Krooninen sairaus

tiivistelmä

perihydroxylated peryleeniä kinoni hypericin on raportoitu olevan voimakas anti-metastaattisen ja antiangiogeenistä toimintaa, syntyy kohdentamalla monipuolinen risteyksessä syöpää edistäviä prosesseja kautta ainutlaatuinen mekanismeja. Hypericin on ainoa tunnettu eksogeeninen reagenssi joilla houkutella pakottaa poly-ubikinaation ja nopeutettu hajoaminen lämpöshokkiproteiini 90 (Hsp90) syöpäsoluissa. Hsp90 asiakas proteiinit siten horjutti ja hajoaa nopeasti. Hsp70 asiakas proteiinit voidaan mahdollisesti myös vaikuttaa kautta mikä estää hsp90-hsp70 väli komplekseja. Osoitamme tässä, että hyperisiini indusoi myös parantaa hajoamista hypoksia-indusoituva tekijä 1α (HIF-1α) kaksi ihmisen tuumorisolulinjoja, U87-MG glioblastooma ja RCC-C2VHL – /- munuaissolukarsinooma ja ei-pahanlaatuiset ARPE19 verkkokalvon pigmenttiepiteelin epiteelisolujen linja. Hypericin-nopeutettu liikevaihto HIF-1α, sääntelyn edeltäjä HIF-1 transkriptiotekijän, joka edistää hypoksinen stressiä ja angiogeenisen vastauksia, ratkaisee fysiologinen HIF-1α proteiinin stabiloimiseksi jota esiintyy hypoksinen soluissa. Hypericin vaikutus poistaa myös korkean HIF-1α tasot ilmaistaan ​​konstitutiivisesti von-Hippel Lindaun proteiini (pVHL) vajausta RCC-C2VHL – /- munuaissyövän solulinjaa. Toisin kuin normaali Ubikitiini-proteasomireitillä riippuva liikevaihdon HIF-α proteiineja, jotka esiintyy normoksia The hyperisiini aiheuttama HIF-1α hajoamista voi tapahtua itsenäisesti solun happipitoisuus tai pVHL-edistänyt ubikitiinistä ligaatio HIF-1α. Se välittyy lysosomaalisen katepsiini-B entsyymien katepsiini-B aktiivisuus on optimoitu soluissa kautta hypericin välittämää väheneminen solunsisäinen pH. Tulosten perusteella näyttää, että hypericin saattavat olla hyödyllistä estää kasvainten kasvua, jossa HIF-1α soittaa keskeisiä rooleja ja pVHL ablatoitu tuumorisoluissa, kuten munuaissolukarsinooma poistamisella kohonneen HIF-1α sisältö näissä soluissa, pienentämässä liiallinen angiogeneesi joka luonnehtii nämä kasvaimia.

Citation: Barliya T, Mandel M, Livnat T, Weinberger D, Lavie G (2011) hajoaminen HIF-1-alfa hypoksiaolosuhteissa Yhdistettynä induktio Hsp90 Polyubiquitination syöpäsoluissa by hypericin: Yksittäiset Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (9): e22849. doi: 10,1371 /journal.pone.0022849

Editor: Anil Kumar Tyagi, University of Delhi, Intia

vastaanotettu: 30 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 30 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 19 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Barliya et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoitti Israelin Cancer Association, Grant 20090033 (https://ica.cancer.org.il/english/) ansiosta panos Rick ja Rita Weinstein, ja kaksi kilpailevaa avustusta Tel Avivin yliopisto: Tällä Maratier Foundation ja Elsa ja Leo Abramson Foundation, Tel Avivin yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. G. Lavie on taloudellinen intressi Hy Biopharma Corporation, joka kehittää huumeiden hypericin (kuvattu tässä) kuin syöpälääkkeen. Yhtiö kuitenkin on kehittynyt kliinisissä tutkimuksissa ja on epätodennäköistä saada mitään tämän julkaisun. Tutkimusta ei rahoittivat tämän yrityksen ja siellä ei ole muita palkkioita jollekin kirjoittajat. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

