Krooninen sairaus

tiivistelmä

Abelson (c-Abl) esikasvaintekijän koodaa erittäin konservoitunut nonreceptor Proteiinityrosiinikinaasin että on rooli solujen lisääntymisen, erilaistumisen, apoptoosin ja soluadheesion. c-Abl edustaa tiettyä syövän tavoite eturauhassyövän poikkeava aktiivisuus tämän kinaasin on liitetty stimulaatio eturauhasen syövän kasvua ja etenemistä. Kuitenkin mekanismi sääntelyn c-Abl ei ole tiedossa. Kirjoittajat raportoivat, että Abl kinaasit säännellään uudella microRNA, miR-4723, eturauhassyövässä. Expression profilointi miR-4723 ilmentymisen kohortin eturauhassyövän kliinisistä näytteistä osoitti, että miR-4723 ilmentyminen laajalti vaimennetaan eturauhassyövässä. Low miR-4723 ilmentyminen korreloi merkitsevästi huono selviytymisen tulokseen ja meidän analyysien mukaan miR-4723 on merkittävää potentiaalia tauti biomarkkerina diagnoosin ja ennusteen eturauhassyövän. Arvioida toiminnallinen merkitys väheni miR-4723 ilmentyminen eturauhassyövässä, miR-4723 on yli-ilmentynyt eturauhassyövän solulinjoissa, jota seuraa funktionaalisissa määrityksissä. miR-4723 yliekspressio johti pienensi merkitsevästi solujen kasvua, clonability, invaasio ja muuttoliike. Tärkeää on, miR-4723 ilmentyminen johti dramaattiseen apoptoosin eturauhassyövän solulinjoissa viittaa siihen, että miR-4723 on pro-apoptoottisten miRNA säätelevä eturauhasen syövän synnyssä. Analyysi otaksuttu miR-4723 tavoitteet osoittivat, että miR-4723 tavoitteet integriinin alfa- 3 ja metyyli CpG sitovan proteiinin lisäksi Abl1 ja Abl2 kinaasien. Edelleen olemme huomanneet, että ilmentyminen Abl kinaasi korreloi käänteisesti miR-4723 ilmentyminen eturauhassyövässä kliinisistä näytteistä. Lisäksi, Abl1 pudotus osittain phenocopies miR-4723 reexpression eturauhassyöpäsoluissa viittaa siihen, että Abl on toiminnallisesti merkitykselliset tavoite miR-4723 eturauhassyövässä. Yhteenvetona olemme tunnistaneet uuden microRNA välittävän sääntely Abl kinaasien eturauhassyövässä. Tämä tutkimus viittaa siihen, että miR-4723 voi olla houkutteleva kohde terapeuttiselle interventiolle eturauhasen syöpä.

Citation: Arora S, Saini S, Fukuhara S, Majid S, Shahryari V, Yamamura S, et ai. (2013) MicroRNA-4723 Estää Eturauhassyöpä Kasvu inaktivointi Abelsonin perhe Nonreceptor proteiinityrosiinikinaaseja. PLoS ONE 8 (11): e78023. doi: 10,1371 /journal.pone.0078023

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 28, 2013; Hyväksytty: 07 syyskuu 2013; Julkaistu: 01 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Arora et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Center for Research Resources National Institutes of Health (NIH) kautta Grant Number RO1CA 138642, RO1CA160079, T32DK007790 ja VA Merit Review ja VA Program Project. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on miesten yleisin maligniteetti ja toiseksi yleisin syy syövän kuoleman miehillä Yhdysvalloissa. Eturauhassyöpä luumetastaasipotilailla on merkittävä kuolinsyy kärsivissä potilailla [1]. Huolimatta monista kehittyessä kliininen eturauhassyövän hoito on haastavaa ja on johtava syy syöpään liittyvien sairastuvuutta ja kuolleisuutta. Suuria haasteita ovat rajoitettu hoitovaihtoehtoja metastasoineeseen, kastraatio-resistenttejä ja kyvyttömyys nykyisen diagnostisten testien helposti erottaa veltto aggressiivisia kasvaimia [2]. Siksi on ollut paljon kiinnostusta tunnistamisessa romaani, vaihtoehtoinen eturauhassyövän biomarkkerit mikä voisi johtaa entistä parempien prognoosi-, diagnoosi- ja hoitotoimenpiteiden taudin.

