Krooninen sairaus

tiivistelmä

interleukiini-6 (IL-6) on osallisena keuhkojen syövän kasvainten synnyssä, syövän etenemiseen, etäpesäkkeitä, ja lääkeresistenssin. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että saarto IL-6 signalointi voi estää kasvaimen kasvua ja lisäävät huumeiden herkkyyttä hiirimalleissa. Kliiniset tutkimukset ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) paljastavat, että IL-6 täsmähoitoihin lievittää NSCLC liittyvä anemia sekä kakeksia, vaikka muut kliiniset vaikutukset vaativat lisätutkimuksia. Ylitimme

IL-6

– /-

hiirten

Kras

G12D

mutanttihiirien, jotka kehittävät keuhkokasvaimia jälkeen aktivointi mutantti

Kras

G12D

, tutkia IL-6 esto vaikuttaa kasvaimen etenemiseen ja elinaika

in vivo

.

Kras

G12D

;

IL-6

– /- hiirillä ilmeni kohonneita tumorigeneesin, mutta hitaampi kasvaimen kasvua ja elinajan pitenemiseen, kuin

Kras

G12D

hiirillä. Edelleen, jotta tutkia

IL-6

poisto edistää poistaminen keuhkosyöpään etäpesäkkeiden, me syntyy

Kras

G12D

;

p53

flox /flox

;

IL-6

– /- hiirissä, joka kehitti keuhkosyöpä joiden suuntaus alennettua etäpesäkkeitä ja pidempi eloonjäämisen kuin

Kras

G12D

;

p53

flox /flox

hiirillä. Kasvaimet alkaen

Kras

G12D

;

IL-6

– /- hiiret osoittivat lisääntyneen ilmentymisen TNFa ja vähentynyt ilmentyminen CCL-19, CCL-20 ja fosforyloidun STAT3 (pSTAT3) kuin

Kras

G12D

hiirillä; mutta nämä muutokset eivät olleet läsnä välillä kasvaimia

Kras

G12D

;

p53

flox /flox

;

IL-6

– /- ja

Kras

G12D

;

p53

flox /flox

hiirillä. Säätelyä pSTAT3 ja fosforyloidun AKT (Pakt) havaittiin

Kras

G12D

kasvaimista

p53

poisto. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että

IL-6

poisto kiihdyttää kasvaimen kehittymisen mutta viiveet syövän etenemiseen ja pidensi elinaikaa kertaa

Kras

ajettavat hiirimallissa keuhkosyöpään. Näitä vaikutuksia voidaan vaimentaa

p53

poisto.

Citation: Tan X, Carretero J, Chen Z, Zhang J, Wang Y, Chen J, et al. (2013) menetys

p53

vaimentaa panos on

IL-6

poisto on Tukahdetut taudin etenemiseen ja laajennettu Survival in

Kras

ajettavat Hiiren Lung Cancer. PLoS ONE 8 (11): e80885. doi: 10,1371 /journal.pone.0080885

Editor: Victoria Lawson, University of Melbourne, Australia

vastaanotettu: toukokuu 29, 2013; Hyväksytty: 08 lokakuu 2013; Julkaistu: 15 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Tan et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee NIH (CA122794, CA140594, CA163896, CA166480, CA154303, ja Lung SPORE P50CA090578), United vastaan ​​Keuhkosyöpä, American Lung Association, Susan Spooner Research Fund (KKW), Kiinan kansallinen Key Ohjelman Basic Research (2012CB945100, 2011CB504202 ) ja National Natural Science Foundation of China (31030040). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kertyvät näyttö osoittaa, että tulehduksen vaikuttavan kasvainten kehittymiseen, kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden [1,2]. Oncogene liittyvä tulehdus johtaa inflammatoristen sytokiinien, kuten interleukiini-6 (IL-6) [3,4], pleiotrooppinen sytokiini osallistuu tulehdus, immuniteetti, luun aineenvaihduntaan, hermo, lisääntyminen ja hematopoieesin [5]. Kuitenkin IL-6 liittyy myös lisääntynyt riski sairastua keuhkosyöpään [6-8]. IL-6 voidaan havaita hengityksen kondensaatti potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [9], ja seerumissa joidenkin keuhkosyöpäpotilaita, mutta ei ole havaittavissa potilailla, joilla on hyvänlaatuinen keuhkosairaus [10]. Kohonnut IL-6 tasoa myötävaikuttaa pahanlaatuiseen keuhkopussieffuusio [11,12], leikkauksen jälkeisiä komplikaatioita [13], ja leikkauksen jälkeisen uusiutumisen [14] keuhkosyöpään. Useat tutkimukset ovat korreloi korkea verenkierrossa IL-6 tasolle heikko selviytymisen keuhkosyöpäpotilaita [15-23]. IL-6-tulehduksen korreloi heikentävä syöpään liittyviä oireita, kuten väsymystä, tromboembolia, kuihtuminen ja anemian [3], ja IL-6 signalointi aktivaatio korreloi keuhkosyövän kemoterapian resistenssin [16,24]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, on tärkeä rooli IL-6: useita näkökohtia keuhkosyöpään.