muodostaminen kasvainetäispesäkkeiden levittämällä syöpäsoluja ja niiden räjähdysmäinen kasvu on edelleen yleisin syy syövän hoidon epäonnistumisen ja kuoleman. Kasvainsolujen uudistaa soluväliaineen, muuttaa solun adheesio-ominaisuuksia, tunkeutuvat ympäröiviin kudoksiin ja transmigrate distaaliseen elinten muodostamiseksi metastaasipesäkkeiden. Kehittäminen pesäkkeet tuottavat hypoksia ja tarve neoangiogeneesiin kasvun tukemiseksi. Hypoksia stabiloi stressivasteen esiaste HIF-1α [1], mikä sen translokaatiota tumaan kautta hsp90 riippuvainen prosessi, [2], [3] ja heterodimerisaatio kanssa HIF-1β, tuottaa toiminnallinen HIF-1-transkriptiotekijän. HIF-1 edistää transkriptio -100 stressin vastaus kohdeproteiinien lukien VEGF. VEGF stimuloi voimistunutta ilmentymistä primaarireseptorinaan VEGFR2. VEGF-VEGFR2 komplekseja, jotka muodostavat vaativat yhdessä hsp90 aktivoida alavirran signalointia, joka aloittaa neoangiogenic cascade, [4] ja aktivoi integriiniä fokaalisen adheesion kinaasi (FAK) -Src signalointikompleksiin. Sekä FAK ja Src myös Hsp90 asiakas proteiineja, jotka vaativat yhdessä tämän kaperoni- ylläpitää niiden toiminnallinen konformaatioita [5], [6]. Nämä toiminnot ovat muodostumista paikallisessa tarttumisessa liittyy F-aktiini supistuvien laite, jotka liittyvät solukalvon ja aktivoi siirtymisen koneen kautta vuorovaikutusta soluväliaineen [7]. Siten Hsp90 estäminen voi häiritä useita sivustoja angiogeeninen ja solujen hajonta signa- ja häiritä syövän etenemiseen.

lisääntyi tuntuvasti HIF-1α sisältöä, joita esiintyy monissa kasvaintyypeissä syytöstä HIF-1 edistämisessä oncogenesis. Syövän etenemistä nopeutetaan heterogeeninen mekanismeja kuten toimimattomia /poistetut VHL-geenin munuaissolukarsinooma ja hemangioblastooma [8], inaktivoitu IDH1 geeni glioblastoma [9], mutaatiot mitokondrion meripihka- dehydrogenaasit vuonna paragangliooma, ym [10]. Todellakin, kohonnut kasvaimensisäisenä HIF-1α (tai HIF-2α) liittyvät nopeutetun potilaan kuolleisuutta, ilmenee retrospektiivinen immunohistokemiallinen analyysit parafiiniin biopsiasektioiden eri kasvaimista [11]. Se on tällä hetkellä hyväksytty, että vähenevä kasvainten HIF-1α tasoja voi sisältää merkittäviä kliinisiä etuja, ruokkien intensiivinen etsii pienmolekyylisalpaajilla HIF-1α.

reagenssit jolla on erilaisia ​​toimintoja, jotka kykenevät häiritsemään kasvainsoluproliferaation, muuttoliike ja neoangiogenic signalointi todennäköisesti tehokkaammin estää muodostumista etäpesäkkeiden ja hyödyttävät syöpäpotilaita. Yksi tällainen mahdollisesti lupaava reagenssi on perihydroxylated peryleeniä kinoni – hypericin. Huomasimme, että hypericin estää tehokkaasti muodostumista etäpesäkkeiden miten hiiren rinta- ja okasolusyöpä kasvaimet

in vivo

[12], ilmeisesti häiritsemällä signaalipolkuja edistävät angiogeneesiä [13] ja kasvainsoluproliferaation [14]. Yhteinen nimittäjä yhdistää eri toimintoja on ainutlaatuinen kyky hypericin toimia eksogeenisia indusoijana pakko poly-ubikinaa- lämmön shock proteiini 90 (Hsp90), epävakautta ja nopeasti halventava lukuisia hsp90-client proteiinit [14].

Kirjoittajat raportoivat, että hypericin voivat hajota HIF-1α soluissa kautta ainutlaatuinen hypoksia ja proteasomin riippumaton mekanismi. Vaikka HIF-1α on hsp90 asiakas proteiini [15] hajoavan muiden hsp90 inhibiittorit [16] hyperisiini aiheuttama HIF-1α kataboliaa näyttää liittyvän ainutlaatuinen lysosomaalisen katepsiini-B riippuvainen mekanismi, aktivoituvat alennettuun solunsisäisen pH-ympäristössä. Lisäksi osoitetaan, että angiogeenisten signalointi kaskadi voi vaikuttaa hypericin useisiin kohtiin, tekee tämä molekyyli mahdollisesti lupaavat anti syövän hoidossa.

Tulokset

Pakko HIF-1α hajoamista hypoksiaolosuhteissa solu- hoito jossa hypericin

Tavoitteena tulkita mekanismi antiangiogeenisen aktiivisuuden hypericin [13], tutkimme onko hypericin vaikuttaa HIF-1α mukautuva vakauttaminen, jota esiintyy hypoksiaolosuhteissa puuttuessa proliini ja asparagiinin hydroksylaatio [1 ] kolme ihmisen solulinjoissa: U87-MG-glioblastoomasoluissa, RCC-C2

VHL – /- (C2

VHL – /-) munuaisten karsinoomasoluja puutteellinen pVHL, ja ARPE-19 verkkokalvon pigmenttiepiteelin soluihin. Solut Ensimmäinen altistettiin hypericin 72 tuntia, tarvittava aika optimaalista hypericin vaikutuksia kehittää ja hypoksia tuotettu kemiallisesti CoCl

2 ja joilla on alhainen hapen ilmakehässä (0,5% O

2, 5% CO

2 ja 94,5% N

2) viimeisen 6 tunnin hoidon estämiseksi hypoksinen sytotoksisuuteen. HIF-1α tasot analysoitiin soluliman ja ydinvoiman jakeet Western blotit. Tulokset, Fig. 1 osoittavat, että altistuminen 10 uM ja 30 uM hypericin vähensi tehokkaasti hypoksian indusoimaa kasvua HIF-1α tasot hypericin annoksesta riippuvaisella tavalla in ARPE-19-solut (Fig. 1A) ja U87-MG-soluissa (kuvio. 1B ). Pienentämisellä HIF-1α olivat voimakkaampia ydinvoiman jakeet kaksi solulinjoista, varsinkin kun hypoksian aiheutettiin kemiallisesti CoCl

2.

