Krooninen sairaus

tiivistelmä

seriini /treoniini-kinaasi 31 (STK31) on yhtä uusista syövän /kivesantigeenien joille sen biologisia toimintoja edelleen suurelta osin epäselvä. Tässä osoitamme, että STK31 yli-ilmennetään monissa ihmisen peräsuolen syövän solulinjoissa ja kudoksissa. STK31 lokalisoituu pericentrin vuonna centrosomal alueen kaikissa vaiheissa solusyklin. Mielenkiintoista, kun solut läpikäyvät mitoosin, STK31 myös paikantuu sentromeerien, Keski kara, ja keskiosalla. Tämä lokalisointi toiminta on samanlainen kuin kromosomaalisen matkustajan proteiineja, joiden tiedetään olevan tärkeitä pelaajat kehräkokoonpanon tarkistuspisteen. Ilmaisu on STK31 on solusyklin riippuva säätelemällä oletetun D-box lähellä sen C-pään alueen. Ektooppisesti-ilmaisi STK31-GFP lisää solujen vaeltamiseen ja invasiivisia kyky muuttamatta leviämisen nopeus syöpäsolujen, kun taas knockdown endogeenistä STK31 by lentivirusta johdettuja shRNA johtaa mikrotubulusten kokoonpanoa vikoja, jotka pidentävät kestoa mitoosin ja aiheuttaa apoptoosin. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että poikkeava ilmentyminen STK31 edistää kasvainten muodostumiseen somaattisissa syöpäsoluja. STK31 voisi siten toimia mahdollisena terapeuttisena kohteena ihmisen somaattisten syövissä.

Citation: Kuo PL, Huang YL, Hsieh CC-J, Lee JC, Lin BW, Hung LY (2014) STK31 on solu-Cycle säätelemä proteiini, joka edistää tuumorigeenisyyteen epiteelisyöpäsolujen. PLoS ONE 9 (3): e93303. doi: 10,1371 /journal.pone.0093303

Editor: Cayetano Gonzalez, tutkimusinstituutti biolääketieteen, Espanjassa

vastaanotettu: 30 joulukuu 2013; Hyväksytty: 03 maaliskuu 2014; Julkaistu 25 maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Kuo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia NSC101-2325-B-006-001 ja NSC102-2325-B-006-001 National Science neuvosto myöntää IBMS-CRC100-P01 peräisin Academia Sinica, projekti edistäminen Academic Excellence ja kehittäminen maailmanluokan Research Centers , ja Center for Infectious Disease ja signaalitransduktioreittiin Research, National Cheng Kung yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

solunjakautumisen nisäkässoluissa säätelee useiden proteiinikinaasien, jotka ohjaavat sen etenemistä eri vaiheissa solusyklin. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että misregulation solusyklikinaasien voi aiheuttaa rajoittamattoman leviämisen ja poikkeava jakautuminen solujen johtaa genomin epästabiilisuuden, jotka molemmat ovat tunnusmerkkejä syövän [1], [2]. Kertyneet näyttö osoittaa, että mitoosi kinaasit ovat vastuussa solujen suojaamiseen kromosomiaberraatiot ja aneuploidia-. Mitoosi kinaasien kuten Polo kaltaiset kinaasit (PLK) ja Aurora-kinaasien osallistuvat säännellään sentrosomimäärän sykli ja mitoosisukkulan muodostumisen. Kun kaksisuuntainen kara on muodostettu, kehräkokoonpanon tarkistuspiste (SAC) proteiineja, kuten Bub1 ja bubR1: tä tarvitaan asianmukaisen kaksisuuntaisen suunta sisko kromatidien ja asianmukainen yhteyksiä Kinetokori ja karan mikrotubuleihin [2]. Muutoksia signalointireiteissä mukana näissä mitoosi kinaasien voi johtaa poistumista mitoosin joiden seurauksena poikkeavaan kromosomiluku, mikä aneuploidiaa ja lopulta syöpä [3].

sentrosomimäärän on pidetty tärkeänä osana eläinten solunjakautuminen. Se koostuu kahdesta keskusjyvänen ortogonaalisella järjestely ympäröi elektronitiheisiin pericentriolar materiaali (PCM) [4], [5]. Monet centrosomal proteiinit sijaitsevat PCM on löydetty, ja ne tärkeitä rooleja, jotka ovat erittäin korreloivat centrosomal toiminnot [6]. Nämä centrosomal proteiinit voidaan jakaa eri luokkaan niiden toimintoja. Ensimmäisen luokan käsittää proteiineja, jotka toimivat tukirunkoja kokoonpanoon muiden proteiinien, ja näin ollen tarvitaan säilyttämään rakenteen sentrosomin. On myös joukko proteiineja, jotka toimivat mikrotubulusten nukleaatioon. Lopuksi monet säätelymolekyyleja, kuten kinaasien, fosfataasien ja molekyylejä, jotka osallisena solusyklin säätelyssä [7]. Useat todistelinjat osoittavat, että poikkeava ekspressio centrosomal proteiinien tai sentrosomin toimintahäiriö voidaan yhdistää kasvaimien syntyyn [8] – [10].

