevästi vähemmän luukatoa johtuen kehittyneen osteolyyttisiä leesioita (* p 0,05).

Keskustelu

tässä raportissa tarkasteltiin molekyylitason mekanismeja moduloidaan Wnt signalointi, jotka voivat vaikuttaa hyvin dokumentoituja korkea tropismi eturauhassyövän luuhun aikana etäpesäke. Oletimme, että luu johdettu Wnt signalointia laukaisee geenin ilmentymisen muutoksia syöpäsolut, joka parantaa heidän kiinnitys ja itseohjautuva luun sekä edistää luun syöpäsairauksia. Tämän hypoteesin testaamiseksi, otimme esiin PC solut Wnt antagonistien DKK1 ja SOST, ja todettu DKK1 edistämiseksi, ja SOST estävän PC hyökkäystä. Lisäksi osteoblastien eristää

Sost

hiirten oli voimakas positiivinen vaikutus PC invaasio; vaikutus, joka on dramaattisesti tasapäiseksi lisäämällä rekombinantti SOST proteiinia.