Abelson (Abi) perheen erittäin konservoituneen nonreceptor Proteiinityrosiinikinaasit tärkeä rooli erilaisissa biologisissa prosesseissa kuten solujen selviytymistä, proliferaatiota, soluadheesiota ja liikkuvuus [3]. Nisäkässoluissa on kaksi Abi perheen kinases- Abl1 (c-Abl) ja Abl2 (Abl-Related-Gene, Arg) -, jotka läsnä kaikissa [3], [4]. Keskeistä biokemiallisia ja fysiologisia toimintoja Abl kinaasien ovat niiden yhdistelmä säännellyn SH3-SH2-TK (Src homologia 3-Src homologia 2-tyrosiinikinaasin) domain kasetti sytoskeletaalisten proteiini- ja DNA-sitovia domeeneja, yhdistelmä, joka antaa ainutlaatuisen signalointiominaisuudet näitä proteiineja [5]. Aktiivisuus Abl kinaasien on tiukasti säännelty monitahoisen joukon molekyylin sisäisiin vuorovaikutuksiin että iskeytymistä Abl kinaasidomeenin ja johtaa tehokkaaseen automaattinen esto tyrosiinikinaasiaktiivisuuden [6]. Häiriöt autoinhibition, kuten translokaatio

Abl1

tai

Abl2

vieressä erilaisia ​​geenejä (esim

Bcr

,

Tel

,

ETV6

), johtaa konstitutiivisen aktivaation, joka ajaa pahanlaatuisten kasvainten, erityisesti leukemiat [4], [7], [8]. Mutaatiot

Abl1

geeni liittyy yleisesti krooninen myelooinen leukemia (KML), jossa

Abl1

geeni aktivoituu kulkeutuu sisällä

Bcr

(katkaisupiste cluster region) geeni kromosomissa 22, luo uusi fuusio geeni,

Bcr-Abl

, joka koodaa sääntelemätön, tyrosiinikinaasin.

Vaikka Abl1 ja Abl2 ovat tunnettuja ajo leukemia kehittämiseen, niiden rooli kiinteät kasvaimet on arvostettu vasta äskettäin [4]. c-Abl ja /tai Abl2 aktivoituvat joissakin kiinteiden kasvainten solulinjat kautta ainutlaatuinen mekanismeja, jotka eivät liity geenimutaation /translokaatiota, ja niiden aktivointi edistää proliferaatiota, matriisi hajoaminen, invaasio, kasvaimen kehittymisen ja /tai etäpesäkkeitä, riippuen kasvaimen tyypistä [4]. Kertyvät todistusaineisto viittaa siihen, että aktivaatio c-Abl /Abl2 edistää eturauhassyövän etenemiseen [4]. c-Abl ja /tai Abl2 ilmentyminen merkittävästi lisääntynyt (arvioitiin immunohistokemiallisesti [IHC]) eri kasvaimissa mukaan lukien eturauhassyöpä [4], [9], [10]. On merkittävää, hiljentäminen c-Abl esti osteoblastien lisääntymistä ja edistää osteoblastien erilaistumista, mikä osoittaa, että c-Abl esto voi estää luun metastaattista kasvua [11]. Dasatinib (BMS-354825), kaksi Src-kinaasia (SKF) [12] ja Abl-kinaasi-inhibiittori [13] on kliinisesti testattu eturauhassyövän hoitoon luumetastaasin ja on tällä hetkellä vaiheen 3 kliinisissä tutkimuksissa [14] – [ ,,,0],16]. Toinen SFK /Abl-estäjän bosutinib (SKI-606) tukossa muuttoliike, invaasio, ankkurointi riippumattoman kasvun ja leviämisen PC3 ja DU-145 syöpäsolujen liittyy merkittävä lasku fosforylaatioon signalointimolekyylien (AKT, mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi , polttoväli adheesiokinaasi) [17]. Lisäksi bosutinib esti

in vivo

PC3 kasvaimen kasvua subcuteaneous tai intraskeletal injektio [4], [17]. Aktivointi c-Abl verihiutaleiden kasvutekijä (PDGF) edistää eturauhassyövän solujen eloonjäämistä [18]. Abl kinaaseja myös tärkeä rooli säätelyssä eturauhassyövän motiliteettia /invaasion ja etenemiseen [19] – [21]. Siten Abl kinaasien tärkeitä rooleja eturauhassyövän ja ovat tärkeitä tavoitteita tietyn syövän hoitoon. Kuitenkin, molekyylimekanismi yli-ilmentymisen Abl kinaasien eturauhasen syöpä ei ole tiedossa. Kirjoittajat raportoivat, että Abl kinaasit säännellään uudella microRNA, miR-4723, eturauhassyövässä.

MikroRNA (miRNA) muodostavat evoluutiossa konservoituneen luokan pieniä ei-koodaavaa RNA: iden säätelemään negatiivisesti ilmentymistä useiden geenien kautta sequence- erityistä vuorovaikutusta 3′- transloimattomat alueet (UTR) ja sukulais-mRNA tavoitteet [22]. On vakiintunut, että miRNA ohjata eri avain cellular prosessien kuten leviämisen, apoptoosin, erilaistumiseen, kehittäminen [23], ja ovat sekaantuneet ihmisten sairauksia, kuten syöpää [24]. miRNA on todettu, että toimivat klassinen onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille [24]. Kertyvät todisteet osoittavat, että on olemassa korrelaatioita miRNA ilmaisun ja kliininen toistuminen, kehittäminen etäpesäkkeiden ja /tai eloonjääminen [25], [26]. Koska niiden kudosten ja tautikohtaista ekspressiokuvioiden ja sääntelyn mahdollisia, miRNA ovat arvioidaan mahdollisia biomarkkereita diagnoosin ja ennusteen ihmisen maligniteettien [27].