kohdistaminen mitoosi-kinaasien on pidetty erittäin onnistunut strategia syöpähoidon [11 ], [12]. Pienen molekyylipainon inhibiittorit kohdistuvat CDK, Aurora-kinaasien, tai PLK on tutkittu niiden kyvyn keskeyttää syövän kehittymiseen [13] – [16]. Nämä estävien yhdisteiden osoittavat tehoa

in vivo

ihmisen tuumoriksenografteja, ja jotkut niistä ovat tutkitaan parhaillaan kliinisissä kokeissa [17]. Toisaalta, syövän hoidossa, joihin liittyy immunoterapia käyttäen T-soluja, jotka tunnistavat syöpään antigeenejä, on tullut lupaava syövän hoitomuoto [18], [19]. Näin ollen, tunnistaminen uusien tuumoriantigeeneistä ja kasvaimen spesifisten T-soluepitooppien on hyödyllistä syövän immunoterapiassa. Yksi ryhmä tuumoriantigeenejä kutsutaan syöpä /kivesantigeenien (CTA: t), sen ilmentyminen tavallisesti on rajattu kiveksissä [20]. Immunogeeninen syöpärokotteisiin kohdistaminen Toimintakehotukset eivät aiheuta merkittävää vaaraa haittatapahtumien koska niiden ilmaisun rajoittuvat mies sukusolut, immunologisesti etuoikeutettu kehon, ja ovat siten ihanteellisia kohteita syövän hoitamiseen.

edellisen raportin osoitti että

seriini /treoniinikinaasi 31

(

STK31

) mRNA-tasolla kivesten potilaiden kudosten ilman kypsien sukusoluilla on merkittävästi pienempi kuin normaalin miehet [21]. Aiempi raportti osoitti, että STK31 on uusi CTA [22]. Täällä me tutkimme osallistumista ja fysiologinen rooli STK31 syövän kehittymisessä. Olemme havainneet, että STK31 paikantuu sentrosomin kaikissa vaiheissa solusyklin. Mitoosin aikana, STK31 osakkeita vastaavia subsellulaarisen lokalisoinneissa kanssa mitoosi kinaasien Aurora-B ja PLK1. Solusyklin riippuva ilmentymä STK31 ohjataan ubikitiinistä proteasomin hajoamista. Ehtyminen STK31 vaikuttanut mikrotubulusten kokoonpanoa prosessin aikana interphase, mikä viittaa sen mahdollisen roolin mikrotubulusten nukleaatioon. Lisäksi puutos STK31 viivästyksiä mitoosi etenemistä, johtaa epäonnistumiseen poistua mitoosia, ja johtaa apoptoosin. Yhdessä meidän tutkimus tarjoaa mahdollisen syövän terapeuttista strategiaa, jota voidaan harkita tulevaisuudessa sovelluksia.

Materiaalit ja menetelmät

potilasnäytteiden

paksu- ja peräsuolisyövän kudokset saatiin mukaisesti Helsingin julistuksen. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of National Cheng Kung yliopistollisessa sairaalassa. Kirjallisen suostumus luovuttajalta säilytettiin National Cheng Kung yliopistollisen sairaalan tietokantaan ja käyttää tutkimustarkoituksiin.

Plasmidit, Cell Lines ja transfektio

Human STK31 täyspitkä cDNA kloonattiin vektoriin pEGFP -N 1. AZ521, ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinja, viljeltiin DMEM-alustassa (Sigma) plus 10% MEM (GIBCO) ja 1% NEAA: ta (Bio-West). HCT116, ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinjaa, pidettiin RPMI-1640-alustassa (GIBCO). Kaikki alustat täydennettiin 10% FBS: ää (Bioscience), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä (GIBCO). Ohimeneviä transfektiosta solut kasvatettiin 80% konfluenssiin ja transfektoitiin väliaikaisesti STK31-GFP käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollan.