[A] ARPE19, [B] U87-MG, [C ] RCC-C2

VHL – /- ja [D]. RCC-C2

VHL + (VHL-geenin valmistettuna) solulinjoja altistettiin 10 ja 30 uM hypericin 72 tuntia. Viljelmät altistettiin hypoksinen olosuhteet 150 uM CoCl

2 (A B, ylempi paneeli dubletti) ja joilla on alhainen hapen ilmakehässä (0,5% O

2, 94,5% N

2 ja 5% CO

2) (A B, alempi paneeli dupleteiksi) viimeisen 6 tunnin hoidon jälkeen. Hypericin aiheutti hajoamista HIF-1α. Välimiehen HIF-1α proteolyyttisen leimasi estämällä HIF-1α hajoamisen kanssa CA-074 katepsiini B: n estäjä, jossa MG-132 ja ALLN proteasomaalisten kalpaiinin estäjät annetaan viljelmiin viimeksi 6 tunnin inkuboinnin kanssa solut. Soluliman tiivisteet ja ydin- uutteet valmistettiin, erotettiin SDS-PAGE ja Western blotit kehitettiin anti-HIF-1α. Equal lastaus varmistettiin β-Actin. [E]. Vaikutukset hyperisiini on solunsisäistä pH: ta U87-MG ja C2

VHL – /- soluja. Quantitative BCECF, pH-riippuvaisen fluoresenssi mitattiin spectrofluorimetrically (FRU osoittaa Fluorescence Suhteellinen Units). [F]. Analyysi rooli hypericin välittämän solunsisäisen pH laskee edistämisessä HIF-1α liikevaihto alle CoCl

2 hypoksia, määritetään seuraavat sytoplasman alkalinisoi- 20 mM NH

4CL sovellettu viimeisten 6 tunnin inkubaation. Sytoplasmisen emäksiseksi vähentynyt hypericin aiheuttama HIF-1α liikevaihto alle CoCl

2 hypoksian.

Voit selvittää miten hypericin parantaa HIF-1α hajoamista käytimme VHL-geenin poistetaan C2

VHL- /- solulinja. pVHL, alustan tunnustamista ja sitova moduuli E-3 ubikitiinipromoottori ligaasilla kompleksi sitoo HIF-1α seuraavat prolyyli hydroksylaatio on HIF-1α prolyyli-hydroksylaasin meeniproteiinia-2 [17], mikä ubiquitinating HIF-1α välittyvät proteasomaalisten hajoaminen tämä stressi-vastauksen transkriptiotekijä esiaste [18]. pVHL puute häiritsee tämä hapen vaikutuksesta hajoaminen reaktio, joka johtaa konstitutiivista kertymiseen HIF-1α. Tutkimme HIF-1α sisällön C2

VHL – /- solut seuraavan 72 tunnin hoitoja hypericin. Konstitutiivisesti korkea HIF-1α sisällön C2

VHL – /- solut laski altistuminen hypericin (Fig. 1 C näyttelyesineet) samalla tavalla samanlainen kuin vähennykset HIF-1α havaittu U87-MG ja ARPE-19-solujen käsiteltyjen jossa hypericin hypoksiaolosuhteissa. HIF-1α poistamista hypericin C2

VHL – /- solut tapahtui riippumatta pVHL ja sen havaittiin olevan herkkä esto kanssa MG132 tai ALLN proteasomaalisten kalpaiinin estäjien (Fig. 1 C), mikä sulkee pois osallistumista Ubikitiini-proteasomireitillä tässä prosessissa. HIF-1α hajoamista hypericin oli kuitenkin tehokkaasti estää katepsiini-B: n estäjä CA-074 C2

VHL – /- solut (Fig. 1 C) ja vaikuta CLi-III, katepsiini-L-estäjä (tietoja ei ole esitetty). Nämä havainnot osoittavat, että hypericin tehostetun HIF-1α liikevaihdon välittyy hajotusaineenvaihduntaa katepsiini-B-tyypin entsyymi riippumatta Ubikitiini-proteasomireitillä.

stabiili transfektointi VHL osaksi C2

VHL – /- solut palautettiin E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkaisia ​​toimintoja [19], mukaan lukien HIF-1α proteasomaalisten heikkenemistä normoksia ja HIF-1α vakauttamiseen hypoksisissa olosuhteissa (Fig. 1 D). Tässä asetelmassa hypericin kiihtyi HIF-1α hajoamista hypoksiaolosuhteissa, kumoamisesta hypoksian aiheuttaman HIF-1α vakauttamista VHL-rekonstruoitu RCC-C2