miR-4723 on äskettäin löydetty miRNA [28], jossa ei ole tutkittu. Analysoimme ilmentyminen miR-4723-5p (suuret muodossa miR-4723, kutsutaan miR-4723) ilmentyminen kohortin eturauhassyövän kliinisistä näytteistä ja totesi, että miR-4723 ilmentyminen on laajalti vaimennetaan eturauhassyövässä ja ei korreloi merkitsevästi huono selviytyminen tulokseen ja syövän etenemiseen. Funktionaaliset tutkimukset käyttäen eturauhassyöpäsolulinjoissa osoitti käyttökuntoon miR-4723 ilmaus johti pienensi merkitsevästi solujen kasvua, clonability, invaasio ja muuttoliike. Merkittävää on, miR-4723 reexpression johti dramaattiseen apoptoosin eturauhassyövän solulinjoissa viittaa siihen, että miR-4723 on pro-apoptoottisten miRNA joka säätelee eturauhasen syövän synty. Edelleen, meidän tiedot viittaavat siihen, että tätä uutta miRNA on tärkeä säätelijä Abl1 ja Abl2 kinaasien joka puolestaan ​​säätelee eturauhasen syövän synnyn. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti, joka (i) määritellään uusi miRNA säätelyyn of Abl kinaasien eturauhassyövässä ja (ii) tunnistaa uusi kasvain vaimennin miRNA eturauhassyövässä. Tämä sääntelymekanismina olemassaolo saattaa olla hyödyllistä terapeuttisessa väliintulon eturauhassyöpää.

Tulokset

miR-4723 Expression on Laajalti heikennetty Eturauhassyöpä

arvioimiseksi roolin asennuspalveli- 4723 eturauhassyövässä, miR-4723 ilmentyminen analysoitiin ihmisen kliinisissä eturauhasessa (kuvio. 1A). Kliinis potilaiden ominaisuuksiin on esitetty taulukossa S1. Tutkimme ekspressiotasot miR-4723 laser kaapata microdissected (LCM) eturauhassyöpäkudoksille (n = 57) ja sovitettu viereisten normaali alueiden reaaliaikainen PCR. Vaikka ilmaus miR-4723 oli muuttumattomina 6/57 tapauksissa (10%) ja korkeampi 9/57 tapauksissa (16%), joka on merkittävä osa kudosnäytteet (42/57, ~74%) osoitti alempi miR-4723 tasot suhteessa vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Erot olivat tilastollisesti merkittäviä kanssa Wilcoxonin testi (p 0,0001). Tämä viittaa siihen, että miR-4723 on laajalti vaimentua eturauhassyövässä ja on potentiaalinen eturauhassyövän kasvaimia estävä.

(A) Quantitative RT-PCR-analyysi suhteellisen miR-4723 ekspressiotasot laser kaapata mikropaloitelluista (LCM) PCa kudokset (n = 57) ja potilaan sovitettu viereisten normaali alueilla. Data normalisoitiin RNU48 valvontaa. Taulukossa on koottu suhteellisen miR-4723 ekspressiotasot näissä yksilöitä. (B) Korrelaatio miR-4723 lausekkeen kliinis ominaisuuksiin eturauhassyöpäpotilaalla kuten Gleason luokalla, patologinen vaiheessa ja biokemiallisten uusiutuminen.

alassäätely miR-4723 ilmentyminen liittyy syövän etenemisen Eturauhassyöpä

määrittää, jos miR-4723 ilmentymistä kliinisissä kudoksissa korreloi kliinis ominaisuudet, kuten Gleason luokalla patologinen vaiheessa ja biokemiallisten toistumisen syöpä (Fig. 1 B). Vähentynyt miR-4723 ilmentymistä havaittiin 66%: ssa tapauksista alhaisen Gleason grade (4-6), 74% tapauksista Gleason luokan 7 ja 75%: ssa tapauksista korkeampi Gleason arvosana (8-10). Tämä suuntaus viittaa siihen, että ilmentyminen miR-4723 pyrkii laskemaan korkeampiluokkaisiin eturauhassyöpää. Samoin vähentynyt miR-4723 ilmentymistä havaittiin 68%: ssa tapauksista patologisten vaiheen pT2 vs. 73% tapauksista pT3 vaikka ei ollut merkittävää korrelaatiota biokemiallisten uusiutuminen.

