Krooninen sairaus

tiivistelmä

Puute kolmiulotteinen (3-D) suurikapasiteettisten (HT) seulontamäärityksille suunniteltu tunnistamaan syövän vastaisen hyökkäyksen lääkkeet on merkittävä este vähentää syöpään liittyvän kuolleisuuden, jossa keskeinen haaste on määrityksessä standardointia. Esitetty on kehittää uusi 3-D invaasiomääritys HT potentiaalia, johon liittyy ympäröivä solu-kollageenin pallojen sisällä kollageenia luoda 3-D ympäristössä, jonka kautta solut voivat hyökätä. Standardointi saavutettiin suunnittelemalla työstää 96-kuoppalevylle luoda tarkasti nimetty paikka solun kollageenin palloja ja käyttämällä dialdehydin dekstraania estävän kollageenia supistuminen, pysyisi tasaisena koko ja muoto. Tämä mahdollistaa automatisoitu lukema määrittämiseen vaikutuksen estävä yhdisteiden syöpäsoluinvaasiota. Herkkyys osoitettiin kykyä erottaa vaihtelevaan invasiivisuus syöpäsolulinjojen, ja kestävyys määritettiin laskemalla Z-tekijä. Z-kerroin 0,65 on saatu vertaamalla vaikutuksia DMSO ja anti-β1-integriini-vasta-aine, joka on inhiboiva reagenssia, on hyökkäys DU145 syöpäsoluja, mikä viittaa siihen, tämä uusi määritys on sopiva suuren mittakaavan lääkekehityksen. Todisteena Periaatteessa NCI Diversity Yhdiste Kirjasto seulottiin ihmisen invasiivisia syöpäsoluja. Yhdeksän yhdisteitä, joilla suuri teho ja lievästi tunnistettiin myös DX-52-1, yhdiste aiemmin raportoitu estävän solujen vaeltamiseen, kriittinen tekijä syövän invaasio. Tulokset osoittavat, että tämä innovatiivinen HT-alusta on yksinkertainen, tarkka ja helppo jäljitellä 3-D invaasiomääritys varten syöpälääke löytö.

Citation: Evensen NA, Li J, Yang J, Yu X, Sampson NS, Zucker S, et ai. (2013) kehittäminen suuren tuotantotehon Kolmiulotteinen invaasiomääritys Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE 8 (12): e82811. doi: 10,1371 /journal.pone.0082811

Editor: Ming Tan, University of South Alabama, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 syyskuu 2013; Hyväksytty 6 marraskuuta 2013. Julkaistu 11 joulukuuta 2013

Copyright: © 2013 Evensen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat osittain Baldwin Breast Cancer Foundation ja National Cancer Institute (1R01CA166936). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etäpesäke on tärkein kuolinsyy syöpäpotilailla ja yksi vaikeimmista biologisia prosesseja ihmisen sairauksiin [1]. Suuri haaste kehittämisessä syöpälääkkeet, joilla pyritään estämään etäpesäke on puute tehokkaita välineitä lääkekehityksen. Lääkekehitysalan ohjelmat olivat pääasiassa kohde-pohjainen seulonta, joka on johtanut uusiin luokkiin farmakologisia aineita, pääasiassa tyrosiinikinaasin estäjät ja monoklonaalisia vasta-aineita [2]. Kuitenkin, koska useimmat syöpien kehittää lukuisia mutaatioita aikana kasvaimen etenemistä [3], yksittäiset cancer cell klooneja usein kiertämiseksi estävien yhdisteiden pääasiallisesti yhtä suunnattu molekyyleihin [4]. Epäonnistuminen kaupallistaa monet julkisesti rahoitetun, tavoitteita lääkekeksintöjensä ajaa tarve uusia lähestymistapoja nopeuttamaan lääkekehitykseen metastasoineeseen syöpien. Siten kehittää uusia työkaluja, joita voidaan käyttää sellaisten tehokkaiden lääkkeiden kohdistaminen invasiivisen fenotyypin syöpäsolujen, vaatimus alkuvaiheessa etäpesäkkeiden [5], sekä myöhemmässä vaiheessa syövän uusiutumiseen johtuu itse kylvö mikro /makro- metastasized kasvaimia [6], on välttämätöntä muuntaa tämän hengenvaarallinen tauti on krooninen yhteen.

