Krooninen sairaus

tiivistelmä

DEAD laatikko RNA helikaasia p68 (Ddx5) on tärkeä androgeenireseptorin (AR) transkription koaktivaattoria eturauhassyövässä (PCA) ja on yli -expressed myöhäisessä vaiheessa tauti. β-kateniinin on monitoiminen proteiini tärkeitä rakenteellisia ja merkinantotoimintoihin joka on säädelty PCA ja samankaltainen p68, on vuorovaikutuksessa AR yhteistyöhön aktivoida ilmentymistä AR kohdegeenien. Tärkeää on, p68 muodostaa komplekseja ydin- β-kateniinin ja edistää geenin transkriptio paksusuolen syövän osoittaa toiminnallinen vuorovaikutus näiden kahden proteiinien syövän etenemiseen. Tässä tutkimuksessa tutkimme suhdetta p68 ja β-kateniinin PCA voidaan arvioida niiden mahdollisia yhteistyön AR-riippuvaisia ​​geeniekspressiota, mikä voi olla merkitystä kehitettäessä kastraatiotasolle resistenttien eturauhassyövän (CRPCa). Käytämme immunosaostus osoittamaan uutta vuorovaikutusta p68 ja β-kateniinin tumassa Eturauhassyövän soluja, jotka on androgeeniriippuvaisessa LNCaP-soluissa, mutta androgen riippumaton hormoni tulenkestävät johdannainen saman solulinjan (tyypillinen CRPCa taudin tyyppi). Parannettu AR aktiivisuus nähdään androgeeniriippuvaisissa lusiferaasireportteri määrityksissä upon ohimeneviä kotransfektoimalla p68 ja β-kateniinin lisäaineena vaikutus, ja p68-köyhdytettyä Kromatiini-immunosaostus (chip) väheni rekrytointi AR ja β- kateniinin että androgeeniresponsiivinen promoottorialueille. Lisäksi löysimme p68 immunosaostettiin tuottavia ja ei-tuottavia muotoa RNA-polymeraasi II (RNAP II) ja osoittavat p68 rekrytoidaan kasvavaan alueille AR välitteistä

PSA

geeni, mikä viittaa rooli p68 helpottamisessa RNAP II transkription AR-välitteisen geenejä. Nämä tulokset viittaavat p68 on tärkeää helpottaa β-kateniinin ja AR transkriptioaktiviteettia PCA soluissa.

Citation: Clark EL, Hadjimichael C, Temperley R, Barnard A, Fuller-Pace FV, Robson CN (2013) p68 /DdX5 tukee β-kateniinin RNAP II aikana androgeenireseptorin välittämän Transkriptio eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (1): e54150. doi: 10,1371 /journal.pone.0054150

Editor: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Ranska

vastaanotettu: toukokuu 29, 2012; Hyväksytty: 7. joulukuuta 2012 Julkaistu: 17 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Clark et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Eturauhasen Toiminta Charity [PCRF9 /07-CNR ELC]; ja Medical Research Council, Cancer Research UK, ja Department of Health Eturauhassyöpä mekanismit Progression ja hoito (Prompt) yhteistyö [G0100100 /64424 CNR]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

puhkeaminen ja eteneminen eturauhassyövän (PCA) ohjaa transkription toimintaa androgeenireseptorin (AR), ja ablaatio androgeenien on tehokas strategia varhaisessa vaiheessa taudin [1]. Kuitenkin PCa voivat siirtyä kastraatiotason resistenttejä eturauhassyöpä (CRPCa) fenotyyppi, joka on tällä hetkellä mahdotonta hoitaa [1], [2]. Poikkeava aktivaatio AR ajatellaan merkittävä rooli kehityksessä CRPCa; prosessi oletetaan olevan, osittain välittyy hallitsemattoman aktivaation koaktivaattoria proteiineja, jotka helpottavat ilmentymistä AR reagoivien geenien minimaalinen hormoni ympäristöön [3]. Ymmärtäminen molekyyli- tapahtumista, jotka etenemistä CRPCa tapahtuu, saattaa johtaa tunnistamiseen uusia tavoitteita ja parantavat eloonjäämistä potilaille, joiden tauti.