miR-4723 on Potential Diagnostic ja Prognostiset markkeri eturauhassyöpä

Kun otetaan huomioon havaittu laajaa downregulation miR-4723 eturauhassyövässä kliinisissä näytteissä, arvioimme mahdollinen kliininen merkitys miR-4723 ilme. Voit selvittää mahdolliset valmiudet miR-4723 diagnostisena biomarkkeri eturauhassyövän, suoritimme ROC (Receiver Operating Characteristic) analyysejä kohortin kliinisissä näytteissä (kuvio. 2A). ROC-analyysit osoittivat, että miR-4723 ilmentyminen voi olla yksittäinen merkittävä parametri erottamaan normaalin ja kasvaimen kudokset, jossa ala ROC-käyrän alla (AUC) 0,727 (95% CI: 0,655-+0,792, p 0,0001). Edelleen, me ositettu meidän eturauhassyövän kliiniset kohortti perustuu miR-4723 ilmaisun ja suorittaa Kaplan-Meier selviytymisen analyysi. Tämä analyysi osoitti, että eloonjääminen väheni merkittävästi potilailla, joilla on alhainen miR-4723 ilme (Fig. 2B) (p = 0,0431). Nämä analyysit viittaavat siihen, että miR-4723 on merkittävää potentiaalia voidaan käyttää ja ennustavia markkeri eturauhassyövän.

(A) ROC-käyrä analyysi osoittaa kykyä miR-4723 ilmaus syrjiä pahanlaatuinen ja ei- pahanlaatuinen eturauhasen kudosnäytteitä. (B) Kaplan-Meier eloonjäämiskäyriä eturauhassyöpäpotilaiden, kerrostunut perustuu miR-4723 ilmaisun (matala ja korkea). p-arvo perustuu log rank -testi (* p 0,05).

miR-4723 yliekspressio vaimentaa tuumorigeenisyystesti eturauhassyöpäsolujen

arvioida mahdolliset kasvain ehkäisevästä rooli miR-4723, me yli-ilmentynyt miR-4723 eturauhasen syöpäsolulinjoissa (PC3 ja LNCaP) ja sen jälkeen toiminnalliset analyysit (Fig. 3). Ohimenevä transfektio Mir-4723 edeltäjä johti yli-ilmentymisen miR-4723 määritettynä reaaliaikainen PCR (Kuva. S1). Expression of miR-4723 johtivat selvästi morfologisia muutoksia sekä solulinjoissa (Fig. 3A). Erityisesti selvä lasku osa pitkänomaisen, Karan muotoinen solut rinnastettiin kasvu pyöristetty, apoptoottisten solujen. Morfologiset muutokset havaittiin miR-4723 yliekspressio ehdotti lisääntymiseen apoptoottisia soluja. Merkittävä väheneminen solujen elinkelpoisuuden havaittiin ajan mittaan PC3 /LNCaP-solut yli-ilmentävät miR-4723 (Fig. 3B) verrattuna soluihin, jotka ilmentävät ohjaus miR (miR-CON). miR-4723 yliekspressio myös vähentynyt kyky muodostaa klooneja PC3 /LNCaP verrattuna miR-CON (Fig. 3C). TranswellTM muuttoliike ja hyökkäys määritykset osoittivat, että miR-4723 ilmaisu laski migraation (Fig. 3d) ja hyökkäys (Kuva. 3E) molempien solulinjojen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-4723 yli-ilmentyminen estää tuumorigeenisyyden eturauhasen syöpäsoluja.

arvioimiseksi toiminnallinen merkitys mir-4723 eturauhassyövässä, miR-4723 esiaste oli yli-ilmentynyt PC3 /LNCaP solulinjat lyhytaikaisella transfektiolla seurasi toiminnalliset analyysit (suoritettiin 72 tuntia transfektion). (A) Morfologiset muutokset PC3 /LNCaP upon miR-4723 ilmentymisen arvioitiin faasikontrasti- microsopy. (B) Cellular elinkelpoisuuden määrityksessä (C) Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä, (D) Transwell-migraatiomääritys ja (E) Invasion määritys PC3 /LNCaP valetransfektoituja tai transfektoitu miR-CON tai miR-4723 (* P 0,05 ).

yli-ilmentyminen miR-4723 indusoi apoptoosia syöpäsolujen

mitataan apoptoosin ohjaus (mock tai miR-CON transfektoitu) ja miR-4723-transfektoiduissa soluissa flow sytometrinen analyysi anneksiini-V-FITC-7-AAD värjättiin PC3-solut (Fig. 4A-B). Havaittiin, että keskimääräinen apoptoottinen solu fraktiot (varhainen apoptoottinen + Apoptoottiset) on merkittävästi lisääntynyt, kun miR-4723 reexpression (12% + 5%) verrattuna miR-CON tai mock transfektoidut solut (3% + 1%), jossa on samanaikainen väheneminen että elävien solujen populaation. Tämä viittaa pro-apoptoottisen roolin miR-4723 ja ehdottaa, että miR-4723 vaikuttaa apoptoottisia reittejä säätelyssä kasvainten muodostumiseen.

