Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Keuhkosyöpä on kehittymässä nopeasti johtava kuoleman syy Kiinan syöpäpotilailla. Syy tekijät Kiinan keuhkosyöpä kehitys ovat edelleen suurelta osin epäselvä. Täällä palveluksessa shRNA kirjasto-pohjainen menettämisestä toiminto näytön genomin laajuinen ja puolueettomasti kuulustella mahdollisia tuumorisuppressoriproteiinia ehdokkaita immortalisoidut ihmisen keuhkojen epiteelisolujen linja BEAS-2B.

Menetelmät /Results

Soft agar analyysit tehtiin seulontaan BEAS-2B solut infektoitu retrovi- shRNA kirjastoon hankittu ominaisuus kiinnittymisestä riippumattoman kasvun, iso ( 0,5 mm halkaisijaltaan) ja hyvin erotetut pesäkkeet eristettiin lisääntymisen . PCR: t suoritettiin monistamiseen integroidun shRNA fragmentti yksittäisistä genomi-DNA: ta kustakin pesäke, ja kukin PCR-tuote toimitetaan DNA sekvensointi paljastaa integroidun shRNA ja sen kohdegeenin. Kaikkiaan 6 ehdokas muutoksen vaimentimet lukien INPP4B, Sesn2, TIAR, ACRC, Nup210, LMTK3 tunnistettiin. Me validoitu Sesn2 ehdokkaana keuhkosyövän tuumorisuppressorin. Knockdovvn Sesn2 jota shRNA kohdentamalla 3 ’UTR: Sesn2 transkriptio stimuloi voi- lisääntymistä ja pahanlaatuisiin keuhkojen keuhkoputkien epiteelisolujen BEAS-2B aktivoimalla Akt-mTOR-p70S6K signalointi, kun taas ektooppinen ilmentyminen Sens2 uudelleen tukahdutti pahanlaatuisiin esiin jonka Sesn2 shRNA. Lisäksi knockdovvn Sesn2 in BEAS-2B solujen edisti BEAS-2B cell-istutetut ksenograftin kasvaimen kasvua nude-hiirissä. Lopuksi DNA-sekvensointi osoitti mutaatioita Sesn2 geeni ovat harvinaisia, proteiini tasot Sesn2 77 kiinalaisen keuhkosyöpäpotilaita vaihtelee suuresti verrattuna niiden viereisten normaaleissa kudoksissa, ja alhaisen ekspressiotason Sesn2 kumppaniaan köyhien selviytymisen näillä tutki potilaita Kaplan Meier-analyysi.

Johtopäätökset

shRNA perustuva näyttö on osoittanut Sesn2 on potentiaalinen tuumorisuppressoriproteiinia keuhkojen epiteelisoluissa. Ilmaisu taso Sesn2 voi toimia ennustetyövälineenä merkki Kiinan keuhkosyöpäpotilaita klinikalla.

Citation: Xu H, Sun H, Zhang H, Liu J, Fan F, Li Y, et al. (2015) Lentotoiminnan ShRNA Perustuu Genetic Screen Tunnistetut Sesn2 mahdollisena tuumorisuppressori Keuhkosyöpä kautta tukahduttaminen Akt-mTOR-p70S6K Signaling. PLoS ONE 10 (5): e0124033. doi: 10,1371 /journal.pone.0124033

Academic Editor: Max Costa, New York University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 22 joulukuu 2014; Hyväksytty: 03 maaliskuu 2015; Julkaistu: May 11, 2015

Copyright: © 2015 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Rahoitusta saatiin Natural Sciences Foundation of China (avustus nro 81272582). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on nousemassa yleisin ja tappava pahanlaatuisuuden Kiinassa sekä maailman [1,2]. Perustuu patologiset ominaisuudet, keuhkosyöpä voidaan jakaa kahteen suureen alatyyppiin, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC). NSCLC että osuus on yli 80% kaikista keuhkosyöpää voidaan edelleen jakaa adenokarsinooma (~ 48%), okasolusyöpä (~ 28%) ja suuri cell carcinoma (~ 24%) [1,3]. Vaikka suuria edistysaskeleita saavutettua diagnostiikka, leikkaus, sädehoito ja kohdennettuja hoitomuotojen, keuhkosyöpä edelleen hallussaan melko huono ennuste ja sen 5 vuoden pysyvyys on edelleen niinkin alhainen kuin 10% -15% viimeisten 30 vuoden aikana [3].