VHL + soluja (C2

VHL + solut) (Fig. 1 D). HIF-1α hajoamista hypericin C2

VHL + solut myös inhiboi CA-074 (Kuva. 1 D). Täten katepsiini-B-reitin edelleen pääväylä HIF-1α hajoamista hypericin hypoksiaolosuhteissa seuraavissa pVHL valmistamisesta.

hypericin aikaansaa vähennyksiä solunsisäinen pH

Siirtymä HIF-1α liikevaihdostaan fysiologisen pVHL välittämää proteasomaalisten heikkenemisen katepsiini-B riippuvainen mekanismi aiheuttama hypericin sai meidät tutkimaan, ovatko muutokset solunsisäisessä olosuhteissa osaltaan tätä muutosta. Koska valon aiheuttamien fotodynaaminen toiminta hypericin saada alennuksia solunsisäinen pH (pH

i) tuumorisolujen [20], me arveltu, että hypericin voi myös aiheuttaa solunsisäisen pH: n alentaminen pimeässä kautta redox toimintaa, optimoimalla olosuhteet lysosomientsyymin aktiivisuutta. pH

i mitattiin U87-MG ja C2

VHL – /- solut, joita käsiteltiin 10 ja 30 uM hypericin 72 tuntia pimeässä, seuranta riippuu pH esterolyyttisen katkaisua asetoksimetyyli-esterin johdannainen BCECF ( katso menetelmät lisätietoja). Huolimatta tiukka huolto pimeässä, kirjasimme hyperisiini pitoisuudesta riippuva vähennyksiä solunsisäinen pH U87-MG ja C2

VHL – /- solut (Fig. 1 E). Sytosolin pH

i laski U87-MG soluja lähtötasosta 7,12 ± 0,08-6,75 ± 0,06 10 uM hypericin (p≤0.05), ja 6,45 ± 0,20 30 uM hypericin (p≤0.03). C2

VHL – /- solut pH

i laski 7,18 ± 0,04-6,85 ± 0,28 (p≤0.08) 10pM hypericin ja 6,42 ± 0,2 30 uM hypericin (p≤0.05). Nämä tutkimukset osoittavat, että hypericin myös saa aikaan pitoisuudesta riippuvaista vähennyksiä solun pH

i pimeässä.

Voit selvittää alennetaan pH

i on välttämätöntä katepsiini-B välittämä HIF-1α hajoamista hypericin, vaikutus sytoplasman alkalinisoi- NH

4CL on HIF-1α soluliman sisällön tutkittiin hypericin käsiteltyjä soluja. U87-MG solut altistettiin hypericin 72 tuntia pimeässä ja 150 uM CoCl

2 hypoksian aiheuttamaa viimeisten 6 tunnin inkuboinnin alusta täydennettynä 20 mM ammoniumkloridilla herättämään soluliman alkalinisaatio. Sytosoliset uutteet valmistettiin ja Western blotit kehitettiin vasta HIF-1α. Kuva. 1F osoittavat, että ennaltaehkäisy solunsisäisen pH laskee vähentynyt HIF-1α hajoamista hypericin kuitenkin korkeammalla 30pM hypericin pitoisuus jotkut HIF-1α hajoamista hypoksiaolosuhteissa pidettiin. Tämä hajoaminen näytti olevan vähemmän herkkiä katepsiini-B-estäjä CA-074 ja voi heijastaa osallistumista proteasomin reitin riippuvainen mekanismi.

hypericin häiritsee HIF-1α sitoutumisen VEGF ja GLUT1 geenin promoottori HRE sekvenssit

hypericin parannettu HIF-1α hajoamista ja siitä HIF-1 ydinvoiman sisällön puute, oletettiin vähentää HIF-1 vuorovaikutukset hypoksiavaste elementtejä (hRes) stressin vasteen geenin promoottorit kuten VEGF ja GLUT1. HIF-1 sitoutumisen ihmisen VEGF-geenin promoottori HRE oli näin ollen analysoitava hypericin saaneilla U87-MG, C2

VHL – /- ja ARPE-19-soluihin käyttäen Fluoresenssi sähkövoimaan Shift määritykset (F-EMSA). Solut altistettiin hypericin 72 tuntia, valmistettiin tumauutteet, ja DNA-proteiini-kompleksin muodostumisen VEGF-promoottori HRE elementti sisältävät fluoresoivat koettimet analysoitiin SYPRO Ruby fluoresenssi. C2

VHL – /- solut laakeri korkea lähtötilanteessa HIF-1 pitoisuus, HIF-1 muodostunut DNA-proteiini komplekseja HRE anturi (Fig. 2A). Ei ilmainen koetin havaittu (SYBER Green värjäys, vasen paneeli), mikä enimmäkseen sidottu DNA-koetin. Käsittelyllä 30pM hypericin, HIF-1-HRE kompleksin muodostuminen oli merkittävästi vähentynyt useimpien DNA-koetinta jäljellä sitoutumattoman (kaista 2).