Tehokas kohdentaminen syöpäsoluinvaasiota edellyttää myöntyväinen teknologia matkimaan

in vivo

olosuhteissa. Yhä enemmän todisteita on osoittanut, että kolmiulotteinen (3-D) matriiseihin syövän soluviljelmässä tiiviimmin matkivat

in vivo

olosuhteissa verrattuna 2-D soluviljelmässä olosuhteissa. Siksi seulonta 3-D viljelyolosuhteissa tarjoaa korkeamman ennustearvo tulevaa kliinistä tehoa mahdollisten lääkkeiden ja mahdollistaa paremman optimoinnin [7,8]. Nykyinen 3-D suurikapasiteettisten (HT) seulontamäärityksille keskittyvät ensisijaisesti yhdisteiden tunnistamiseksi, jotka estävät kasvaimen kasvua ja lisääntymistä [9-15]. On yritetty kehittää 3-D invaasio määrityksissä HT valmiudet [16-18]. Kuitenkin käyttää näitä määritykset anti-syöpäsoluinvaasiota lääkekehityksen on Esteenä vuoksi korkeat kustannukset laajamittainen seulonta [16,17], vaatimus pitkiä inkubaatioaikoja (esim 3-5 päivän itämisaika ) ja päätepisteen lukemien määritetään alhainen signaali: tausta suhteet [17], raskaita menettelyjä [16,18,19], ja /tai puute standardoitu ja automatisoituja tekniikoita määrällisesti soluinvaasiota [20].

Tässä meillä on aikaansaada uusi kollageenin geelin pallomainen perustuva 3-D-invaasio HT seulontavälineenä tunnistetaan lääkeaineet, jotka osoittavat anti-invaasio-ominaisuudet. Hyödyntämällä innovatiiviselle työstää levy yhdessä dialdehydinä dekstraanin sekoitettuna kollageenin ennaltaehkäisemiseksi, tämä uusi 3-D invaasiomääritys sallii standardointi ja automatisoitu lukema, joka on keskeinen edellytys HT seulontaan. Tulosten mukaan meidän 3-D invaasiomääritys on toistettavissa, tehokas, helppo ja nopea suorittaa, ja riittävän herkkiä tunnistamaan yhdisteitä, jotka estävät syöpäsolujen invaasiota. Mahdollisuuksia näiden aktiivisten osumia olevan myönteinen vaikutus syöpäpotilaiden estämällä levittämistä kannattaa käyttää tämän määrityksen nykyisissä lääkekehityksen ohjelmia.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

tyyppi I kollageeni (etikkahappo-uutettu natiivi tyypin I kollageenin rotan hännän jänne) ja propidiumjodidia (PI) hankittiin BD Bioscience Discovery Labware. Rekombinantti kudoksen estäjä metalloproteinaasi-2 (TIMP-2) ja anti-MT1-MMP Hemopeksiini domeeni-vasta-aine hankittiin Chemicon International, Inc. RNAi-Ready pSIREN Retro-Q vektori erityisten geenien ja pQCXIP retrovirus- vektori stabiilien solujen hankittiin Clontech. Hoechst tumaväriä ostettiin Invitrogen. Anti-β1-integriini-vasta-aine hankittiin GE Healthcare. Staurosporiini, paklitakseli, ja dekstraani (Mw = 500000) hankittiin Sigmalta.

solulinjojen ja hoito Solujen

Ihmisen fibrosarkooma HT-1080, ihmisen eturauhassyövän LNCaP, DU145, ja PC3, ihmisen rinta- epiteelin syövän MDA-MB-231-solulinjat hankittiin ATCC: ltä. LNCaP-solut, jotka ilmentävät vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) tai MT1-MMP-GFP kimeerinen cDNA aikaisemmin kuvatulla tavalla [21]. Soluja pidettiin DMEM-korkean glukoosin tai RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), joka sisälsi 10% FBS: ää ja 1% Pen /Strep. SK-3

rd soluja ja mammosphere muodostumista on kuvattu aikaisemmin [22]. Lyhyesti, nämä solut viljeltiin ultra-low kiinnitys astiat (Corning) suspensiona DMEM-F12 (Cellgro), jota oli täydennetty B27 (01:50, Invitrogen), EGF (20 ng /ml BD Biosciences), 0,4% naudan seerumin albumiinia (Sigma), ja 4 ug /ml insuliinia (Sigma) [22].

3-D Cell Sironta määritys

Tämä määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, yhden solun suspensiot LNCaP-soluja (4×10

4 solua /ml), joka ilmaisee GFP tai MT1-MMP-GFP sekoitettiin tyypin I kollageenin (2,5 mg /ml lopullinen konsentraatio). Solu-kollageenin geelin Viljelmien annettiin jähmettyä 24-kuoppaisilla levyillä. Sen jälkeen jähmettyminen, täydellistä alustaa lisättiin kanssa tai ilman merkitty estäjiä. Solujen hajonta kyky seurattiin alla Nikon mikroskoopin yli 6 päivää.

3-D Multi-cell Sferoidiviljelmiä invaasiomääritys

Tuottaa soluaggregaatteja, SK-3

rd solut (1000 solua /ml) viljeltiin ultra-low tarttuvuus kulttuuri astiat 12 päivää. Kuulat siirrettiin sitten 24-kuoppaisilla levyillä, jotka sisältävät tyypin I kollageenin. Sulautettu palloset viljeltiin sitten 3 päivää alle normoxic tai hypoksinen olosuhteet. Sillä hypoksinen olosuhteet, soluja inkuboitiin käyttäen BioSpherix ProOx C21 asetettu 1% O

2 ja 5% CO

2. Sillä monen solun sferoidiviljelmiä menetelmä hyödyntäen lasi -mikrokantajapallosia, LNCaP MT1-MMP-GFP ilmentäviä soluja viljeltiin kuulilla 24 tuntia ravistellen. Solu-helmi aggregaatit siirrettiin sitten ja upotettu tyypin I kollageenin ja viljeltiin vielä 3 päivää.