mekanismit ajo keuhkosyöpä kehitys ovat monimutkaisia, geneettiset muutokset, tupakointi ja ympäristön eri päästön ovat yleisiä aiheuttajia johtuvan keuhkosyöpä esiintyminen. Tuumorisuppressoreilla kanssa menettämisestä toiminnon mutaatioita, deleetioita ja /tai epigeneettiset hiljentäminen usein ratkaiseva rooli keuhkojen kasvaimien syntyyn [4]. Esimerkiksi mutaatio määrä p53-geenin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) voidaan saavuttaa 60%, jopa menee jopa 80% vuonna pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) [5]. Muita tuumorisuppressoreilla kuten PTEN paljon pienemmillä mutaationopeutta myös osalliseksi keuhkoadenokarsinooma [6]. Lisäksi paremmin ymmärtäminen molekyyli- muutoksia tapahtui keuhkojen solu pahanlaatuisiksi, löytö keuhkosyöpään liittyvien tuumorisuppressorigeeneille tarjoaa myös tehokkaampia ja yksilöllisiä hoitoja varten keuhkosyövän hoitoon [7]. Tätä varten tunnistaa uusia tuumorisuppressoreilla on genominlaajuisten ja puolueettomasti on yksi keskeisistä tehtävistä keuhkosyövän tutkimukseen. Sen toteaminen uusi tuumorisuppressorigeeneille on melko vaikeaa, koska niiden väistyvä ilmaisun luonteesta. Cancer koko genomi-analyysi osoittaa, että on olemassa monia alhainen suhde mutaatioita kasvainsoluissa, ja mutaatiot vaihtelevat eri alkuperää kudosten [8]. ShRNA kirjasto-pohjainen menettämisestä toiminto näytön kohdistaminen ihmisen transcriptome kuulustella mahdollisia tuumorisuppressoriproteiinia ehdokkaita systemaattisesti kuolemattomaksi ihmisen soluissa on osoittautunut tehokkaaksi lähestymistapa löytämään uusia tuumorisuppressoreilla [9,10], käyttämällä tätä lähestymistapaa, useita uusia tuumorisuppressorien kuten Rest, PTPN12 jne löydettiin [11,12].

Sestrins kuuluvat pieni ja kehittyvä säilyneeseen koostuu kolmesta jäsenestä nisäkkäillä, joista Sesn1 ja Sesn2 ovat stressin indusoima ja p53 säännellään [13,14]. Kyky Sesn1 ja Sesn2 estää solujen kasvua ja proliferaatiota johtuvan niiden inhibitio mTORC1 toiminnan kautta AMPK riippuvaisen mekanismin eri ihmisen ja hiiren solulinjoja, sekä hiiren maksassa [15].

seuraus Sesn2 hallita solujen kasvua ja selviytymistä edelleen kiistanalainen. Tarkka rooli Sesn2 solun eloonjäämiseen voi riippua luonteesta stressiä. On osoitettu, että Sesn2 ilmentyminen estää solujen kasvua ja proliferaatiota vasteena genotoksinen stressi (kuten DNA-vaurioita) ja Sesn2 puutos tekee hiiren fibroblasti alttiimpia onkogeenisen transformaation kautta helpotus p53 riippuu mTOR [16]. Lisäksi kohonnut Sesn2 esti IR-indusoitua mTOR signalointi ja herkistyneet MCF7-solujen IR säteilytys [17], sen sijaan, ilmaus Sesn2 suojattu iskemian, alhainen glukoosi ja H

2O

2 indusoiman apoptoosin LNCaP-soluissa [18 ].