Lentivirusvektorikonstruktit Short-hiusneula-RNA (shRNA) Transfektio

pLKO.1 Mission lyhyet RNA (shRNA) vektorit vastaan ​​

STK31

(TRCN0000003274, TRCN0000003275, TRCN0000003276 ja TRCN0000028838-A4, TRCN0000028841-B4, TRCN0000028758-F3, TRCN0000028817-G1, TRCN0000028819-H2) oli saatu kansallisesta RNAi Core Facility (Institute of Molecular Biology /Perimän Research Center, Academia Sinica, Taiwan). Tehokkuus

STK31

shRNA seurattiin Sekä Immunoblotvärjäys ja Q-PCR-analyysi (kuviot S2A ja S2B). Sillä STK31 pudotus, soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin ja infektoidaan

STK31

shRNAs jonka infektiokertoimella (MOI) neljän täydennetty 8 ug /ml polybreeniä (Sigma). 48 tunnin kuluttua infektion, 1 ug /ml puromysiiniä (Sigma) lisättiin kasvualustaan ​​valintaa varten. Sen jälkeen vielä 48 tunnin viljelyn jälkeen solut kerättiin kokonais-RNA puhdistuksen tai kokosolulysaattia uuttamalla.

Western Blot-analyysi, ja vasta-aineet

Solulysaatit valmistettiin lyysipuskurissa (150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% Na-deoksikolaattia, 1 mM EDTA, ja 50 mM Tris-HCl; pH 7,4), johon on lisätty 1X proteaasiestäjäseostabletit (Roche Molecular Diagnostics) ja 1X fosfataasinestäjällä cocktail (P0044, Sigma). Anti-α-tubuliinin (DM1A), anti-γ-tubuliinin (GTU88), anti-aktiini, anti-GAPDH, anti-sykliini B, anti-fosfo-Histone 3 /seriini 10, ja anti-Aurora-B-vasta-aineet hankittiin Sigma. Anti-myc-vasta-aine saatiin yhtiöltä Invitrogen. Anti-pericentrin (Ab4448) hankittiin Abcam. Anti-GFP-vasta-aine (JL-8) hankittiin Clontech.

Real Time PCR ja alukkeet

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan kuva. Käänteistranskriptio suoritettiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttäen IMPROM-II Reverse Transcriptase (Promega). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR etu qPCR esiseos (Bio-Rad), joka CFX96 Real-Time System ja C1000 lämpösyklilaitteeseen (BIO-RAD), ja reaktio suoritettiin käyttäen seuraavia olosuhteita 44 sykliä: 95 ° C 15 s, 60 ° C: ssa 10 s, ja 72 ° C: ssa 5 s. Sekvenssit alukkeiden käyttää, ovat seuraavat: eteenpäin aluke ja käänteinen aluke ihmisten

STK31

ovat 5′-CAGGACCAGAAACTGATTGAAG-3 ’ja 5′-TCCATTCAAAGAAGCTGGAGTAG-3’, vastaavasti. Reaaliaikainen fluoresenssin seurantaa ja sulamiskäyräanalyysi suoritettiin Bio-Rad mukaan valmistajan suositusten (Bio-Rad). Tiedot analysoitiin Bio-Rad CFX Manager -ohjelmiston versio 1.5 määrittää kynnyssykli (

Cp

) edellä tausta kunkin reaktion. Suhteellinen määrä kohdegeenin normalisoitiin kuin

aktiini

saman cDNA: sta.

Immunofluoresenssivärjäys

Soluja kasvatettiin peitinlaseilla huuhdeltiin PBS: llä ja kiinnitettiin sitten 3,7% formaldehydiä 6 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, tai vahvistetaan jääkylmää metanolia /asetoni (w /w, 01:01) 10 minuutin ajan -20 ° C: ssa. Kiinnityksen jälkeen solut tehtiin läpäiseviksi inkuboimalla 0,01% Tween-20 PBS: ssa 3-5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Havaitsemiseksi sentrosomien tai mikrotubulusten, solut värjättiin monoklonaalisella anti-γ-tubuliinia (GTU-88, 1:200 laimennus) tai anti-α-tubuliinin (DM1A, 1:200 laimennus), vastaavasti, jonka jälkeen inkuboitiin Alexa Fluor 488 tai 568 kanin anti-hiiri-IgG (1:200 laimennus, Invitrogen). Havaitsemaan endogeenista STK31, solut värjättiin monoklonaalisella hiiren STK31 vasta-ainetta, 1G10, jonka jälkeen inkuboitiin Alexa Fluor 488 tai 568 kanin anti-hiiri-IgG. Kuvat havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (Personal DV Applied Precision, Issaquah, WA), jossa on dekonvoluutiolla toiminto (

softWORX

).

virtaussytometria

AZ521 soluja erilaisilla solusyklin käsittely kiinnitettiin 80% etanolilla 24 h -20 ° C: ssa ja värjättiin sitten propidiumjodidilla (PI) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solusyklin vaihe jaettiin analysoitiin FACS Calibur väline (BD Biosciences).