3-D Invasion määritys

Syöpäsolut (8×10

7 solua /ml ) sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa 3 mg /ml neutraloitua tyypin I kollageenia jäällä, minkä jälkeen lisättiin dialdehydin dekstraaniliuosta (lopullinen 0,25% kokonaismäärästä). Solu-kollageenin seos siroteltu osaksi kuoppia keskellä kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevylle. Optimaalinen koko kuoppa kussakin kuopassa on 2 mm halkaisijaltaan ja vaatii 4,18 mm

3 (pl) [4 /3πr³, r = 1 mm] solusta kollageenin seoksen luoda pallomainen piste sisällä kuoppaan. Jähmettymisen jälkeen solu-kollageenin pisteitä 37 ° C: ssa, kerros neutraloitua tyypin I kollageenia (80 ui, 1,5 mg /ml lopullinen konsentraatio) lisättiin kattamaan solu-kollageenin pallonpuoliskolla. Sen jälkeen 10 minuutin inkubaatio 37 ° C: ssa, kootut soluinvaasiota kompleksi peitettiin 80 ui elatusainetta lisättiin estäjiä tai ajoneuvo.

Havainnointi tunkeutuneet Cells

tunkeutuneet syöpäsolut värjättiin sekä Hoechst 33342 (25 ug /ml) tumavärjäystä koko solujen ja PI (2,5 ug /ml) ja värjäys kuolleet solut ja sen jälkeen pesun PBS: llä. Invasion syöpäsolujen jälkeen tutkittiin käyttämällä fluoresenssimikroskopialla. Automatisoida kvantifiointia hyökkäsi solujen vaihekontrasti ja Hoechst kuvien koko levyn saatiin. Kynnys alkaen faasikontrastikuvassa vaaditaan valvonta (käsittelemätön tai ajoneuvon käsitelty) kuoppaa 96-kuoppaisen levyn oikaistiin eron perusteella toisin välillä ulkona ja sisällä kaivon luoda kaksi binary kerrosta. Binary kerros ulkopuolella pit kopioitiin muodostamiseksi kohdealueen (ROI), joka sitten levitetään Hoechstin kuvia. Tunkeutuneet solujen ROI Sitten automaattisesti laskettiin käyttäen objektien määrän. Tämä tehtiin käyttäen NIS-elementit Br 3.2 Software.

hapettaminen dekstraanikonjugaattien lomakkeeseen dialdehydin Dekstraani

2,5 g dekstraania liuotettiin 100 ml: aan Dih

2O. Natriumperjodaattia (NAIO

4) (1,65 g) lisättiin 18 tunnin inkubaation, sekoittaen huoneenlämpötilassa. Reaktion sammuttamiseksi, 1 ml etyleeniglykolia lisättiin. Liuos dialysoitiin dI

2O ja 3 päivää, lyofilisoitiin ja liuotetaan dI

2O lopulliseen konsentraatioon 2,5% dialdehydin dekstraania.

proteaasimäärityksessä

Yhteensä solujen proteolyyttinen aktiivisuus määritettiin käyttäen Fluorescent Detection Kit (Sigma). Lyhyesti, solulysaatteja inkuboitiin 20 tuntia 37 ° C: ssa fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -leimatuilla kaseiini substraattina. Lysaatit olivat trikloorietikkahappoa (TCA) saostui. Sisältäviä supernatantteja hajanainen FITC-kaseiinia yhdistettiin sitten määrityspuskurissa ja fluoresenssi-intensiteetti mitattiin virityksellä 485 nm ja emissio aallonpituudella 535 nm käyttäen SpectraMax Gemini EM (Molecular Devices) fluoresoiva -levynlukijaa.

Tilastollinen analysointi

Studentin paritonta kaksipuolinen t-testiä käytettiin arvioimaan eroja p-arvot 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Yhdistetyt tiedot esitettiin keskiarvona ± SD kaikissa analyyseissä kolmen riippumattoman kokeen. GraphPad Prism 5 ohjelmistoa käytettiin tässä analyysissä.