β-kateniinin on olennainen osa Wnt koulutusjakson pelissä rooli signaalitransduktion. Sytoplasmisen vakauttaminen ja ydinvoiman kertymistä β-kateniinin on ”tuntomerkki” aktivaation Wnt-signalointireitin (katso arvostelua [4], [5]). Eturauhasen soluissa, β-kateniinin on todettu olevan yhteydessä ligandoidun AR ja toimimaan AR koaktivaattoria parantaminen sekä Wnt ja androgeeniresponsiivinen geenin transkriptio (tarkistetaan [6] – [8]). Aktivoitu AR voi shuttle β-kateniinin tumaan ja parantaa AR transkription, mikä viittaa ligandiin riippuvainen vuorovaikutus [9]. Kuitenkin ksenografteissa korjattu kastraatiotason kestävästä hiiristä myös havaittu olevan kolokalisaation ja vuorovaikutus AR ja β-kateniinin [10]. LNCaP-PCa-solujen puuttuessa androgeenien, H2-relaxin-välitteisen fosforylaation Akt ja GSK-3β aiheutti vakiintunut sytoplasmisen kerääntymisen β-kateniinin, joka myöhemmin sitoo AR ja kulkeutua tumaan, mikä viittaa siihen, että androgeenien läsnäolon ei ole olennaista vuorovaikutusta AR ja β-kateniinin tietyissä olosuhteissa [11]. Mielenkiintoista, co-lokalisointi ja vuorovaikutus AR ja β-kateniinin ei nähty kasvaimet kerättiin kuohitsemattomat hiirillä, mikä viittaa siihen, että tämä vuorovaikutus on nimenomaan etenemistä PCa jotta CRPCa ja optio lisätutkimuksia. Suoria todisteita β-kateniinin osana AR transkription monimutkainen kautta on osoitettu Kromatiini Immunosaostaminen (chip) tutkimukset, jotka osoittavat β-kateniinin rekrytoitiin promoottorialueissa sekä androgeenien ja Wnt reagoiva geenien läsnä ollessa ja puuttuessa androgeenien [11 ], [12]. Edelleen viittaavat siihen, että kasvu metastaattisen eturauhaskasvainsoluissa luun tapahtuu androgeenireseptorin välittämän Wnt aktivointi [13], ja lisääntynyt ydinvoiman β-kateniinin tasoja ovat korreloineet eturauhassyövän taudin etenemiseen [14], [15]. Lisäksi, vähentäviä tai E-kadheriinin, joka tavallisesti sitoo β-kateniinin solukalvolle oletetaan tasojen lisäämiseksi solun β-kateniinin ja edistää AR aktiivisuus [7]. Yhdessä tulokset viittaavat tärkeä rooli β-kateniinin etenemisessä PCa että CRPCa fenotyypin. On kuitenkin selvää, että tarkka mekanismeja, joilla β-kateniinin välittää AR transkriptionaalisen aktiivisuuden ja kasvua CRPCa puuttuessa androgeenien, ansaitsee lisätutkimuksia.

RNA helikaasia p68 (Ddx5) on kasvuun ja developmentally- säännelty prototyyppinen jäsen DEAD laatikko perheen helikaasit. p68 toimii monissa solun prosesseissa yleisesti väärin säädellystä syövässä prosessointi mukaan lukien esi-mRNA ja vaihtoehtoisen silmukoinnin, solujen lisääntymistä, microRNA käsittely (tarkistetaan [16], [17]), ja ribosomien biogeneesin [18]. p68 tunnetaan myös vuorovaikutuksessa useiden komponenttien transkription monimutkainen ja yhteistyöhön aktivoi transkription tekijöitä, kuten kasvaimen p53, estrogeenireseptorien α (ERa) ja β-kateniinin (katsaus [16], [19], [20 ]). Olemme aiemmin osoittaneet p68 yli-ilmentynyt PCA ja joka toimii yhteistyössä aktivaattori AR [21]. Lisäksi eturauhasen kasvaimia, p68 on yli-ilmentynyt useissa muissa syöpäsolujen tyyppejä, kuten paksusuolen ja rinta-, viittaa siihen, että p68 toimii mahdollisen kasvaimen promoottori ([22], ja tarkistetaan [17]). p68 ja erittäin homologista proteiinia p72 (Ddx17), yli-ilmentää ja muoto komplekseja β-kateniinin tumassa koolonkarsinoomasoluissa aktivoida geenin transkription ja edistää soluproliferaatiota [22] – [24]. Tyrosiini 593-fosforyloitujen p68 liittyy myös β-kateniinin sytoplasmassa paksusuolen syövän soluja, joissa se edistää β-kateniinin tumaansiirtymiseen kautta RanGTPase Wnt-riippumaton reitti vuorovaikutuksen kautta β-kateniinin ja siirtymä ak- siini [25], [26 ]. Kuitenkin ristiriitaisia ​​tutkimus ei löytänyt todisteita siitä, että p68 oli tarpeen tumaansiirtymiseen of β-kateniinin samaa solutyyppiä [27], ja tyrosiini 593 fosforyloimat- p68 ei poikennut villityypin sen kyky stimuloida β-kateniinin riippuvaisen transkription toisessa tutkimuksessa [23].

tässä artikkelissa käytämme immunosaostus, siru ja lusiferaasireportterista tekniikoita yhdessä siRNA oligo nukleotidin knockdown, tutkia suhdetta p68 kanssa β-kateniinin ymmärtää molekyylitason mekanismi jonka he mahdollisesti välittävät poikkeavaan aktivointi AR ja kasvu Eturauhassyövän soluja, osana AR transkription monimutkainen.

