Krooninen sairaus

tiivistelmä

DNA metyylitransferaasi inhibiittorit atsasytidiini ja decitabine edustavat arkkityyppinen lääkkeitä epigenetic syövän hoidossa. Luonnehtia demetyloiva aktiivisuutta atsasytidiini ja decitabine käsittelimme paksusuolen syövän ja leukemiasoluista molempien lääkkeiden ja käytetyn array-pohjainen DNA metyloituvuutta yli 14.000 geenin promoottorit. Lisäksi lääkkeen aiheuttama demetylaatio verrattiin metylaation of isogeenisen koolonkarsinoomasoluissa puuttuu molemmat DNA metyylitransferaasi 1 (DNMT1) ja DNMT3B. Osoitamme, että lääkkeen aiheuttama demetylaatio kuviot ovat erittäin spesifisiä, ei-satunnainen ja toistettavissa, mikä osoittaa kohdennettua remetylaatiossa erityisiä loci jälkeen replikointi. Vastaavasti, olemme huomanneet, että CG-dinukleotidien sisällä CG saaret tuli edullisesti remethylated, osoittaa rooli DNA-sekvenssin yhteydessä. Havaitsimme myös osajoukko geenien, joita ei koskaan demetelyloitiin lääkehoitoa joko paksusuolensyöpä tai leukemiasolulinjoilla. Nämä demetylaatio vastustuskykyisiä geenejä rikastettiin Polycomb Tukahduttamistoimet Complex 2 komponentteja alkion kantasoluja ja transkriptiotekijää sitovia motiiveja ei ole läsnä demetyloitunutta geenejä. Tuloksemme antaa yksityiskohtaisia ​​oivalluksia DNA metylaation aiheuttama atsasytidiini ja decitabine ja ehdottaa osallistumista kompleksin sääntelymekanismeja in lääkkeen aiheuttama DNA demetylaation.

Citation: Hagemann S, Heil O, Łyko F, ​​Brueckner B ( 2011) atsasytidiini ja desitabiinista Pakotettava Gene-Specific ja Non-Random DNA Demetylaatio Human Cancer Cell Lines. PLoS ONE 6 (3): e17388. doi: 10,1371 /journal.pone.0017388

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 marraskuu 2010; Hyväksytty: 01 helmikuu 2011; Julkaistu: 07 maaliskuu 2011

Copyright: © 2011 Hagemann et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1463) FL (www.dfg.de). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Poikkeava DNA: n metylaatio on merkittävä tunnusmerkki syöpä [1], [2], [3]. Syöpäsoluissa, globaali hypometylaatio mukana hypermetyloitunut ja transkriptionaalisesti äänieristys tuumorisuppressorigeeneille. Nämä niin sanotut epimutations edistää menetys leviämisen ohjaus syöpäsoluissa [4], [5], [6].

ylläpito hypermetylaation aiheuttama epimutations edellyttää jatkuvaa aktiivisuutta DNA: n metyylitransferaaseja (DNMTs) solunjakautumisen aikana. Täten inhibition DNMTs on käytetty onnistuneesti epigeneettisiä syövän hoidossa kääntää epimutations ja aktivoida epigeneettiseltä äänieristys tuumorisuppressorigeeneille [7], [8], [9], [10]. Archetypal DNMT inhibiittorit 5-atsasytidiini (atsasytidiini, AZA) ja 2′-deoksi-5-atsasytidiini (decitabine, DAC) on hyväksytty hoitoon myelodysplastinen oireyhtymä, preleukeeminen luuydinsairaus. Huolimatta niiden käyttöä klinikalla ja lukuisissa prekliinisissä tutkimuksissa, tieto toimintatavan näistä lääkkeistä on vielä kesken [11].

Yksi suurimmista johdonmukaisesti havaittu solujen vaikutuksia atsasytidiini ja decitabine on DNA demetylaatio . Kuten nukleosidianalogit, AZA ja DAC sisällytetään jäljittelevän DNA, jossa ne voivat muodostaa kovalenttisidoksellisia DNMTs [12], [13], [14]. Tämä pyydystäminen DNMTs johtaa passiiviseen demetylaatio aikana DNA: n replikaation ja solunjakautumisen. Estämällä DNA: n metylaation AZA ja DAC on onnistuneesti esitellä valikoitujen loci erilaisissa kliinisissä tutkimuksissa [7], [9], [15].