Tulokset

rajoitukset Current Invasion Analyysit haittaavat HT Screening Capabilities

Tällä hetkellä käytössä oleva 3-D invaasio määritykset perustuvat seurantaa solu sironta kyky ja voidaan koota monella tavalla. Kuitenkin ne kaikki puuttuu avainmääritteet vaaditaan HT suojausmahdollisuudella. Esimerkiksi jotkut määritykset voi erottaa estäjiä solujen lisääntymisen ja invaasiota. Tällaisissa määrityksissä yksittäisten solujen upotettu matriiseja, kuten tyypin I kollageenia, tutkitaan niiden invasiivisen käyttäytymisen perusteella sironta- kasvuun kuvio seuraavan proliferaation. Kuviossa 1A-a, LNCaP-solut, vähemmän invasiivisia ihmisen eturauhassyövän solulinjaa, jotka ekspressoivat stabiilisti kalvo tyypin 1 matriksimetalloproteinaasi (MT1-MMP) fuusioituna vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) (MT1-GFP) näytetään sironta kasvun malli, ilmaisee invasiivisen käyttäytymisen verrattuna GFP-ohjaus soluja, jotka sen sijaan on muodostettu solu aggregaatin sisällä geeliä. Tämä on yhdenmukaista aikaisempien raporttien kanssa, jotka osoittavat, että MT1-MMP voi aiheuttaa hyökkäyksen kuin aggressiivinen solutyyppejä [23]. Kuitenkin sekä solujen invaasiota ja lisääntymistä tarvitaan muodostamaan hajallaan kasvumalli ja on standardoinnin puute estää automatisoituja lukema. Siksi tämä yksittäinen solu sironta määritys ei sovellu HT syöpälääkettä löytö nimenomaan suunnattu syövän invaasio.

A). Yksisoluiset sironnan määritys: Vaikka yksittäiset LNCaP-solut sekoitettiin kollageenin ja tutkitaan päivittäin. MT1-GFP-proteiinia ekspressoivien solujen vähitellen näytetään sironta kasvua kuvion jälkeen 6 päivää viljelmässä verrattuna yhteenlasketun kasvua GFP-proteiinia ekspressoivien solujen. b. Yhteenlaskettu sironta määritys: SK-3

rd-soluja viljeltiin 12 päivää muodostamiseksi mammospheres, siirretään ja upotetaan kollageeni, ja sitten viljeltiin normoksia tai hypoksia. Hajallaan kuvio nähtiin 3 päivän jälkeen hypoksiaolosuhteissa. c. Mikrokantajan helmi sironta-määritys: MT1-GFP ilmentävät LNCaP-soluja viljeltiin helmiä 24 tuntia, sitten siirretään ja upotetaan kollageeni. Tunkeutuneet soluja nähdään hajallaan kuvio päivänä 3. Mittaviivat = 20 um. B) arviointi syöpäsolun invasiivisuus käyttämällä uusia 3-D invaasiomääritys: LNCaP-solut, jotka ilmentävät vektorisäätö (a) tai MT1-MMP (b), ihmisen eturauhassyövän PC3-solut (c), ja DU145-soluja (d) suspendoitiin kollageenin , siroteltu osaksi kuoppaan 96-kuoppalevylle, ja peitetty kollageeni seurasi media. Sen jälkeen, kun 18-tunnin inkuboinnin, PC3 ja DU145, sekä MT1-MMP ilmentävien LNCaP-soluja, osoittivat lisääntynyttä numerot hyökkäsi soluja verrattuna LNCaP vektorisäädön soluja. Asteikko bar = 50 pm.

välttämiseksi nämä esteet, monen solun sferoidiviljelmiä menetelmä [20] otettiin käyttöön, joka on tunnustettu potentiaalia voidaan käyttää HT invaasiomääritys. Kuten osoitettiin käyttämällä SK-3

rd soluja viljeltiin hypoksisissa olosuhteissa, jonka tiedetään lisäävän kaupan MT1-MMP solun pintaan [22], pallojakaantuminen muodostuminen päätelaitteiden arviointi invaasion edellyttää pitkän kulttuuri kertaa, yleensä ottaen 6-12 päivää, ja siitä puuttuu tasakokoisia (kuvio 1A-b). Välttää koko vaihtelu, lasi -mikrokantajapallosia identtiset kokoja voidaan käyttää tukirakenteina pallomainen muodostumisen [24], kuten on esitetty kuviossa 1A-c käyttäen LNCaP MT1-GFP ilmentäviä soluja. Kuitenkin sijainti helmiä sisältävien solujen siirtymisen jälkeen matriisi ei voida tehdä tasaiseksi. Vaikka nämä määritykset voidaan käyttää seurantaan syöpäsoluinvaasiota, pitkät ajoajat ja standardoinnin puute ja automatisoitu lukema ominaisuudet vaikeuttavat niiden hyödyntämistä HT seulonta työkaluja.