tulokset

p68 ja β-kateniinin Interact tumassa Eturauhassyövän Cells

Koska androgeenireseptorin (AR) assosioi itsenäisesti β-kateniinin ja p68 PCA soluissa [21], [28], ja p68 ja β-kateniinin vuorovaikutuksessa koolonkarsinoomasoluissa [23]. Me spekuloida mahdollinen kolmitie proteiini vuorovaikutus AR, β-kateniinin ja p68 PCA soluissa. Ligandi vapaa AR on eristäytynyt sytoplasmassa Eturauhassyövän soluja ja kun hormonin sitoutumisen siirtyy pääasiassa tumaan [29]. Aiemmin löysimme p68 olevan tumaproteiini PCA soluja, joiden lokalisointi oli muuttumattomana androgeenien hoitoon [21]. Kuitenkin p68 on todettu sytoplasmassa paksusuolen syövän soluihin, joissa se on yhteydessä β-kateniinin [23], [25], ja β-kateniinin on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa AR sytoplasmassa PCa solujen ja siirtyä ytimen läsnä ollessa ja puuttuessa androgeenien [9] – [11]. Vuonna Näiden havaintojen, pyrimme vahvistamaan lokalisoinnin β-kateniinin ja p68 että LNCaP ja hormoniresistentti LNCaP-AI PCa solulinja (katso materiaalit ja menetelmät). Kuten odotettua vastauksena R1881 hoitoon (10 nM), AR siirtämisellä tumaan sekä LNCaP ja LNCaP-AI-solut (kuvio 1A). Androgeenien hoito ei merkittävästi muuta ydinvoiman lokalisoinnin p68 joko LNCaP tai LNCaP-AI-solujen ja vastaavasti lokalisoinnin β-kateniinin pysyi muuttumattomana, kun R1881 hoitoa. Suhteellisesti vähemmän β-kateniinin löytyy ydin verrattuna sytoplasmaan LNCaP-solujen, suhteellisesti suurempi LNCaP-AI solutyyppiä. Tämä heijastaa aikaisempia havaintoja, osoitti AR konstitutiivisesti sukkulat β-kateniinin tumaan LNCaP-AI solujen mukauttamista androgeeniriippumattomaksi olosuhteet [10], [12].

. Rajattu immuno-blot kuvat osoittavat soluliman ja ydin- LNCaP ja LNCaP-AI PCa solulysaateista (+/- R1881 10 nM, 8 tuntia), testattiin peräkkäin β-kateniinin, AR, p68, α-tubuliinia ja TATA sitova (TBP) vasta-aineet . B. Vuorovaikutus Kohdunulkoisten p68 ja β-kateniinin COS-7-soluissa. Kokosolulysaateista COS-7-soluissa, jotka on transfektoitu pcDNA

3-p68-myc ja PCS

3 + Myc

6-β-kateniinin konstruktit (+/- R1881 10 nM, 8 tuntia), oli immunosaostettiin β-kateniinin ja p68-vasta-ainetta vastaavasti. Rajattu immuno-blotit peräkkäin β-kateniinin, p68 ja myc antibody.C. Vuorovaikutus endogeenisen p68 ja β-kateniinin tumassa LNCaP ja LNCaP-AI PCa solujen läsnä ja poissa androgeenien. Rajattu immuno-blot kuvia LNCaP ja LNCaP-AI ydinvoiman lysaatit, immunosaostettiin p68-vasta-(+/- R1881 10 nM, 8 tuntia), ja tutkittiin peräkkäin β-kateniinin ja p68. Pura näytteet sisältävät joko koko solu tai ydin- lysaatin ja proteiini G-Sepharose ilman vasta-aineen läsnäoloa. Ohjaus (Con) näytteet sisältävät vasta-aineen ja proteiini G sepharose uuttopuskuriin vain.

Co-immunosaostus HCT-116 solulysaateista kanssa β-kateniinin vasta-tunnistetaan endogeenista p68 vuorovaikutusta β-kateniinin kokonaan lysaatit paksusuolen syöpäsoluissa [23]. Tarkempi analyysi käyttämällä Myc-merkityn typistyk- p68 osoitti, että COOH päätepisteestä p68 voinut vuorovaikutuksessa β-kateniinin, ja vuorovaikutus oli läpi helikaasi (N-terminaali) verkkotunnus p68. Sen jälkeen meidän immuno-blot havaintoja kuviossa 1A, jossa sekä β-kateniinin ja p68 todettiin tumassa LNCaP ja LNCaP-AI solujen läsnä ollessa ja puuttuessa androgeenien, me tutkimme, p68 ja β-kateniinin suoraan vuorovaikutuksessa tumassa Eturauhassyövän soluja. Kuvio 1B esittää ektooppinen samanaikainen immunosaostus yli-ilmaisi myc-leimatun p68 ja β-kateniinin fuusioproteiinit androgeenireseptorin negatiivinen COS-7-solulinja, sekä läsnäollessa ja ilman R1881 (10 nM). Osoittavat, että alle