Äskettäin vaikutukset AZA ja DAC on myös tutkittu päälle genomisen tasolla. Rajallisen sopivien työkalujen genominlaajuisia metylointianalyysi, nämä tutkimukset alun perin rajattu analyysi lääkkeen aiheuttama transkriptio muutoksia. Esimerkiksi geeni-ilmentymisen profilointia käytettiin analysoimaan vaikutuksia DAC geenin ilmentymisen mallia HCT116 koolonkarsinoomasoluissa ja tulokset viittaavat siihen, että sen lisäksi geenin aktivointi hypermetyloitunut geenien transkription downregulation voi olla tärkeä vaikutus DAC [16], [17]. Viime aikoina, Illumina GoldenGate matriiseja käytettiin suoraan luonnehtia lääkkeen aiheuttama DNA: ssa demetyloimalla 1505 CG-dinukleotidien edustavat 807 syöpään liittyvien geenien myelooisen leukemian soluja [11]. Kuitenkin, johtuen suhteellisen vähäinen kattavuutta array, tuloksena tietoja ei analysoitu yksityiskohtaisesti ja molekyylitason ominaisuudet DNA demetylaatio vasteita pysyi tutkittava.

Tässä tutkimuksessa käytimme genomin mittakaavassa Infinium analyysi järjestelmällisesti luonnehtia demetylaation vasteet jälkeen AZA ja DAC hoito kahdessa ihmisen syöpäsolujen linjat. Tätä varten olemme tutkineet metylaatiotasoilla yli 27000 CG dinukleotideissä edustavat yli 14000 geenejä [19] HCT116 koolonkarsinoomasoluissa ja HL-60 myelooinen leukemia soluja. Tuloksemme osoittavat, että AZA ja DAC demetyloivat CGS ei-CG saarilla tehokkaammin kuin CG saarilla (CGI). Lisäksi atsatiopriini- ja DAC johtaa ei-satunnainen ja toistettavissa DNA demetylaatio malleja HCT116 ja HL-60-solujen. Lisäksi tunnistimme osajoukko CGS joka ei ole demetyloituu jälkeen huumehoitoaloitteilla eikä solujen äärimmäisen alenemisesta DNMT1 eikä DNMT3B [20], [21]. Demetylaatio kestävät CGS liittyvät geenit valikoivasti sitoo Polycomb- Sortavat Complex 2 (PRC2) komponentit ES-soluissa ja rikastetaan transkriptiotekijän sitovat motiivit ole läsnä demetyloitunutta geenejä. Nämä tulokset purkaa malleja DNA demetylaatio AZA ja DAC ja viittaavat siihen, että lääkkeen aiheuttama demetylaation säätelee määritelty molekyylitason mekanismeja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Human HCT116 koolonkarsinoomasoluja ja HCT116 kaksoispoistuma (DKO) soluja (DNMT1 – /-, DNMT3B – /-) oli ystävällisesti toimittanut Bert Vogelstein (heinäkuu 2007), ja viljeltiin tavanomaisissa olosuhteissa McCoyn 5A-väliaine, jota oli täydennetty 5% L-glutamiinia ja 10% FCS: ää (Invitrogen). Identiteetti HCT116-solujen varmistettiin DMSZ (Braunschweig, Saksa; tammikuuta 2008) käyttäen DNA-profilointi kahdeksan lyhyt peräkkäiset toistot. HL60-solut saatiin ATCC: stä ja viljeltiin tavanomaisissa olosuhteissa RPMI (Sigma), jota oli täydennetty 5%: ista L-glutamiinia ja 10% FCS: ää (Invitrogen). Tuore alikvootit kaikista solulinjoja käytettiin kokeisiin. Analysoimaan vaikutuksia 5-atsasytidiini (AZA) ja 2′-deoksi-5-atsasytidiini (DAC), soluja viljeltiin alusta täydennettynä yhdisteiden, annettuina pitoisuuksina.

estäjät

5 mM kantaliuokset AZA (Sigma) ja DAC (Calbiochem) valmistettiin liuottamalla aineita tislattuun H

2O (GIBCO), ja niitä säilytettiin -80 ° C: ssa. Välittömästi ennen käsittelyä, kantaliuokset laimennettiin soluviljelyalustaa osoitetuissa konsentraatioissa.

Genominen DNA metylointianalyysi

Drug käsiteltyjä soluja inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla AZA ja DAC jälkeen 24 h kylvö ajan, ja genominen DNA valmistettiin käyttäen DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen). Global genomisen DNA: n metylaatio tasot määritettiin kapillaarielektroforeesilla kuten aiemmin on kuvattu [22].