TUNEL Pitoisuus

Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 PBS: ssä mukana 0,1% natriumsitraattia. TUNEL Testi suoritettiin jossa

In situ

Cell Death Detection Kit, TMR, (Roche) valmistajan menettelyohjeen.

haavanparantumis- Pitoisuus

AZ521 soluja ja HCT116 solut ympättiin 3 cm: n maljoille, jonka pitoisuus on 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti. Sen jälkeen 24 h transfektion GFP ja GFP-STK31 solut haavoittui varovaisella tip-naarmuuntumista. Leveys leesion vaihteli 500 pm 1 mm ja sen kuvantaa mikroskoopilla 0 h, 6 h, 12 h, ja 24 h. Migration tehokkuutta mitattiin haavan välein.

TranswellTM Pitoisuus

siirtokuoppaan, jonka huokoskoko on 3,0 um (Millipore, Bedford, MA) päällystettiin 5 ug /cm

2 kollageenia geeli ja kuivattiin ilmassa yön yli tai 0,5 mg /ml matrigeeliä (BD biosciences) 1 h. GFP- tai GFP-STK31-transfektoidut solut suspendoitiin uudelleen elatusaineissa ilman 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja ympättiin transwell laitettiin 24-kuoppalevylle, joka sisälsi elatusainetta, jossa oli 10% FBS: ää. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, Transvvell- huuhdeltiin PBS: llä ja kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi suodattimet poistettiin kuopista ja asennettu pidentää Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää reagenssi DAPI, ja solujen suodattimet laskettiin alle immunofluoresenssilla mikroskoopilla (Olympus, BX51).

Tulokset

Expression of STK31 ihmisen eri Cancer Cell Lines and Clinical paksu- ja kudokset

STK31

yliekspressio kliinisissä peräsuolen syöpä näytteistä on aiemmin kuvattu [23]. Analysoida ekspression

STK31

syöpäsolulinjoissa, Q-PCR suoritettiin ihmisen syöpäsolulinjoissa AZ521, A549, HeLa, ja A375. Näistä, joka on peräisin eri kudoksista, AZ521, mahalaukun adenokarsinooma, osoitti korkeinta

STK31

mRNA: n ilmentymisen (kuvio 1A). Ilmaus

STK31

mRNA arvioitiin edelleen monissa paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja verrattuna AZ521. Tulokset osoittivat, että kaikki nämä solut ilmensivät korkeita

STK31

(kuvio 1 B). Sama tulos esiintyi kliinisissä peräsuolen kudoksiin, mikä ilmaisi korkea

STK31

vuonna syöpäkudokset suhteessa normaaleissa kudoksissa saman henkilön (kuvio 1 C). Joka perustuu korkean endogeenisen

STK31

mRNA, AZ521 käytettiin solujen mallia tässä tutkimuksessa.

(A) Kokonais-RNA ihmisen neljän syöpäsolulinjasta eri kudoksissa, AZ521 ( ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinja), A549 (ihmisen keuhkosyöpä solulinja), HeLa (ihmisen kohdunkaulan syövän solulinja), A375 (ihmisen melanooma syövän solulinja), ja yksi normaalin ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen (normaali), joka oli eristetty reaaliaikaiseen PCR määrittää

STK31

mRNA-tasoja.

STK31

oli merkittävästi yli-ilmentyy ihmisen mahasyövän solulinja, AZ521, verrattuna muihin ihmisen syöpäsolulinjoja. (B) Kokonais-RNA valmistettiin kuusi mahasyövän solulinjoja käytetään havaitsemaan

STK31

mRNA: n ilmentymisen taso reaaliaikaisella PCR kuvatulla A (C) Pariksi paksu- ja peräsuolisyövän kudosten (N, normaali kudos; T, kasvainkudos) kerättiin eristää kokonais-RNA: havaitsemiseksi ekspressiotasot

STK31

RT-PCR: llä.

Actin

käytettiin sisäisenä kontrollina. Kahdeksan edustaja pariksi näytteitä näytettiin.

Endogeeniset STK31 sijaitsee sentrosomimäärän, Kinetokori, Keski Karan ja keskiosalla aikana Mitosis

Jotta voitaisiin edelleen tutkia fysiologisia rooleja STK31 vuonna somaattisten syöpäsolut, erityisiä STK31 monoklonaalisia (1G10, kuvio 2A) ja polyklonaalisia (19717) vasta-aineita vastaan ​​tuotettujen ihmisen eri STK31 peptidit (kuvio 2A, ylempi). Spesifisyys näiden kahden vasta-aineen osoitettiin Western blot-analyysi yhteensä lysaatit AZ521 solujen eksogeenisesti EGFP: tä ilmentämään-leimatun ihmisen STK31-proteiinia (STK31-GFP) tai hiiren Stk31 proteiinia (Stk31-GFP) (kuvio 2A). Tulokset osoittavat, että endogeeninen STK31 (kuvio 2A, kaista 7), eksogeenisen STK31-GFP (kuvio 2A, kaista 8), ja Stk31-GFP-fuusioproteiini (kuvio 2A, kaista 9) voidaan havaita, että monoklonaalinen vasta-aine, 1G10. Polyklonaalisia STK31 vasta-aineita, 19717, voi tunnistaa vain eksogeenisen STK31-GFP (kuvio 2A, kaista 5), ​​mutta ei endogeenisen STK31 ja Stk31-GFP (kuvio 2A, kaistat 4 ja 6). Spesifisyyden monoklonaalinen vasta-aine, 1G10, A549-solut ja AZ521 solujen vahvistettiin myös havaita endogeenisen STK31 (kuvio S1). Differentiaalinen proteiini tasot A549-solut ja AZ521 solut ovat linjassa mRNA: n ilmentymisen määritettynä reaaliaikaisen käänteistranskriptio-PCR (Kuva 1A).