in vitro

olosuhteissa p68 ja β-kateniinin pystyvät suoraan sitomaan itsenäisesti AR ja androgeenien. (N.B. korkeampi bändi β-kateniinin immunosaostus blot on epäspesifinen kaistan havaitaan myc vasta-aine). Kuitenkin endogeeninen proteiini immunosaostettiin ydin- LNCaP otteet osoitti β-kateniinin-p68 vuorovaikutus helpotettiin läsnäollessa androgeenien (R1881, 10 nM), mutta toisaalta siinä LNCaP-AI solulinja vuorovaikutusta helpotettiin puuttuessa androgeenien ( R1881, 10 nM) (kuvio 1 C). (N.B. päinvastaisessa immunosaostus käyttäen β-kateniinin vasta-kaatamaan p68-proteiini ole osoittanut vuorovaikutusta kahden proteiinin joko LNCaP tai LNCaP-AI solutyyppiä, huolimatta lukuisista yrityksistä erilaisilla vasta P-kateniinin). Olemme myös löytäneet endogeenistä vuorovaikutusta p68 ja β-kateniinin AR negatiivinen PC3 solulinjassa (katso kuva S1 tukemisessa tiedot), mikä osoittaa, että läsnä on funktionaalista AR on mahdollisesti tärkeä endogeeninen vuorovaikutusta p68 ja β-kateniinin Eturauhassyövän soluja [21], [28].

p68 Vuorovaikutus on RNAP II ja rekrytoimista toiminnalliset alueet

PSA

Gene

Olemme aiemmin kuvattu p68 kuin toiminta kuin ”adapteri” tai ”kytkin” proteiinia, joka voi koordinoida integroitu prosessit transkription aloittamisesta, venymään ja mRNA in AR-säädellään geenin ilmentymisen [30]. Rekrytointi p68 endogeenisen AR reagoiva geenit voivat helpottaa silmukointiyksikkövälitteiseen kokoonpano ja nostamaan RNA-polymeraasi II (RNAP II) venymä, jotka vaikuttavat silmukoitumiskohta tunnustamista ja edistää eksonin ohittaminen in orastavan selostukset. Koska perustettu rooleja β-kateniinin ja p68 pelata transkription aloittamisen AR geenien, pyrimme laajentamaan näiden tulosten ja tutkia suhdetta p68 kanssa RNAP II PCA soluissa. Löysimme p68 immunosaostettiin sekä endogeenisten tuottavia (fosforylaation ser-2) ja ei-tuottavia (fosforylaation ser-5) muotoja RNAP II PCa-soluissa, sekä läsnäollessa ja ilman androgeenien (kuvio 2A R1881, 10 nM hoidon ). Viittaa mahdolliseen rooli p68 aktiivisuuden (lisäksi AR koaktivaattoria toiminto), aikana venymään vaiheissa AR säänneltyjen transkription. Olemme aiemmin osoittaneet Kromatiini-immunosaostus (chip) ja QPCR analyysi yli 100 minuutin androgen hoito (R1881, 10 nM) ajan funktiona, co-rekrytointi p68 kanssa AR on androgeeniresponsiivinen ja -vahvenne alueilla AR säänneltyjen

PSA

geeni [21]. Laajentaminen Näiden havaintojen me optimoitu QPCR alukkeita muilla

PSA

geeni (in-välillä tehostaja ja promoottori alue (EP), eksonin 1, intronin 2, eksonin 3, intronin 3, eksonin 5 ja 3’dsF alueita), sen selvittämiseksi, onko p68 rekrytoitiin muualla kuin transkription aloittamista. (Huom pohjamaali sijainti ja järjestys tiedot näille alueille löytyy taulukosta S1 tietoja. Ei ollut mahdollista optimoida QPCR alukkeisiin intronin 1, eksonin 2, intronin 4 tai eksonin 4 alueilla

PSA

geeni). Kuvio 2B esittää merkittävää (

p

0,05 *) ero rikastamista AR upon R1881 hoito (10 nM) säädettyyn aikaan pistettä (0, 15, 30, 45, 90 ja 120 minuuttia) ARE III alueella

PSA

geeni, kuten on osoitettu aiemmin [31]. Rikastaminen AR muissa alueita ei nähty. Vastaavasti kuvio 2C esittää merkittävää (

p

0,005 **) syklinen dissosiaation-yhdistys rekrytointi p68 upon R1881 hoito (10 nM) ja ARE III alueella, vaikka rekrytointi ei rajoitu tähän alueeseen EP , eksoni 3, introni 3, eksoni 5 ja 3’dsF alueilla osoitti myös merkittävää etua. Rekrytointi ei saavuttanut merkitsevyyttä ARE I, eksoni 1 ja Intron 2 alueilla. Nämä havainnot merkitsevät p68 liittyy sekä transkription aloittamisen ja venymä muotoja RNAP II ja rikastettu ei pelkästään transkription aloituspaikat on AR säännellyn geeni mutta eksoni, introni ja 3’dsF alueilla, viittaa mahdolliseen toiminto p68 helpottamisessa käsittely AR-geenin transkription RNAP II.