IL-6 ilmentymistä voidaan havaita keuhkotuumoreissa [25], ja 53% keuhkosyövän solulinjat [26], ja IL-6 reittejä aktivoituvat ihmisen keuhkosyövän kantasolulinja [27-29]. Toiminnalliset analyysit viittaavat siihen, että IL-6 vaikuttaa kyky syöpäsolujen etäpesäkkeitä kaukaisiin kohtiin [30,31], ja että IL-6 edistävät kasvaimen kasvua parakriinisellä tavalla

in vivo

[4,26,32] . Näin ollen ei ehkä ole yllättävää, että

IL-6

pudotus, geneettinen ablaatio, tai käsittelemällä neutraloiva IL-6-vasta-aine inhiboi kasvaimen kasvua

in vivo

[4,33]. Toisaalta, aktivointi IL-6 signalointi osallistuu vastustuskyvyn epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) estäjät hiirimallissa NSCLC [34,35], kun taas salpaus lisää lääkeaineen herkkyys ksenograftimalleissa [34].

IL-6-monoklonaalinen vasta-aine terapia voidaan ennustaa estää tulehduksellisten mikroympäristön keuhkosyöpä. Yksi tällainen hoito, ALD518, on tehty prekliinisiä ja vaiheen I ja II kliinisissä kokeissa. Se näyttää olevan hyvin siedetty ja ameliorates NSCLC liittyvä anemia sekä kakeksia [3], vaikka kokonaisuus kliinisiin tuloksiin on vielä tutkittava.

arvioimiseksi osuus IL-6 signalointi eston kasvaimen etenemiseen ja elinaika

in vivo

, ylitimme

IL-6

– /-

hiirten mutantti

Kras

G12D

hiirillä, koska IL-6 on alavirtavaikuttajainhibiittorit onkogeenisten Ras edistää kasvaimien syntyyn [4]. NSCLC diagnoosina on usein etäpesäkkeitä ja on huono ennuste. Hoitoon ja ehkäisyyn keuhkosyövän etäpesäkkeiden suuria täyttämättömiä tarpeita [36]. Inaktivoivat mutaatiot

p53

löytyy ainakin 50% NSCLC tapauksista [36], ja

Kras

G12D

aktivointi mukana

p53

poisto voi aiheuttaa keuhkovaurion tuumorietäpesäke [37]. Toiminnan tutkimiseen IL-6 etäpesäkkeitä, myös luotu

Kras

G12D

;

p53

flox /flox

;

IL-6

– /- hiirillä ..

Materiaalit ja menetelmät

Hiiret

IL-6

– /-

hiiret hankittiin The Jackson Laboratory ja ylläpidetään steriiliin kotelossa [38]. Ehdollinen

Lox-Stop-Lox Kras

G12D

(jäljempänä

Kras

G12D

) hiirissä [39] ja

p53

flox /flox

hiirillä [40] on kuvattu aiemmin.

Kras

G12D

ja

Kras

G12D

;

LL-6

– /-

hiiret ympättiin 5 x 10

6 PFU adenovirus Cre (adeno- Cre) intranasaalisen hengitettynä aktivoida onkogeenisen

Kras

G12D

keuhkoihin.

Kras

G12D

;

p53

flox /flox

ja

Kras

G12D

;

p53

flox /flox

;

IL-6

– /-

hiiret ympättiin 5 x 10

5 PFU adeno- Cre. Kaikki kokeelliset menettelyt suoritettiin mukaisesti National Institutes of Health Guide for Care ja koe-eläinten käytön. Protokolla hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean Dana-Farber Cancer Institute (luvan numero 04-094). Kaikki leikkauksia tehtiin alle Avertin anestesiassa minimoida kärsimyksen. Sen jälkeen eutanasia, elimet, kuten sydän, maksa, perna, munuainen, maha, suoli, selkärankaan, aivoihin, rinta-, iho- ja kivesten tai munasarjojen, oli tehty brutto tarkastusta varten etäpesäkkeitä. Keuhkokasvaimia kiinni keuhkopussissa katsottiin päälaen keuhkopussin etäpesäkkeitä. Epäillään etäpesäkkeitä kerättiin ja varmistettiin histologiset piirteet.