tulokset

shRNA näytön muutosta vaimentimet keuhkojen epiteelisolujen

Anchorage riippumaton kasvu on ominaista solun pahanlaatuisen muutoksen

in vitro

. Transformoidut solut menettävät kontaktin esto, voivat kasvaa ja selviytyä ilman kiinnittymään toisiinsa kulttuuriin matriisiin. Siksi pehmeä agar määritys mittaamaan ankkurointi riippumaton kasvu on edullinen tapa löytää uusia muunnos synnyssä [19]. Kuten useimmat keuhkosyöpä johtuvat epiteelisolujen päätimme keuhkoputken epiteelisolujen BEAS-2B ensisijaisen näytön. BEAS-2B soluista peräisin terveen ihmisen keuhkokudoksesta transformoitiin SV40-Large T-antigeenin. Nämä solut ovat kuolemattomiksi, mutta kyvyttömyys lisääntyä tehokkaasti ilman soluväliaineen ja muodostaa kasvaimia karvattomissa hiirissä [20]. Olemme tartuttaa BEAS-2B solut retroviruksen shRNA kirjasto rakennettiin pSM2 retrovirusvektorilla. ShRNA kirjasto koostuu 87283 shRNAs kohdistaminen 32216 ihmisen transkriptien [9,10]. Kirjasto seulottiin 72 allasta 1000 shRNAs kohti altaan käyttämällä protokollaa kuvattu aiemmin (kuvio 1A) [21]. Tartunnan BEAS-2B-solut valittiin 0,5 ng /ml puromysiiniä ja 1 viikko, sitten arvioimme infektoitujen solujen kiinnittymisestä riippumattoman proliferaation (kuvio 1B). Sekä negatiivinen kontrolli shFF2 ja shRNA kirjasto tartunnan BEAS-2B-soluja kasvatettiin 0,35% agaria kolme viikkoa. Laskimme siirtomaa numerot shFF2 ohjaus ja shRNA kirjasto Levyt violetti crystal värjäystä. Kun taas shFF2 solujen aiheuttama paljon pienempi ja vähemmän numerot pesäkkeitä, kirjaston transformoidut solut esiin paljon enemmän ja suurempia pesäkkeitä ylemmässä pehmeän agaralustalla. Keskimääräinen määrä transformoitujen pesäkkeiden olivat 86 ± 20 per 10cm levy shFF2 soluja ja 205 ± 35 shRNA kirjaston soluja perustui tuloksiin kolmen erillisen kokeen (kuvio 1 C). Suuri ( 0,5 mm halkaisijaltaan) ja hyvin erotetut yksittäisiä pesäkkeitä poimittiin laajentamiseen säännöllisesti yksikerrosviljelmän. Arvioitu 100 ankkurointi riippumaton yksittäistä kloonia eristettiin ja viljeltiin. Genomisen DNA: n yksi pesäke uutettiin ja suoritettiin PCR monistamiseksi hiusneula-DNA integroidun shRNAs ja sen jälkeen antamalla Sangerin DNA-sekvensoinnilla. Vaikka useimmat PCR-tuotteet eivät ole tuottaneet informatiivinen DNA sekvensointi tuloksia, koska joko teknisistä kysymyksistä tai useita lajeja shRNAs nykyisten yhdessä genomissa, vielä tunnistivat yhteensä 6 yksittäisiä geenejä kohdistettu 6 ainutlaatuinen shRNAs läpi sekvensoidaan provirus- shRNAs alkaen näiden yksittäisiä klooneja (taulukko 1 ja S1 Taulukko yksityiskohtaista tietoa). Niistä 6 ehdokas muutosta vaimentimet, INPP4B on tunnettu kasvain vaimennin mukana ovat rinta- ja eturauhassyöpää [22,23], roolit loput ehdokas geenien suppressioon solutransformaatiota eivät ole olleet selkeitä tai hyvin tunnettu vielä. Koska Sesn2 geeni on liitetty solun säätelyssä kautta p53 signalointireitin siten, päätimme Sesn2 kuin alkuun ehdokas tuumorisuppressori ja validoitu sen solutoiminnoille sekä

in vitro

ja

in vivo

.

(a) kaaviokuva geneettinen näytön muutoksen suppressorit BEAS-2B-soluja. Retrovirukset kuljettavat shRNA kirjasto muodostettiin transfektoimalla viruksen pakkaus solujen shRNA plasmideilla. BEAS-2B-soluja infektoitiin FF2 shRNA tai shRNA kirjaston viruksia ja viljeltiin pehmeässä agarissa 10 cm levyjä 3 viikkoa, suuria ja yksittäisiä pesäkkeitä eristettiin solujen laajentamiseen, PCR-monistus ja DNA-sekvensoinnilla integroidun shRNAs. (B) Kuvat ovat muodostuneiden pesäkkeiden pehmeillä agarmaljoilla. Transformoidut pesäkkeet havaittiin kristalliviolettivärjäys- värjäyksellä (ylempi paneeli) tai valomikroskoopilla 20x suurennuksella (alempi kuva). (C) Yhä suurempi ankkurointi riippumatonta pesäkettä muodostettiin kirjastossa tartunnan soluissa kuin shFF2 tartunnan saaneiden solujen, tiedot esitetään keskiarvona pesäkeluvussa ± keskihajonta levyä kohti perustuvat kolmen riippumattoman infektiokokeet, *

p

0,05 Studentin t-testiä.

Sesn2 tukahduttaa pahanlaatuinen transformaatio BEAS-2B solujen

Sesn2, ensimmäinen tunnistettu Hi95, on hypoksia indusoituva proteiini ja näyttää funktio estämällä mTOR-signalointireitin [18]. Jotkut tutkimukset osoittavat, että se voi toimia kasvaimia estävänä, koska sen soluproliferaation inhibointi, mutta ei ole suoraa näyttöä siitä, että [16]. Meidän shRNA geneettistä näyttöä ja DNA: n sekvensointi tuloksia, löydettiin kolme BEAS-2B transformoitujen pesäkkeiden kätkeminen samanlainen shRNA kohdistettu 3 ’UTR: Sesn2 transkriptien (nimetty shSesn2-1 varten shRNA sekvenssi-informaatiota katso S1 taulukko). Poissulkemiseksi off-tavoite vaikutuksia, suunnittelimme ja testattiin kaksi shRNAs (nimetty shSesn2-2 ja shSesn2-3, katso S1 taulukko) kohdistaminen eri alueilla 3 ’UTR: Sesn2 selostukset. Solulinjat ilmentävät Sesn2 kohdistaminen shRNAs analysoitiin Western-blottauksella ja endogeenisen Sesn2 on vähentynyt noin 80% on shSesn2-2 ilmentävä solulinja (kuvio 2A). Jaoimme niitä Sesn2-2 hiljentäminen solut pehmeässä agarmaljoille. Kun 3 viikon kasvun shSesn2-2 hiljentäminen solu osoitti vahvaa pesäkkeiden muodostumisen kyky kanssa 435 ± 25 pesäkettä per 10cm levy, kun taas vähemmän ja pienempiä pesäkkeitä (106 ± 40 per levy) muodostettiin shFF2 säätökennotyyppi ympätty levyt (kuvio 2B ). Lisäksi ektooppinen ilmentyminen Sesn2 ohjaa pcDNA3.1 vektorin shSesn2-2 hiljentäminen solun osittain uudelleen tukahdutti pesäkkeiden muodostumisen mahdollisuuden aikaansaama shSesn2-2 (kuvio 2B), mikä osoittaa, havaittu fenotyyppien todennäköisesti johtuu vähentämiseen Sesn2, ei aiheuttama shRNA off-tavoite vaikutuksia. Testaa