. Rajattu immuno-blot kuvia LNCaP ydinvoiman lysaatit immunosaostettiin RNAP II H5 (ser-2), RNAP II H14 (ser-5), RNAP II CTD hiiren monoklonaalinen ja p68-vasta-ainetta (+/- R1881 10 nM, 8 tuntia), tutkittiin peräkkäin p68 ja RNAP II-vasta-aineen. Pura näytteet sisältävät ydin- solulysaatista ja proteiini G-Sepharose ilman vasta-aineen läsnäoloa. Ohjaus näytteet sisältävät vasta-aineen ja proteiini G sepharose ydin- uuttopuskuria vain. B. rekrytointi AR ja C. p68 alueisiin

PSA

geeni. LNCaP-soluja käsiteltiin 10 nM R1881: n ja kerättiin 0, 15, 30, 45, 90 120 minuutin ajankohtina. Näytteet immunosaostettiin AR, p68 tai kontrolli-IgG-vasta-aineita ja kierrätettyä materiaalia käsitellään Chip määrityksessä. QPCR tiedot edustavat n = 3 riippumatonta ChIP määrityksiä normalisoida tulotasoilla (+/- SE). (N.B. QPCR alukkeita ei voitu optimoida kaikkiin eksoni ja introni alueilla

PSA

geeni). Riippumaton pariksi näyte

t

testiä käytettiin vertaamaan rikastus rekrytointiin eri

PSA

alueet ja näyttää merkitys. D. Kaavio

PSA

geenin kuvaa eksoni /introni-rajoista.

p68 Function tarvitaan Rekrytointi AR ja β-kateniinin Järjestäjälle alueiden androgeeniresponsiivinen Genes

Olemme aiemmin osoittaneet laskua mRNA ja proteiini tasoilla AR ja androgeeniresponsiivinen

PSA

geeni kun p68 knockdown siRNA [21]. Yhdenmukainen Siru Edellä kuvattujen havaintojen, β-kateniinin rekrytoimista ja -vahvenne alueilla androgeeniresponsiivinen ja Wnt signalointia kohdegeenien sekä läsnäollessa ja ilman androgeenien [11], [12]. Valossa Näiden havaintojen suoritimme ChlP kokeiluja LNCaP köyhdytetty p68 siRNA selvittämään p68-toiminto vaadittiin AR ja β-kateniinin värväyksen promoottorialueiden androgeeniresponsiivinen geenejä. p68 suunnattu siRNA taintumisen lauseke (vaimennus p68 mRNA -50%

p

0,0494 * ja protein~90% 72 tuntia transfektion jälkeen), ei merkittävästi muuttanut β-kateniinin mRNA tai proteiini ekspressiotasoja verrattuna kontrolli (ei-hiljentäminen, NS) siRNA LNCaPs soluissa, läsnä ollessa tai poissa ollessa R1881 (kuvio 3A, B ja C vastaavasti). Androgeenistimulaation helpottaa vaatimaton (0,8-kertainen) rekrytointi AR ARE I alueella

PSA

promoottorin valvonnassa (NS) siRNA transfektoiduissa LNCaP-soluissa, kuten odotettua (kuvio 4A), joka oli merkittävästi heikennetty kontrolloida tasolle in p68 köyhdytettyä soluissa (

p

0,0077 **). Samoin androgeenistimulaation kasvoi AR värväyksen ARE III tehostaja alueella

PSA

geeni 9 kertaiseksi ohjaus (NS) siRNA transfektoidut solut (kuvio 4B), kun taas p68 tyhjentynyt soluissa, rekrytointi samalla alueella oli vähennetään 4 kertaa (

p

0,0008 ***). Samanlainen vaimennus AR rekrytointi nähtiin myös

KLK2

(0,25-kertainen,

p

= 0,1593 kuvio 4C) ja

TMPRSS2

(1-kertainen,

p

0,0016 ** kuvio 4D) promoottori alueiden p68 suunnattu siRNA köyhdytettyä solujen upon R1881 hoitoa, vaikka tämä ei pääse merkitystä ja androgeenistimulaatiota eivät osoittaneet rikastamisen AR rekrytointi on