perustaminen Quantitative 3-D invaasiomääritys arviointijärjestelmän Cancer Cell Invasion

tunnustavat tarpeen 3-D HT määrityksen, joka testaa invasiivisia kyky solujen nopeampi ajoaika kehitimme nopeasti kollageenigeelin perustuu 3-D invaasiomääritys. Osoitettava kykenevänsä meidän määrityksen havaita eroja invasiivisia kapasiteetin eri syöpäsolutyyppien, ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa eritasoisia aggressiivisuus, kuten androgeeniriippumattomaksi (DU145 ja PC3) ja riippuvainen (LNCaP) solulinjoissa sekä MT1 -MMP ilmentävät LNCaP-soluja, tutkittiin. Ilmoitetun syöpäsolut yhdistettiin neutraloitua natiivin tyypin I kollageenia, pisteviiva keskelle kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevylle, ja annetaan jähmettyä, lopulta muodostaen solun kollageeni dot /pallonpuoliskolla, jossa on selvä raja ja muoto. Sen jälkeen jähmettyminen, solu-kollageenin pallonpuoliskolla oli upotettu cover-kerros neutraloitua tyypin I kollageenin ja annetaan jähmettyä. Media lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan ja solujen annettiin tunkeutua ympäröivään matriisiin 18 tuntia. Kuten kuviossa 1B, metastaattista DU145 ja PC3-solut osoittivat lisääntynyttä määrää invasiivisen solujen ulkonevat yli alkuperäisen solun kollageenin rajan, kun taas LNCaP solut, jotka ilmentävät vektorisäätö cDNA epäonnistui näyttämään soluinvaasiota. Lisäksi vaikutus MT1-MMP ilmentymisen solun invaasio helposti määrittää kasvu määrä hyökkäsi solujen MT1-MMP ilmentävien LNCaP-soluja verrattuna vektorisäädön-soluissa (kuvio. 1Ba b).

Jotta suoraan vertailla uusia 3-D invaasiomääritys on nykyisin käytössä 3-D-solun sironnan määrityksessä, inhiboivaa vaikutusta kudoksen estäjä metalloproteinaasi-2 (TIMP-2, endogeeninen inhibiittori MT1- MMP) [25] ja anti-PEX-aineen (suunnattu MT1-MMP Hemopeksiini domain) [26] on MT1-GFP aiheuttama LNCaP soluinvaasiota testattiin. Jotta uusia 3-D invaasiomääritys, solut perustettu, kuten on kuvattu kuviossa 1 B, johon on lisätty joko TIMP-2 tai anti-PEX-vasta-ainetta solun viljelyalustaan. Kvantifiointi tunkeutuneet solujen paljasti 61% ja 76%: n vähennys MT1-GFP indusoi solujen invaasiota TIMP-2 ja anti-PEX-vasta-ainetta, vastaavasti (kuvio 2A). 3-D-solun sironnan määrityksessä, joka on esitetty kuviossa 2B, laadullisesti osoittaa inhibitiota MT1-GFP-induced cell invasion käsittelyn kautta joko TIMP-2 tai anti-PEX-vasta-ainetta. Tämä vertailu osoittaa, että vaikka nämä sironta määrityksistä saadaan selkeä, laadulliset tiedot, jotka osoittavat syöpäsoluinvaasiota, ne eivät sovellu HT lääkekehityksen ohjelmia, jotka vaativat kvantitatiivisia tuloksia, joita meidän määritys voi tarjota.

A B) vertailu uusia 3-D invaasiomääritys ja 3-D-cell sironta-määritys: vaikutus kontrolli-lgG (Rabbit, 10 ug /ml), kudoksen estäjä metalloproteinaasi-2 (TIMP-2) (10 nM), tai anti-MT1-MMP-Hemopeksiini domeeni-vasta-ainetta (anti-PEX Ab) (10 ug /ml) on MT1-GFP-indusoidun LNCaP soluinvaasion arvioitiin kautta 3-D invaasiomääritys (A) ja 3-D-solun sironnan määrityksessä ( B). Invasiivinen kasvumalli oli valokuvattu päivänä 1 (A) ja päivänä 6 (B) vastaavasti. TIMP-2 ja anti-PEX Ab laski solu invasiivisen /sironnan kykyä MT1-GFP ilmentävien solujen. Mittakaava = 20 um. C) annos-riippuvainen inhibitio ihmisen rintasyövän MDA-MB-231-solujen anti-β1-integriini-vasta-aine: MDA-MB-231 soluinvaasion tutkittiin käyttäen 3-D invaasiomääritys läsnä ollessa anti-β1-integriini-vasta-aineen eri pitoisuuksilla vs. kontrolli-lgG. Tunkeutuneet soluja mikroskooppisesti (vasen paneeli) ja laskettiin (oikea paneeli). Pylväät edustavat keskiarvoa + SD.

tehokkuuden määrittämiseksi meidän määrityksessä annos-vaste-koe suoritettiin käyttäen MDA-MB-231, invasiivisen rintasyövän solulinjassa, ja anti-β1-integriini-vasta-aine, jonka tiedetään estävän solujen vaeltamiseen, keskeinen askel syöpäsoluinvaasiota. Annoksesta riippuva inhibitio MDA-MB-231 soluinvaasion käsiteltäessä anti-β1-integriini-vasta-aine oli helposti määrällisesti (kuvio 2C). Yhdessä nämä tiedot osoittavat kykyä uusia 3-D invaasiomääritys helposti, tehokkaasti, ja arvioida määrällisesti invasiivisia fenotyyppi erilaisten syöpäsolujen sekä huumeiden vaikutuksista invasiivisuus.