Löytyy edistäjinä: [A]. VEGF-geeni, analysoitiin fluoresenssi sähkövoimaan Shift Assay (F-EMSA). Tumaproteiinien erotettiin 6% SDS-PAGE, värjättiin SYBER Green leimatun DNA-koettimen ja sitoutumattoman proteiinin havaittiin SYPRO Ruby proteiiniin sitoutumisen fluorokromiin. Geelit skannattiin käyttäen FL-5000 laser-pohjainen skanneri. [B]. GLUT1 geeni analysoitiin kromatiinin immunosaostuksella (chip). Leikatut kromatiinin immunosaostettiin anti HIF-1α-vasta-aineen ja DNA eristettiin tästä kromatiini monistettiin alukkeilla, jotka ovat spesifisiä GLUT1 geenin promoottorialue. [C]. Häiriöitä hypericin VEGF promoottoriaktivoinnilla kasvainsolulinjoissa. Vasen kuva – C2

VHL – /- solut. Kaista 1 – käsittelemättömät solut, kaista 2 soluja käsiteltiin 30 uM hypericin 72 tuntia. Oikea luku – U87-MG soluissa. Kaista 1 – käsittelemättömät solut, kaista 2 – soluja altistetaan hypoksia (150 uM CoCl

2 viime 6 tuntia), kaista 3 – CoCl

2-hypoksia viime 6 tuntia ja hypericin 30pM 72 tuntia, ja kaista 4 – hypericin, 30 uM 72 tuntia.

normoxic U87-MG-solujen, HIF-1-HRE monimutkaisempia tasot olivat alhaiset ja lisääntynyt hypoksiaolosuhteissa jättämättä mitään havaittavaa vapaa DNA-koetinta. Hypoksia aiheuttama, HIF-1-HRE kompleksin muodostuminen kumottiin hypericin solu hoito (Fig. 2A, keskimmäinen paneeli) jättäen DNA koetin enimmäkseen sitoutumaton. In hypoksinen ARPE-19-solujen proteiini-HRE monimutkaisempia tasot olivat korkeampia kuin normoxic peruslinjoista ja hypericin vähentää tehokkaasti HIF-1 – koetin sitovia. Samoin vapaa anturi tyypillisesti vähän hypoksinen soluissa, lisääntynyt altistuminen hypericin (Fig. 2A, oikeanpuoleinen paneeli). Hoito hypericin solulinjoja korkean HIF-1 tasot johtuvat hypoksian tai viallinen pVHL (C2

VHL – /- solut) vähensivät vuorovaikutusta hypoksiavaste elementtejä.

HIF-1 yhteisvaikutuksia muiden stressivaste geeni-promoottori hRes kuin GLUT1 geeni vaikutti myös hypericin mikä näkyy kromatiinin immunosaostuksella analyysejä. Chromatin valmistettu ytimet hypericin käsiteltyjen ja kontrolli solut hajotettiin ja HIF-1 sisältävien fragmenttien immunosaostettiin anti-HIF-1 vasta-aineella. HRE-sidottu HIF-1 tasot määritettiin monistaminen uutettu DNA PCR: llä käyttämällä GLUT1 promoottoria spesifisiä koettimia. In U87-MG-solujen altistus hypoksia lisännyt HIF-1 vuorovaikutukset GLUT1 promoottori HRE (Fig. 2B keskimmäinen paneeli), kun taas samanaikainen altistuminen hypericin alentanut promoottori sitoutuneen HIF-1 (kaista 3). Samankaltaista vähenemistä tapahtui ARPE19 soluissa (kuvio. 2B, vasen paneeli). C2

VHL – /- solut, hyperisiini aiheutti dramaattisen lasku GLUT1 promoottori sidottu HIF-1 (Fig. 2B, oikea paneeli). Kaiken vähennykset HIF-1α sytoplasman sisällön hypericin käsiteltyjen hypoksinen soluissa johti myös vähensi kypsä HIF-1 transkriptio edistävää toimintaa solutumissa, vähenevät HIF-1 vuorovaikutusta VEGF ja GLUT1 geenin promoottorit.

hypericin häiritsee VEGF promoottoriaktivoinnilla kasvainsolulinjoissa

pienenemistä HIF-1 VEGF: ään sitoutumisen ja GLUT1 promoottorit aiheuttamat hypericin, kysytään analyysit vaikutuksista hypericin VEGF promoottoriaktivoinnilla. U87-MG ja C2

VHL – /- solut transfektoitiin väliaikaisesti reportteri-konstrukti, joka sisältää HRE osa VEGF-geenin (pGL3P-1100). Solut jaettiin 30pM hypericin hoidetussa ryhmässä (72 tuntia) ja hoitamattomaan verrokkiryhmään. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin vastaan ​​pGL3P ajoneuvon kontrollivektorilla transfektoidut solut, joilta puuttuu reportteri-konstrukti. Kuva. 2C (vasen näytteille) osoittaa ekspression korkea lusiferaasiaktiivisuus käsittelemätön kontrolli C2