KLK2

promoottori . Kuitenkin olemme nähneet rekrytointi AR

KLK2

promoottorin muissa aikapisteissä (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista, samanlainen kuvio vaimennus β-kateniinin rekrytointi upon p68 suunnattu siRNA Knockdown nähtiin myös. Lisääntynyt β-kateniinin rekrytointia sekä ARE I (0,6-kertainen) ja ARE III (0,8-kertainen) alueilla havaittiin heti androgeenistimulaation hallinnassa (NS) siRNA transfektoituja soluja verrattuna ei-käsiteltyjen solujen (kuvio 4E ja 4F vastaavasti), odotetusti . Kuitenkin p68 köyhdytetyn soluissa, β-kateniinin rekrytointi oli merkittävästi heikennetty alle ohjaus (NS) siRNA tasoja molemmilla alueilla (1,1-kertainen,

p

0,0023 ** ja 1,3-kertaisiksi, p 0,0011 ** vastaavasti). Samanlainen β-kateniinin de-rekrytointi toistettiin

KLK2

ja

TMPRSS2

promoottori p68 köyhdytettyä soluissa (1,25-kertainen,

p

0,0003 ** * Kuva 4G, ja 1-kertainen,

p

0,0005 *** Kuva 4H vastaavasti). Vaikka on huomattava, että toisin kuin AR rekrytointi, lisääntyminen β-kateniinin rekrytointi (1,75-kertainen) on nähtävissä

KLK2

promoottorialue tällä androgeenireseptorin ajankohtana. Olemme raportoineet lasku AR mRNA ja proteiini tasoilla kun p68 ehtyminen LNCaP aiemmin [21], joka tukee käsitystä, että p68 toimii AR koaktivaattori. Siksi vähentäminen rekrytointi AR promoottorialueiden androgeeniresponsiivinen geenien p68 köyhdytetyn soluissa voisi odottaa, koska AR itsessään on androgeeniresponsiivinen geeni. Kuitenkin p68 tyhjentynyt soluissa, löysimme β-kateniinin rekrytointi alennetaan alemmalla tasolla kuin käsittelemättömien solujen lainkaan promoottorialueille arvioidaan (samanlainen IgG-tasot). Ehdota suoran p68 vuorovaikutusta voidaan tarvita helpottamaan lastaus β-kateniinin transkriptionaalisesti aktiivinen alueille androgeeniresponsiivinen geenejä. Tämä tieto korostaa p68 funktio rekrytointi koaktivaattoria β-kateniinin ja AR promoottorialueiden androgeeniresponsiivinen geenien.

mRNA ekspressiotasot p68 A. ja β-kateniinin B. hallinnassa (NS) ja p68 siRNA-transfektoiduissa LNCaP-soluja (+/- R1881 10 nM, 16 tuntia). QPCR data normalisoitiin GAPDH tasoa ja taita muutos lasketaan suhteessa kontrolliin (NS) (-R1881) mRNA-tasot (asetettu 1). Riippumaton näyte

t

testiä käytettiin vertaamaan erojen ekspressiotasot ja näyttää merkitys. C. Cropped immuno-blot kuvia lysaatit LNCaP käsiteltiin 10 nM R1881 (16 tuntia) ja transfektoitu ohjaus (NS) ja p68 siRNA. Blotit testattiin peräkkäin β-kateniinin, p68 ja α-tubuliinin vasta-aineita.

LNCaP-soluja, jotka oli transfektoitu p68 tai ohjaus (NS) siRNA, käsiteltiin 10 nM R1881: ssa 90 minuuttia ja immunosaostettiin joko AR ABC D. tai β-kateniinin E. F. G. H. vasta-aineet (mukaan lukien IgG-kontrollivasta-ainetta). Talteen aineisto käsiteltiin Chip määrityksen ja rekrytointi

PSA

ARE I (A F),

KLK2

(C G)

TMPRSS2

(D H) promoottorialueille arvioidaan suhteessa 0 minuutin ajankohtana. p68 heikkeni LNCaP oli vähentynyt AR β-kateniinin rekrytointi hoidon jälkeen 10 nM R1881: n 90 minuutin kaikki alueet arvioidaan kontrolliin verrattuna (NS) siRNA-soluja. Tulokset esitetään edustavat n = 3 itsenäisestä kokeesta (+/- SD). Riippumaton näyte

t

testiä käytettiin vertaamaan erojen ekspressiotasot ja näyttää merkitys.

p68 ja β-kateniinin Additiivisesti Paranna transkriptionaalista aktiivisuutta androgeenireseptorin säädeltyjen geenien

Koska p68 ja β-kateniinin vuorovaikutuksessa PCA soluissa ja p68 helpottaa rekrytointia β-kateniinin ja androgeeniresponsiivinen geenin promoottorit. Seuraavaksi me päätimme tutkia yhdistetty vaikutus koekspressio p68 ja β-kateniinin on transkriptionaalista aktiivisuutta AR käyttäen androgeeniriippuvaisen lusiferaasireportteri määritykset COS-7-soluissa. AR-välitteistä p (ARE)