(A) Apoptoosin määritys PC3-soluissa jälkeen miR-CON (vasemmanpuoleiset paneelit) tai asennuspalveli- 4723 (oikea paneeli) transfektion 72 tunnin arvioituna anneksiini V-FITC /7-AAD värjäystä. (B) edustus keskimääräinen apoptoottisten jakeet (varhainen + myöhäinen apoptoottiset) kussakin ryhmässä (* p 0,05).

miR-4723 indusoi G2-M pidätys eturauhassyöpäsoluissa

FACS (fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu) analyysi osoitti, että ekspressio miR-4723 PC3-soluissa johtaa huomattavaan lisääntymiseen solujen G2-M-vaiheen solusyklin verrattuna miR-CON (Fig. 5) . Tämä viittaa siihen, että miR-4723 ilmentyminen indusoi G2-M pidätys eturauhasen syöpäsoluja.

Solusyklianalyysiä jälkeen mock (vasen paneeli) /miR-CON (keskimmäinen paneeli) tai miR-4723 (oikea paneeli) hoidot osoittavat induktio G2 /M vaiheessa pidättäneet miR-4723. 72 tuntia transfektion jälkeen. solut värjättiin DAPI tumaväriä varten FACS-analyysiä.

miR-4723 Tavoitteet Abl kinaasien eturauhassyöpäsoluissa

Tunnistaa efektoreita miR-4723, luettelo mahdollisista miRNA tavoitteiden luotiin yhdistämällä ennustettu tavoitteet päässä miRDB tavoite ennustusalgoritmi [29], [30] ja profilointi geenien ilmentymistä, jotka liittyvät apoptoosin ja solusyklin käyttämällä reitin keskittynyt PCR Arrays. Yhdenmukainen havaitut vaikutukset miR-4723 apoptoosiin ja solusyklin, löysimme useita tärkeitä molekyylejä näistä soluprosesseihin mahdollisina miR-4723 tavoitteita. Profilointi apoptoosin ja solusyklin liittyvät geenit osoittivat johdonmukaisesti vaimennussäätely Abl1 geenin (Fig. 6A-B). Validoida Näiden tulosten suoritimme RT-PCR-analyysi tutkia suhteellinen mRNA ekspressiotasot Abl1 ja totesi, että miR-4723 yliekspressio johtaa laski Abl1 ilmentymisen (Fig. 6C). Tämä viittaa siihen, että miR-4723 tukahduttaa Abl1 kautta mRNA: n hajoamisen.

(A) profilointi, apoptoottisten geenien ja (B) Cell cycle liittyvät geenit jälkeen yli-ilmentymisen miR-4723 PC3-soluissa osoittaa downregulation Abl1 mukaan asennuspalveli- 4723. (C) Suhteellinen mRNA: n ilmentymisen on Abl1 geenin arvioidaan RT-PCR: llä. (D) Kaaviokuva Abl1 ja Abl2 3′-UTR osoittavat suhteelliset asemat otaksuttu miR-4723 sitoutumiskohtia. (E) Immunoblotit endogeenisten Abl1, Abl2 ja muut miR-4723 tavoitteet PC3 transfektoiduissa soluissa kuten. GAPDH käytettiin latauskontrollina. (F) Abl1 3 ’UTR -konstruktio käsittää miR-4723 sitoutumiskohtien tai kontrollirakenteella kotransfektoitiin PC3 soluihin miR-4723 tai miR-CON ja analysoitiin suhteellinen lusiferaasiaktiivisuutta (* p 0,05).

in silico

analyysit osoittivat, että Abl1 hallussaan viisi mahdollista miR-4723 kohdesivustot sen 3′-UTR (Fig. 6D). Sivustot 2-5 ovat evoluutiossa säilyneitä kädellisillä (simpanssi, gorilla, reesusapina) (Fig. S2). Lisäksi olemme havainneet, että läheistä sukua Abl2 hallussaan potentiaalinen miR-4723 kohdesivustoa sen 3′-UTR (Fig. 6D, alempi paneeli). Tämä sivusto on konservoitunut simpanssi ja gorilla (Fig. S2).

ohjaamina nämä havainnot teimme Western blot-analyysi luulotellun miR-4723 tavoitteet PC3-soluissa, jotka olivat joko valetransfektoidut tai transfektoitu miR-4723 /miR-CON (Fig. 6E). Mielenkiintoista, miR-4723 yliekspressio vähensivät proteiinin tasot Abl1 ja Abl2 jotka koodaavat Abelsonin perheen nonreceptor tyrosiini- proteiinikinaasien. Lisäksi olemme havainneet, että miR-4723 tukahduttaa metyyli CpG sitovan proteiinin (MeCP2) ja integriinin, alfa 3 (ITGA3). 3’UTR of MeCP2 hallussaan kymmenen potentiaalista miR-4723 kohdesivustot kun taas ITGA3 on neljä potentiaalista miR-4723 kohdesivustot (Fig. S3).

Tutkimme, onko c-Abl proto on suora toiminnallinen tavoite miR-4723 eturauhassyövässä. Ohimenevä transfektio ihmisen PC3 syöpäsolujen kanssa Abl1 3’UTR plasmidi yhdessä miR-4723 edeltäjä johtanut merkittävään väheneminen promoottorin aktiivisuuden verrattuna kontrollivektorilla (Fig. 6E) viittaa siihen, että miR-4723 suoraan tukahduttaa tätä geeniä. Nämä havainnot johtivat meidät päättelemään, että miR-4723 säätelee kohortin geenien tärkeä rooli solujen selviytymisen, tarttuvuus, invaasio ja etäpesäkkeiden erityisesti Abl kinaasien.

Abl1 Knockdown Osittain Phenocopies miR-4723 Reexpression in Eturauhassyöpä solut

Voit selvittää Abl on toiminnallisesti relevantti kohde miR-4723 eturauhassyövässä, me esti Abl1 ilmaisua käyttäen siRNA onko Abl1 pudotus toiminnallisesti jäljittelee vaikutuksia miR-4723 yli-ilmentymisen. Käsittelimme PC3-solujen Abl1 siRNA seurasi

in vitro

funktionaalisia määrityksiä (Fig. 7). Kahdet siRNA vastaan ​​Abl1- Abl1 siRNA1 ja siRNA2- käytettiin tehostamisvälineenä Knockdown arvioituna immunoblot-analyysillä (Kuva. 7A). Ei-spesifinen siRNA (NS) käytettiin kontrollina. Merkittävä väheneminen solujen elinkelpoisuuden havaittiin Abl1 siRNA käsitellään PC3-soluja, verrattuna soluihin, käsiteltiin ohjaus siRNA (Fig. 7B). Abl1 Knockdown myös vähensivät kyky muodostaa klooneja PC3-solujen kontrolliin verrattuna (kuvio. 7C). Solusyklin analyysi osoitti, että Abl1 Knockdown johti G2-M-vaiheen pysähtymisen samanlainen miR-4723 yli-ilmentymisen (Fig. 7D). Apoptoosimäärityksessä osoittivat, että apoptoottinen solu fraktiot huomattavasti, kun Abl1 pudotus verrattuna kontrolliin siRNA-käsiteltyjä soluja, samanlainen vaikutus kuin joka havaittiin, kun miR-4723 uudelleen PC3-soluissa (kuvio. 7E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Abl1 on tärkeä tekijä kasvaimia ominaisuuksien eturauhassyöpäsolujen ja että Abl1 inhibitio osittain phenocopies anti-tuumorigeenisen vaikutuksia miR-4723 eturauhassyövässä.

PC3-solut transfektoitiin Abl1 siRNA /epäspesifinen (NS) ohjaus siRNA 72 h sen jälkeen eri määrityksiä. Kaksi siRNA vastaan ​​Abl1- Abl1 siRNA1 ja siRNA2- käytettiin funktionaalisissa määrityksissä. (A) Suhteellinen Abl1 proteiinin ilmentymisen jälkeen siRNA transfektioiden arvioituna immunoblottauksella. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (B) solunelinkykyisyysmääritys, (C) Pesäkkeenmuodostusta määritys, (D) Solusyklianalyysiä, (E) Apoptoosin määritys PC3-soluissa jälkeen NS siRNA (vasen paneeli) /Abl1 siRNA1 (keskimmäinen paneeli) /Abl1 siRNA2 (oikea paneeli) hoitoja.

ilmentyminen Abl kinaasi korreloi käänteisesti miR-4723 Expression in Eturauhassyöpä

varmistamiseksi edelleen Abl kuin patologisesti relevantti kohde miR-4723

in vivo

selvitimme korrelaatio miR-4723 ja Abl ilmaisun osajoukko kliinisen kohortin. Teimme immunohistokemiallista värjäystä Abl PCa kudoksissa (n = 12), ja havaittiin negatiivinen korrelaatio Abl ja miR-4723 ilmentymistä (Fig. 8). Kliiniset näytteet, joilla on alhainen miR-4723 ilmentymistä (suhteessa viereisiin normaali kudos) osoitti korkeita Abl ilmentymisen (Fig. 8).

tutkittiin korrelaatio miR-4723 ja Abl ilmentymisen osajoukko kliinisen kohortti suorittamalla immunohistokemiallisella värjäyksellä Abl PCA kudoksissa (n = 12). Suhteellinen ekspressiotasot Abl (kuten tekee IHC) ja miR-4723 (määritettynä RT-PCR) varten analysoidut näytteet ovat edustettuina pylväskaavio.

Keskustelu

laaja määrä kirjallisuutta osoittaa, että miRNA muutu merkittävästi eturauhasen syöpä [31]. Koska molekyyli- vuorovaikutukset miRNA sukulaisamideillaan kohdegeenien tutkitaan esillä Tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa uusia miRNA säätelevien eturauhasen syövän synty. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet uuden kasvaimen tukahduttava miRNA, miR-4723, eturauhassyövässä. miR-4723 on äskettäin löydetty miRNA [28], joka ei ole tutkittu vielä. Expression profilointi miR-4723 ilmentymisen kohortin eturauhassyövän kliinisistä näytteistä osoitti, että miR-4723 ilmentyminen laajalti vaimentua eturauhassyövässä. Kun otetaan huomioon alhainen ilmaisun, arvioimme mahdollisuuksia miR-4723 kuin eturauhassyöpä biomarkkereiden. Analyysimme osoittaa, että alhaisen miR-4723 ilmentyminen voi olla merkittävä parametri erottamaan normaalin eturauhasen ja tuumorikudoksissa. Edelleen alhainen miR-4723 ilmentyminen korreloi merkitsevästi huono selviytymisen tulokseen ja syövän etenemisen kliinisissä näytteissä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että tämä uusi miRNA on merkittävää potentiaalia tauti biomarkkeri eturauhassyövän diagnoosia ja ennustetta.

Havaittu downregulation miR-4723 ilmentymistä PCA kliinisissä näytteissä ehdotti myös, että tätä uutta miRNA saattaa olla kasvain heikentävän aktiivisuutta. Tämän testaamiseksi suoritimme toiminnalliset tutkimukset käyttäen eturauhassyöpäsolulinjoissa PC3 ja LNCaP. Me yliekspressoitu miR-4723 näissä PCa solulinjoissa seuraa funktionaalisia määrityksiä. Tuloksemme viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen miR-4723 PCA soluissa tukahduttaa tuumorigeenisyyteen, vahvistaa kasvaimen esti roolia miR-4723 eturauhassyövässä. miR-4723 yliekspressio johti pienensi merkitsevästi solujen kasvua, clonability, invaasio ja muuttoliike. Mikä tärkeintä, nämä tutkimukset osoittavat, että miR-4723 on pro-apoptoottisten miRNA joka säätelee eturauhasen syövän synty. Tämä on ensimmäinen raportti syytetään tuumorisuppressorina rooli tämän miRNA eturauhassyövässä jossa osoitamme, että sillä on merkittävä proapoptoottisten rooli.

Nisäkässoluissa miRNA syy geenien niiden kohdegeenien kautta sekä translaation esto ja mRNA: n hajoamisen ja yksilön miRNA pystyy säätelemään kymmeniä erillisiä mRNA: iden [22]. Ymmärtää toiminnallista roolia miR-4723 eturauhasessa Karsinogeneesin etsimme oletetun kohdegeeneissä että on tärkeä rooli solujen selviytymisen, tarttuvuus, invaasio ja metastaasi. Tuloksemme viittaavat siihen, että c-Abl-proto-onkogeenin ja Abl2 /Arg ovat merkittäviä toiminnallisia tavoitteita miR-4723 eturauhassyövässä. Abl1 ja Abl2 koodaavat Abelson perheen nonreceptor tyrosiini- proteiinikinaasien, jotka ovat läsnä kaikissa erittäin konservoitunut metazoan kehittyminen [3]. Nämä kinaasit rooli säätelyssä solujen lisääntymistä, erilaistumista, apoptoosin, soluadheesiota ja stressistä [3]. Poikkeava aktiivisuus näistä tyrosiinikinaasien ovat sekaantuneet stimulaation syövän kasvua ja etenemistä erilaisissa kasvaimissa, erityisesti leukemiat. Tutkimukset osoittavat, että aktivointi c-Abl /Abl2 edistää eturauhassyövän etenemiseen [4]. Eturauhasen kasvaimia, c-Abl ja /tai Abl2 ilmentyminen lisääntyi merkitsevästi arvioitiin immunohistokemiallisesti [IHC]) [4], [9], [10]. Aktivointi c-Abl verihiutaleiden kasvutekijä (PDGF) edistää eturauhassyövän solujen eloonjäämistä indusoimalla ekspressio antiapoptoottisten proteiinien, MCL-1, välityksellä p68 /β-kateniinin signalointireitin [18]. Abl kinaaseja myös osansa motiliteettia /invaasion eturauhasen syöpäsolujen, kuten c-Abl /Arg-välitteisen fosforylaation galektiini-3 esti sen katkaisun PSA mikä nostaa täyspitkä solunulkoinen galektiini-3 ja siirtolaisuudesta ja invaasion Eturauhassyövän soluja [19], [21]. Rooli c-Abl eturauhasen syövän etenemisessä on osoitettu johtuu sen kyvystä fosforyloida Wiskott-Aldrichin oireyhtymä proteiinin perheen jäsen 3 (WASF3) on proteiini, joka säätelee solujen liikkuvuutta ja hyökkäyksen ja ylössäädellään pitkälle metastasoitunut PCa [20 ]. Näin ollen nämä kinaasit ovat tärkeitä kohteita tiettyjen syövän hoitoon ja Abl-kinaasi-inhibiittorit ovat tällä hetkellä kliinisissä tutkimuksissa, että eturauhassyövän hoitoon luumetastaasi. Dasatinibia (BMS-354825), dual Src-ryhmän kinaasin (SFK) [12] ja Abl estäjä [13] on Faasi 3 kliinisissä tutkimuksissa [14] – [16]. Dasatinibi hillitsee ja tehostaa osteoblastien erilaistuminen, mikä osoittaa, että c-Abl esto voi estää luun metastaattista kasvua [11]. Bosutinib (SKI-606), toinen SFK /Abl-estäjä, estää niiden kasvun eturauhasen syöpäsolujen