VHL – /- transfektanttisoluilla, joka osoitti suuntausta tukahdutetaan lusiferaasiaktiivisuuden hyperisiini-käsitelty C2

VHL – /- solut noin 40% , mikä viittaa siihen, että hyperisiini taipumus häiritä VEGF-promoottorin aktivaatio C2

VHL – /- solut, mutta erot eivät saavuttaneet tilastollista merkittävyyttä (

P

= 0,06, Mann Whitneyn testi). Lusiferaasin tasoja ajoneuvon plasmidin pGL3P olivat alhaiset, ja samanlainen molemmissa ryhmissä (ei esitetty).

U87-MG-solujen VEGF-promoottori vahvasti myös aktivoituvat vasteena hypoksialle (Fig. 2C), kun taas solujen käsittely 30 uM hypericin kokonaan poisti hypoksian indusoiman promoottorin aktivaation (

P

= 0,05) (3

rd sarake). Hypericin yksin ilman hypoksia ei ollut vaikutusta promoottoriaktivoinnilla (4

nnen sarakkeen). pGL3P ajoneuvon hallinnan vektori transfektantit olivat alhaiset kaikissa ryhmissä (ei esitetty). Näin ollen, hyperisiini voi estää VEGF-promoottorin aktivaatio hypoksisissa olosuhteissa kautta HIF-1α hajoamista U87-MG-soluja.

hypericin moduloi VEGF-geenin transkription kasvainsolulinjoissa

vaimennussäätely VEGF-promoottorin aktivaation johtuen hypericin aiheuttaman HIF-1α katabolian hypoksisiin soluissa kehotetaan tutkimus vaikutuksista hypericin-esiin, HIF-1α hajoamista VEGF-geenin transkription. U87-MG ja ARPE-19-solut altistettiin hypericin (72 tuntia pimeässä) alistettiin CoCl

2 hypoksia viimeisen 6 hoidon aikana. RNA valmistettiin ja VEGF transkription analysoitiin semikvantitatiivisella RT-PCR: llä käyttäen alukkeita ulottuu exon1 ja exon8 VEGF-A-geenin. Nämä alukkeet monistamaan kaikki kuusi VEGF silmukointivariantit ja semikvantitatiivinen analyysit mahdollistavat ero profiilin analyysit tasoa eri VEGF jatkos transkriptio. Tulokset osoittavat, että ARPE-19-solut, hypoksian aiheuttamaa modulaatiot VEGF silmukointivariantti transkription profiileja. Kun hypoksia yhdistettiin altistuminen hypericin, transkriptio VEGF

189 ja VEGF

165 isoformeja dramaattisesti lisääntynyt hypoksiaolosuhteissa laski (Fig. 3A), erityisesti 30 uM annoksesta (Fig. 3A, kaista 4). VEGF

145 ilmaistu käsittelemätön kontrolli soluissa ja tukahduttamaan hypoksia uudelleen ilmaisi seuraavat hypericin hoidon (Fig. 3A, kaista 4).

. In ARPE-19-solut, B. in U87-MG-solujen ja C. C2

VHL – /- solut.

U87-MG solujen lähtötasolle noin VEGF-isoformien alla normoksia, pääasiassa VEGF

189 olivat korkeat johtuen hypoksian riippumattomien mekanismien kuin reaktiivisia happiradikaaleja [21], NO [22], fosfatidyyli-3-kinaasin ja MAP-kinaasin aktivaation toiminnan kautta mTOR [23], tai menetykseen IDH1 geenin toiminto glioblastoma [9]. Kuitenkin transkriptio VEGF-isomuotojen ensisijaisesti VEGF

206, VEGF

165 ja VEGF

121 kasvoi seuraavan solun altistumisen hypoksia. Heidän transkriptio pieneni, kun solu altistumisen 30pM hypericin (Fig. 3B, kaista 3). C2

VHL – /- solut ilmentävät konstitutiivisesti HIF-1α, VEGF transkriptio oli näin ollen erittäin korkea lähtötilanteessa. Altistuminen hypericin (72 h) indusoi vähennykset VEGF

206, VEGF

189 ja niukasti myös VEGF

165 (Fig. 3C). Mielenkiintoista on, että kun hyperisiini-käsitellyt solut olivat myös altistettiin CA-074 (100 ug /ml), katepsiini-B: n estäjä, joka esti hyperisiini-avusteinen HIF-1α hajoamista, VEGF-geenin transkriptio oli myös stimuloidut verrattuna soluihin, käsiteltiin hypericin vain (Fig. 3C). Yhteenvetona hyperisiini kannustanut muutoksia VEGF silmukointivariantti ekspressiokuvioita merkittävimmin ARPE-19-solut (Fig. 3A) ja myös havaittavissa U87-MG ja C2

VHL – /- solut.

ehkäisy VEGFR2 /KDR ilmentymisen hypericin käsitellyissä soluissa

modulaatiot VEGF-geenin transkription kuviot aiheuttama hypericin välittämä nopeutettu HIF-1α hajoamista, aiheellinen analyyseja hypericin vaikutuksia välittäjiä angiogeneesin proteiinitasolla. Mahdollinen korrelaatiot Hsp90 toimintaa arvioitiin myös johtuen hsp90 polyubiquitination, inaktivoitumista ja hajoaminen, jotka myös aiheuttama hypericin [14], ja roolit Hsp90 pelaa keskeisiä alueita angiogeenisen kaskadin [2], [24].

Effects of hypericin hoidon VEGFR2 /KDR ilmentyminen tutkittiin kolmessa solulinjoissa, mukaan lukien ARPE-19, koska VEGFR2 ilmentyy myös RPE-soluissa [25]. Käsittely hypericin aiheuttama merkittävä suppressio VEGFR2 solun sisällön U87-MG ja ARPE-19-solut kuitenkin reseptorin tasot pysyivät muuttumattomina munuaisten C2

VHL – /- solut (Fig. 4A). Sen määrittämiseksi, vähennetään VEGFR2 lauseke johtui vähentynyt VEGF tuotantoa täydensimme kasvualustaan ​​on U87-MG ja ARPE-19-solujen VEGF (10 ng /ml) kanssa tai ilman hepariinia (1 yksikkö /ml 48 tuntia) yhden päivän kuluttua hypericin hallinto ja analysoitiin VEGFR2 ilmentymistä näissä soluissa. Nämä hoidot eivät muuta hypericin vaimentua VEGFR2 ilmaisun ja ei kasvanut VEGFR2 tasoja (tietoja ei esitetty). Siksi, tutki hyperisiini moduloitu VEGFR2 mRNA ekspressiotasot näissä soluissa. RNA valmistettiin hypericin käsitellyistä soluista (72 tuntia pimeässä) ja semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysit suoritettiin VEGFR2 alukkeilla käyttäen VEGFR1 kuin vertailukohta. Nämä kokeet paljastivat, että VEGFR2 geenitranskription oli tosiasiallisesti ja valikoivasti estävät hypericin kaikissa kolmessa solulinjoissa, kun taas VEGFR1 transkriptio vaikutti vähemmän (kuva S1). He ehdottavat, että hypericin laukaisee epigeneettisellä vaikutuksia valikoivasti vähen- tämisessä ilmaus VEGFR2 ja useita muita geenejä. Kuitenkin tämä suuri aihe ylittää kuulu tämän käsikirjoituksen ja keskustellaan lisää toisaalla.

[A]. Western blot -analyysit VEGFR2-proteiinin tasot soluliman otteita käsittelemätön kontrolli-solut (C), tai soluja käsiteltiin 30 uM hypericin 72 tuntia (HYP). [B]. Värjäys U87-MG solut falloidiinia-FITC. (1) Käsittelemättömät solut ja (2) käsiteltyjä soluja hypericin 30 uM 72 tuntia. Orange nuolet osoittavat F-aktiinisäikeiden; keltainen nuolet kuvaavat romahtanut aktiini kerääntyessä altistuksen jälkeen hypericin. [C]. VEGFR2-hsp90 kompleksin muodostumiseen hoidon jälkeen hypericin 30 uM 72 tuntia. Tulokset immunosaostus anti-Hsp90 ainetta ja kehittäminen Länsi-blotit anti-VEGFR2 vasta-aine. Hypericin vähentynyt VEGFR2-Hsp90 kompleksin muodostumisen. [D]. Induktio pakko hsp90 poly-ubikinaa- by hypericin (30 uM 72 tuntia) ihmisen syöpäsolu linjat. Ylälevy – immunosaostus anti-hsp90 ja Western blot anti-hsp90-vasta-aine (valvonta); keskimmäinen paneeli – immunosaostus anti-hsp90 ja Western blotilla antiubikitiinivasta-, ja alapaneeli immunosaostus anti-ubikitiinipromoottori ja Western blot anti-hsp90. (I.p. – immunosaostus; W. B. – Western blotit).

VEGFR2 alavirran signalointia aktivaation VEGF-VEGFR2 vuorovaikutukset edellyttää myös yhdessä hsp90 [24]. Hsp90 osallistuminen on merkitystä meidän analyysejä antiangiogeeninen vaikutuksia, koska olemme aiemmin raportoitu hiiren rinta- ja squamous kohdunkaulan syöpäsolujen hypericin indusoi hsp90 polyubiquitination ja nopeutettu hajoaminen, epävakautta ja alentavaa hsp90-client proteiineja näissä soluissa [14]. VEGFR2 loppupään signalointi aktivoi alphavbeta3 ja polttovälin tarttuvuus kinaasi (FAK) muodostaa tukirangan paikallisia tarttumista ja F-aktiini polymeerit [24]. FAK ja Src myös HSP90 asiakkaan proteiineja ja todellakin hypericin hoito häiritsee F-aktiini polymerointi (Fig. 4B). Siksi tutkittiin hypericin vaikutukset VEGFR2 yhdessä hsp90, analysoimalla VEGFR2 alasveto seuraavat immunosaostus anti-hsp90-vasta-aine. Kuva. 4C osoittaa, että VEGFR2 yhteistyössä immunosaostumia hsp90, mutta tämä samanaikainen immunosaostus kumottiin hoidon jälkeen 30 uM hypericin kaikissa kolmessa solulinjoissa. Tämä ilmeisesti yleinen havainto osoittaa, että VEGF-VEGFR2-Hsp90 kompleksin muodostuminen vähenee johtuen toimia hypericin.