3 Luc toimittaja oli voimakkaasti kannustanut 2-kertaisesti, kun AR upon R1881 (10 nM) androgeenien hoitoon (kuva 5, vertaa vaaleanharmaa bar + R1881 ja tummanharmaa palkki -R1881). Yli-ilmentyminen β-kateniinin osoitti vähäistä p (ARE)

3 Luc reportteri aktiivisuutta läsnä ollessa tai ilman R1881 osoittavat, että β-kateniinin ei vaikuta suoraan p (ARE)

3 Luc reportteri aktiivisuus puuttuessa AR. Kuitenkin koekspressio AR ja β-kateniinin osoitti 8 kertaistanut p (ARE)

3 Luc reportteriaktiivisuutta upon R1881 hoito, vahvistaa β-kateniinin kuin koaktivaattoria AR yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen [28 ]. Samoin koekspressio AR ja p68 osoitti 5 kertainen lisäys p (ARE)

3 Luc reportteriaktiivisuutta seuraavat R1881 hoidon, myös vahvistaa p68 kuin koaktivaattoria AR yhtäpitäviä aikaisempien havaintojen. (N.B. p68 on osoitettu ei vaikuta p (ARE)

3 Luc reportteri aktiivisuutta suoraan ilman AR [21]). Kuitenkin koekspressoimalla AR, β-kateniinin ja p68 konstruktioita osoittivat merkittävää 18-kertainen (

p

0,0011 **

) B kasvaa p (ARE)

3 Luc reportteri aktiviteetti upon R1881 hoito, 10 kertaa suurempi kuin AR ja β-kateniinin koekspressoimalla, jotka osoittavat p68 on merkittävä additiivinen vaikutus AR ja β-kateniinin transkriptionaalista aktiivisuutta. Tämä nähtiin myös toisen androgeenin säädellään

PSA

promoottorin lusiferaasireportteri- (p (PSA) Luc), jolloin co-ilmentymisen AR, β-kateniinin ja p68-konstruktit havaittiin merkittävä 8-kertaiseksi (

p

0,0057 **) kasvaa reportteriaktiivisuutta, 5 kertaa suurempi kuin AR ja β-kateniinin ilmentäminen rinnakkain, mikä vahvistaa additiivista vaikutusta p68 on β-kateniinin ja AR transkriptioaktiviteettia (ks olevat tiedot, kuva S2). p68 on raportoitu muodostavan heterodimeerejä erittäin homologinen helikaasin p72 (DdX17), ja yhteistyö aktivoida β-kateniinin välitteisen geeniekspression aiemmin [23]. Huomasimme, että kotransfektoimalla AR, β-kateniinin ja p72 konstruktioita ei ollut merkittävää additiivinen vaikutus p (ARE)

3 Luc reportteriaktiivisuutta verrattuna kotransfektoimalla AR, β-kateniinin ja p68 konstruktioita (katso taustatiedot, kuva S3

p

= 0,3646). Tämä on samanlainen kuin edellisen raportin, joka löytyy p72 voinut parantaa AR transkription aktiivisuutta p (ARE)

3 Luc toimittaja [21], ja ehdottaa spesifisyys p68 transkription aktivoituminen AR PCA. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, β-kateniinin ja p68 voi toimia yhdessä toisena aktivaattoreina parantaa AR säänneltyä transkription.

COS-7-solut transfektoitiin kolmesti p (ARE)

3Luc toimittaja ja pCMV β-galaktosidaasi plasmideilla yhdessä nisäkkään ekspressiovektoreita AR, β-kateniinin ja p68 (+/- 10 nM R1881). Lusiferaasiaktiivisuus korjattiin vastaavien β-galaktosidaasin aktiivisuus, jolloin saadaan suhteellinen aktiivisuus. Valikoima plasmidi tasoja (+ ja ++) vastaa 50 ja 100 ng vastaavasti. Tiedot esitetään suhteessa AR aktiviteetti yksin (-R1881) (asetettu 1), ja edustavat vähintään n = 3 lusiferaasianalyysissä kokeita (+/- SE). Riippumaton näyte

t

testiä käytettiin vertaamaan erojen ekspressiotasot ja näyttää merkitys.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa kuvaamme toiminnallinen vuorovaikutus p68 , β-kateniinin ja AR tumassa Eturauhassyövän soluja. AR on osoitettu signaalin kautta Wnt /β-kateniinin väylän PCa kuin mukautuminen castrate androgeenien [12], ja β-kateniinin tiedetään olevan vuorovaikutuksessa muiden co-aktivaattoreita AR [32]. Tässä esittelemme immunosaostus, p68-köyhdytettyä siru ja