in vivo

kasvaimen lähestymiskiellon kyky myönnettyjä Sesn2, The shSesn2-2 ja shFF2 solua injektoitiin ihonalaisesti oikeaan ampits että Balb /c nude-hiirissä. Tällä 28. päivänä istutuksen jälkeen, muodostunut ksenografti leikattiin kustakin hiirestä, tilavuus ja paino mitattiin kunkin tuumorin ja verrattiin. Kuten on esitetty kuviossa 2C, vahva ksenograftin kasvaimen muodostumisen mahdollisuuden havaittiin shSesn2-2 ilmentävät solut (ja yhteenveto kaikista kasvainten muodostettu Sesn2 pudotus solulinja kahdessa erässä nude-hiirten, katso S2 kuviossa). Keskimääräinen ksenograftin kasvainten tilavuudet shSesn2-2 ja shFF2 istutetut hiiret ovat 521,45 ± 25.51mm

3ja 69.02 ± 31.48mm

3 (kuvio 2D), ja keskimääräinen kasvaimen painot olivat 0,523 ± 0,064 g ja 0,156 ± 0,071 g vastaavasti (kuvio 2E), nämä erot ovat tilastollisesti merkitseviä (p 0,05 Studentin t-testi). Yhdessä tuloksemme osoittavat, että knockdovvn Sesn2 edistää pahanlaatuisten transformaatio BEAS-2B soluissa sekä

in vitro

ja

in vivo

, ja Sesn2 voi toimia mahdollisena tuumorisuppressoriproteiinia keuhkojen epiteelisoluissa .

(A) pudotti endogeenisten Sesn2 kaksi riippumatonta shRNAs kohdistaminen 3 ’UTR: Sesn2 selostukset, vahvistettiin immunoblottauksella. (B) keskimääräinen pesäkkeiden muodostettu shSesn2-2 transformoituja soluja 4 kertaa suurempi kuin shFF2 transformoituja soluja, *

p

0,05. Kohdunulkoinen ilmentyminen Sesn2 uudelleen tukahdutetaan ankkurointia riippumaton kasvu shSesn2-2 ilmentävien solujen. (C), (D) ja (E) knockdovvn Sesn2 in BEAS-2B soluissa johti tehostetun kasvainten muodostumista nude-hiirissä. Sesn2 vaiennetaan Solut istutetaan kainaloihin on

Balb /c

nude-hiirissä, ksenograftit muodostettiin kuukautta myöhemmin siirron jälkeen ja valokuvattu, punaiset nuolet ilmoitettu muodostunut kasvaimia alle hiiren ihon (ylempi paneeli C). Kuva kahden edustavan leikellään kasvaimia osoitettiin alemmassa paneelissa C. Keskimääräinen kasvainten ja painot siirrettyjen hiiriä Sesn2 hiljentämiseen ja FF2 ohjaus soluja mitattiin ja piirrettiin D ja E, tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta kohden hiiri ryhmä, *

p

0,05 jota Studentin t-testi.