Histologia ja immunohistokemia

Kun eutanasiaa, keuhkot poistettiin ja kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin yön yli ennen parafiiniin. Viisi mikrometrin osien hiiren keuhkojen kudoksia leikattiin. Jotkin leikkeet värjättiin H BrdU (ab6326, Abcam) 1: 200; Ki67 (ab15580, Abcam) 1: 200; Endomucin (14-5851, eBioscience) 1: 100; lohkaista Kaspaasi-3 (9661, Cell Signaling) 1: 300. Digest-All 2B trypsiini (Invitrogen) käytettiin hakea antigeenin MAC2 (CL8942AP, Cedarlane) värjäys 1: 5000. Tällä 400X suurennos, kaikki MAC2-positiiviset makrofagit kasvaimissa laskettiin 3km mikroskooppikenttää kaikkein MAC2-positiivisten makrofagien tarkistuksen jälkeen koko keuhkojen osassa. Kolme hiirtä per genotyyppi analysoitiin.

leviämisen analysointi

20 viikkoa infektion jälkeen, hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti 10 ui 10 mM BrdU PBS: ssä per gramma kehon painoa ja lopetettiin sen jälkeen, kun 2 tuntia. Koko keuhkot otettiin talteen ja käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla. Tällä 400X suurennos, kaikki BrdU-positiivisten kasvainsolujen tumat laskettiin 3km mikroskooppikenttää kaikkein BrdU-positiivisten ytimien tarkistuksen jälkeen koko keuhkojen osassa. Neljä hiirtä per genotyyppi analysoitiin. Samaa menetelmää käytettiin laskemiseen Ki67-leimattuja kasvainsoluja rataosuuksilla hiiristä 28 viikkoa infektoinnin kanssa adeno-Cre.

Western blotting

Keuhkokasvaimia kerättiin

Kras

G12D

ja

Kras

G12D

;

LL-6

– /-

hiirillä 32 viikkoa infektion jälkeen ja

Kras

G12D

;

p53

flox /flox

ja

Kras

G12D

;

p53

flox /flox

;

IL-6

– /-

hiirillä 15 viikkoa infektion jälkeen Western blot -analyysiin. Kasvaimet, hajotettiin homogenisaattorilla RIPA-puskurissa (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM natriumkloridia, 1% Nonidet P-40, 0,25% natriumdeoksikolaatti, 1 mM EDTA), joka sisälsi täydellisen mini proteaasi-inhibiittoreita (Roche) ja fosfa- estäjät (5870 , Cell Signaling). Nuclear ja Sytoplastiset Extraction Kit (CW199B, Cowin Biotech Co., Ltd. Kiina) käytettiin poimia soluliman (C) ja ydinenergian (N) fraktioista kasvaimia. Lysaatit (20 ug per kaista) erotettiin 10% polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin PVDF-suodattimia, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa vasta-aineita P-aktiini (sc-1615, Santa Cruz), Perk (4376, Cell Signaling), yhteensä-ERK (9102, Cell Signaling), Pakt (4060, Cell Signaling), yhteensä-AKT (4685, Cell Signaling), pSTAT3 (9145, Cell Signaling), STAT3 (sc-7179, Santa Cruz), p65 (SC- 372, Santa Cruz), PARP (9532, Cell Signaling), GAPDH (TA-8, Peking ZHONGSHAN Golden Bridge Biotechnology Co., Kiina), tai β-kateniinin (ab32572, Abcam). Western blotit valotettiin röntgen- filmejä tai skannattu kanssa ImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare).

Quantitative real-time PCR

mRNA uutetaan kasvaimia

Kras

G12D

ja

Kras

G12D

;

LL-6

– /-

hiirillä 32 viikkoa infektion jälkeen ja

Kras

G12D

;

p53

flox /flox

ja

Kras

G12D

;

p53

flox /flox

;

IL-6

– /-

hiirillä noin 16 viikon kuluttua infektion analysoitavaksi. 2 ug kokonais-RNA käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen SuperRT cDNA synteesi kit (Beijing Cowin Biosciences Co., Ltd. Kiina). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen BioRad iQ5 Realtime PCR -järjestelmää ja StepOnePlus Realtime PCR -järjestelmää (ABI), jossa Reaaliaikainen PCR Master Mix, joka sisälsi SYBR Green (QPK-201, TOYOBO, Japani) ja ainutlaatuinen alukkeita (taulukko S1). Kolmesta neljään näytettä kustakin ryhmästä oli detected.Gene ilmaisun tulokset normalisoitiin p-aktiini-mRNA: n.

