Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että microRNA ilmentyminen syövässä voidaan säädellä epigenetic tapahtumia. Viime aikoina olemme havainneet, että keuhkosyövän miR-212 oli vahvasti alassäädetty. Kuitenkin mekanismit säätelyyn miR-212 ilmaisua ei tunneta. Siksi me kantaa tähän tutkimalla molekyylimekanismeihin miR-212 hiljentäminen keuhkosyövässä. Havaitsimme histonimodifikaation sijaan DNA hypermetylaation kuten epigeneettiset tapahtumat, jotka säätelevät miR-212 tasot NSCLC. Lisäksi olemme havainneet, että miR-212 hiljentäminen in vivo läheisesti liittyy taudin vakavuuteen.

Citation: Incoronato M, Urso L, Portela A, Laukkanen MO, Soini Y, Quintavalle C, et al. (2011) Epigeneettiset asetus miR-212 Expression in Lung Cancer. PLoS ONE 6 (11): e27722. doi: 10,1371 /journal.pone.0027722

Editor: Tobias Eckle, University of Colorado Denver, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 24 lokakuu 2011; Julkaistu: 15 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Incoronato et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tukevat varoja: Fondazione IRCCS SDN www.sdn-napoli.it, 5 x 1000 Istituto di Ricerca Diagnostica e Nucleare Fondazione IRCCS SDN, Associazione Italiana Ricerca sul cancro (AIRC) (avustus n.ro 10620) www.airc .it ja MERIT (RBNE08E8CZ_002) www.miur.it GC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maailmanlaajuisesti keuhkosyöpä on yleisin syöpä kannalta sekä ilmaantuvuus ja kuolleisuus (1,35 miljoonaa uutta tapausta vuodessa 1,18 miljoonaa kuolemantapausta), jossa korkein Euroopassa ja Pohjois-Amerikassa. Päätyyppiä keuhkosyöpään ovat

pienisoluinen keuhkosyöpä

(SCLC) ja

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä

(NSCLC). Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä karsinoomat ovat adenokarsinoomat, levyepiteelisyöpä keuhkojen karsinoomat, ja suuri solu keuhkosyövän. Nämä kasvaimet ovat vain 20-30% positiivisen kliinisen vasteen, mutta syy hoidon vastus on vielä tuntematon.

MikroRNA (miRNA) ovat evolutiivisesti konservoituneita, endogeeninen koodaamattomaan RNA noin 22 nukleotidin (nt) pitkä mukana proteiini-ilmentymisen sääntelyä posttranskriptionaalisella tasolla [1]. With kynnyksellä miRNA ilmaisun profiloinnin merkittävää on pyritty korreloida miRNA ilme kasvaimen ennusteeseen [2], [3]. Tähän mennessä useat alassäädetty miRNA löytyy keuhkosyöpä korreloi elossaololuku [4], [5], [6] sekä hoitovasteen [7]. Tämä havainto johti monien tutkimusryhmät tunnistamaan molekyylitason mekanismeja vastuussa purkamista näiden miRNA ihmisen syövissä.

Epigenetiikka viittaa muutoksia geenien ilmentyminen, jotka tapahtuvat ilman muutosta DNA-sekvenssin. On olemassa kaksi ensisijaista ja toisiinsa epigeneettiset mekanismit: DNA: n metylaatio CpG-saarekkeiden sisälle promoottorialueille ja translaation jälkeiset muuttaminen histoni hännät kuin asetylaatio, fosforylaatio, metylaatio ja ubiquitilation [8], [9], [10]. Lisäksi tunnettujen geneettisten mutaatioiden mukana neoplastisen transformaation, monet todisteet viittaavat siihen, että syöpäsolut ovat muuttunut epigenetic koneet, koska joko DNA: n metylaatio tai histonimodifikaation on modifioitu verrattuna normaaleihin soluihin [11].

Äskettäin löydettiin sekä

in vivo

ja

in vitro

että miR-212 voimakkaasti vaimentua keuhkosyövässä ja että sen kohdunulkoinen ilmaisua lisääntynyt TRAIL (tuumorinekroositekijä liittyvää apoptoosia indusoiva ligandi) herkkyys keuhkosyöpään solujen [ ,,,0],12]. Koska monet MikroRNA vaimentua syövässä on tiukasti sidoksissa CpG-saarekkeen hypermetylaation ja /tai muutos histonimerkkien muutokset [13], [14], [15] mietimme onko sama muutokset saattavat olla mukana miR-212 hiljentäminen keuhkosyövän . Näin ollen, tässä käsikirjoitus selvitettiin sekä DNA: n metylaation kuvioita ja histoni muutokset miR-212 promoottorialueen Calu-1 (NSCLC) ja MRC5 (ihmisen normaaleja fibroblasteja, jotka ovat peräisin sikiön keuhkoissa fibroblasti-solut), joilla on erilaiset miR-212 ekspression profiileja. Tuloksemme osoittavat, että vaikka transkription aloituskohdasta miR-212 on upotettu CpG-saarekkeen, sen transkription inaktivointi keuhkosyöpä ei liity DNA hypermetylaation tila vaan muutokseen metylaatiostatuksen histoni hännät liittyy promoottorialueen tämän microRNA. Lisäksi käyttämällä kudosnäytteet keuhkosyövän eri TNM pysähdyspaikan olemme analysoineet ekspressiotasot miR-212 ja totesi, että sen hiljentäminen läheisesti liittyy taudin vakavuuteen.

Tulokset

Expression of miR-212 eri keuhkosyövän vaiheissa

Viime aikoina olemme osoittaneet molemmat

in vitro

ja

in vivo

että miR-212 ilmentyminen keuhkosyöpä on alassäädetty verrattuna normaali keuhko [12]. Sen testaamiseksi, onko sen hiljentäminen korreloi vaiheessa kasvain, kudosnäytteitä kerättiin 34 NSCLC-vaikuttanut potilaiden eri TNM pysähdyspaikan (kliiniset piirteet on koottu taulukkoon 1). Sitten analysoitiin miR-212 ilmentyminen qRT-PCR: llä (kuvio 1A). Kuten on esitetty, T1 /T2 näytteet, ilmentymisen miR-212 on enimmäkseen heterogeeninen. Päinvastoin, T3 /T4 näytteitä, miR-212 ilmentyminen oli tasaisesti alassäädetty. Kuvio 1B esittää keskimääräistä T1 /T2 näytteitä verrattiin T3 /T4. Nämä tiedot osoittavat, että hiljentäminen miR-212 liittyy läheisesti vakavuus taudin.

(A) Kokonais-RNA uutetaan kudoksesta kerätyt näytteet 34 NSCLC-sairastuneet yksilöt eri TNM pysähdyspaikan (T1-T2 -T3-T4) käytettiin analysoimaan miR-212 ilmentyminen Real-Time PCR. (B) keskiarvo ± SD miR-212 ilmentymä pool T1 /T2 vs. T3 /T4. Virhe palkit osoittavat SD. * P 0,05, t-testi. Kuten on esitetty, että T1 /T2 lavastus ilmentymistä miR-212 on selvästi heterogeeninen kun taas T3 /T4 lavastus miR-212 ilmentyminen on voimakkaasti vaimentuu ja korreloi sairauden vakavuuden.

rooli epigenetic mir-212 ilmentymisen käyttäminen CpG Island Searcher ohjelma (https://www.cpgislands.com/) huomasimme, että miR-212 lokus upotettu CpG-saarekkeen. Tiedetään, että useat miRNA ovat epigeneettiseltä vaiennetaan yhdessä CpG-saarekkeen hypermetylaation syöpäsoluissa [16], [17]. Meillä on siis tutkittava, onko menetys miR-212 ilmentyminen NSCLC liittyi DNA hypermetylaation. Me analysoitiin bisulfiitti genomista sekvensoimalla DNA metylaatiostatuksen ennustetun transkription aloituspaikat (TSSs) PRI-miR-212 [18], [19] Calu-1 ja MRC5 solulinjoja, jotka ilmentävät eri määriä miR-212 (kuva 2A). Kuten kuviossa 2B, in Calu-1 alueella analysoitiin pitkälti alle-metyloitu. Sen varmistamiseksi, että transkription hiljentämisen miR-212 keuhkosyöpä ei ollut yhteydessä CpG metylaatio, Calu-1-soluja käsiteltiin kaksi eri pitoisuutta DNA: n metylaation inhibiittorin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5’Aza), kuten . miR-212 ilmentyminen arvioidaan sen jälkeen q-RT-PCR: llä (Fig. 2C-D). Kuten on esitetty kuviossa 2C-D, kun 5’Aza hoito, miR-212 ekspressiotasot olivat ennallaan. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että metylaatio ei liity miR-212 hiljentäminen NSCLC.

(A) Expression analyysi miR-212 in NSCLC (Calu-1) ja normaalin ihmisen fibroblasteista peräisin sikiön keuhkoissa (MRC5 ) by reaaliaikainen PCR. (B) bisulfiittimodifiointi genomisen sekvensoinnin analyysit miR-212 CpG saari Calu-1 ja MRC5 soluja. Kahdeksan yksittäinen klooneja edustaa kunkin näytteen. Musta ja valkoinen neliöt edustavat metyloitu ja metyloimattoman CpG vastaavasti, ja kukin pystypalkki havainnollistaa yhtä CpG. (C) Expression analyysin kypsien miR-212 Real-Time PCR in Calu-1 solujen puuttuessa (kontrolli) tai läsnä ollessa 1 uM (vasen paneeli) ja 5 uM (oikea paneeli) ja DNA: n metylaatio estäjän 5-atsa- 2′-deoksisytidiini (5-atsa-2dC), kuten on osoitettu. NSCLC, DNA hypermetylaatiota CpG-saarekkeen ei havaita viittaa siihen, että tämä epigeneettisellä muutos ei ole vastuussa miR-212 hiljentäminen. Keinot ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta kolmena kappaleena annetaan.

Metylointi ja asetylointi analyysi histones liittyy TSS Mir-212

olivatko muutokset histoniproteiineista voisi osuus miR-212 downregulation in NSCLC. Suoritimme siru analyysi neljällä vasta-aineita tiettyjä histonimodifikaation: H3K4me3 ja H3K9Ac, liittyy yleensä transkription aktiivinen chromatin ja H3K27me3 /H3K9me2 yleensä liittyy transkription aktiivinen chromatin. Tämän jälkeen vertasimme histonimerkkien kuvio ennustetun miR-212 TSS sekä Calu-1 ja MRC5 soluja. Kuten odotettua, löydettiin merkittäviä eroja metylaatiostatuksen H3K27 ja H3K9 ja asetylointi aseman H3K9 (kuvio 3). Tarkemmin sanottuna Calu-1-soluissa, jotka ilmentävät vähäistä miR-212, TSS MIR-212 on rikastettu läsnäolo histoniproteiinien kanssa kovalenttisia modifikaatioita mukana geenien (H3K27me3 ja H3K9me2). Päinvastoin, korkean miR-212 ilmentävien MRC5-solut osoittivat kasvua histonimodifikaation liittyy geenin aktivointi (H3K9Ac) verrattuna Calu-1-soluja. Tuloksemme viittaavat siihen, että epigeneettisellä muutostöitä histones klo miR-212 TSS osallistua sen epigeneettiset hiljentämisen NSCLC.

siru ja Real-Time PCR käytettiin tutkimaan, in Calu-1 ja MRC5 soluja, histoni muuttaen promoottorialueen miR-212 käyttämällä vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja H3K4me3, H3K27me3, H3K9me2 ja H3K9Ac. Negatiivinen kontrolli vasta-aine (IgG) sisällytettiin siru määrityksessä. Keinot ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta kolmena kappaleena annetaan.

Altered miR-212 ilmentyminen NSCLC liittyy muutoksiin histonimodifikaation

histoni metyylitransferaasin EZH2 erityinen H3K27 metyyli transferaasi, on usein yli-ilmentynyt ihmisen syövässä [20]. Lisäksi immunohistokemiallinen analyysit paljastivat, että G9a, tietty H3K9 metyylitransferaasi, oli hyvin ilmaistu keuhkosyövän kudosnäytteiden verrattuna normaaliin keuhkojen näytteitä [21].

Näiden havaintojen perusteella, me analysoitiin q-RT-PCR ekspressiotasot EZH2 ja G9a entsyymien Calu-1 ja MRC5 soluja. Kuten on esitetty kuviossa 4, Calu-1-soluissa ilmeni kohonneita määriä EZH2 (A) ja G9a (B) verrattuna MRC5 soluja. Päinvastoin, ekspressiotasot H3K9 de-acetylase HDAC ei eroa kahden solun tyypin kuviossa 4C.

(A) Expression analyysi EZH2, (B) G9a ja (C) HDAC-entsyymien Real- Time PCR in Calu-1 ja MRC5 soluja. (D) Expression analyysi kypsän miR-212 Calu-1-solut käsittelemättömiä (-) tai käsiteltiin (+) ja siEZH2 ja TSA estäjää tai (E), jossa TSA ja BIX01294 (BIX) estäjät. (D) Calu-1-solut transfektoitiin erityisiä EZH2-siRNA: ssa 24 tuntia. Sitten soluja inkuboitiin 100 ng /ml TSA 24 tuntia ja miR-212-ekspressio arvioitiin qRT-PCR: llä. Down-regulation of EZH2 ilmaisun jälkeen siEZH2 transfektion arvioitiin western-blottauksella käyttäen anti-EZH2-vasta-ainetta. Vahvista yhtä suuri lastaus kalvon immunoblotat- anti-β-aktiini vasta-aine. (E) Calu-1-soluja käsiteltiin 100 ng /ml TSA 16 tai 24 tuntia läsnä tai poissa ollessa 10 uM BIX 16 tuntia ja miR-212-ekspressio arvioitiin Real-Time PCR. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Calu-1-soluissa ylössäätelyyn EZH2 ja G9a entsyymien lisääminen parantaa histoni metylaatio ja siten vähentää miR-212 ekspressiotasot. Tarkoittaa ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta kolmena kappaleena annetaan.

Samat tulokset saatiin toisessa NSCLC solulinjassa, A549. Kuten kuviossa S2, A549-solut osoittavat alhainen miR-212 (A), säätelyä EZH2 (B) ja G9a (C) ja vastaavat tasot HDAC (D), vertaamalla MRC5.

jotta voitaisiin vahvistaa osallistumista histonimodifikaation miR-212 hiljentäminen NSCLC, me esti sekä EZH2 ilmaisun ja HDAC ja sitten analysoidaan vaikutuksia miR-212 ilmentymisen Calu-1-soluissa. Tämän tavoitteen, Calu-1-solut transfektoitiin EZH2-siRNA ja /tai käsitelty TSA, spesifinen inhibiittori HDAC. miR-212 arvioitiin sitten Q-RT-PCR: llä. Kuten odotettua, joko siRNA-välitteinen knock-down of EZH2 metylaasi tai TSA estoa HDAC de-acetylase toiminta osaltaan lisätä miR-212 ekspressiotasot (kuvio 4D). Mielenkiintoista on, että vaikutus oli suurempi (neljä taittuu), kun läsnä on sekä estoja. Sama vaikutus havaittiin A549-soluja (kuvio S2E). Inhibition EZH2 ja HDAC tuotettu lisäys (kaksi-taittuu) ja miR-212 myös MRC5-soluja (kuvio S2F).

Jotta roolin määrittämiseksi G9a on miR-212 hiljentäminen, Calu-1 -soluja käsiteltiin BIX01294, spesifinen inhibiittori G9a metylaasi, läsnä ollessa tai puuttuessa TSA. miR-212 arvioitiin q-RT-PCR: llä. Kuten odotettua, hoito sekä reagenssien osaltaan lisätä miR-212 ekspressiotasot enintään 5 taitoksia (kuvio 4E). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että säätelyä EZH2 ja G9a entsyymien keuhkosyöpä lisääminen parantaa histoni metylaatio ja siten vähentää miR-212 ekspressiotasot. Kun käytetään samanaikaisesti, siEZH2 /TSA tai BIX01294 /TSA tuotetaan enemmän vaikutuksia miR-212 ilmentyminen verrattuna yhden inkuboinnin. Näin ollen, on mahdollista spekuloida, että H3K27me3 tai H3K9me2-välitteisen hiljentäminen koneiden vaatii HDAC, kuten on raportoitu aikaisemmin Lachner M

et ai

[22].

vaikutukset estämällä EZH2, G9a ja HDAC on histoniproteiineista

tämän perusteella tulosten perusteella olemme pohtivat esto EZH2, G9a ja HDAC-entsyymien Calu-1-solut voivat aiheuttaa muutoksen H3K27me3, H3K9me2 ja H3K9Ac histoni merkitsee kuvio on TSS Mir-212 vaikuttavat siten miR-212 ekspressiotasot. Tämän tavoitteen, Calu-1-soluja käsiteltiin siEZH2 ja TSA ja siru analyysit suoritettiin käyttäen H3K27me3 ja H3K9Ac vasta-aineita, vastaavasti. Mielenkiintoista on, estämällä sekä metylaasilla (EZH2) ja de-acetylase (HDAC), voimakkaasti lisääntynyt asetylointi H3K9 ja vähensi metylointi H3K27 MIR-212 TSS käsittelemättömiin soluihin verrattuna (kuvio 5A). Nämä tulokset korreloivat säätely ylöspäin miR-212 samassa koeolosuhteissa (vertaa kuvio 4D kuvioon 5A). Lisäksi, Calu-1-soluja käsiteltiin BIX01294 ja TSA-inhibiittorit ja siru analyysit tehtiin käyttäen H3K9me2 ja H3K9Ac vasta-aineita, vastaavasti. Kuten odotettua, havaittiin, että estämällä katalyyttistä aktiivisuutta joko metylaasilla (G9a) tai de-acetylase (HDAC), väheni voimakkaasti metyloinnin H3K9 ja huomattavasti asetylointi H3K9 on miR-212 TSS käsittelemättömiin soluihin verrattuna (kuvio 5B) . Yhdessä nämä tulokset vahvasti osoittavat, että tiettyjä muutoksia histonimodifikaation määrittää miR-212 hiljentäminen NSCLC.

siru ja qRT-PCR käytettiin analysoimaan Calu-1-soluissa, histoni muutostöissä ennustettu Kääntäkää 212 TSS (A) puuttuessa (scrb) tai läsnä ollessa TSA ja siEZH2, ja (B) puuttuessa (scrb) tai läsnä ollessa TSA ja BIX estäjien, vastaavasti. (A-B) Calu-1-soluja käsiteltiin läsnä on ilmoitettua estäjien kuvatulla legenda kuvassa 4. Tulokset osoittavat, että histonimodifikaation katalysoivat EZH2, G9a ja HDAC-entsyymien sivustot ovat mukana miR-212 hiljentämisen NSCLC. Tarkoittaa ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta kolmena kappaleena annetaan.

vaikutus estämällä EZH2, G9a ja HDAC on apoptoosin Calu-1-soluissa

On tunnettua, että eston HDAC TSA, indusoi solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin erilaisissa syöpäsoluissa kuten gliooma, virtsarakon syöpä, leukemiasoluja ja SCLC [23], [24]. Sitä paitsi ihmisen bronchoepithelial soluissa transfektion G9a ja EZH2 jonka siRNA aiheuttaman apoptoosin ja G1 pidätys, vastaavasti [25]. Viimeaikaisten havaintojen osoittaneet, että ektooppinen ekspressio miR-212 herkistää Calu-1-solujen TRAIL-indusoidun apoptoosin [12]. Siksi tarkistanut, esto EZH2, G9a ja HDAC-entsyymien saattaa lisätä TRAIL herkkyyttä Calu-1-soluissa. Tämän tavoitteen, Calu-1-soluja käsiteltiin BIX01294 ja TSA estää G9a ja HDAC-entsyymien ja apoptoosi arvioitiin Western blot -analyysillä kaspaasi-8: n aktivoituminen TRAIL hoitoon. Kuten esitetään kuviossa 6A, kaspaasi-8 on selvästi aktivoidaan läsnä ollessa G9a tai HDAC inhibition. Lisäksi kaspaasi-8 aktivaation lisäkorotukset läsnä molempien entsyymien esto, edellyttäen, että korreloi säätely ylöspäin miR-212 (vertaa kuviota 6A kuvioon 4E). Samaa tarkoitusta varten, apoptoosin induktio arvioitiin estämällä EZH2 ja HDAC-entsyymien siEZH2 ja TSA. Toisin kuin saadut tulokset edellä, kaspaasi-8 aktivoituu ainoastaan ​​läsnä ollessa HDAC inhibition eikä läsnä EZH2 knock-down (kuvio 6B). Edelleen vahvistaa nämä tulokset teimme anneksiini V apoptoosimäärityksessä (kuvio S1).

(A) Calu-1-soluja käsiteltiin puuttuessa (-) tai läsnä ollessa (+), 100 ng /ml TSA ja /tai 10 uM BIX, kuten aiemmin on kuvattu, sitten soluja inkuboitiin 1 ng /ml Super-Killer TRAIL 3 tunnin ajan. Lysaatit analysoitiin Western-blottauksella anti-kaspaasi-8-vasta-ainetta. Lohkaisu kaspaasin 8 oli selvempää Calu-1-solut käsitellään läsnä molempien estäjiä. (B) Calu-1-solut transfektoitiin siEZH2 ja käsiteltiin poissaollessa tai läsnä oli 100 ng /ml TSA, kuten aiemmin on kuvattu, sitten soluja inkuboitiin 1 ng /ml TRAIL. β-aktiini vasta-ainetta käytettiin latauskontrollina.

Keskustelu

MikroRNA ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t molekyylejä, jotka toimivat endogeeninen posttranskriptionaalisella äänenvaimentimia kohdegeenien ja ovat tärkeitä säätelijöitä eri cellular prosessit kuten apoptoosin [26], [27]. Viat apoptoottinen ohjelma voi edistää hoidon kestävyys ja kasvaimen etenemiseen, ja ne voivat johtua sääntelemättömään ilmentymiseen anti-apoptoottisten molekyylien. Määrä löysi MikroRNA ja niiden tavoitteita kasvaa nopeasti osoittaa niiden olennainen rooli ylläpitää geeniekspressioprofiili. Olemme hiljattain osoitettu ensimmäistä kertaa pro-apoptoottisen roolin miR-212 keuhkosyöpää. Tarkemmin, huomasimme, että miR-212 pystyi kohdistamaan antiapoptoottinen proteiini PED yläreguloituja keuhkosyövän [28] viittaa siihen, että sen toiminta voi edistää tuumorisuppressiogeeneksi koska se negatiivisesti estää molekyyli osallistuu apoptoosin vastus [12]. Lisäksi analysointi ihmisen kudoksista näytteet normaalista ja keuhkosyöpää huomasimme, että säätely ylöspäin PED proteiinin keuhkosyöpä kudoksissa korreloi miR-212 hiljentäminen ja

in vitro

kanssa apoptoosin vastus. Kuitenkin suhde miR-212 hiljentämiselle etenemisen ja sairauden vakavuuden oli vielä tuntematon. Tätä varten käytetään kudosnäytteiden NSCLC-vaikutti potilasta T1-T2-T3 ja T4 lavastus, huomasimme, että T1 /T2 ilmentymistä miR-212 oli heterogeeninen taas T3 /T4 kaikki näytteet analysoitiin osoitti asennuspalveli- 212 downregulation. Nämä tulokset viittaavat siihen, että hiljentäminen miR-212 keuhkosyöpään on läheistä sukua taudin vakavuuteen. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja miR-212 hiljentäminen keuhkosyövässä vielä tunneta, ja tämä oli painopiste Tutkimuksemme.

Useat tutkimukset ovat analysoineet ilmentymisen miR-212 eri solutyypeissä, jotta määrittää sen rooli kudosspesifisiä fysiologia. miR-212 ekspressiotasoja havaittiin korkeampi etuaivojen alueilla aikuisen rotan aivoissa [29] voimakkaasti vaimentua kudoksissa sikiöiden anencephaly [30] ja, yhdessä miR-132, korkeampi hippokampuksen neuronien. Lisäksi miR-212 on kuvattu mukana normaalissa dendrite kypsymisen vastasyntyneen neuronien hippokampuksessa [31].

Toistaiseksi harvat raportit osoittavat osallistumista miR-212 syövässä, mutta ne kaikki osoittavat että tämä miRNA vapautetaan säännöstelystä eri ihmisen syövän. Erityisesti, miR-212 ilmentyminen vähenee sekä mahasyöpä (GC) solut ja ihmisen primaarisissa GC kudoksissa viittaa siihen, että sen downregulation voi liittyä mahasyövän kautta kohdegeenien, kuten metyyli-CpG: tä sitova proteiini [32]. Haiman adenokarsinooma kudoksissa miR-212 on yli-ilmentynyt ja sen kohteena ovat retinoblastooma tuumorisuppressorigeeni [33] Käyttäen mikrosiruanalyysi kolmetoista miRNA, mukaan lukien miR-212, havaittiin yliekspressoituvat merkittävästi suun kasvaimissa [34]. Lisäksi lisääntynyt ilmentyminen HB-EGF (hepariinia sitovat EGF-kaltainen kasvutekijä) johtuen alas-säätely miR-212 pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on kuvattu mahdollinen mekanismi setuksimabin vastus [35 ].

Syöpäsolut on erityinen epigenome. Viime vuosikymmenen aikana monet tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeavuus epigeneettiset merkkien, kuten DNA: n metylaation CpG-saarekkeiden ja kovalenttisia muutoksia histoni proteiineja, jotka liittyvät kromatiinin organisaatiossa, vaikuttavat merkittävästi pahanlaatuisiksi. Toisaalta, on osoitettu, että ilmentyminen miRNA voidaan vaikuttaa epigenetic muutokset. Virtsarakon kasvaimet todettiin, että miR-127 on vaiennetaan promoottori metylaation ja sen ilmentymistä voidaan palauttaa hypomethylating aineet [16]. Lujambio

et al

käsitellään useita syövän johdetut solulinjat lymphonode etäpesäkkeet DNA demetyloivan aineiden ja käyttämällä miRNA ilmaisua mikrosiruanalyysi todettiin, että miR-148a, miR-34b /C, ja miR-9 perheen osoitti syövän erityinen CpG-saarekkeen hypermetylaation [36]. Samoin koolonkarsinoomasoluissa miR-124a hiljentäminen liittyi CpG-saarekkeen hypermetylaation [17]. Bioinformatiikan ohjelmia löysimme CpG saari edistäjä miR-212-geenin. Poikkeava metylaatio promoottorin CpG saarialue on yleinen epigeneettiset mekanismi transkription hiljentäminen. Siksi mittasimme vaikutuksia AZA on transkription säätelyyn miR-212 Calu-1-solut, jotka ilmentävät alhainen miRNA. Yllättäen, vaikka promoottori elementti miR-212 sijaitsee sisällä CpG-saarekkeen olemme havainneet, että Calu-1-hoidon spesifinen estäjä DNA-metylaasia ei muuttanut ilmentymisen miR-212.

Epigeneettiset hiljentäminen nisäkässoluissa on välittyy ainakin kaksi erillistä histonimodifikaation: H3K27 trimethylation ja H3K9 dimetylaatio [37]. Suhde DNA hypermetylaation ja näiden histonimodifikaation ei ole täysin ymmärretty. Mielenkiintoista, Kondo

et al

osoitti vastatunnistetun epigeneettisellä näkökohta geenin vapauttamisen syöpäsolun [38]. He havaitsivat, että jopa 5% geenien CpG microarray hiljennettiin syövän soluissa merkitty korkeus H3K27me3 liittyy suhteellisen alhainen promoottorin DNA: n metylaatio. Lisäksi viime aikoina on havaittu, että miR-22 hiljentäminen liittyy kertyminen H3K27me3 riippumaton promoottori-DNA: n metylaation akuutti lymfaattinen leukemia [39]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että H3K27me3 on vaihtoehtoinen tila geenien syövän riippumattomia DNA: n metylaation. Yhdenmukainen nämä viimeaikaiset tutkimukset suoritimme ChIP analyysi keuhkosyöpäsoluissa (Calu-1) ja normaaleissa ihmisen fibroblasteissa peräisin sikiön keuhkoissa (MRC5) tutkimaan muutoksia histonimodifikaation liittyy transkription aktiivinen ja /tai passiivinen kromatiiniin miR-212 promoottori alue. Kuten odotettua, löydettiin kasvavia määriä H3K27me3 ja H3K9me2 (kovalenttisen modifikaation osallistuvien geenien) on promoottorialue miR-212 Calu-1 verrattuna MRC5 soluja ja kasvavat määrät H3K9Ac (kovalenttisen modifikaation osallistuvien geenien ilmentymistä) on promoottorialueen miR-212 MRC5 verrattuna Calu-1-soluissa. Lisäksi olemme havainneet, että inhibiittorit osallistuvien entsyymien histonimodifikaation, ts siEZH2, TSA ja BIX01294, pystyivät säätää ylös miR-212 ilmentymisen Calu-1-soluissa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että vaikka DNA: n hypermetylaatio näyttää olevan välttämätöntä geenien, transkription hiljentämisen miR-212 NSCLC liittyy H3K27me3 /H3K9Ac tai H3K9me3 /H3K9Ac liittyvät histonimodifikaation riippumaton promoottorin DNA: n metylaation.

Testasimme myös vaikutuksia TRAIL aiheuttama solujen kuoleman NSCL eri estäjien.

Itse asiassa viimeaikaiset havainnot osoittivat, että ektooppinen ilmentyminen miR-212 herkistää Calu-1 solujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin [12]. Meidän tiedot osoittavat, että TRAIL herkkyys Calu-1, arvioitiin Western blot-analyysi kaspaasin 8 ja FACS-analyysillä, on suurempi kasvoi inhibitio G9a niin että EZH2. Puuttuminen vaikutuksen siEZH2 trail herkkyyttä Calu-1 soluja voidaan katsoa johtuvan eri mekanismeja. On mahdollista, että: (i) 70%: n vähennys EZH2 saatu käsittelemällä erityisten siRNA ei ole riittävä lisäämään TRAIL vastaus (ii) EZH2 knock-down lisäksi miR-212, voi säädellä muita tärkeitä signalointimolekyylejä mukana TRAIL signalointi (iii) säädellä perävaunu signalointireitin EZH2 voidaan tarvita samanaikaista HDAC-esto, joka voi moduloida ekspressiotasoja eri osallistuvien molekyylien TRAIL vastausta. Lisätutkimuksia tarvitaan tutkia näitä eri näkemykseen.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että miR-212 hiljentäminen korreloi taudin vakavuuteen, koska se on huomattavasti säädellä vähentävästi T3 /T4 lavastus sijasta T1 /T2 lavastus ja että sen hiljentäminen keuhkosyövässä liittyy sen histonimodifikaation sijaan DNA hypermetylaation.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Calu-1 (NSCLC) ja MRC5 (ihmisen normaaleja fibroblasteja, jotka ovat peräisin sikiön keuhkojen fibroblastin) -soluja kasvatettiin DMEM: ssä. Media oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM L-glutamiinia ja 100 U /ml penisilliiniä /streptomysiiniä.

Keuhkosyöpä näytteet

Yhteensä 34 Formaliini -Kiinteä, parafinoidut (FFPE) kudosnäytteitä koostuu sekä adeno- ja okasolusyöpää kerättiin arkistoista patologian osaston, Kuopion yliopistollisen sairaalan, Suomi. Lupa käyttää materiaalia saatiin kansallisen valvontaviranomaisen Sosiaali- ja terveysministeriön ja Suomen tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean Pohjois-Savon sairaanhoitopiirin, Kuopio, Suomi.

RNA ja Real-Time PCR

Soluviljely.

Yhteensä-RNA: t (miRNA ja mRNA) sekä Calu-1 ja MRC5 soluja uutettiin käyttäen miRNeasy mini Kit (Qiagen) mukaan valmistajan protokollaa.

Tissue mallin:

Kokonais-RNA (miRNA ja mRNA) peräisin FFPE kudosnäytteet uutettiin käyttäen RECOVERALL- Yhteensä Nucleic Acid eristäminen Kit (Ambion) mukaisesti valmistajan protokollaa. Käänteistranskriptio koko miRNA ja mRNA suoritettiin käyttäen 500 ng (soluviljelmästä) tai 50 ng (alkaen FFPE kudosnäytteiden) kokonais-RNA /näyte miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen) mukaan valmistajan protokollaa. Kvantitatiivinen analyysi miR-212, EZH2, G9a ja HDAC suoritettiin RealTimen PCR: llä käyttämällä miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen) mukaan valmistajan protokollaa. Kuten sisäisiä käytimme RNU5A ja GAPDH. EZH2 paitsi (Fw: CCACCATTAATGTGCTGGAA Rv: TTCCTTGGAGGAGTATCCACA) kaikki käytetyt alukkeet ostettiin Qiagen. Reaktion havaitsemiseksi miRNA ja mRNA: iden suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Kokeita tehtiin kolmena rinnakkaisena kullekin aineiston pisteelle, ja data-analyysi suoritettiin käyttäen ohjelmistoa (Bio-Rad).

DNA metylointianalyysi

CpG Island Searcher ohjelma (http: //www.cpgislands.com/) käytettiin osoittamaan, että miR-212 koodaava alue on upotettu CpG-saarekkeen. DNA: n metylaatio tila arvioitiin Sekvensointianalyysin bisulfiitin-muunnetun genomisen DNA sisältyvät vastaaviin CpG-saarekkeen. Vetysulfiittikäsittelyä indusoi kemiallista muuntamista metyloitumattoman sytosiinin urasiiliksi jättäen metyloidut sytosiini ennallaan. Genomi-DNA on muutettu käyttäen EZ DNA Metylointi Kit (Zymo Research) mukaan valmistajan protokollaa. Ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta käytettiin templaattina monistamiseen alueesta sisältäen miR-212 transkription aloituskohdasta käänteisfaasi juoste käyttämällä seuraavia alukkeita: 5′-TTTTGGGTGGTATTTGAATTTT-3 ’; RV 5’-CCCCTCCTCAATTCCTAAA-3 ’. Sitten PCR-tuotteet kloonattiin p-GEM-T Easy Vector System II (Promega), ja kahdeksan itsenäistä kloonia kustakin näytteestä sekvensoitiin.

Kromatiini immunosaostus analyysi

kromatiini immunosaostus määritykset suoritettiin käyttäen Lowcell ChIP Kit (Diagenode) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, soluja käsiteltiin 1% formaldehydiä, joka on silloitusainetta, 10 min. Sitten, kromatiini hierretään Bioruptor (Diagenode) ja keskimääräinen pituus on 0,4-0,8 kb. Leikatut kromatiinin immunosaostettiin 16 tuntia 4 ° C: ssa käyttäen seuraavia vasta-aineita: anti-thrimethyl-K4 histoni H3, anti-thrimethyl-K27 histoni H3, anti-dimetyyli-K9 histoni H3 ja anti-asetyyli-K9 histoni H3 (Diagenode) . Lisäksi, 1/100 liuos kerätään ennen kuin lisätään vasta-ainetta käytettiin sisäisenä kontrollina määrän tulo DNA. Real-Time PCR suoritettiin 25 ul: ssa, joka sisälsi 5 ui immunosaostettiin DNA, 12,5 ui SYBR green PCR Master Mix (Qiagen) ja 150 nM spesifisiä alukkeita (FW 5′-GGAGTCCAGCTTCCTCTCCT-3 ’; RV 5’-GCTCCTGGGGGTCTTCAC) . PCR-protokolla sisältyi 10 minuutin ajan 95 ° C: ssa ja 40 sykliä 15 sekuntia 94 ° C: ssa ja 1 min 60 ° C: ssa. Kokeita tehtiin kolmena rinnakkaisena kullekin aineiston pisteelle, ja data-analyysi suoritettiin käyttäen ohjelmistoa (Bio-Rad).

Sirna Transfektio

siRNA duplex negatiivisen kontrollin ja EZH2 mRNA (Dharmacon) transfektoitiin ohimenevästi 48 h Calu-1-soluihin käyttämällä Lipofectamine 2000 -reagenssia (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten ilmentyminen arvoja EZH2 ja miR-212 tasot arvioitiin Real-Time PCR ja western blot-analyysi. Kokeita tehtiin kolmena rinnakkaisena datapisteen.

Protein eristäminen ja Western blotting

Solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä, ja hajotettiin JS puskurissa (50 mM HEPES, pH 7,5, joka sisälsi 150 mM NaCl, 1% glyseroli, 1% Triton x 100, 1,5 mM MgCl2: a, 5 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, ja 1 x proteaasi-inhibiittorin cocktail). Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad) käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina, ja yhtä suuret määrät proteiineja analysoitiin SDS-PAGE (12,5%: inen akryyliamidi). Geelit eletkroblotattiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore, Bedford, MA).