hiljentäminen Sesn2 by shRNA edistää sekä solujen kasvuun ja solujen vaeltaminen

Accelerated solujen kasvua ja solujen vaeltamiseen ominaisuudet ovat pahanlaatuisia transformoitujen solujen. Tutkia vaikutuksia Sesn2 solujen kasvuun ja solujen vaeltaminen, perustimme Sesn2 vaiennettu solulinjassa tarttumasta retroviruksen shSesn2-2 osaksi keuhkojen A549-soluissa (kuvio 3A). Solusyklin profiileja tuloksena solulinjoissa määritettiin virtaussytometrialla. Suuri S-vaiheessa suhteessa havaittiin shSesn2-2 soluissa kuin siinä, shFF2 soluja (39,22% vs. 23,45%, kuvio 3B), joka osoittaa hiljentäminen Sesn2 aiheuttama nopeutetun solusyklin etenemisen. Sitten me seurataan solujen kasvua MTT: llä, ja löysi shSesn2-2 solut lisääntyvät nopeammin kuin shFF2 soluja (p 0,05, kuvio 3E). Haavan paranemisen kokeet suoritettiin shSesn2-2 ja shFF2 solujen tarkistaa suhde ekspression Sesn2 ja migraatiota. Ennen määritystä, shSesn2-2 ja shFF2 soluja esikäsiteltiin mitomysiini C: llä sen varmistamiseksi, että sulkemisen haavan johtui solujen vaeltamiseen, mutta ei proliferaatiota. Keskimääräinen sulkeminen alueet olivat 15,30 ± 2,56, 26,03 ± 3,96, 74,93 ± 5,72 at 6h, 12h ja 24h seuraava tyhjästä luomista shSesn2-2 soluissa ja 2,42 ± 1,05, 7,37 ± 1,38, 28,4 ± 4,08 sisään shFF2 soluissa (kuvio 3C ja kuvio 3D). Nopea haavan sulkeminen shSesn2-2 solujen tuettavien puute Sesn2 edistää solujen kulkeutumista keuhkojen A549-soluissa.

(A) konformaatio Sesn2 Knockdown A549-soluissa immunoblottauksella. (B) Solusykli profiilit keuhkoadenokarsinooma A549cell ilmentävät shSesn2-2 ja shFF2. Solut värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin virtaussytometrialla. Korkeampi S faagi osuus havaitaan shSesn2-2 soluissa ehdotti nopeammin solusyklin etenemistä verrattuna shFF2 soluihin. (C) Kuvat ovat haavan paranemista kokeen suorittaa shSesn2-2 ja shFF2 ilmentävien solujen ilmoitettuina aikoina. Keskimääräinen haavansulkemiseen prosenttiluvut soluryhmäkohtaisesti piirrettiin in (D), merkittävää paranemista ero havaittiin 24 tunnin haavan paranemista, *

p

0,05. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. (E) kenno kasvuvauhdin shSesn2-2 ja shFF2 ilmentävien solujen määritettiin MTT määrityksissä ja verrattiin kaksisuuntainen Anova-testi (*

p

0,05).

Sesn2 estää Akt-mTOR-p70S60K signalointi

seuraus että Sesn2 liittyy säätelyssä muuttaneet tilaa BEAS-2B epiteelisolujen saa meidät mitkä molekyylien piiri voi vaikuttaa menetys Sesn2 toiminto. Kuten Akt-mTOR signaalireitin tärkeä rooli erilaisissa kasvaimissa ja Sestrin perhe on ollut mukana tukahduttamista mTORC1 aktivoinnin sitoutumalla AMPK [24], tarkistimme vaikutukset mTOR aktivoituminen vaiennettu Sesn2 A549-soluissa. Olemme havainneet tasot fosforyloitua p70S6K, alavirran kohde mTOR ja indikaattori mTOR aktivointia, ja fosforyloidun Akt at Ser473, aktiivinen laji Akt, A549-solut ilmentävät shSesn2-2 tai shFF2. Normaaleissa soluviljelmässä kunnossa, pohjapinta tasot fosforyloitua p70S6K ja fosforyloidun Akt molemmissa solulinjoissa olivat tuskin havaittavissa (tuloksia ei ole esitetty). Sen jälkeen, kun on lisätty 100 nM insuliinia seerumia kahden solulinjan 20 min, fosforyloitu p70S6K oli havaittavissa molemmissa solulinjoissa, mutta paljon fosforyloidun p70S6K havaittiin Sesn2 pudotus-soluissa (kuvio 4A). Nämä tiedot osoittavat, mTOR-p70S6K polku on enemmän aktivoituu Sesn2 hiljentämiseltä shRNAs. Useat aiemmat tutkimukset raportoitu insuliinin aiheuttamaa Akt aktivaation hiirillä edellyttää ehjä mouse Sesn2 [25], mutta silti havaittu merkittävää aktivoitumista Akt kun insuliinia stimulaation Sesn2 vaientaminen soluissa. Havaintomme voi heijastaa ristiriitainen rooli Sesn2 vastauksena luonteeltaan erilaisia ​​stressiä. Suostumuksella havaintomme, yli-ilmentyminen Sesn2 aiheutti vähemmän fosforyloidun Akt-S473, tekee MCF-7-solut herkempiä säteilylle [17]. Yhdessä meidän havaintojen mukaan Sesn2 voi toimia tuumorisuppressorigeeniä jotka estävät syöpäsolujen lisääntymistä elinkelpoisuus kautta sääntelyn Akt-mTOR-p70S6K signaalireitin.

(A) A549-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti shSesn2-2 tai shFF2 olivat seerumin puutteessa yön yli ja stimuloitiin uudelleen 100 nM insuliinin 20 min, ilmentymistasojen Akt, p70S6K ja niiden fosforyloitu lajien havaittiin immunoblottauksella, jossa mainituilla vasta-aineilla. (B) voimakkuus proteiinin bändejä immunologiseen blotit kvantifioitiin densitomet- skannauksen. Suhteellinen ekspressiotaso kunkin proteiinin normalisoitui tason perusteella GAPDH kussakin lysaatin ja piirretty B, tietoja näytetään keskimääräisenä ± keskihajonta (SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 todetaan merkittävä ero ekspressiotasot tarkastelluilla proteiinien kahdessa solulinjassa.