(A) Kaavamainen esitys STK31 polypeptidin. Kaksi epitooppia, aminohapot 231-350 ja 982-996, käytettiin antigeenejä tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta, 1G10, ja polyklonaaliset vasta-aineet, 19717, vastaavasti. Puhdistuksen jälkeen spesifisyys 19717 (kaistat 4-6) ja 1G10 (kaistat 7-9), on vahvistettu immunoblottauksella (IB) analyysillä käyttäen AZ521 yhteensä lysaattia (kaistat 1, 4, ja 7), STK31-GFP (sisältää ihmisen muodossa STK31 kaistat 2, 5, ja 8), tai Stk31-GFP (sisältää hiiren muodossa Stk31 kaistat 3, 6, ja 9) transfektoitiin AZ521 solulysaateista. Anti-GFP käytettiin positiivisena kontrollina IB ekspression havaitsemiseksi STK31-GFP: n ja Stk31-GFP (kaistat 1-3). α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. (B) AZ521 solut kahdesti värjättiin 1G10 (vihreä) ja pericentrin (punainen, tunnettu centrosomal proteiini). DNA visualisoitiin käyttämällä DAPI (sininen). Profaasissa, a-d; metafaasissa, e-h; Anaphase, i-l; ja telophase, m-s. Sulautuneen kuvat näkyvät oikealla (d, h, l, ja p). (C) AZ521 solut yhdessä immunovärjättiin 1G10 (vihreä, a-e) ja anti-Aurora B (punainen, f-j) vasta-aineita. Sulautuneella kuvat näkyvät (k-o). (D) Solut kaksinkertaisesti värjättiin STK31 (vihreä), Aurora-B (punainen), ja DNA (sininen). Vain sulautunut kuvia näytettiin. Nuolet osoitti rinnakkaispaikantumisen on STK31 ja Aurora-B koko solusyklin.

perehtyä biologisen toiminnan STK31 syövän solujen solunosasijaintia endogeenisen STK31 määritettiin. AZ521 solut yhdessä immunovärjättiin vasta-aineiden STK31 (1G10) ja pericentrin (PCNT), joka on sentrosomin liittyvä proteiini, jonka immunofluoresenssianalyysillä. Aikana prophase ja metafaasissa, STK31 yhteistyössä paikallistaa PCNT, mikä viittaa yhdessä karan navat (kuva 2B-h). Lisäksi, STK31 havaittiin asumaan sentromeerisen alueen aikana metafaasissa (kuvio 2B, e-h), Karan midzone aikana anafaasia (kuvio 2B, i-l), ja konsentroitiin lopuksi on keskiosalla telofaasin aikana hitaasti liikkuvista (kuvio 2B, m- p).

edelleen varmistamiseksi lokalisoinnin STK31 mitoosin aikana, AZ521 solut ko-immunovärjättiin vasta-aineiden STK31 ja kromosomaalinen matkustaja kompleksi (CPC) proteiini, Aurora-B (kuvio 2C). CPC koostuu Aurora-B-kinaasin, INCENP, elossa, ja borealin [24], ja sen tiedetään kulkeutuvan sisäinen sentromeerien karan midzone ja päiväntasaajan solujen aivokuori aikana metafaasivaiheen-Anaphase siirtyminen. Immunofluoresenssivärjäyksen osoitti, että Aurora-B näyttää solun uudelleen lokalisointi käyttäytyminen, joka on aiemmissa tutkimuksissa (kuvio 2C, f-j). Huomattavaa on, STK31 värjäytymistä (kuvio 2C, a-e) havaittiin sovitettava paikallistaa Aurora-B on sentromeerisen alueella, kara-alue, ja keskiosalla (kuvio 2C, k-o). Huomaa, että lisäksi kolokalisaation Aurora-B, STK31 todettiin myös vahvat signaalit karan navat (kuvio 2D, nuolet). Tämä subsellulaariseen jakelu STK31 on samanlainen kuin Polo kaltainen kinaasi 1 (PLK1) [25].