Array perustuu DNA: n metylaatio analyysi

Array-pohjainen geenin-spesifisen DNA: n metylaation analyysi suoritettiin käyttäen Infinium HumanMethylation27 helmi siru teknologia (Illumina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pian, bisulfiitti käsiteltiin genominen DNA oli koko genomin vahvistetaan ja hybridisoidaan HumanMethylation27 BeadChip. Oligomeerit, liitetty kaksi erilaista helmi tyyppiä kohden kuulusteli locus, vastaa joko metyloitumattomalla tai metyloitu tila, joka mahdollistaa yhden emäksen pidennyksestä ja havaitsemiseen. Metylaatiostatuksen tietyn sytosiini on merkitty keskimääräinen beta (AVB) arvot, jos 1 vastaa koko metylaatio ja 0 ei-metylaatio. Delta beta (DB) arvot laskettiin vähentämällä AVB arvojen käsitellyt tai Knockout solujen valvonnan AVB arvoja. Biologinen näytteitä (katso kuva S2) kunkin kokeen ryhmiteltiin ja array antureilla

P

≥0.05 suljettiin pois analyysistä. Loci pisteytettiin metyloitiin jos AVB oli suurempi tai yhtä suuri kuin 0,2 [23]. Täydellinen CG metyloinnin tiedot löytyvät ArrayExpress tietokannassa (www.ebi.ac.uk/arrayexpress). Tarkempi kuvaus normalisoinnin ja edelleen laskelmat viittaavat Methods S1. Tulokset analysoitiin Illumina n BeadStudio ohjelmisto, versio 3.1.3.0 ja R, versio 2.10.0 [24]. Erityisesti seuraavat R paketit käytettiin data-analyysi: grafiikka (boxplots), tilastot (ytimen tiheys arviot ja tilastolliset analyysit), The Limma paketti [25] rakentamiseen Venn kaavioiden ja ristikko paketti [26] näytön monimuuttuja tiedot (trellis alat).

454 DNA-bisulfiitti-sekvensointi

Deep DNA bisulfiitti sekvensointi CGS 4-geenien (PIK3CG, Ells1, Aff2, NTRK3) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [27], [ ,,,0],28]. 454 sekvensointi, bisulfiitti-käsitelty genomista DNA: ta monistettiin käyttäen sekvenssi-spesifisiä alukkeita, jotka sisältävät hoitoa erityisiä viivakoodeja ja 454 linkkeri-sekvenssit (kuvio S7). 454 syvä sekvensointi suoritettiin jonka DKFZ Genomics ja proteomiikka Core Facility.

Analyysi transkriptiotekijän sidosmotiivien

Tunnistaa rikastettua transkriptiotekijän sitova motiiveja käytimme verkkotyökalu PScan [29] ja 130 transkriptiotekijän sitova profiilit (

H. sapiens

) päässä Jaspar tietokannasta [30]. Analyysi geenien keskittyi alueen -450-+50, suhteessa niiden transkription aloituskohdasta. Yhteenvetona tulokset PScan analyysin lämpökarttana näyttää luonnollisen logaritmin

P

arvot luotiin.

Tulokset

perustaminen hoidon edellytysten atsa- ja DAC indusoimaan demetylaatio vuonna HCT116-soluissa

ensimmäisenä askeleena kohti järjestelmällistä luonnehdinta demetylaation indusoimia atsasytidiini (AZA) ja decitabine (DAC), pyrittiin maksimoimaan demetylaation tehokkuus, minimoida haittavaikutusten varalta [31], [32] ja estää remetylaatiossa havaittuna pitkäaikaisessa hoidossa [33]. Tätä varten me käsiteltiin HCT116-solujen kanssa kasvaa lääkeainepitoisuudet (kuvio 1A) ja useiden ajanjaksojen ajan (kuvio 1 B) määrittää globaalin genomisen metylaatiotasoilla kapillaarielektroforeesilla. Tulokset osoittivat selvästi sekä lääkkeitä, jotka maksimi demetylaatio saavutettiin pitoisuudet 1 uM kuluttua 24-36 h DAC osoittavat 60%: n vähennys ja AZA osoittavat 50%: n vähennys globaalin DNA: n metylaatio.

Koska azanucleosides edellyttävät DNA: n kahdentuminen tehtävää varten, analysoimme onko solujen määrä S-vaiheessa saattaa vaikuttaa lääkehoitoa. HCT116-soluja käsiteltiin 0,1, 1 ja 10 uM AZA tai DAC ja solusyklin jakautuminen analysoitiin FACS: lla (fluoresenssi Acitvated Cell Sorting). Vaikka solujen osuus S-vaiheessa lisättiin 24 tunnin kuluttua hoidon 0,1-10 uM AZA tai DAC, vain enää inkubaatioajat pienensi jäljittelemään solujen useiden lääkeainepitoisuudet (kuvio S1A). Lisäksi FACS-analyysit paljasti myös, että vain korkea lääkeainepitoisuudet (10 uM) johti G2 vaiheessa pidätys, joka oli mukana väheneminen soluja G1 vaiheessa (kuvio S1B). Myös korostunut solukuolemaa havaittiin vain korkean lääkeaineen pitoisuudet, erityisesti käsittelyn jälkeen 10 uM AZA, mikä osoittaa, että AZA-käsiteltyjen solujen pysähtyi kopioida ja kuoli. Nämä havainnot vahvistivat, että demetylaatio pitäisi analysoida 24 tunnin kuluttua ja 1 uM lääkeainepitoisuuden jättää vaikuttavat sekoittavat huumeiden myrkyllisyys.

Array-pohjainen genominlaajuisia DNA metylointianalyysi

analysoida DNA metylaation of HCT116 solujen genomin laajuisesti käytimme Infinium metylaatio profilointiin kysellä metylaatiostatuksen 27578 CG dinukleotidien edustavat 14475 liittyvät geenit [11], [19]. Metylointi yksittäisten loci määritettiin keskimääräinen beeta (AVB) arvot vaihtelivat 0 (metyloitumaton) 1 (täysin metyloitu). Perustuen aiempiin tutkimuksiin [19], vain CGS joka osoitti se pienentää tai suurentaa niiden AVB arvo (delta beta, DB) on vähintään 0,2 käytettiin analysointiin metylaatiomuutokset. Biologinen rinnakkaisnäytettä HCT116 valvonnan solujen ja lääkkeellä käsiteltyihin soluihin osoitti erittäin korkea samankaltaisuus (kuvio S2A, B, C), mikä vahvistaa teknistä luotettavuutta array ja korkea spesifisyys lääkkeen aiheuttamista metylaation.

Seuraavat data-analyysi osoitti selvästi bimodaalinen jakauma CG-dinukleotidi metylaation, jolla on alhainen-metylaatio huippu (13667 ja 27571 CGS), joka löydettiin AVB arvot vaihtelevat 0-0,2 ja korkea-metylaatio huippu (8222 ja 27571), joka käsitti väliaika 0,8-1,0 (kuvio 1C). Kuten käsittelemättömissä soluissa, bimodaalinen metylointi jakelu havaittiin myös hoidon jälkeen solujen AZA ja DAC (katso kuvio 1 C). Kuitenkin, kun huumehoidon korkean metylaatio huippu (AVB≥0.8 hallitsee solua) siirrettiin alentaa metylaatio arvoja, mikä osoittaa lääkkeen aiheuttama demetylaation.

A Global metylointianalyysi (CE) on HCT116 käsiteltyjen solujen ilmoitetut pitoisuudet AZA ja DAC: ssa 24 tuntia. B Time-kurssi CE mittaus lääkkeen aiheuttamista demetylaatio käyttäen 1 uM AZA tai DAC; Co, käsittelemättömät HCT116-soluissa. C, Kernel tiheys arviot Infinium metylaation tietojen käsittelemättä (Co) ja lääkkeellä käsiteltyihin soluihin. D, validointi Infinium metylaation dataa 454 bisulfiitti sekvensointi; metylaatio tiedot 4 CG loci mitattuna joko Infinium analyysiä tai 454 sekvensoinnilla, korreloivat voimakkaasti (Pearsonin korrelaatiokerroin r = 0,84); atsatiopriini- ja DAC on merkitty A ja D, vastaavasti; Eri loci on merkitty väreillä: PIK3CG (sininen), NTRK3 (vihreä), Ells1 (punainen), ja AFF2 (musta).

validoimiseksi metylaatio array tuloksia, käytimme erittäin kvantitatiivinen 454 bisulfiitti sekvensointi [28] erittelevät neljä voimakkaasti metyloitu CGS joka tuli demetelyloitiin huume-hoidon HCT116-soluissa. Keskimäärin saimme noin 300 lukee per CG (katso kuva S7). Korrelaatio analyysi bisulfiitin sekvenointitulosten ja array tulokset (kuvio 1 D) osoitti erittäin hyvä yleinen sopimus molempien menetelmien (r = 0,84). Nämä tulokset osoittavat, että Infinium metylointi array tuottaa tarkka esitys HCT116 metylaatiokuvion meidän kokeita.

Drug aiheuttama demetylaatio kuviot ovat ei-satunnainen

lisäanalyysit array tiedot osoittivat, että hoito kanssa AZA johti demetylaatio (DB≤-0,2) 6% (852 13911), että CGS metyloitavaa ohjaus soluissa (kuvio 2A). Esittää vielä korkeampi tehokkuus, DAC indusoi demetylaation 11% (1487 ja 13911) näistä CG sivustoja (kuvio 2B). Wilcoxonin summa testi vahvisti merkitystä eroa metylaation atsa- ja DAC-käsiteltyjä soluja (kuvio 2C,

P

2 x 10

-16). Korkeampi tehokkuus DAC-välitteisen demetylaation geenissä ominainen taso on sopusoinnussa globaalin metylointianalyysi in HCT116-soluissa (kuvio 1A, B).

Metylointi muutoksia HCT116-soluissa käsiteltiin 24 h AZA (A ) tai DAC (B); sinisiä pisteitä ja numerot edustavat demetyloituu CGS (DB≤-0.2). C, Boxplots osoittavat jakelu metyloitu CGS vuonna HCT116 vertailunäytteet sekä soluja käsiteltiin AZA tai DAC; mustat viivat tarkoittavat medians lovet standardin virheitä, asetinrenkaan kvartiiliväli, ja viikset 2.5th ja 97.5th prosenttipisteet. D, Venn kaaviot osoittavat päällekkäisiä demetyloiduksi CGS huumeiden käsiteltyjä soluja.

Perustuen havaintoon, että demetylaation kuviot näyttivät olevan yllättävän erityinen korkean välisten rinnakkaisia ​​toistettavuus, mietimme onko molemmat lääkeaineet yleisesti demetyloitunut CG dinukleotideja. Tunnistaa yleisesti demetyloituu CGS me ryhmitelty AZA ja DAC jäljittelee vastaavasti ja löysi huomattavaa päällekkäisyyttä CGS jotka demetelyloitiin molempien lääkkeiden (kuvio 2D). Tämä päällekkäisyys oli merkittävästi suurempi kuin odotettua satunnaisotannalla demetylaation (

P

2 x 10

-16, Fisherin eksakti testi), mikä osoittaa, että tietty lokuksen ensisijassa demetelyloitiin AZA ja DAC. Huolimatta laajasta demetyloiva aktiivisuutta AZA ja DAC, huomattava määrä CG dinukleotidien ilmestyi vastustuskykyisiä lääkkeen aiheuttamista demetylaatio in HCT116-soluissa (kuvio 2A, B).

Resistance lääkkeen aiheuttamalle demetylaatio on enimmäkseen voitettu DNMT1 ; DNMT3B kaksinkertainen tyrmäys solujen

edelleen karakterisoimiseksi CGS vastustuskykyisiä lääkkeen aiheuttamista demetylaatio saimme metylaatio profiileja HCT116 solujen voimakkaasti alenemisesta DNMT1 ja täydellinen menetys DNMT3B (DKO solut). Tietojen analysointi paljasti korostunut demetylointi DKO soluissa yli 85% metyloitua CGS on demetyloituu (kuvio 3A). DKO solut osoittivat myös suurimmassa määrin demetylaation edustaa mediaani DB arvot alle -0,55 suhteessa kontrolliin soluihin (kuvio 3B). Vertailun vuoksi havaitsimme merkittävästi (

P

2 x 10

-16, Wilcoxonin sum test) alemman asteen demetylaatio varten AZA ja DAC (kuvio 3B).

, DKO solut merkittäviä eroja HCT116 soluja niiden metylaatiokuvion; sinisiä pisteitä ja luvut edustavat demetyloituu tai hypermetyloitunut CGS (DB≤-0,2 tai ≥0.2). B, Boxplots esittävät demetylaation (DB) huumeisiin käsiteltyjen HCT16 solut ja DKO soluja; mustat viivat tarkoittavat medians lovet standardin virheitä, asetinrenkaan kvartiiliväli, ja viikset 2.5th ja 97.5th prosenttipisteet. C, vertailu suhteellisen keskimääräisen metylaation huumeiden käsiteltyjä soluja ja DKO solujen määritettynä maailmanlaajuinen genomista metylointianalyysi (CE) ja Infinium metylointianalyysi. D, Venn kaaviot osoittavat päällekkäistä demetyloiduksi CGS välillä lääkkeellä käsiteltyihin soluihin ja DKO soluja.

vieressä verrattuna keskimääräiseen metylaatio taso geenin liittyvän CGS johdettu Infinium array maailmanlaajuista metylaatio mitattuna kapillaarielektroforeettisesti (CE) (kuvio 3C). Lisäksi Infinium metylointianalyysi, CE myös kyselee CGS toistuvia elementtejä, jotka muodostavat enemmistön metyloitua DNA: ta ihmisen genomissa [34]. Mielenkiintoista on, että aste demetylaatiota koko genomi-DNA oli aina korkeampi kuin geenispesifistä demetylaatio. Tämä viittaa siihen, että CGS toistuvia elementtejä tuli tehokkaammin demetyloituneiksi kuin geenin liittyvän CGS. Kun verrataan demetylaation huumeiden käsitellyn ja Knockout solulinjojen, huomasimme, että 92%: n CGS demetelyloitiin AZA ja 90% CGS demetelyloitiin DAC myös demetyloida DKO soluissa (kuvio 3D). Kuitenkin meidän tulokset osoittavat, että lääkkeen aiheuttama demetylaation spesifisten geenien on suhteellisen tehoton verrattuna koko genomin ja DNMT-vajaiden solujen.

Drug-induced demetylaation syöpään liittyvien ja bona fide tuumorisuppressorigeeneille

seuraavaksi analysoidaan lääkkeen aiheuttama demetylaation paneelissa syöpään liittyvien geenien (mukailtu GoldenGate metylointi Cancer Panel I, Illumina). Out of 807 syöpään liittyvien geenien tässä paneelissa, 784 (edustaja 2125 CGS) olivat myös läsnä Infinium metylointi siru. Analyysi meidän metylaation tietojen mukaan syöpään liittyvien geenien olivat erittäin metyloitua kuin ei-syöpään liittyvien geenien, jotka ovat läsnä Infinium alustalla mutta ei GoldenGate (kuvio 4A). Lisäksi syöpään liittyvien metylaatio oli voimakkaasti vähennetty DKO-soluissa (kuvio 4A).

A, mediaani metylaatiotasoilla syöpään liittyvien ja ei-syöpään liittyvien CGS käsittelemättömissä soluissa (Co), lääkkeellä käsiteltyihin soluihin (AZA, DAC) ja DKO soluja. B, Heatmap CG metylaation syöpään liittyvien geenien. C, Heatmap of hypermetyloitunut bona fide tuumorisuppressorigeenin-geenien lääkeaineella hoidettuja ja DNMT tyrmäyksellä soluja.

Yksityiskohtainen analyysi osoitti, että ulos 2125 syöpään liittyvän CGS, sarja 906 CGS oli hypermetyloitunut ( AVB≥0.8) in HCT116 kontrolli soluissa. DAC demetyloidaan nämä hypermetyloitunut syöpään liittyvien geenien, joilla on samanlainen tehokkuus kuin AZA (kuvio 4B). Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että lähes kaikki geenit olivat vahvasti demetyloida DKO soluissa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös joukko hypermetyloitunut bona fide tuumorisuppressorigeeneille (kuvio 4C). Nämä tiedot kuvaavat edelleen kyky DAC ja AZA kohteeseen demetyloimiseksi tuumorisuppressorigeeneille, ja viittaavat siihen, että lääkkeen aiheuttama yleinen geenispesifiseen demetylaatio on vertailukelpoisella heikko.

Non-CG saaria ja erittäin metyloidut CGS ovat ensisijaisesti demetyloitunutta

tarkentaa analyysimme, me eron CGI ja ei-CGI-liittyvä CGS. Kuten odotettua [35], [36], CGS ei-CGI olivat pääasiassa metyloitu (3667 ja 7513, AVB≥0.8), kun taas ne, jotka CGI olivat pääosin metyloimatonta (12782 ja 20002, AVB≤0.2) (kuvio 5A). Lisäksi meillä on myös havaittu merkittävä osa erittäin metyloitua CGS jotka liittyivät CGI (4527 ja 20002, AVB≥0.8), joka on yhdenmukainen CGI hypermetylaation syövän [6]. Mielenkiintoista, tuloksemme osoittavat, että sekä, AZA ja DAC, demetyloidaan suurempi osuus metyloitua CGS eivät sijaitse CGI. Tarkemmin sanottuna HCT116-soluissa, AZA demetyloitunut 3,0% (219 7224) metyloituneiden CG dinukleotideissä CGI mutta 9,5% (633 6687) metyloitua CGS ei-CGI (kuvio 5B); DAC demetyloitunut 6,6% (474 ​​7224) CG dinukleotideissä CGI mutta 15,2% (1,013 of 6687) CGS ei-CGI (kuvio 5C). Yhteenvetona toteamme, että CG dinukleotidien CGI tuli ensisijaisesti remethylated jälkeen huumeen aiheuttama passiivinen demetylaatio (

P

2 x 10

-16, Fisherin tarkka testi).

, Boxplots osoittavat eroja metylaatio välillä CGI ja ei-CGI. B, Boxplots osoittavat demetylaatio tehokkuutta merkitty DB arvot atsa- ja DAC-käsiteltyjen HCT116-solujen riippuu CG yhdessä CGI. For A ja B, mustat viivat tarkoittavat medians lovet standardin virheitä, asetinrenkaan kvartiiliväli, ja viikset 2.5th ja 97.5th prosenttipisteet. C, Boxplots osoittavat demetyloituminen tehokkuutta funktiona määrin CG-metylaation atsa- ja DAC-käsiteltyjen HCT116-soluissa. Metylaatiotasoilla ryhmiteltiin 10% välein 0-100% metylaation mustia merkkejä tarkoittavat keskilinjan asetinrenkaan kvartiiliväli, ja viikset 2.5th ja 97.5th prosenttipisteet.

Sen analysoimiseksi, onko demetyloituminen hyötysuhde on funktio aste CG metylaation, me ryhmitelty CGS niiden metylointi tasolla 10 välein 10%: sta 100% metylaation ja päättänyt, missä määrin CGS eri aikavälein otettiin demetyloitunut. Tuloksemme osoittavat, että atsa- ja DAC aiheuttaman demetylaatio oli tehokkaampaa erittäin metyloitua CGS (metylaatio välein 60%: sta 100% metylaation). Tämän merkitys vaikutusta valaistaan ​​edelleen analogista analyysi demetylaatio tehokkuuden DKO soluissa. Täällä CGS kaikista metylaatiotasoilla olivat demetyloitunut yhtä hyvin, mistä osoituksena jatkuvasti kasvava etäisyys niiden mediaanien perustason (kuvio 5D). Yhteenvetona toteamme, että AZA ja DAC ensisijaisesti johtavat demetylaation erittäin metyloitua CG dinukleotideissä.