vahvistaa myös tässä, että hypericin indusoi hsp90 polyubiquitination ihmisen solulinjoissa. Immunosaostus U87-MG ja C2

VHL – /- solulysaateista anti-hsp90 vedetty alas ubikitiinipromoottori seuraavat hypericin altistuksen ja päinvastoin: immunoprecipation anti-ubikitiinipromoottori vedetty alas hsp90 (Fig. 4D).

hsp90 poly-ubikinaa- häiritsee ydinaseiden kuljetukseen HIF-1α ennen hajoamista HIF-1α

onko hypericin välittämää epävakautta HIF-1α riippuu myös hypericin aiheuttama poly-ubikinaa- hSP90 suoritimme ajasta riippuva arviointeja vaikutuksista hypericin on hsp90 poly-ubikinaation ja nykyaikaisesti on hsp90-liittyvä HIF-1α solun sisältö U87-MG soluja hypoksiaolosuhteissa. Solut altistettiin 10 ja 30 uM hypericin 48 tuntia, jona aikana hsp90 poly-ubikitinaation tuli havaittavissa ja 72 tuntia, kun kaperonin on hajonnut [14]. Hypoksia aiheutettiin kanssa CoCl

2 viimeisen 6 tunnin kokeen jälkeen solut hajotettiin ja sekä soluliman ja ydin- uutteet valmistettiin. Hsp90 immunosaostettiin sen vastaavan vasta-aineen ja Western blotit kehitettiin anti-HIF-1α-vasta-aineita tarkkailemaan hsp-90 sidottua HIF-1α ja anti-hsp90 kontrollina (kuvio. 5A). HIF-1α tasoilla sitoutuneen hsp90 verrattiin yhteensä HIF-1α analysoitiin Western blot suoraan koko soluliman ja ydinvoiman jakeet. Tulokset osoittavat, että altistuminen hypericin 48 tuntia hsp90 tuli poly-ubikitinoituja, mutta chaperone hajoaminen oli ensisijaisesti huomattava korkeammalla annoksella 30 uM hypericin (Fig. 5A, vasen kuva). Soluliman HIF-1α alkoi hajota tällä 48 tunnin aikapisteessä, vasta hoidon 30pM hypericin (Fig. 5B, ylempi vasen paneeli). Kuitenkin HIF-1α ydinvoiman kuljetus oli voimakkaimmin kumottu molemmat hypericin annostasoilla (Fig. 5B, 48 h ajan kohta 2

nd paneeli, tumafraktios-). Tämä johtui voimakas riippuvuus HIF-1α ydinvoiman liikenteen ehjä hsp90 kaperonitoiminta [26]. Hsp90 poly-ubikinaa- by hypericin aiheuttanut menetyksen kaperonitoiminta ja esti fysiologinen HIF-1α trans-kulkeutuminen tumaan, jossa se normaalisti dissosioituu hsp90 [27]. HIF-1α sidottu hsp90 ja yhteistyötä immunosaostettiin anti hsp90-vasta-aine myös voimakkaammin heikentyy hsp90 ubikinaa- jälkeen 48 tuntia (kuvio. 5B, alempi vasen paneeli). Klo 72 h sytosolin hsp90 oli erittäin hajonnut alle tunnistustason (Fig. 5A, oikea kuva) ja vaikutti sekä yhteistyössä immu- HIF-1α ja HIF-1α kuljetetaan tumaan (kuvio. 5B, kolmas ja neljäs kuvaa). Yhteenlaskettu soluliman HIF-1α sisältö on 72 tunnin aikapisteessä oli myös vahvasti hajonnut, mutta jotkut HIF-1α proteiini pysyi havaittavissa. Näin ollen, sytosolinen HIF-1α liittyvät hsp90 vähentynyt poly-ubikinaa- of hsp90 kasvoi (Fig. 5A 5B), mutta korreloi vähemmän todellista hsp90 hajoamista.

U87-MG-solut altistettiin 10 30pM hypericin 48 tuntia (vasemmanpuoleiset paneelit) ja 72 tuntia (oikea paneeli) hypoksisissa olosuhteissa (150 uM CoCl

2) ja hsp90 ilmaisun ja saattajan määräämisestä toimintaa analysoitiin. Sytosoliset uutteet immunosaostettiin anti-hsp90 ja Western blotit kehitettiin: [A] anti-hsp90-vasta-aineita. [B] anti HIF-1α.