in vitro

ja

in vivo

[17]. Kaiken kaikkiaan nämä tutkimukset viittaavat siihen, että Abl kinaasit tärkeä rooli eturauhassyövän. Kuitenkin mekanismit sääntelyn Abl kinaasi toimintaa ei täysin ymmärretä. Kirjoittajat raportoivat uudenlainen miRNA säätelyyn näiden kinaasien eturauhassyövän.

MicroRNA säätelyyn sekä Abl1 ja Bcr-Abl on tutkittava hematopoieettisia maligniteetteja. Bueno

et al.

Osoitti, että Abl1 on välittömänä kohteena miR-203 hematopoieettisia maligniteetteja. miR-203 vaimentuu geneettinen ja epigeneettiset mekanismit hematopoieettiset maligniteetit, joka joko Abl1 tai Bcr-Abl1, ja palauttaminen miR-203 ilmaisun vähensi Abl1 ja Bcr-Abl1 tasoilla ja estivät solujen lisääntymistä [32], [33]. Eräässä tuoreessa tutkimuksessa, miR-451 on myös osoitettu säädellä negatiivisesti Bcr-Abl-ilmentymisen kroonisen myelooisen leukemian [34], [35]. Tällaiset tutkimukset ovat puutteelliset eturauhassyövässä. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti osoittaa uusia miRNA välittämää inaktivoitumista Abl kinaasien eturauhassyövässä. Ottaen huomioon nykyisen tulosten, ehdotamme, että havaitut vaikutukset miR-4723 on apoptoosin lisääntymistä, invaasiota ja muuttoliike välittävät sen kyky tukahduttaa Abl kinaasien.

Yksilö miRNA pystyy säätelemään useita erillisiä mRNA: t [36], [37], ja se on osoitettu, että pleiotrooppisten tukahduttaminen useita loppupään tavoitteet voivat selittää fenotyypin havaitut muutokset muuttuneita tasoja tiettyjen miRNA [38] – [42]. Huomasimme, että miR-4723 myös tukahduttaa metyyli CpG sitovan proteiinin (MeCP2) ja integriinin, alfa 3 (ITGA3). MeCP2 on ydin- monitoiminen proteiini mukana useissa solun prosesseissa, kuten kromatiinin uudelleenjärjestely, arkkitehtuuri, ja kopioinnin säätely [43]. Viime vuosina rooli MeCP2 on ilmennyt solujen kasvua ja proliferaatiota [44]. Eturauhassyövän, tutkimukset osoittavat, että MeCP2 tarvitaan eturauhasen syöpäsolujen kasvua [45], [46]. Inhibitio MeCP2 ilmaisun vakaa lyhyt hiusneula-RNA pysäytti kasvua sekä normaalin ja syövän ihmisen eturauhasen solujen samalla kohdunulkoinen MeCP2 ilmaisu koitui kasvu etu ihmisen eturauhasen syöpäsolujen. Tärkeää on, sen ilmentyminen sallittu androgeeniriippuvaisissa solut voivat kasvaa riippumattomasti androgeenistimulaation ja säilyttämään tuumorigeenisia ominaisuuksien androgeeni-köyhdytettyä olosuhteissa [45]. Toisessa tutkimuksessa, vaimentaminen MeCP2 PC3-soluissa johti vähentynyt proliferaatio ja lisääntynyt apoptoosin [46]. Integriini A3 (ITGA3), joka on adheesiomolekyyli on Integriiniperheen, pelaa useita keskeisiä rooleja prosesseissa vaaditaan syövän etenemisen, kuten lisääntymistä, eloonjääntiä, invaasio, ja etäpesäkkeiden [47]. Tämä integriinireseptoriantagonisteja muodostaa komplekseja erilaisten kalvo, solun tukirangan ja molekyylejä säädellä solun tarttumisen, muuttoliike, signaalitransduktio solukalvojen läpi, ja solun tukirangan organisaatio [47], [48]. Integriinit ovat houkuttelevia kohteita anti-syöpähoitojen ja on ollut prekliinisen ja kliinisen tuotekehityksen antagonistien kohdistaminen integriinien [49].

Yhteenvetona Tutkimuksessamme tunnistaa miR-4723 tärkeänä miRNA joka säätelee eturauhassyövän kasvua inaktivaation Abl kinaasien, MeCP2, ITGA3. Tutkimuksemme vahvistetaan, että alhainen ilmentyminen miR-4723 on yhteydessä huonoon säilymiseen ja etenemisen eturauhassyöpä.