Koska ei-CGI-associated CGS osoittavat korkeampia metylaatiotasoilla kuin CGI-liittyvä CGS (kuvio 5A), me analysoitava tarkemmin, jos ero metylaatio molempien ryhmien johti havaittu eroa demetylaatio tehokkuuden välillä CGI- ja ei-CGI-associated CGS (kuvio 5B, C). Tätä varten me ryhmitelty CGS, niiden metylaatio tasolle käsittelemättömissä soluissa, välein yhtäläisten metylaation ja määritettiin demetylaation CGS vuonna CGI ja ei-CGI (kuviot S3, S4). Tämä analyysi vahvisti, että metylaatiotasoilla yli 50-60% HCT116-soluissa (yli 20-30% for HL60 solut, katso alla), CGS ei-CGI muuttuneet merkittävästi demetyloiduksi kuin CGS vuonna CGI.

Huumeiden aiheuttama demetylaatio in myeloidileukemiasolut

pyrki vahvistamaan aikaisempien havaintojemme mallissa läheisemmin hyväksytyssä käyttötarkoituksessa DAC ja AZA. Tämän vuoksi käsittelimme HL-60 myelooinen leukemia soluja 24 h lääkekonsentraatioita että aiheutettiin vahvin demetylaation vaste (0,5pM DAC tai AZA) ja jälleen saatu metylaation profiileja Infinium analyysi. Tulokset osoittivat, että atsatiopriini- johti voimakkaaseen demetylaatio (DB≤-0,2) 16% (1,839 of 11406) ja CGS metyloitavaa ohjaus soluissa (kuvio 6A). DAC indusoi demetylaation 8% (941 11406) näistä CG sivustoja (kuvio 6B). Metylaatiotasoilla välillä lääkkeellä käsiteltyihin soluihin erosivat merkitsevästi (

P

2 x 10

-16, Wilcoxonin sum test), kuten edellä on kuvattu HCT116-soluissa, ja me taas havaittiin voimakasta päällekkäisyyttä CGS demetelyloitiin AZA ja DAC (kuvio S5E). Vertailu CGI liittyvien CGS ja ei-CGI-liittyvä CGS osoitti, että CGS vuonna CGI olivat vähemmän metyloituja kuin ei-CGI, joka on yhtä mieltä meidän havainnot HCT116-soluissa. Myös kuten aikaisemmin havaittiin HCT116-soluissa, AZA ja DAC demetyloitunut CGS ulkopuolisissa CGI tehokkaammin kuin CGI in HL60 soluissa (kuvio 6C, D) (

P

2 x 10

– 16, Wilcoxonin sum test). Vastaa meidän havaintojen HCT116-soluissa, lääkkeen aiheuttama demetylaatio oli myös tehokkaampaa erittäin metyloidut CGS in HL60 -soluista (kuvio 6E, F).

Metylointi muutoksia HL60 solut käsiteltiin 24 h AZA (A) tai DAC (B); sinisiä pisteitä ja numerot edustavat demetyloituu CGS (DB≤-0.2). C, D, Boxplots osoittavat demetylaatio tehokkuutta merkitty DB arvot atsa- ja DAC-käsiteltyjen HCT116-solujen riippuu CG yhdessä CGI; mustat viivat tarkoittavat medians lovet standardin virheitä, asetinrenkaan kvartiiliväli, ja viikset 2.5th ja 97.5th prosenttipisteet. Boxplots osoittavat demetylaation tehokkuutta funktiona määrin CG metylaation E, atsa- ja F, DAC-käsiteltyjen HL60 solut. Metylaatiotasoilla ryhmiteltiin 10% välein 0-100% metylaation mustia merkkejä tarkoittavat keskilinjan asetinrenkaan kvartiiliväli, ja viikset 2.5th ja 97.5th prosenttipisteet.

Vastustuskyky demetylaatio korreloi PRC2 käyttöasteen ja transkriptiotekijä sitova

Olemme vihdoin harkita uusiksi molekyylitason mekanismeja, jotka voivat moduloida lääkkeen aiheuttama demetylaatio tehokkuutta. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että spesifinen sitoutuminen Polycomb komplekseja (PRC2) voi aiheuttaa hypermetylaatiota geenin promoottorit aikana tuumorigeneesin [37], [38]. Näin ollen, PRC2 liittyvät alueet voivat altistua nopeaan remetylaatiossa replikaation jälkeen. Niinpä osoitettu genominlaajuisten yhdistyksen tiedot SUZ12, TE, ja H3K27 trimethylation [39] vastaavaan Cgs on Infinium sirulle. Meidän analyysi paljasti, että CGS liittyvät kuulusteli PRC2 komponenteilla korkeampi mediaani metylaatio kuin CGS ei liity PRC2 (kuvio 7A). Mielenkiintoista, PRC2 liittyvä CGS olivat huomattavasti vastustuskykyisempiä demetylaatio AZA ja DAC (kuvio 7B, C).

, Boxplots osoittavat jakelu CG metylaation PRC2 liittyvien CGS ja ei-PRC2 liittyvä CGS in HL60 soluissa. B, C, Boxplots osoittavat demetylaatio tehokkuutta merkitty DB arvot atsa- ja DAC-käsiteltyjen HL60 solut riippuvaisia ​​yhdessä PRC2 komponentteja. For A, B, ja C mustat viivat merkitsevät medians lovet standardin virheitä, asetinrenkaan kvartiiliväli, ja viikset 2.5th ja 97.5th prosenttipisteet. D, Venn kaaviot osoittavat CGS joka ei tullut demetyloiduksi (AVB≥0.8) huumeiden käsitellään HCT116 ja HL60 soluissa ja DKO soluissa, vastaavasti. E, Prosenttiosuus demetylaatio vastustuskykyisten CGS liittyy PRC2 komponenttien HCT116 ja HL60 solut ja päällekkäisistä CGS molempien solulinjojen (HCT116 HL60). F, merkitys rikastaminen transkriptiotekijän sitoutumiskohdista geenien demetylaation kestävät CGS in HCT116 ja HL60 solut ja CGS joka tuli demetelyloitiin AZA ja DAC HCT116 ja HL60 solut (herkkä demetylaation). Heatmap pylväät edustavat log (

P

arvot) rikastamista 130 transkriptiotekijöiden.

tarkentaa tätä analyysiä, voimme myöhemmin keskittyneet demetylaatio kestävä CGS. Olemme tunnistaneet joukon 1129 geenin liittyvän CGS jotka olivat resistenttejä demetylaatio AZA ja DAC HL60 solut (AVB≥0.8). Mielenkiintoista on, että 75% näistä CGS olivat resistenttejä myös lääkkeen aiheuttama demetylointi HCT116-soluissa (kuvio 7D). Yksityiskohtainen analyysi osoitti, että PRC2 komponentit olivat vahvasti rikastettu promoottorialueet CGS vastustuskykyisiä demetylointi HCT116 ja HL60-soluja, samoin kuin päällekkäin resistenttejä CGS molempien solulinjojen (kuvio 7E). Tunnistamaan muita tuntomerkkejä demetylaatio-herkkä ja kestävä CGS, analysoimme myös jos geenit kätkeminen demetylaatio kestäviä CGS on ominaista eri sarjaa transkriptiotekijän sidosmotiivien verrattuna geeneihin, jotka tulevat demetyloitunutta. Käyttämällä työkalu Pscan [29], analysoitiin läsnäolo sitoutumiskohtien 130 transkriptiotekijöitä 644 geenien (851 CGS), jotka olivat resistenttejä demetylointi HCT16 ja HL-60-solujen ja 121-geenien (128 CGS), joka tuli demetyloida molemmat solulinjat jälkeen lääkehoitoa. Analyysi paljasti, että demetylaatio-herkkä ja kestävä CGS liittyvät geenit, jotka osoittavat toisiaan täydentäviä rikastumista transkriptiotekijän sitoutumiskohtia (kuvio 7F, kuvio S8). Mielenkiintoista, vastaava transkriptiotekijät myös kuulua eri transkriptiotekijän perheitä (katso kuva S9). Esimerkiksi sitoutumiskohdat Forkhead laatikko (Fox) transkriptiotekijöitä rikastuvat demetylaatio herkkä geenejä perustuotteiden Helix-Loop-Helix (bHLH) transkriptiotekijän sitoutumiskohtia rikastuvat demetylaation vastustuskykyisiä geenejä. Nämä tulokset vahvistavat käsitystä, että erityiset molekyylitason mekanismeja, jotka perustuvat sekvenssikontekstissa ja chromatin kokoonpano, osallistuvat säätelyyn lääkkeen aiheuttama DNA demetylaation.

Keskustelu

rooli DNA: n metylaation kasvainkudoksessa solubiologian on systemaattisesti analysoitu HCT116-soluissa ja DNMT knockout solujen kahdessa edellisessä tutkimuksessa [16], [17]. Nämä tutkimukset hyödyntää epäsuoraa lähestymistapaa farmakologisen paljastumista [40] tunnistaa metyloidut geenien muutosten kautta niiden transkription profiilin. Mielenkiintoista, viimeaikaiset tiedot osoittavat, että AZA ja DAC aiheuttaa erilaista geenien vain vähän päällekkäisyyttä [41].