Alhainen ekspressiotasot Sesn2 korreloivat huono eloonjäämisen Chinese keuhkoissa syöpäpotilailla

jotta todeta syy suhdetta häiriöitä Sesn2 toiminta ja keuhkojen kasvain genesis, keräsimme koepalanäytteistä 77 keuhkosyöpäpotilaita diagnosoitiin kasvain sairaalan Harbin Medical University (yksityiskohtaiset clincopathological ominaisuudet 77 Kiinan keuhkosyöpäpotilaita koottiin S2 taulukko). Genominen DNA uutettiin näistä keuhkosyöpään kudosten ja niiden viereisen normaalin keuhkojen kudoksiin. Amplifioimme 3. ja 4. eksonit (jotka ovat kaksi DNA-elementtejä, jotka koodaavat funktion domeenia Sesn2) ja Sesn2 geenien ja altistetaan PCR-tuotteet Sangerin DNA-sekvensoinnilla. Kaikkien sekvensoitujen näytteet, vain kahden pisteen mutaatioita, Val (GTA) 76 Ala (GCA), Thr (ACG) 103 Lys (AAG) on eksonissa 3 Sesn2 geenin havaittiin (katso taulukko 2), ja tämän kahden esiintyy mutaatioita samanaikaisesti. Lisäksi vain yksi keuhkosyöpä potilas (1 out of 77) todettiin kätkeminen kaksi mutaatiota. Hyvin alhainen mutaationopeus Sesn2 geenin ihmisen keuhkosyöpä viittaa rakenteellisen muuttamisen Sesn2 geeni ei ole merkittävä syy osaltaan pahanlaatuisiin keuhkojen epiteelisolujen. Voit testata, onko tämä Sesn2 mutantti häiritsee toiminta endogeenisen villityypin Sesn2, esittelimme Sesn2 cDNA kätkeminen Val76 Ala ja Thr103 Lys mutaatioita pcDNA3.1 ekspressiovektori Beas-2B soluissa. Transformoidut solut yli-ilmentyminen Sesn2 mutantti ei saada selvää ankkurointi riippumattomaan kasvuun verrattuna soluihin, jotka on transformoitu tyhjällä vektorilla (p 0,05) (S2 kuvassa). Tämä havainto viittasi mutaatiot Val76 Ala ja Thr103 Lys, että eksonin 3 Sesn2 geenin ei ehkä saada aikaan vahva dominantti negatiivinen aktiivisuus ainakin BEAS-2B-soluja.

Seuraavaksi määritimme proteiinin tasot Sesn2 niissä keuhkosyöpä kudoksissa immunoblottauksella. Kudoksen kokonaispinta-lysaatit syntyy homogenoimalla ja levitettiin SDS-PAGE resoluutio. Proteiini taso Sesn2 paljasti Western-blottauksella vasta-aineilla Sesn2, signaalin voimakkuus Sesn2 proteiinin kvantitoitiin densitometrialla skannaus (kuvio 5A). Määrittelemme suhteellista ilmentymistä Sesn2 niin alhainen, keskitason ja korkea verrattuna Sesn2 tasolla niiden viereisten normaalin keuhkojen kudoksia (yksityiskohdat tämän määritelmän kuvattiin materiaalia ja-osio). Yhteenvetona on 77 keuhkosyöpään Tutkituista potilaista 57 potilasta sai Pienten ja keskisuurten ilmentymä Sesn2, 20 potilasta sai korkean ilmentymisen Sesn2. Analysoimme ilmaus jakautuminen Sesn2 kattaa niiden kliinis luokkiin kuten squamous-, adenokarsinooma ja pienisoluinen karsinooma sekä sukupuolen, iän ja luokan solujen erilaistumisen, löysimme ei ole merkittävää eroa Sesn2 ilmaisun kyseisten luokat (katso yksityiskohdat S2 taulukko). Näin ollen, Sesn2 ekspressiotasot eivät todennäköisesti vaikuta näihin kliinis-keuhkosyöpäpotilaiden.