Expression of STK31 on Cell Cycle riippuvainen

tutkimiseksi solusyklin ekspressiokuvio ja STK31, AZ521 solut synkronoidaan nokodatsoli (NZ) tai kahden tymidiiniä hoidon varmistettiin virtaussytometrillä (kuvio 3A), ja ekspressio endogeenisen STK31-proteiinin määritettiin Western blot -analyysillä. Tulos osoitti, että STK31 proteiinin ilmentyminen väheni G2 vaiheessa ja alimmilleen vuoden M vaiheessa (kuvio 3B). Western blot analyysi kokosoluliuotteista vapautuu nokodatsoli hoito osoittivat, että STK31-proteiinin tasot olivat alhaisimmat NZ-käsitellyissä soluissa (kuvio 3C, kaista 2), ja sen jälkeen vapauttaa, STK31 asteittain mitoosin aikana (kuvio 3C, kaistat 3-10). Lopettamisen jälkeen mitoosia, solusyklin uudelleen tuli G1 vaiheeseen, joka oli merkitty sykliini-B1 hajoamista 180 min vapautumisen jälkeen, ja STK31 taso nousi (kuvio 3C, kaista 7). Ektooppisesti-ilmaisi STK31-GFP esittää samaa ilmaisua kuvion endogeenisten STK31 (kuvio 3D). Kaksi keskeistä strategioita osallistuvat solusyklin sääntelemättömien proteiineja. Ensinnäkin proteiini runsaus voidaan säätää transkription tasolla. Toiseksi, proteiini liikevaihtoaan proteolyyttisen hajoamisen, mikä on tärkein mekanismi, joka säätelee irtautuminen mitoosia, on kohdistettu APC /C-Cdh1 kompleksin kautta tuhoamista laatikko (D-box). Ensin tarkistetaan endogeenistä

STK31

mRNA Q-PCR, ja totesi, että

STK31

mRNA väheni prometaphase (kuvio 3E). Mielenkiintoista on, että vaikka proteiinin ilmentymistä STK31 on esitetty alemmalla tasolla G2 vaiheessa (kuvio 3B), ja mRNA-tasolla ei ole mitään selvää ero asynchronized soluja (kuvio 3E). Lisäksi analysoimalla aminohapposekvenssi STK31, olemme huomanneet, että STK31 sisältää konservoituneita D-box motiivin Arg

643 kanta (R

643) (kuvio 4A). Vahvistamaan, että alentunut taso STK31 at mitoosin exit johtuu APC /C-induced ubikitiinistä proteasomin hajoamista, D-box mutantti GFP-STK31 muodostettiin tutkimaan solusyklin ekspressiokuviota (kuvio 4A). Kuviosta 4B, ilmentymisen STK31-GFP D-box-mutantti oli merkittävästi lisääntynyt G2 vaiheessa suhteessa villityypin STK31-GFP.

(A) Asynchronized tai nokodatsoli (NZ) hoidetun AZ521 soluja kerätyt analysoimaan solukierron väestö virtaussytometrialla. Prosenttiosuudet G1, S ja G2 /M on esitetty alla. Pyöreä-up-solujen jälkeen NZ hoidon olivat shake-off ja määritellään M vaihe soluja, ja kiinnittyneet solut jälkeen jäljellä shake-off pidettiin G2 vaihe. (B) kokonaismäärä AZ521 lysaatit asynchronized (Asy), M vaihe (M), ja G2 vaiheessa solut kerättiin Western blot -analyysillä anti-STK31 polyklonaalisia vasta-aineita. Fosfo-histoni H3 seriini 10 (P-H3 /S10) on merkkiaine mitoosi-soluja. (C) AZ521 solut vapautetaan nokodatsoli hoidon eri ajankohtina (0-360 min) kerättiin ekspression analysoimiseksi kuvio STK31 IB analyysi. Anti-sykliini-B ja anti-fosfo-histoni H3 (p-H3 /S10) vasta-aineita käytettiin mitoottisiin markkereita. (D) AZ521 soluja ektooppisesti ilmentävät GFP tai STK31-GFP hoidettiin nokodatsoli. M vaihe round-up solut kerättiin shake-off, ja jäävät kiinni solut kerättiin G2 vaihe. Asynchronized soluja (Asyn) on esitetty. α-tubuliinia tai GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina IB. (E) Kokonais-RNA eri solusyklin vaiheissa AZ521 kerättiin analysoida ekspression

STK31

mRNA: real-time PCR. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin (N = 3), ja välineet, joilla keskivirheet on esitetty.

(A) oletetun D-box-motiivi sijaitsee aminohapot 643-651 ja STK31. Konservoituneita asema, Arg643 (R643), sisällä D-box näytettiin. (B) Asynchronized (Asy), M vaihe, ja G2 vaihe AZ521 solujen STK31-GFP tai STK31-GFP /D-box mutantti ilmaisun kerättiin suorittamaan IB analyysi käyttäen anti-GFP-vasta. Ekspressiotasot STK31-GFP näytetään suhde. Fosfo-histoni H3 seriini 10 (P-H3 /S10) on merkkiaine mitoosi-soluja. GAPDH on latauskontrollina.

yli-ilmentyminen STK31 Lisäykset Cell Migration ja invasiivisuus

Koska yliekspressio STK31 syöpäsolulinjoissa ja peräsuolen syövän kudoksissa (kuvio 1) fysiologinen rooli STK31 kasvainten synnyssä oli alle tutkittiin ektooppisesti-yli-ilmentyy STK31-GFP. STK31-GFP ei lisätä solujen lisääntymistä korko AZ521 ja HTC116 soluja (kuvio 5A) tai solusyklin jakautumisen (kuvio 5B). Kuitenkin yli-ilmentyminen STK31-GFP teki parantaa solumigraation kyky AZ521 ja HTC116 (kuvio 5C). Perustuen transwell muuttoliikettä ja invaasio määrityksissä, yli-ilmentynyt STK31-GFP mahdollisti AZ521 ja HTC116 solujen läpi matrigeelin tai COLLEGEN-päällystettyihin kuoppiin (kuvio 5D). Q-PCR-analyysi, ilmentymistason

matrix metallopeptidaasi 2

(

MMP2

), muuttoliikkeen markkeri, korotettiin STK31-GFP-ilmaisi soluissa, mutta enimmäkseen masentunut sh

STK31

-transfected soluja (kuvio 5E).

(A) Equal määrä AZ521 tai HCT116 solujen GFP tai STK31-GFP: n ilmentymisen ympättiin, ja solujen kasvua seurattiin laskemalla elävien solujen numerot ilmoitettu aika. Kolme riippumatonta kokeet suoritettiin ja niiden määrälliset tulokset on esitetty. Ilmaus GFP tai STK31-GFP päivänä 1 ja päivänä 5 havaittiin IB käyttäen anti-GFP-vasta-ainetta. α-tubuliinin on sisäinen kontrolli. (B) AZ521 solujen GFP tai STK31-GFP: n ilmentymisen kerättiin analysoida solupopulaation jakautuminen virtaussytometrialla. (C) AZ521 tai HCT116-solujen GFP tai STK31-GFP: n ilmentymisen käytettiin suorittamaan haavan paranemista migraatiokokeessa. Aikaväli solumigraation eri ajankohtina (0-24 h) mitattiin ja se on esitetty. Kvantitatiiviset tulokset esitetään alla. (D) AZ521 (ylempi) tai HCT116 (alempi) solujen GFP tai STK31-GFP: n ilmentymisen ympättiin tyypin II kollageenilla päällystetty tai Matrigel päällystettyä trans-kuoppiin suorittamaan solumigraation tai invaasion määrityksissä. Sen jälkeen värjätään DAPI, DNA väriaineella, solut laskettiin ja määrälliset tulokset on esitetty. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin. (E) transfektoidut solut STK31-GFP tai tartunnan lentiviraalinen-pohjainen

STK31

shRNA (sh

STK31

) kerättiin havaitsemiseksi ilmauksia

MMP-2

by reaaliaikainen PCR (oikealla). Yliekspressoitu STK31-GFP havaittiin IB-analyysi (vasemmalla). Ilmaisu on

STK31

sh

STK31

solut määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä ja normalisoitu

β-aktiini

(keskellä).

ehtyminen STK31 Syyt Microtubule Assembly Viat aikana Interphase

STK31 oletettiin ottamaan mikroputkiorganisaatiota pohjalta sen centrosomal lokalisoinnin. Tämän testaamiseksi käytimme kylmäkäsittelyllä aiheuttaa mikroputkidepolymeroitumi- nen ja sitten indusoida mikrotubulusten uudelleen kasvuun. Solut fiksattiin ja immunovärjättiin anti-α-tubuliinin tarkkailla kokoamista ja venymä mikrotubulusten. Solut, joissa

STK31

shRNA koodattu EGFP (sh

STK31

GFP, The knockdown tehokkuus katso kuva S2B) osoitti vikoja kolmella tasolla: pieni /ei vikoja (Kuva S3A), kohtalainen vikoja (Kuva S3B) ja vakavia vikoja (Kuva S3C). Vertasimme transfektoiduissa soluissa sh

STK31

GFP ja solut transfektoitiin Luciferase shRNA koodattu EGFP (shLuc-

GFP

) kontrolleina, ja määritetään solujen lukumäärä kullekin ( Kuva S3D). Tulokset osoittivat, että solut köyhdytetyn STK31 pystynyt osoittamaan asianmukaisesta järjestämisestä mikrotubulusten.

Euroopan Knockdown Expression of STK31 mukaan shRNA Tulokset Mitoottista Progression Viive GC-1 Cell

analysoida, miten ehtyminen STK31 vaikuttaa mitoosi etenemistä, käytimme elävien solujen nopeutus mikroskopia seurata kohtalo GC-1-solut transfektoitu sh

STK31

GFP ja vertasi niitä, jotka on transfektoitu sh

Luc

GFP (kuva S4) jälkeen vapautuu kaksinkertainen tymidiinin lohko. Me ajoitettu kesto mitoosi etenemisen kromosomista tiivistyminen (mitoosi merkintä) ja sytokineesiin (mitoosi exit). Huomasimme, että se kesti 185 min varten sh

Luc

GFP solun loppuun mitoosin (kuviot S4A-S4H), kun taas 357 min varten tarvitaan sh

STK31

GFP solun päästä telophase (kuviot S4i-S4P). Keston välein transfektoitujen solujen sh

STK31

GFP kasvoi kaksinkertaiseksi verrattuna transfektion sh

Luc

GFP (kuvio S4, P ja H, vastaavasti). Tämä viittaa siihen, että STK31 puute aiheuttaa viiveen mitoosi etenemisen GC-1 solun.

Euroopan Knockdown Expression of STK31 mukaan shRNA Syyt Mitoottista Katastrofi ja johtaa apoptoosi Syöpäsolut

sitten tutki mahdollista roolia STK31 käyttäen knockdown lähestymistapaa. Western-blottaus suoritettiin AZ521 infektoitujen solujen lentiviruksen STK31 shRNA (sh

STK31

) saatu Academia Sinica testata taintumisen tehokkuutta (kuvio 6A). Ensin tarkistetaan vaikutus lentiviruksen sh

STK31

infektoiduista soluista häiritsee solupopulaatio takia solunosasijaintia ja solusyklin riippuvaista ekspressiokuviota STK31. Virtaussytometria-analyysi osoitti, että lisääntynyt subG1 ja laski G2 /M-havaittiin lentiviruksen sh

STK31

infektoiduista soluista (kuva 6B). Vahvistaa, onko STK31 puutos johtaa apoptoosin, sekä aktiivinen kaspaasi 3 ja TUNEL-määritys suoritettiin AZ521 infektoitujen solujen lentiviruksen sh

STK31

. Vuodesta kuviot 6C ja 6D, STK31 pudotus solut osoittivat selvää apoptoosin väestöstä.

(A) 72 tunnin kuluttua infektiosta lentiviruksesta-pohjainen

STK31

shRNA (sh

STK31

) tai kontrolli shRNA (shCtrl), AZ521 solut kerättiin määrittämiseksi STK31 ilmaisua IB. (B-D) ohjaus (shCtrl) tai sh

STK31

infektoiduista soluista (sh

STK31

) kerättiin analysoimiseksi solusyklin populaation virtaussytometrialla (B), havaitsemaan ilmaisu aktiivisen kaspaasi-3 IB (C), ja suorittaa TUNEL-määritys (D). Solut käsiteltiin DNaasi I käytettiin positiivisina kontrolleina C ja D. soluja ilman hoitoa olivat negatiivisten kontrollien TUNEL määrityksessä. Punainen signaali 6D edustaa apoptoottisia soluja. ***,

P

arvo 0,001. (E) Aikaväli kuvia transfektoitujen solujen

STK31

shRNA koodattu EGFP (sh

STK31

GFP) (A-H). Solut synkronoitu nokodatsoli (150 ng /ml) 16 tuntia. Vapautumisen jälkeen nokodatsolin soluja havaittiin nopeutus mikroskoopilla. Naapurimaa transfektoimattomissa solut (merkitty valkoisella nuolella) onnistuneesti koki mitoosin ja täydellinen sytokineesi, kun taas knockdown solun (merkitty keltaisella nuolella) pysyi pitkään mitoosi kaltainen vaiheessa. Me ajoitettu kesto mitoosin ydin- kirjekuori erittely (0 min, a) ja totesi, että 272 min knockdown solu päätyneet apoptoottisen kaltainen toiminto (h).

lisäksi pyytänyt onko ehtyminen STK31 indusoi sama vaikutus mitoosi etenemiseen syöpäsoluissa. Samoin Aikaintervallitallennuksen mikroskopia tarkkailuun käytettiin AZ521 transfektoitujen solujen sh

STK31

GFP. Soluja käsiteltiin nokodatsoli 16 tuntia ja sitten tehtiin elävien solujen kuvantamiseen. SH

STK31

GFP solut eivät poistua mitoosia, kun taas kontrolli solut onnistuneesti päätökseen mitoosin ja tuli G1 vaiheeseen (kuvio 6E).