standardointi Kehitetty invaasiomääritys

Kuten osoitettiin, yleisimmät esteet kehitettäessä 3-D HT näytöt ovat standardointi ja automatisoituja lukema. Vaikka määritys on yksinkertainen ja nopea, koko yhdenmukaisuus ja sijoittaminen solun kollageenin pallonpuoliskolla luoda este näiden kriteerien. Standardoimiseksi ja mahdollistaa automaatio, joka on asentanut 96-kuoppalevyn 2 mm halkaisijaltaan kuoppaan (4,18 mm

3) keskellä Kunkin kuopan suunniteltu (kuvio 3A). Kuoppa on yhtenäinen koko ja sijainti kussakin kuopassa, joka mahdollistaa standardointi 3-D invaasiomääritys ja automatisoitu lukema ohjataan NIS elementit (Nikon) kuvankäsittelyohjelma yhdessä moottorivaihetta.

A) Kaaviokuva (yläpaneeli) ja 3-D invaasiomääritys kanssa työstää levy: (a) solu-kollageenin seos on täynnä osaksi 2 mm halkaisijaltaan kuoppia keskelle jokaiseen kuoppaan tooled 96-kuoppalevylle, luoden aloilla, jotka vievät tilavuus on 4,18 mm

3; (B) ulkonevat solu-kollageenin pallonpuoliskon peitetään kollageeni; (C) väliaineessa, joka sisältää yhdisteitä lisätään, ja levyä inkuboidaan 18 tuntia; ja (d) tunkeutuu soluihin jälkeen kuoppa rajan lasketaan. Mustat pisteet edustavat soluja. Kaavio ei mittakaavassa. Kuva on leikkausta työstää levy kuoppa keskellä jokaisen hyvin näkyy (alapaneeli). B) kollageenin supistumisen kautta dialdehydinä dekstraani: HT1080-solut sekoitettiin kollageenin kanssa tai ilman lisäämällä dialdehydin dekstraania ennen päällekkäin kollageeni. Faagi kontrastin kuvat otettiin ajankohtana 0 ja 18 tuntia (vasen ruutu, Mittakaava = 250 nm) ja 18 tuntia tooled levyn (oikea paneeli, Mittakaava = 100 um). Punaiset nuolet osoittavat reunan kuoppia. Punainen arrowheads osoitti solun reunalla-kollageenin aloilla. C) Faasikontrasti- ja loisteputki kuvia hyökkäsi HT1080 solujen tooled levy Hoechstilla väriainetta. Asteikko bar = 100 pm. D) Automatisoitu kvantifiointiin: Sekä vaihekontrasti ja loisteputki kuvia (a b) on HT1080-solujen seuraavat hyökkäystä hankittiin käyttäen Nikon TE-2000-ohjattu NIS Elements kuvankäsittelyohjelma. Kynnys on faasikontrastikuvassa ensimmäisen kuopan säätyvät kontrasti luoda kaksi binary kerrosta, yksi sisällä kuopan (korostettu mustalla) ja yksi ulkopuolella pit (korostettu vaaleanpunainen) (c). Binary kerros ulkopuolella kuoppaan (vaaleanpunainen alue) kopioitiin muodostamiseksi kohdealueen (ROI), joka sitten levitetään Hoechst kuva (d). Tunkeutuneet solujen ROI sitten automaattisesti laskettiin kanssa laskettiin solut esiintyvät purppurainen väri (e).

yleinen rajoitus käytön kollageenin geeli 3-D soluviljelmässä on supistuminen johtuu remodeling kollageenisäikeitä erilaiset solutyypit [27,28], joka muuttaa kokoa solu-kollageeni geeli. Tämän osoittamiseksi HT1080 ihmisen fibrosarkoomasolulinjoilla-kollageenin pallonpuoliskolla oli kuvattu hetkellä 0 ja 18 tuntia. Solu-kollageenin pallonpuoliskon supistui merkittävästi vähentää halkaisija 0-18 tuntia ja estää näin tarkka kvantifiointi soluinvaasiota kuin parametrin kaivon (kuvio 3B, yläpaneeli). Tämän ongelman poistamiseksi, lisäämällä dialdehydiä dekstraania, jolla on kyky silloittua kollageeni [29], tutkittiin. Dialdehydi dekstraani sekoitettiin HT1080 solun kollageenin seos ennen dotting kuhunkin kuoppaan. Kuten kuviossa 3B on esitetty (alapaneeli), lisäksi dialdehydin dekstraanin inhiboi merkittävästi kollageenin supistumista ja säilytti alkuperäisen koon ja rajaa solun kollageenin pallonpuoliskolla. Ei estävä vaikutus syöpäsoluinvaasiota havaittiin.

onko tämä uusi muotoilu pystyy automatisoitu lukeman, yhdistelmä tooled hyökkäyksen levy, automatisoitu mikroskooppinen vaiheessa (Prior Scientific, Inc.), ja kuvankäsittelyohjelma (Nikon, NIS-elementit) hyödynnettiin . Sen jälkeen kun oli inkuboitu 18 tuntia, HT1080-solut värjättiin tumavärjäystä Hoechst dye seuraa kuvan hankinta. Sekä vaihekontrasti ja ydin–värjätään kuvia HT1080 soluja otettiin kustakin kuopasta; edustava kuva on esitetty kuvassa 3C. Kynnys alkaen faasikontrastikuvassa säädettiin perustuu eron kontrasti sisällä kuoppaan ja ulkopuolella kuoppa (hyökkäys alue) luoda binary kerroksiin. Määritetyt binary kerros ulkopuolella varikkoalueella sitten kopioidaan muodostaa kohdealueen (ROI), joka sitten levitetään Hoechst kuvaa. Lukumäärä solujen ROI, tai invaasio alue, sitten automaattisesti laskettiin (ohjeita kuvassa. 3Da-e). Käyttämällä Nikonin 10x (0,25 NA) objektiivilinssi ja moottorivaihetta asennettu Nikon TE2000s käänteismikroskooppi, skannaus koko 96-kuoppalevyn 4 kuvaa per kuoppa voi olla valmis 6 minuuttia (tuloksia ei ole esitetty). Kyky nopeasti hankkia ja analysoida tietoa sallii seulonnasta monien yhdisteiden lyhyessä ajassa, joka on tarpeen HT näytöksiin.

määrittämiseksi luotettavuutta, tai Z tekijä [30], meidän 3-D invaasiomääritys vaikutukset DMSO ja anti-β1 integriini-vasta hoidon invaasio DU145 solujen tai MT1-GFP ilmentävien LNCaP testattiin. Z kerroin kuvaili Zhang Z kerroin = 1-3xSSD /R (SSD: summa standardipoikkeamat R: itseisarvo ero positiivisten ja negatiivisten kontrollien), jossa Z kerroin arvo 0,5 1,0 osoittaa, että määritys on luotettava [30]. Tiedot kerätään 5 eri päivinä analysoitiin käyttämällä Z tekijä yhtälön (tuloksia ei ole esitetty). Z-kerroin on 0,65 ja 0,72 välillä DU145 soluista ja MT1-GFP ilmentävien LNCaP vastaavasti laskettiin osoittaa, että meidän 3-D invaasiomääritys täyttää erinomaisen määrityksen HT seulontaan. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, kyky meidän 3-D invaasiomääritys voidaan käyttää HT anti-invasiivisen lääkeaineen seulonta työkalu.

Samanaikainen määritys Yhdisteet, jotka inhiboivat Cancer Cell Invasion niistä, jotka ovat sytotoksisia

kyky eristää välillä yhdisteitä, jotka estävät syöpäsolujen invaasiota ja ne, jotka aiheuttavat solukuoleman kanssa aloitusnäyttö voisi kiertää tarve toissijainen sytotoksisuuden näyttö, vähentää energiankulutusta ja lisätä tehokkuutta. Co-värjäys solu-kollageenin pallonpuoliskon Hoechst ja propidiumjodidilla (PI), kokonaismäärä hyökkäsi solujen ja sytotoksisen lääkkeen vaikutuksen voidaan määrittää samanaikaisesti. Arvioida tämän lähestymistavan, HT1080-solut ilmentävät GFP cDNA käsiteltiin DMSO, anti-β1 integriini-vasta-aine, staurosporiinille (STS), joka on estäjä tiedetään aiheuttavan apoptoosia [31,32], tai paklitakseli (taksoli), kemoterapeuttinen lääke, joka stabiloi mikrotubuleiksi ja estää solunjakautumisen johtaa solukuolemaan [33,34]. 18 tunnin jälkeen, DMSO käsiteltiin HT1080 GFP solut osoittivat invaasio ympäröiviin kollageenimatriisia pienellä PI-värjäys, joka osoittaa matalan sytotoksisuus (kuvio 4A). Sitä vastoin solut, joita käsiteltiin anti-β1-integriini-vasta-aine oli vähentynyt invasiivisen kyvyn mutta samantasoiset PI värjäyksen (kuvio 4B). Hoidon STS aiheutti merkittävän kasvun solukuoleman, kuten ilmenee voimakas PI-värjäyksellä ja solut näytetään kumottu soluinvaasion (kuvio 4C). Taxol, hitaampi vaikuttava lääke, aiheutti vähennetään merkittävästi soluinvaasiota vaatimaton kasvu solukuoleman (kuvio 4D). Nämä tiedot osoittavat kykyä meidän määrityksen eristää lääkkeiden ainoastaan ​​estävät solujen invaasion lääkkeet, jotka estävät syöpäsolujen invaasiota johtuu sytotoksisen vaikutuksen.

HT1080 soluja, jotka ekspressoivat GFP koottiin 3-D invaasiomääritys läsnä ollessa (A) DMSO: ssa, (B) anti-β1-integriini-vasta-aineen (5 pg /ml), (C) staurosporiini (STS) (500 nM) tai (D) paklitakseli (Taxol, 1 uM) 18 tunnin ajan. Solut värjättiin Hoechst ja propidiumjodidilla (PI) 30 minuuttia, minkä jälkeen mikroskooppinen tutkimus. Vähentynyt soluinvaasiota havaitaan käsittelemällä anti-β1 integriini-vasta-aine, STS, ja taksolin. Kuitenkin STS ja taksolin osoittavat korkeampaa PI värjäystä, osoittaa lisääntynyt solukuoleman. Numerot oikeassa yläkulmassa kulmat edustavat kokonaismäärästä invasiivisia soluja (Hoechst kuvat) tai soluja, jotka kuolivat jälkeen tunkeutuvat (PI kuvat) alaan. Asteikko bar = 100 pm.

validointi HT kapasiteetti 3-D invaasiomääritys

Osoituksena periaate, National Cancer Institute Diversity Set II yhdiste Library, jotka sisältävät 1974 rakenteellisesti erilaisia ​​yhdisteitä, seulottiin käyttämällä MDA-MB-231 rintasyövän solulinjassa. Yhdisteet lisättiin kuoppiin lopulliseen pitoisuuteen 10 uM. DMSO, joka on ajoneuvon, ja anti-β1-integriini-vasta-ainetta käytettiin negatiivisena ja positiiviset kontrollit, vastaavasti. Positiiviset osumaa määritettiin perustuen kynnyksen 50%: n inhibition hyökkäystä. Tämän perusteella, 24 positiivista osumaa todettiin, 9 joista vahvistettiin 25% sytotoksinen kautta MTT-määrityksellä (kuvio 5A ja tietoja ei ole esitetty). Yksi näistä osumia oli tunnettu anti-vaeltavia yhdisteestä, quinocarmycin analoginen DX-52-1 [35], jotka tarjoavat lisäksi osoitus siitä, että määritys voidaan onnistuneesti identifioimaan yhdisteitä, jotka kykenevät estämään syöpäsolujen invaasiota (kuvio 5B).

) NCI Diversity Set II yhdiste kirjasto seulottiin käyttäen 3-D invaasiomääritys ja MDA-MB-231-solujen, mikä johtaa yhteensä 24 osumaa, 9 joista estävän muttei sytotoksinen. B) quinocarmycin analoginen, DX-52-1 positiivisesti tunnistettu anti-invasiivisen yhdiste. Kuvat ovat näkyvät DMSO-kontrollin ja DX-52-1 (10 uM) 18 tunnin kuluttua inkubaation. Kumotaan soluinvaasiota ja sytotoksisuus havaittiin soluissa, joita käsiteltiin DX-52-1. Numerot oikeassa yläkulmassa kulmat edustavat kokonaismäärä invasiivisia solujen kentässä. Asteikko bar = 100 pm. C) TranswellTM kammio muuttoliikettä suoritettiin MDA-MB-231-solujen käsitelty DMSO tai DX-52-1 18 tuntia. Edustavat kuvat kalvoja (8 um huokoskoko) näkyvät vasemmassa paneelissa. Kvantifiointi solumigraation näkyy oikeassa paneelissa. DX-52-1 käsitellyt solut olivat vähentyneet leviämiskyky. Pylväät edustavat keskiarvoa + SD. D) Fluorescent Proteaasi Detection määritystä (Sigma) suoritettiin solulysaateista MDA-MB-231-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai DX-52-1 18 tuntia. Ei vaikutusta proteolyyttinen aktiivisuus havaittiin käsiteltäessä DX-52-1. Pylväät edustavat keskiarvoa + SD. ** Tarkoittaa

p

0,01.

Johtuen siitä, että tavoite tunnistaminen on hyödyllistä ennustettaessa sivuvaikutuksia ja optimoimalla lyijyä ehdokkaita, on tärkeää saada loppupään määritykset, jotka voivat auttaa selvittämiseksi mahdollinen mekanismi (t), positiivisen osumia . Koska hyökkäys vaatii sekä muuttavien ja proteolyyttisiä toimintoja, tärkeä seuraava askel on ero näiden kahden solun ominaisuuksista. Hyödyntämällä DX-52-1 esimerkkinä, tavanomainen TranswellTM kammion migraatiokokeessa ja epäspesifisen proteaasimäärityksessä (Sigma) käytettiin. Kuten on esitetty kuviossa 5C D, DX-52-1 merkitsevästi kumottu MDA-MB-231 solumigraatio mutta ei ollut merkittävää vaikutusta proteaasiaktiivisuuksien. Nämä tulokset osoittavat, että esto invasiivisen käyttäytymisen MDA-MB-231-soluissa DX-52-1 johtuu vähenemiseen leviämiskyky, joka tukee aiemmin julkaistu raportteja [35].