(A) Kudoshomogenaatteja valmistettiin resektoitiin keuhkosyövän kudoksia tehtiin immunoblottaus tutkittiin mainituilla vasta-aineilla. Näkyy on edustava kuva Western blot. Kirjain N esittää normaalia kudosta vieressä syöpäkudoksessa, ja kirjain T useita osoittaa syövän kudosnäyte yksittäisen keuhkosyöpä potilaalle. Sesn2 ilmentymistaso kvantifioitiin densitometrialla skannaus ja normalisoitu signaalin perusteella ja lastaus ohjaus GAPDH, yksityiskohtaiset menetelmät määritellään proteiinin ekspressiotaso kuvattiin ja -menetelmä osassa. (B) Potilaat jaettiin korkea ilmaisun ja yhdistetty väliaineen alhainen ryhmään niiden ekspressiotasot Sesn2 tarkastellaan A. Kaplan Meier selviytymisen analyysi osoitti alhainen ilmentyminen Sesn2 korreloi positiivisesti huono eloonjäämisaste tarkastelluilla keuhkosyöpäpotilaita aikana kolmen vuoden seurannan heidän diagnoosi, p = 0,015 log-rank testi osoittaa merkittävää eroa selviytymisen korko kahden potilasryhmissä.

Jaoimme tutki potilaita korkea ilmaisun ja yhdistetty väliaineen alhainen ryhmään niiden ekspressiotasot Sesn2. Kolmen vuoden pysyvyys seurata näiden 77 keuhkosyöpäpotilaita toteutettiin heidän diagnoosi, Kaplan Meier-analyysi osoitti kolmen vuoden eloonjäämisluvut korkean ja matalan keskipitkän ryhmät olivat 65,00% ja 42,11% vastaavasti, log-rank-testi osoitti merkittävää laskua 3 vuoden pysyvyys on alhainen keskipitkän (p 0,05) verrattuna korkean ryhmään (kuvio 5B). Tämän vuoksi päättelemme alhaisen ekspressiotason Sesn2 kumppaniaan huono eloonjäämisprosentti kiinalaisen keuhkosyöpäpotilaita, ja ilmentymistason Sesn2 voi toimia mahdollisena prognostinen markkeri keuhkosyöpäpotilaita klinikalla.

Keskustelu

menettämisestä toiminto näytön avulla shRNA kirjasto on osoittautunut tehokas lähestymistapa löytämään uusia ja odottamattomia tuumorisuppressoreita puolueettomasti. Tässä tutkimuksessa käytimme tätä lähestymistapaa tunnistaa geenien tukahduttaa syövän syntyyn ihmisen keuhkojen epiteelisoluissa. Olemme tunnistaneet useita geenejä osallisina syövän synnyssä. Vaikka geenit eristettiin tämä strategia ei voi olla usein tavoitteita mutaation kasvainten, ne voivat kuitenkin paljastaa uusia väyliä merkityksellisiä kasvaimien syntyyn. Olemme esimerkiksi eristetty inositoli polyfosfaatti 4-fosfataasi tyypin II (INPP4B) geenin, joka on tunnettu tuumorisuppressori rinta-, eturauhas-, ja muiden maligniteettien [22,26]. Mutaatio tai alhainen ilmentyminen INPP4B on läheisesti huonon ennusteen näiden syöpien [23]. Lisäksi tunnistus T-solujen solunsisäistä antigeeni 1-liittyvä proteiini (TIAR) edelleen tukee aikaisempia havaintoja, TIAR on säädellä vähentävästi osajoukko kasvaimia ja HeLa-solut, joilla on alentunut TIAR by shRNA tuottanut suurempia epiteelin nude-hiirissä [27 ]. Nämä tunnetut syövän asiaa geenien tunnistettu kautta näyttöjen ehdottaneet kandidaattigeenit voidaan enemmän tai vähemmän liittyvät elävänä kiinnittymisestä riippumaton leviämisen, jatkotutkimukset ovat tarpeen määritellä, missä määrin nämä geenit ovat mukana keuhkojen kasvaimien syntyyn.

AKT-mTOR-reitin ollut keskeinen rooli syövän kehittymisessä säätelemällä solujen lisääntymistä, apoptoosin ja angiogeneesin [28]. Osoitimme, että puute Sens2 Toiminnon avulla aktiivisuutta AKT-mTOR signalointi voi olla tärkeä mekanismi taustalla kyky Sesn2 hillitä jalostettuina. Kanssa meidän havainto, että Sesn2 on solutransformaatioon vaimennin keuhkojen epiteelisolujen BEAS-2B, Sestrin perhe on osallisena solujen lisääntymistä ja solujen eloonjäämistä kautta tukahduttaa nisäkkään rapamysiinin kohde kompleksin 1 (mTORC1) aktiivisuuden aktivoituminen AMP- riippuvainen proteiinikinaasi (AMPK) p53 riippuvaisella tavalla [15,16,29]. Lisäksi Sestrins välittävät DNA-vaurioita tunnistava reitin koostuu ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) ja p53, vaikka alla oleva mekanismi on epäselvä toistaiseksi [16]. Mielenkiintoista, rooli Sesn2 säätelyssä solujen selviytymistä edelleen kiistanalainen. Esimerkiksi kun DNA aiheuttaman vaurion syövän syntyyn, kohonnut Sesn2 MCF-7-solujen edistää IR indusoi apoptoottista solukuolemaa [17]. Mukaan kuitenkin energinen stressistä kuten ATP puutos aiheuttama 2-deoksiglukoosi (2-PO) altistuminen, Sesn2 suojattu 2-DG solukuolema sekä LNCaP ja hiiren alkion fibroblasteissa [18].