Tilastollinen

Opiskelijan

t

-testi käytettiin arvioimaan vaurion määrää ja määrän BrdU tai Ki67- positiivisia soluja. Fisherin testiä arvioitiin metastasoituneen nopeudella. Kaplan-Meier-analyysi arvioida elinaika. Expression eroja neljään ryhmään analysoitiin ANOVA.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

IL-6

poisto kiihdyttää kasvaimia synnyttävän

Kras

G12D

indusoima keuhko- kasvainten synnyssä

Kuten aiemmin on kuvattu,

Kras

G12D

hiirille kehittyi keuhko- kasvainten jälkeen pitkä latenssi [39].

IL-6

– /- hiirille kehittyi normaalisti [38], ja eivät osoittaneet keuhkojen kasvainten 54 viikkoa ikäisiä (tietoja ei ole esitetty). Sen jälkeen adeno-Cre hengitettynä, PCR-analyysi vahvisti rekombinaatio ehdollisen

Kras

G12D

alleelin (kuvio S1).

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiirillä, oli keskimääräinen eloonjäämisaika 37 viikon kuluttua adeno-Cre rokotus, merkittävästi pidempiä kuin

Kras

G12D

hiiriä (

P

0,0001) (taulukko 1). Hiiret lopetettiin 2, 4, 20, 28, ja 32 viikkoa infektion jälkeen, ja keuhkovaurioita H IL-6

– /-

hiirillä oli varhain keuhkovaurioita. 4 viikon infektion jälkeen,

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiirillä oli enemmän alussa keuhkovaurioita kuin

Kras

G12D

hiiriä (kuvio 1A-C). Nämä vauriot olivat epätyypillisiä adenomatoottisen liikakasvun (AAH) ja epiteelin liikakasvu (EH) ja keuhkoputkia, kuten on raportoitu aiemmin [39].

Genotyyppi

Number käsitelty

Mediaani elossaoloaika (viikkoja) *

Survival alue ( viikkoa) B

IL-6

– /-

13 54

Kras

G12D

1434.627.9 ~ 39.0

Kras

G12D; IL-6

– /-

38 37,0

a29.3 ~ 46.7

p53

flox /flox

8 52

p53

flox /flox; IL-6

– /-

9 52

Kras

G12D; p53

flox /flox

4316.311.1 ~ 19.7

Kras

G12D; p53

flox /flox; IL-6

– /-

44 17.4

b12.7 ~ 23.4Table 1. Vertailu keuhkosyöpään ikäryhmät.

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiirillä oli merkitsevästi pidempi eloonjäämisen kuin

Kras

G12D

hiiriä (

P

0,0001).

b

Kras

G12D

; p53

flox /flox

; IL-6

– /-

hiirillä oli merkitsevästi pidempi eloonjäämisen kuin

Kras

G12D

; p53

flox /flox

hiiriä (

P

0,01). * Mediaani latenssi osoitettu on jälkeen adeno- Cre hoitoa 6-10 viikon iässä, arvioitiin Kaplan-Meier-analyysi. CSV Lataa CSV

(A ja B) edustavat kuvat H 0,01. (D ja E) Kuvat ovat H 1,5 mm)

K

ja

KI

hiiriä (

n

= 6) 28 viikkoa infektoinnin kanssa adeno-Cre . Esitetyt tiedot ovat keskiarvo + s.e.m. *

P

0,05. (G ja H) Kuvat ovat H 1,5 mm)

K

ja

KI

hiiriä (

n

= 6) 28 viikkoa infektoinnin kanssa adeno-Cre . Esitetyt tiedot ovat keskiarvo + s.e.m. **

P

0,01. (J ja K) edustaja kuvia Endomucin-värjättyä keuhko- kudososat (J)

K

ja (K)

KI

hiirillä 28 viikkoa infektoinnin kanssa adeno-Cre. Mittakaava osoittaa 500 um (A, B, D, E, G ja H), tai 100 um (J ja K). Lyhenteet:

K

=

Kras

G12D

.

KI

=

Kras

G12D

;

IL-6

– /-

.

IL-6

poisto hidastaa kasvaimia synnyttävän

Kras

G12D

indusoimaan keuhko- syövän etenemiseen

20 viikkoa infektion jälkeen, keuhkotuumoreista

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiiret olivat vaatimattomasti pienempiä ja vähemmän tiheää kuin

Kras

G12D

hiiriä (kuvio 1D ja E). Viikolla 28 infektion jälkeen, verrattuna

Kras

G12D

hiiriä, enemmän vaurioita havaittiin

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiirten useimpien vaurioiden alkuvaiheessa kasvaimen kehitystä (kuvio 1 F). Kuitenkin kasvaimen 3-10 millimetriä havaittiin keuhkoissa

Kras

G12D

hiiriä, kun taas suurin osa

Kras

G12D

; IL-6

– /-

keuhkokasvaimia oli alle 1,5 mm (kuvio 1G-I). Edelleen, vaikka IL-6 signalointi edistää ihon kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä parakriinisella tavalla [4], emme havaitse mitään eroa

Kras

G12D

ja

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiirissä immunohistokemiallinen värjäys Endomucin, joka on mikroverisuonitiheys merkki mitata angiogeneesin indeksi (kuvio 1J ja K).

IL -6

poisto vaimentaa keuhkojen kasvain leviämisen

Voit selvittää kasvaimen leviämisen vaikuttaa

IL-6

poisto

in vivo

mittasimme BrdU Nimen solujen keuhkokasvaimia. Huomattavasti vähemmän leimattua ytimiä havaittiin keuhkoissa osastoja

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiirillä 20 viikkoa infektoinnin kanssa adeno- Cre verrattuna johdettu ohjaus

Kras

G12D

hiirillä (kuvio 2A-C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin Ki67 värjäytymistä keuhkojen osastoja

Kras

G12D

ja

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiirillä 28 viikkoa infektoinnin kanssa adeno-Cre (kuva S2). Expression of Perk, joka toimii alavirtaan Kras ja liittyy syöpäsolujen lisääntymistä, vähennettiin kasvaimia

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiirillä 20 viikkoa infektoinnin kanssa adeno- Cre verrattuna

Kras

G12D

hiiriä (Kuva 2D ja E). Kaspaasi 3 värjäys eivät paljastaneet eroja tuumorisolujen apoptoosin välillä

Kras

G12D

ja

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiirissä (kuvio 2F ja G).

(A ja B) edustavat kuvat BrdU-värjättyä keuhko- kudososat (A)

K

ja (B)

KI

hiirillä 20 viikkoa infektoinnin kanssa adeno- -Cre. (C) kvantifiointi BrdU-positiivisia kasvainsoluja keuhkokudoksessa osissa

K

ja

KI

hiiriä (

n

= 4) 20 viikkoa infektoinnin kanssa adeno- Cre. *

P

0,05. (D ja E) edustaja kuvia Perk värjättyä keuhkokudoksessa osastoja (D)

K

ja (E)

KI

hiirillä 20 viikkoa infektoinnin kanssa adeno-Cre. (F ja G) edustaja kuvia pilkkoa kaspaasi-3-värjätty keuhko- kudososat (F)

K

ja (G)

KI

hiirillä 28 viikkoa infektoinnin kanssa adeno-Cre. Nuolet osoittavat kaspaasi-3-positiivisia kasvainsoluja. Mittakaava osoittaa 50 um (A, B, F ja G), tai 100 um (D ja E). Lyhenteet:

K

=

Kras

G12D

.

KI

=

Kras

G12D

;

IL-6

– /-

.

IL-6

poisto ulottuu selviytyminen

Kras

G12D

;

p53

flox /flox

hiirten

Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, ei etäpesäkkeitä tai paikallista ilmaannuttua havaittiin

Kras

G12D

hiirillä [39], ja samanlaiset tulokset havaittiin

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiirillä.

Kras

G12D

aktivointi mukana

p53

poisto voi aiheuttaa keuhkovaurion tuumorietäpesäke [37], siis

Kras

G12D

; p53

flox /flox

; IL-6

– /-

hiiret luotu tutkimaan vaikutuksen

IL-6

poisto keuhkosyöpään etäpesäkkeitä.

p53

alleelinen rekombinaatio varmistettiin PCR: llä (kuvio S3).

IL-6

poisto lisäsi mediaanielossaolosta

Kras

G12D

; p53

flox /flox

hiiriä (

P

0,01) (taulukko 1) huolimatta huomattavan keuhkojen kasvain taakka sekä

Kras

G12D

; p53

flox /flox

ja

Kras

G12D

; p53

flox /flox

; IL-6

– /-

hiirillä 12 viikkoa infektion jälkeen (kuvio 3A ja B). BrdU värjäys osoitti molempien ryhmien keuhkotuumoreiden olivat erittäin proliferatiivinen (kuvio 3C ja D), ja Perk ilme oli korkea molemmissa ryhmissä (kuvio 3E ja F); ei tilastollisia eroja ei havaittu.

Kuvat ovat keuhkojen (A ja B), BrdU värjäys (C ja D), Perk värjäys (E ja F) ja kasvaimen etäpesäkkeitä (G ja H) alkaen

KP

(A, C, E ja G) ja

KPI

(B, D, F ja H) hiiriä 12 viikkoa infektoinnin kanssa adeno-Cre. Pisteviivat (G ja H) osoittavat metastasoituneen kasvain reunat. Tähdet osoittavat keskus etäispesäkekasval-. Mittakaava osoittaa 500 um (A, B, G, ja H), 50 um (C ja D) tai 100 pm (E ja F). Lyhenteet:

KP

=

Kras

G12D

; p53

flox /flox

.

KPI

=

Kras

G12D; p53

flox /flox

;

IL-6

– /-

.

Vertailun 17

Kras

G12D

; p53

flox /flox

; IL-6

– /-

hiirillä ja 19

Kras

G12D

; p53

flox /flox

hiiret analysoitiin etäpesäkkeiden noin 16 viikon kuluttua infektion adeno- Cre (taulukko 2). Histologisesti, etäpesäkkeitä todettiin 5 17

Kras

G12D

; p53

flox /flox

; IL-6

– /-

hiiriä (29,4%) ja 10 19

Kras

G12D

; p53

flox /flox

hiiriä (52,6%), vaikka tämä ero ei ollut merkitsevä (

P

= 0,19). Etäpesäkeleesioita että päälaen keuhkosairaudet, kateenkorva (kuva S4A ja B), ja imusolmukkeet havaittiin molemmissa

Kras

G12D

; p53

flox /flox

ja

Kras

G12D

; p53

flox /flox

; IL-6

– /-

hiirissä (kuvio 3G ja H). Heart etäpesäkkeitä (kuvio S4C) havaittiin 2 19

Kras

G12D

; p53

flox /flox

hiirillä (taulukko 2).

Sites etäpesäkkeiden

Kras

G12D; p53

flox /flox

Kras

G12D; p53

flox /flox; IL-6

– /-

Imuneste node10 19 (52,6%) 5 17 (29,4%) Thymus1 19 (5,3%) 1 17 (5,9%) Sydän 2 19 (10,5 %) 0 17Table 2. Site ja tiheys etäpesäkkeiden ensisijaisen keuhkokasvaimia.

CSV Lataa CSV

IL-6

poisto muuttuu, mutta

p53

poisto vaimenee, jotkut tulehdussytokiinejä

Sen tutkimiseksi,

IL-6

poistoista tulehdus, mittasimme makrofagien tiheyden avulla MAC2 värjäystä [41]. Ei merkittäviä muutoksia makrofagien määrän havaittiin keskuudessa kasvaimia

Kras

G12D

, Kras

G12D

; IL-6

– /-

, Kras

G12D

; p53

flox /flox

, ja

Kras

G12D

; p53

flox /flox

; IL-6

– /-

hiirillä (kuva 4A-E). Meillä on myös mitattu mitään muutosta CD3 ilmaisun, T-solujen markkeri, missä tahansa neljästä kasvaimen ryhmää (kuvio S5B).

(AD) edustaja kuvia MAC2-värjätty keuhkojen kudososat (A)

K

ja (B)

KI

hiirillä 28 viikkoa infektion jälkeen ja (C)

KP

ja (D)

KPI

hiirillä 12 viikkoa post infektio adeno- Cre. (E) kvantifiointi MAC2-positiivisten makrofagien keuhko- kasvainten

K

,

KI, KP

, ja

KPI

hiiriä (

n

= 3 ). Tilastollista eroa ei havaittu. (F ja G) Gene IL-1β, TNFa, CCL-7, CCL-19, CCL-20, CXCL-5, CCL-8 ja CCL-24 kasvainten

K

,

KI, KP

, ja

KPI

hiiret määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. Kolmesta neljään kasvaimia kussakin ryhmässä havaittiin ja kolmena PCR: t tehtiin. Geenien ilmentyminen normalisoitiin p-aktiini-mRNA: n. *

P

0,05 vs.

K

kasvaimia. Lyhenteet:

K

=

Kras

G12D

.

KI

=

Kras

G12D

;

IL-6

– /-

.

KP

=

Kras

G12D

; p53

flox /flox

.

KPI

=

Kras

G12D; p53

flox /flox

;

IL-6

– /-

.

Useat sytokiinien tärkeä rooli tulehdus- käsitellä asiaa. Luettelo sisältää IL-1, TNFa ja IL-6. Kemokiinit muodostavat suurimman perheen sytokiinien ja luokitellaan polypeptidiin ryhmien sijainnin kysteiinitähteiden lähellä aminopään (esim., C-C, C-X-C, tai CX3C) [42]. Onkogeeninen Ras indusoi eritystä ELR1 + CXC kemokiiniperhe edistää kasvaimien syntyyn [43]. Jotkut kemokiinit ja kasvutekijät ovat mukana kasvaimen etenemistä [42], joten me seulotaan tulehdussytokiini muutokset kasvaimissa reaaliaikainen PCR. Kolme näytettä kutakin kasvainten ryhmä käytettiin tehdä reaaliaikaisia ​​PCR ilman jäljitellä. Ei ollut merkittäviä eroja löytynyt IL-1α, CXCL-1, CXCL-5, CXCL-9, CXCL-12, CXCL-16, TGF-β2, BMP2, BMP4, CCL-2, CCL-7, CCL-8 , CCL-9, CCL-22, CCL-28 ja CX3CL-1 ilmentymisen keskuudessa neljään ryhmään kasvaimet (kuva S5). Seulonta Tulokset osoittivat joitakin muuttumassa joissakin tulehduksellisten sytokiinien (kuva S5). Olemme vahvistaneet muutokset käyttäen kolmena reaaliaikaisia ​​PCR-reaktioissa, jossa on 3 4 näytettä kussakin ryhmässä. Kohonnut ilmaus TNFa ja vähentää ilmentymistä CCL-19 ja CCL-20 havaittu kasvaimia

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiirissä verrattuna

Kras

G12D

hiirillä. Nämä muutokset olivat poissa välillä kasvaimia

Kras

G12D

; p53

flox /flox

ja

Kras

G12D

; p53

flox /flox

; IL-6

– /-

hiirillä. Vaikka mitään tilastollisia eroja IL-1β, CCL-7, CCL-8, CCL-24 ja CXCL-5-geenin ilmentyminen vahvistettiin neljälle kasvain ryhmään (kuvio 4F ja G).

tutki myös ydinvoiman lokalisointi NF-KB-alayksikön p65, mikä on tärkeää syöpään liittyvien tulehdus ja pahanlaatuisten etenemisen [44,45]. Ei kuitenkaan ole merkittäviä lokalisointi havaittu muutosta joukossa kasvaimia neljästä genotyyppien (kuva S6). Eikä dramaattinen muutosta ei havaittu β-kateniinin ilmentymistä nucleus (kuva S6), joka liittyy keuhkosyöpä kehittämiseen [46]. Expression of pSTAT3, joka on tärkein alavirtaan tavoite IL-6, väheni joissakin

Kras

G12D

; IL-6

– /-

kasvaimissa (kuvio 5), mutta kasvoi

p53-

poistettu kasvaimia. Nämä tulokset osoittivat, että

IL-6

poisto muuttunut kasvain kuvaamaan joitakin tulehduksellisten sytokiinien, vaikka nämä muutokset heikensivät

p53

poisto.

Kasvaimen lysaatit uutetaan

K

ja

KI

hiirillä 32 viikkoa infektion jälkeen ja

KP

ja

KPI

hiirillä 15 viikkoa infektion jälkeen Western blot -analyysiin. Western blot tulokset pSTAT3 ja koko-STAT3 skannattiin toimesta ImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare). Muut tulokset altistettiin X-ray elokuvia. Lyhenteet:

K

=

Kras

G12D

.

KI

=

Kras

G12D

;

IL-6

– /-

.

KP

=

Kras

G12D

; p53

flox /flox

.

KPI

=

Kras

G12D; p53

flox /flox

;

IL-6

– /-

.

Keskustelu

Edellinen tutkimukset ovat osoittaneet, että karsinogeeni aiheuttama tuumorigeneesiä

IL-6

– /-

hiirillä viivästyy 1-2 viikkoa [4,47]; mutta löysimme eroa

Kras

G12D

indusoima kasvain puhkeamista riippumatta

IL-6

puutos. Yksi mahdollinen selitys on, että

Kras

G12D

aktivointi voi aiheuttaa keuhkojen kasvaimien syntyyn vahvemmin kuin muut karsinogeenejä.

Jotkut inflammatoristen sytokiinien liittyy kasvaimen etenemistä [42]. TNFa voi toimia kasvaimen promoottori säätelemällä lukuisiin sytokiinien, kemokiinien, kiinnikkeistä, metalloproteinaasien (MMP) ja angiogeneesiä toimintaa [2,48]. Tässä tutkimuksessa

IL-6

deleetio

Kras

G12D

kasvaimia voimistunut TNFa ilme. Kohonnut ekspressio TNFa voi kompensoida menetystä IL-6 ja siten lisätä kasvaimen kehittymisen. Kuitenkin syövän etenemiseen viivästyy

Kras

G12D

; IL-6

– /-

hiiriä, yhdenmukaisia ​​aiempien tulosten [4,47]. Nämä tiedot osoittavat, että

IL-6

on tärkeää kasvaimen etenemistä

in vivo

ja viittaavat siihen, että IL-6 esto voi olla kaksifaasinen vaiheessa erityisiä vaikutuksia keuhkosyöpä, parantaa kasvaimen kehittymisen varhainen samalla pienentää kasvaimen etenemisen myöhemmin. Näin ollen tämä voi aiheuttaa riskin keuhkosyöpään potilailla, joita hoidettiin IL-6-täsmähoitoihin.

CCL-20 (tai makrofagi tulehdusta kemokiini-3α, MIP-3α), C-C-motiivi kemokiini, on yli-ilmentynyt haimakarsinooma- soluihin ja stimuloi syöpäsolujen kasvua [49]. CCL-19 (tai makrofagin tulehduksellinen proteiini-3 beta, MIP-3β), on tärkeä rooli siirtymien kypsien dendriittisolujen ja T-solujen [50]. Sekä dendriittisolujen ja T-solut ovat kaksiteräinen miekka kasvaimen mikroympäristössä, aloittamisen lisäksi voimakas anti-kasvain immuunivasteita, nämä solut voivat myös edistää syöpäsolujen kasvua ja leviämistä [51,52]. Jatkuvasti aktivoitu tai tyrosiini-fosforyloituu STAT3 (pSTAT3) on löydetty 50% keuhkojen adenokarsinoomat [53,54]. pSTAT3 voi parantaa kasvaimen leviämisen ja menetys pSTAT3 pidätyksistä kasvun premalignien vaurioiden lähes kumoamisesta kehittyneiden kasvaimia [55]. Tässä tutkimuksessa

IL-6

deleetio

Kras

G12D

kasvaimia johti downregulation of pSTAT3, CCL-19 ja CCL-20. Perk ilmentyminen väheni

Kras

G12D

; IL-6

– /-

kasvaimissa 20 viikkoa infektion jälkeen (kuvio 2), mutta lisääntyi useimmissa

Kras

G12D

; IL-6

– /-

kasvaimissa 32 viikkoa infektion jälkeen (kuvio 5). Nämä tiedot viittaavat siihen, että alkuvaiheen, kasvaimen kasvu voi viivästyä alhainen ilmentyminen Perk, pSTAT3 ja CCL-20. Aikana myöhemmissä vaiheissa, kasvaimen kasvu voi saada aikaan säätelyä Perk ja TNFa, vaikka nämä mekanismit on vielä tutkittava.

Tuloksemme osoittavat, että

p53

poisto lisää dramaattisesti vaikuttaa

Kras

flox/flox

;

IL-6

-/-

.

doi:10.1371/journal.pone.0080885.s001

(TIF)

Figure S2. **

P

0,01. p53

flox/flox

;

IL-6

-/-

.

doi:10.1371/journal.pone.0080885.s003

(TIFF)

Figure p53

flox/flox

;

IL-6

-/-

.

doi:10.1371/journal.pone.0080885.s004

(TIF)

Figure . p53

flox/flox

;

IL-6

-/-

.

doi:10.1371/journal.pone.0080885.s005

(TIF)

Figure p53

flox/flox

;

IL-6

-/-

.

doi:10.1371/journal.pone.0080885.s006

(TIFF)

Table S1.