PSA

lusiferaasireportterista data vahvistaa vuorovaikutusta p68, β-kateniinin ja AR PCA soluissa. Alussa vahvisti suora

in vitro

p68-β-kateniinin vuorovaikutus lyhytaikaisella transfektiolla rakententeita osaksi AR negatiivinen COS-7-solulinja (joka ei ollut androgeeniriippuvaisessa). Kuitenkin kun lisätutkimuksia löysimme alla endogeenisten olosuhteissa p68-β-kateniinin vuorovaikutus helpotettiin läsnäollessa androgeenien LNCaP PCa solulinjassa, mutta kääntäen hormoni tulenkestävät (LNCaP-AI) johdannainen tässä solulinjassa (edustaja CRPCa tauti tyyppi), vuorovaikutus helpotettiin puuttuessa androgeenien. Tämä on samanlainen kuin toteamiseen lisääntynyt endogeenisen AR /β-kateniinin kompleksin muodostumista kastraatiotason kestävä PCa hiiri ksenografteja malli, jossa ei vuorovaikutusta AR ja β-kateniinin havaittiin androgeenien läsnäolon [10]. Tämä saattaa viitata sovitettu mekanismi, jonka p68 ja β-kateniinin co-aktivaattorit yhteistoiminnallisesti ylläpitää transkriptionaalista aktiivisuutta AR (ja androgeenin geenien), helpottaa solujen selviytyminen kastraatiotasolle-resistenttejä (CRPCa) sairauden tyyppi. Kuitenkin lisätyötä pyytää perustelemaan koko molekyylitason mekanismi tämän väitteen. Immuno-blot tiedot vahvistivat sijainti solun p68 ja β-kateniinin ollut vaikutusta hormonin (löysimme p68 ja β-kateniinin tumassa Eturauhassyövän soluja sekä läsnä ja poissa androgeenien), ja

PSA

lusiferaasireportteri- tiedot osoittivat kotransfektoimalla p68 ja β-kateniinin konstrukteja oli additiivinen vaikutus transkriptionaalista aktiivisuutta AR läsnä androgeenien. Nämä tiedot viittaavat siihen, että p68 ja β-kateniinin toimimaan yhdessä co-aktivaattorit additiivisesti parantaa transkriptionaalista aktiivisuutta AR, joka mielenkiintoisesti, voi olla vaikutuksia etenemistä CRPCa sairauden tyyppi.

osoitti myös käyttämällä pudotus of p68 ilmaisun siRNA oligonukleotidin yhdistettynä siru, että p68 tarvittiin optimaaliseen rekrytointi AR ja β-kateniinin promoottori alueille androgeenireseptorin säännelty geenejä. Androgeenistimulaation helpottanut rekrytointia AR sekä ARE I ja ARE III alueilla

PSA

promoottori, ja

KLK2

ja

TMPRSS2

promoottori alueilla ohjaus (NS) siRNA transfektoituja LNCaP, joka sittemmin heikennettyjä p68 köyhdytettyä soluissa. Havaittu β-kateniinin rekrytointi samaan androgeenireseptorin säädellään promoottorialueet pienennettiin p68 köyhdytettyä LNCaP-soluissa, kun androgeeni hoitoa, mutta alemmalla tasolla kuin ei-käsiteltyjen solujen (samanlainen kuin IgG-ohjaus). Tämä on mielenkiintoinen havainto, koska se viittaa siihen, että vähentäminen rekrytointi β-kateniinin jotta promoottorialueissa androgen geenien in p68 köyhdytettyä soluissa ei ole vain seurausta vähemmän AR ottaa palvelukseen, ja merkitsee sitä, että p68 toimintoa tarvitaan kuorma β-kateniinin transkriptionaalisesti säännellään alueille androgeeniresponsiivinen geenien.

rooli p68 vaihtoehtoisissa mRNA on hyvin dokumentoitu (tarkistetaan [19], [21], [33]). Olemme aiemmin arvelleet, että p68 voi toimia kuin ”adapteri” tai ”kytkin” proteiinia, joka koordinoi tiiviisti integroituja prosesseja transkription ja RNA käsittely, helpottaa rajat talk välillä transkription ja RNA käsittely AR-geenien, mahdollisesti säätelemällä ja transkription aloittamisesta /venymä RNAP II [30]. RNAP II on kaksi fysiologisesti tärkeää fosforylaatiokohdat kohdissa C-terminaalissa, jotka ovat tärkeitä siirtymistä polymeraasia transkriptioaloitus muodossa (fosforylaation ser-5), perustamiseen venymän transkription kompleksin muodossa (fosforylaation ser-2) . Tässä tutkimuksessa osoitamme käyttäen endogeenista tumauutteita LNCaP PCa soluja, jotka p68 vuorovaikutuksessa sekä Prosessoiva (fosforylaatio ser-2) ja ei-tuottavia (fosforylaatio ser-5) muoto RNAP II, kun läsnä ja poissa androgeenien.