Useimmat silmiinpistävän The Sesn2 poistogeenihiiri esitettäessä kasvainten muodostumista, vaikka mitään selvää oikosulussa elinikä, joka on ristiriidassa sen roolit tuumorisuppressiogeeneksi ja antiaging osoittaneet aiemmin [25]. Miksi on olemassa sellainen fenotyyppinen ero välillä ilmennyt

in vitro

solutransformaatioon ja

in vivo

hiirimallissa? Kun otetaan huomioon, on kolme Sentrin jäsentä nisäkkäillä, joilla on korkea homologia (esim välisen homologian Sesn1B ja Sesn2 on 71%), todennäköisin, Sesn2 voi olla olla tarpeeton rooli hiirillä ja sen puute voi kompensoida sen lähellä homologin kuten Sesn1B tai Sesn3. Kuitenkin solutasolla, toteutus tällaisen korvauksen ehkä riippuu geneettisen taustan ja tietyllä solulinjan, joka voi täysin poiketa tilannetta kokonaisesta organismista kuten tietyt hiirikantojen.

Vastakohtana aiempaan toteamukseen insuliinin aiheuttama aktivoituminen Akt vaatii läsnäoloa Sesn2 osoitettava käyttämällä Sesn2 knock out hiirimallissa [25], meidän tulokset viittasivat insuliinihoitoa saattoi silti edistää tehostetun phoshorylation Akt-S473 A549-solujen Sesn2 tippuu alas shRNAs. Ottaen huomioon, että AKT kaskadi voidaan säädellä monien kalvon proteiinit, jotka sisältävät reseptorityrosiinikinaasien, integriinit, G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien [30], on todennäköistä, että aktivointi Akt ihmisen soluissa on osittain riippumaton ehjä Sesn2. Tueksi havaintomme, yli-ilmentyminen Sesn2 aiheutti vähemmän fosforylaatio Akt-pS473 MCF-7-solujen [17], ja knockdovvn AMPKα, toiminnallinen kumppani Sestrins eston mTORC1, ei vaikuttanut lisäystä Akt-fosforylaation stimuloidaan FoxO1activation [29].

Genetic muutoksia usein edistää inaktivaatioon kasvaimen synnyssä. Menetys heterotsygoottisuuden (LOH) in Sesn1 (6q21) ja Sesn2 (1p35) on myös usein havaittu erilaisissa ihmisen syövissä [14,31]. Toisin kuin master p53-geenin, löysimme mutaationopeus Sesn2 geenin keuhkosyöpään kudos on erittäin alhainen. Niistä kudosnäytteitä resektoitiin 77 keuhkosyöpäpotilaita, vain yksi havaittiin pistemutaatioiden Sesn2 geenissä. Koska 60-80% keuhkosyöpään kudosten satama p53 mutaatioita, ja Sesn1 ja Sesn2 ovat kohdistu suoraa p53-välitteisen transkription, rooli Sesns kasvaimen synnyssä voi olla osa mekanismia taustalla heikentynyt p53 keuhkosyöpäsoluissa .

kliinistä merkitystä Sesn2 ekspressiotason arvioitiin keuhkosyöpä kudosnäytteiden resektoitiin 77 keuhkosyöpäpotilaita. Vaikka Sesn2 proteiinin tasot vaihtelevat paljon tutkituissa keuhkojen kudoksia, on selvä positiivinen korrelaatio alhainen Sesn2 ilmentymistaso ja huono eloonjäämisprosentti tutkituissa keuhkosyöpäpotilaita. Yllättäen, toisin kuin useimmissa tuumorisuppressoreilla yleensä alas-säädellä syövän kudoksissa, olemme havainneet merkittävän osan korkean ilmentymisen Sesn2 (20 joukosta 77) on tutkinut keuhkosyöpä potilaille, heidän Sesn2 tasot jopa ovat paljon korkeammat kuin niiden vieressä normaali keuhkojen kudoksia. Aluksi Sestrins ovat sekaantuneet vastauksena oksidatiivista stressiä, inaktivoinnin Sestrins ja kertymistä reaktiivisen hapen (ROS) on liitetty karsinogeneesi [32]. Onkogeenisissa olosuhteet kuten krooninen tulehdus, pitkäaikainen kasvutekijä signalointi ja korkea oksidatiivisen stressin ehkä haitallista selviytymisen ja leviämistä syöpäsoluja, seurauksena antioksidantti mekanismeja, se ei ole yllättynyt tarkkailla säädelty Sestrins tietyissä osissa Mu76F1:5’-ATGTCCTCTGGGCGAGCAGACAACCTGGCAGTG-3’

Mu76R1:5’-CACTGCCAGGTTGTCTGCTCGCCCAGAGGACAT-3’

Mu103F2: