Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvainsoluja, vaiheittaista onkogeenisiä vapauttaminen signa- indusoi muutoksia solun morfologiassa ja edistää hankinta pahanlaatuinen piirteitä. Täällä, me määritetty joukko 21 geenejä, kuten

FGF9

, määrittäjinä kasvainsolun morfologia jota RNA-interferenssi fenotyyppiset näytön SW480 paksusuolen syöpäsoluissa. Paneelia käyttämällä pieni molekyyli-inhibiittorit, me myöhemmin asettaa fenotyyppivaikutukset, alavirran signalointikaskadien, ja liittyy geeniekspression allekirjoitukset FGF reseptorin signaaleja. Huomasimme, että esto FGF signaaleja indusoi epiteelisolujen tarttumista ja liikkuvuuden menetystä paksusuolen syöpäsoluissa. Nämä vaikutukset välittyvät mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) ja Rho GTPaasi porrastetusti. Suostumuksella Näiden havaintojen estämällä MEK1 /2 tai JNK kaskadissa, muttei PI3K-AKT signalointi akseli myös indusoi epiteelisolujen morfologia. Lopulta huomasimme, että ilmaus

FGF9

oli vahvaa osajoukko kehittyneen paksusuolen syöpiin, ja yli-ilmentyminen korreloi negatiivisesti potilaiden selviytymisen. Meidän toiminnalliset ja ilmaisun analyysit viittaavat siihen, että FGF-reseptori-signaalit voivat edistää paksusuolen syövän etenemisessä.

Citation: Leushacke M, Spörle R, Bernemann C, Brouwer-Lehmitz A, Fritzmann J, Theis M, et al. (2011) RNA Häiriöt Fenotyyppiset Screen Tarkoittaa rooli FGF Signals Colon Cancer Progression. PLoS ONE 6 (8): e23381. doi: 10,1371 /journal.pone.0023381

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 25 helmikuu 2011; Hyväksytty: 15 heinäkuu 2011; Julkaistu: 11 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Leushacke et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: osat työn rahoitti Saksan Bundesministerium für Bildung und Forschung (myöntää NGFN2 01GR0405 ja BGH, ja myöntää PKT-01GS08111-5 ja PKM-01GS08105-8 ja BGH ja MM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Late vaiheita syövän etenemisen voi johtaa metastasoitunut levittäminen kasvainsolujen, jotka ovat menettäneet epiteelin ominaisuuksien ja hankittujen vaeltavia ja invasiivisia ominaisuuksia. Morfologisesti, tämä fenotyypin kytkin muistuttaa muuntaminen kiinteän epiteelisolujen muuttavien mesenkyymisolujen alkionkehityksen aikana, ja näin ollen kaikki nämä prosessit ovat usein kutsutaan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) [1], [2], [3], [4], [5]. Keskeiset vaiheet kehitys- ja kasvaimeen liittyvien EMT ovat menetys E-kadheriinin-pohjainen soluadheesiota (by epigeneettisellä hiljentäminen tai transkription tukahduttamisen

CDH1

, koodaavat E-kadheriinin), uudelleenjärjestelystä solun tukirangan johtaa muuttuneisiin solujen morfologia, ja induktio mesenkymaalisten-spesifisen geenin ilmentymisen, kuten aktivointi

FN1

ja

VIM

[6], [7], [8], [9], [10], [11]. Alkio, EMT tapahtuu järjestäytyneessä ja hyvin toistettavissa tavalla. Kasvainsoluissa kuitenkin EMT kaltaiset ilmiöt voivat olla väliaikaisia, kaoottinen ja epätäydellinen.

alkio, EMT indusoidaan koordinoitu aktivoituminen signalointireittien, kun kasvainsoluissa täydellistä tai osittaista EMT voidaan aikaansaama yhdistetyt toimintaa onkogeenisten mutaatioiden ja kasvutekijän vastaanotetut signaalit sisällä kasvainsolun mikroympäristössä. Silti roolit keskeisten signalointireittien ja molekyylit näyttävät säilytettävä. Esimerkiksi β-kateniinin tarvitaan ensimmäisen alkion EMT, ja muodostuu primitiivisen putki ja Mesodermi [12], kun taas paksusuolen syöpä ja muut kasvaimet β-kateniinin transdusoi avain signaalit leviämisrintamassa, mikä johtaa tuumorisolun tarttuvuus, induktio soluliikkuvuus ja etäpesäkkeiden [13], [14], [15]. Useita reseptorityrosiinikinaaseja (RTK) ovat sekaantuneet sekä, kehitys- ja kasvaimeen liittyvät EMT. Alkion kehitykseen, hajonta tekijä /hepatosyyttikasvutekijän reseptorin MET on välttämätöntä migraatio lihaksen esisolujen, epidermaalinen kasvutekijä (EGF) -reseptorin tarvitaan epiteelin morphogenesis [16], [17], [18], ja fibroblasti kasvutekijä (FGF) -reseptorin FGFR1 ja sen ligandin Fgf8 ovat välttämättömiä solujen vaeltamiseen kautta primitiivisen putki ja Mesodermi muodostumisen [19], [20]. Kasvaimissa, Epäfysiologiset signalointi kautta RTK kuten MET, verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) reseptorin, ja EGR: n ja FGF-reseptorien voi liittyä etenemiseen ja etäpesäkkeitä [21], [22]. Tärkeää on, että EGF: n ja VEGF: n reseptorit ovat kohteita järkevä hoito kehittyneen paksusuolisyövän [23].

-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) reitit, kuten Jun-N-terminaalisen-kinaasin (JNK) ja mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin kinaasi /solunulkoisen säädelty kinaasi (MEK /ERK) reittejä, yhdistää signaalit useilta RTK: t ohjaamaan soluproliferaatiota, solun liikkuvuus ja muiden solun ominaisuudet [24]. Onkogeeninen mutaatioita koodaavat geenit signaalimuuntajia että rele signaaleja RTK ja MAPK reittejä kuten

KRAS

tai

BRAF

voi herkistää signaloinnin kautta MEK /ERK-reitin kasvaimissa, ja tällaiset mutaatiot mitätöi terapeuttinen interventio strategioita ylävirran RTK-reseptoreja [25]. Sekä kehityksen aikana ja kasvaimissa, EMT signaalit usein integroitu transkriptiorepresso- on

CDH1

, kuten Snail, Snail2, Twist ja muut, jotka siis tärkeitä rooleja valvonnassa solumorfologian ja syövän etenemiseen [ ,,,0],9], [10], [26].

Täällä me käytti molekyylien samankaltaisuudesta kehitys- ja kasvaimeen liittyvien EMT tunnistaa uuden ehdokkaan osallistuvien geenien paksusuolen syövän etenemisessä. Eräässä RNA-interferenssi näyttö tunnistimme useita geenejä, joiden inaktivaatio edistänyt epiteelin fenotyyppi ja E-kadheriinin välittämiä solun kiinnittymisen SW480 paksusuolen syöpäsoluissa. Monet geenit tunnistetaan koodin osien keskeisten signalointireittien, kuten Wnt, Hedgehog ja RTK reittejä, esimerkiksi

FGF9

,

PTCH1

,

GLI2

,

Gli3

ja

TCF7L1

. Käyttäen tunnistaminen

FGF9

kuin lyijy, huomasimme, että FGFR signaaleja rooleja menetykseen paksusuolensyöpä soluadheesion ja induktio solun liikkuvuus. Välittäjänä näitä vaikutuksia, FGFR signaalit moduloivat MEK /ERK Cascade ja Rho GTPaasit. Tuloksemme tunnistaa näin FGFR signaaleja tärkeimpiä tekijöitä MEK /ERK kaskadin aktiivisuutta SW480 paksusuolen syöpäsoluissa, vaikka läsnä on onkogeenisessä KRAS-mutaatio. Huomasimme, että

FGF9

ilmaistiin paksusuolensyöpä ja ekspressiotasoja korreloivat potilaan selviytymistä, mikä viittaa siihen, toiminnallinen rooli syövän.

Tulokset

RNAi häiriöitä fenotyyppinen näyttö geenit, jotka säätelevät paksusuolen syövän etenemiseen

Invasiivisen kasvun ja etäpesäkkeiden kasvainten liittyy menetys epiteelisolujen tarttumisen ja voitto solun liikkuvuus. Me perusteltu, että geenit, joiden tuotteet rooleja syövän etenemistä voidaan rikastaa joukossa ilmaistu caudal lopussa puolivälissä raskauden hiirialkiossa paikka, jossa epiteelisolujen läpi kehityshäiriöitä EMT, eli fenotyyppinen kytkin on mesenkymaaliset tilan alhainen soluadheesion ja korkea solun liikkuvuus. Siksi käytetään MAMEP tietokanta (https://mamep.molgen.mpg.de) ja kirjallisuushakuja koota luettelo geenien ilmaistu sijassa caudal lopussa puolivälissä raskausajan (E9.5) alkio, ja tunnistaa niiden ihmisten homologit. Seuraavaksi kohdennettuja nämä geenit käyttäen esiRNAs [27] vuonna SW480 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, mikä näyttää mesenkymaaliset ( ”kara-muoto”) morfologia, ne ovat liikkuvia ja on vähän soluadheesiota. Me seuloa geenejä, joiden inaktivoituminen edistää epiteelisolujen ( ”mukulakivi”) solujen morfologia ja paikallistaminen epiteelisolujen adheesiomolekyyli E-kadheriini ja solu-solu-kontaktien (Fig. 1A). Out of 364 geenien seulotaan, hiljentäminen 18 ehdokasta aiheuttamaa epiteelin morfologia verrattavissa häiriöitä viite

BCL9L

, joka on transkription koaktivaattoria of β-kateniinin [28]. Olemme myös löytäneet kolme geeniä, jonka inaktivointi edistettäessä aiempaa kara-muotoon solujen morfologia. Sitä vastoin kontrolli-transfektoidut solut eivät näytä johdonmukaista morfologisia muutoksia (Fig. 1 B, häiriöiden tehon, ks. S1, on täydellinen luettelo kohdennettuja geenien ja positiivisia, katso taulukko S1 ja taulukko 1, vastaavasti).

kaaviokuva näytön: Genes valittiin seulomalla MAMEP tietokanta (https://mamep.molgen.mpg.de) geenejä, jotka näyttävät kaudaalisesti rajoitettu ilmentyminen hiiren alkion ja kirjallisuuden hakuja. Esimerkki kuvaa tällaisen geeniekspressiomalleja näkyvät päälle vuokaavio. Ihmisen homologit inaktivoitiin RNA häiriöiden SW480-soluissa. Positiiviset geenit tunnistettiin niiden kyvystä edistää epiteelisolujen morfologia. B E-kadheriinin jakelua ja morfologia SW480 transfektoitujen solujen esiRNA vastaan ​​tulikärpäsen lusiferaasi (

Fluc

, negatiivinen kontrolli),

BCL9L

(positiivinen kontrolli) ja useita positiivisia geenejä. Geenit merkityt (*) indusoi enemmän kara-muotoon morfologia. Mittaviivat edustaa 50 um. Täydellinen luettelo geenien suunnataan ruudulla, katso taulukko S1. Täydellinen luettelo geenien positiivinen tulos, katso taulukko 1.

Monet tunnistetut geenit pelata tunnettuja rooleja valvonnassa signalointipolkujen jotka säätelevät alkionkehityksen, urut homeostaasin, ja kasvaimen etenemistä. Löydettiin

TCF7L1

, joka koodaa loppupään transkriptiotekijä Wnt /β-kateniinin signalointiryöpyn [29], samoin kuin Wnt /β-kateniinin signalointi komponentit

SFRP1

ja

CSNK2A1

. Olemme myös eristetty

PTCH1

,

GLI2

, ja

Gli3

, jotka koodaavat osia Hedgehog signalointireitin [30]. Löysimme

FGF9

ja

EPHA4

, koodaa RTK-ligandin ja RTK on efriini alaheimon säätelevät soluadheesiota ja solun tukirangan kautta MAPK ja Rho [31], [32]. Ehdokas geeni

TAX1BP3

voi olla rooleja säätelyssä Rho signaalit [33]. Joukossa useita geenejä osallinen transkription säätelyyn, löysimme

SIX1

, joka koodaa homeobox transkriptiotekijän osallisena solujen erilaistumiseen ja syövän etenemistä [34], [35] (Fig. 2).

Gene symbolit positiivisten annetaan mustat kirjaimet, jotka liittyvät keskeiset reitin osat esitetään harmaalla kirjaimilla, näytetään väriympyrät ja tilata soluosastoon. Sininen: Wnt-reitin, Green: Hedgehog-reitin, Cyan: RTK polkuja. Geenit siirrettiin polkuja kirjallisuuden, Gene ontologia ja muut tietokantahakuihin. Tärkeimmät viitteet annetaan varsinaisessa tekstissä.

FGF signaalit säätelevät tarttuvuus ja liikkuvuusluokka koolonkarsinoomasoluissa

Koska tunnistimme

FGF9

meidän solujen näyttö ja löysi ilmaus FGF9 suolen pahanlaatuisten sekä hiiren ihmisillä (katso alla), olemme keskittyneet roolien FGF signaalien koolonkarsinoomasolut. Ensin vahvisti seulonta tuloksen käyttämällä riippumaton

FGF9

siRNA valmisteen, joka myös indusoi epiteelin fenotyypin SW480, i. e. johti menetys kara-muodon soluja ja lisääntymiseen kalvo- E-kadheriini värjäytymistä (kuvio. S2). Eräässä toisessa koolonisyöpäsolulinja, HCT116, hiljentämisen

FGF9

ei ollut näkyvää vaikutusta. Kuitenkin, kun kohdistaminen

FGFR3

, jotka koodaavat suuren affiniteetin reseptorin FGF9 ja muiden FGF, olemme havainneet, että se edistää epiteelisolujen morfologia HCT116 (Fig. S2). Nämä havainnot osoittavat, että FGF-reseptori-signaalit voivat yleisesti olla rooleja valvontaa paksusuolen syövän solujen morfologia, ja että eri reitti komponentit voidaan rajoittaa eri solulinjoissa.

Seuraavaksi kohdistettiin FGF-reseptorien käyttämällä pientä molekyyli estäjä SU5402 [36], ja arvioidut muutokset solun fenotyypin. Suostumuksella meidän RNA-interferenssi tietojen esto FGF-reseptorien edisti epiteelin morfologian SW480-solujen ja käskenyt E-kadheriinin ja β-kateniinin ja solu-solu kontakteja, mikä osoittaa

de novo

kokoaminen epiteelin vyöliitos (kuvio . 3A). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin morfologian SW620-soluja, jotka ovat peräisin samasta potilaasta, ja HT29 ja HCT116-soluja, jotka ovat peräisin muista potilaista (Fig. S3).

fenotyyppinen kytkin SW480-solujen upon FGF-reseptorin esto SU5402. Ylhäältä alas: Solumorfologia kirkkaassa alalla, immunovärjäystä E-kadheriinin ja β-kateniinin. Kuvat otettiin 72 tunnin kuluttua alusta SU5402 hoidon. Alla: SW480-solut saavat FGF signaaleja, jotka voivat estää SU5402. B Scratch-haavan motiliteettia määrityksen yhteydessä FGF reseptorin esto. SW480-soluja kasvatettiin konfluenssiin, ja naarmut indusoitiin 24 tunnin kuluttua hoidon aloittamisesta. Kirkas kuvia tyhjästä reunan otettiin 24, 48 ja 72 tunnin jälkeen naarmuuntumista. Mittaviivat A ja B edustaa 50 um. C, D immunoväriäys tyhjästä reunasta. C värjäys aktiini ja mikrotubulusten solun tukirangan hallinnassa ja SU5402 käsiteltyjä soluja. Vihreä: aktiini (phalloidin); keltainen: tubuliinia; sininen: ytimet (DAPI); nuolet: alueet tiheä polttoväli kiinnittymisen liikkuvia ohjaus soluissa; arrowheads: tehostettu aivokuoren aktiinivärjäyksen in SU5402-käsitellyissä soluissa. D RhoA uudelleenjako siirryttäessä soluissa, joka pienenee estäjä-käsitellyissä soluissa. Vihreä: aktiini; punainen: RhoA; sininen: ytimiä. harmaa Nuolenpäät ydin- RhoA. Katkoviiva merkitsee naarmu reunasta. Mittaviivat C ja D, edustavat 25 pm. E kvantifiointi leviämisen hallinnassa ja SU5402 käsiteltyjä soluja. Sillä aikaa tietenkin leviämisen solut maljattiin rinnakkaisnäytteiden ja päällekkäisiä näytteet laskettiin kahdesti päivittäin Neubauer hematosytometrillä.

Soluadheesio ja soluliikkuvuus usein korreloi käänteisesti kasvainsoluissa. Siksi arvioitiin myös solun liikkuvuus. Ohjaus SW480-solut nopeasti siirtynyt, kun taas SU5402 käsiteltyjä soluja ei kykenisi enää lähelle naarmu haava (Fig. 3B). FGF-reseptori-esti solujen naarmu reunalla näytetä lisääntynyt värjäytyminen aivokuoren aktiini ja vähentää numerot fokaalisen adheesion kontakteja, mikä osoittaa muuttunut dynamiikka solun tukirangan (Fig. 3C). Lisäksi Rho GTPaasit, jotka ovat keskeisiä efektoreita tasapainoa soluadheesiota ja liikkuvuus [37], ilmestyi paikannettu ydin- pilkkuja vuonna SW480-soluissa valtaavat tyhjästä, ja vähenivät estäjä käsiteltyjen SW480-soluissa (kuvio. 3D). Solujen proliferaatio vaikuttaneet ainoastaan ​​vähän FGF-reseptorin esto (Fig. 3E). Nähtiin samanlainen vaikutus solujen morfologiaan ja liikkuvuus käyttäen rakenteellisesti eivät liity pienmolekyylisalpaaja- FGF-reseptorien, PD173074 (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että FGF-reseptori signaalien voi olla olennainen rooli siirtyminen paikallaan on vaeltava fenotyyppi, joka on ominaista myöhäisen vaiheiden suoliston kasvainprogression johtaen etäpesäkkeitä.

FGF signaalit koolonkarsinoomasoluissa välitetään MAPK-reitin ja Rho

FGF-reseptori-signaalien tiedetään välityksellä MAPK kaskadeja ja kautta phosphoinositid-3-kinaasi (PI3K) /AKT signalointiryöpyn [38]. Siksi analysoi aktiviteetti keskeisillä matkapuhelinverkon signaalimuunta- jälkeen esto FGF-reseptorien tai keskeisiä alavirtaan signaalimuuntajia eli U0126, estävät MEK1 /2-kinaasien klassisen MEK /ERK MAPK cascade, SP600125, estäjä vaihtoehtoisen JNK Cascade ja LY294002 , estäjä PI3K signaalitransduktion. Kuten odotettua, inhibitio MEK1 /2 poistetaan fosforylaation ERK1 /2, ja inhibitio PI3K poistetaan fosforylaation AKT. Kun FGF-reseptori esto, löysimme rajoitetun, mutta toistettavissa vähentäminen ERK1 /2 fosforylaatiota (noin 30%). Sen sijaan aktiivisuutta p85-PI3K ei vaikuttanut. Muutokset fosforylaation AKT osoitti, että ylimääräinen signaalitransduktion verkkojen moduloidaan suoraan tai välillisesti, kun inhiboimaan FGF-reseptorien tai JNK (Fig. 4A, B).

analyysi Phospho-ERK1 /2, Phospho-P85PI3K ja fosfo-AKT in SW480-soluissa hoidon jälkeen DMSO (liuotinkontrolliviljelmissä), SU5402 (estämällä FGFR), U0126 (estämällä MEK1 /2 riippuvainen ERK1 /2 fosforylaatio), SP600125 (estämällä JNK), ja LY294002 (estämällä PI3K-välitteisen AKT fosforylaatio) ovat näkyvissä. Histoni H3 näkyy latauskontrollina. Fosforylaatio tila arvioitiin 40 minuutin kuluttua estäjä hoidon. B kvantitointi ERK1 /2 fosforylaation, keskiarvo kolmesta kokeesta. C Morfologia, E-kadheriinin immunofluoresenssimenetelmällä ja solun motiliteettia SW480-solujen 72 tunnin jälkeen estäjän hoidon. Esto klassisen MAPK tai vaihtoehtoista MAPK /JNK kaskadeja indusoi samanlaisen fenotyypin kuin FGFR eston SW480-soluissa, wheras esto PI3K tai AKT ei ollut tällaista vaikutusta. Huomasimme, että PI3K esto, mutta ei AKT esto, estää solun liikkuvuus. Irrottaminen PI3K ja AKT signaalit on havaittu aikaisemmin kasvaimissa [56]. Scratch-määritys suoritettiin kuten on esitetty. 3B. Mittaviivat edustaa 50 um. D esto FGF-reseptorien tai MEK1 /2 johtaa vähentyneeseen Rho toimintaa. Rho GTPaasi loading määritykset suoritettiin SW480-soluissa 5 min sen jälkeen, kun seerumin stimulaation läsnä ollessa tai poissa ollessa SU5402 tai UO126. N.d .: ei määritetty.

Seuraavaksi testasimme fenotyyppisiä vaikutuksia inhibition alavirran porrastetusti. Hoito SW480-solujen U0126 (estämällä MEK1 /2) tai SP600125 (inhiboimalla JNK) tuettu muodostumista epiteelisolujen adheesion komplekseja, ja estää solun liikkuvuus, joka on samanlainen vaikutus nähdä sen jälkeen, kun estoa FGF-reseptorin signaalia (Fig. 4C, Fig. S4). Sen sijaan fenotyypit hoidon jälkeen LY294002 (estävä PI3K) tai Calbiochem AKT-estäjä eivät olleet vertailukelpoisia vaikutukset nähdään jälkeen FGF-reseptori esto (Fig. 4C). Samanlainen korrelaatio solun fenotyyppejä, kun esto signaloinnin solmukohdat havaittiin HCT116-soluissa, jotka eivät kuitenkaan näytä modulaatio E-kadheriinin lokalisointi missä tahansa olosuhteissa (Fig. S5, katso myös kuvio. S2). Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että FGFR signaalit moduloivat MEK /ERK signalointiryöpyn vuonna SW480-soluissa, ja että toiminta FGFR, MEK1 /2 ja JNK tarvitaan ylläpitoon fenotyypin, joka suosii solun liikkuvuus yli soluadheesiota.

Koska havaitsimme uudelleen lokalisoinnin Rho liikkuvien SW480-soluissa (katso edellä, Fig. 3d), määritimme vaikutus FGFR tai MEK1 /2 signaaleja Rho toimintaa käyttäen Rho lastaus määrityksiä. Tämän vuoksi meidän seerumia SW480-soluissa 24 tuntia, ja arvioidaan Rho aktivoinnin jälkeen seerumin uudelleen stimulaatio. Lisäksi seerumin johti nopeaan induktion aktiivista Rho-GTP kontrollisoluissa, kun taas Rho aktivointi vaarantunut läsnä FGF-reseptorin tai MEK1 /2-estäjät (Fig. 4D). Tämä tulos viittaa siihen, että SW480-soluissa FGF-reseptorien ja MEK1 /2 pelata rooleja säätelyssä Rho GTPaasit, jotka ovat keskeisiä modulaatio solun tukirangan.

FGFR ja MAPK signaalit liittyvät tiettyyn geenin ilmentymisen allekirjoituksia

eristämiseksi geenin ilmentymisen allekirjoituksia liittyvät FGFR signaaleja ja soluliikkuvuus paksusuolen syöpäsoluissa, vertasimme geeniekspressioprofiilien liuotinta ohjaus ja estäjä käsiteltyjen SW480-soluissa. Ensin käytettiin toiminnallista klusterointi geenien purettu välillä ohjaus (DMSO-käsitelty) ja SU5402 käsiteltyjä soluja käyttäen Ingenuity koulutusjakson analyysi (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Niistä signalointi verkkojen voimakkaimmin vaikuttanut tunnistimme klusterin vapautettu liittyvistä geeneistä soluliikkuvuus että keskittyy ERK1 /2-riippuvaisen MAPK-reitin, joka vahvistaa aiemmat tulokset (Kuva. S6). Päätellä verkko sisältää keskeinen signaalimuunta- of liikkuvuutta signaalit kuten

ERK1 Twitter /2 ja

PTK2

(polttoväli tarttuvuus kinaasi), ja konvergoi transkriptiotekijät

kesäkuu

/

JUNB

ja

FOSL1

. Tärkeää on,

FOSL1

on aikaisemmin todettu olevan keskeinen transkriptiotekijän valvonnassa tuumorisolujen motiliteetin [39].

Seuraavaksi vertasimme DMSO-käsiteltyjen ja PI3K-estäjä-käsiteltyjen SW480-soluissa (näytetään mesenkymaaliset ”kara-muoto” morfologia ja heikko soluadheesiota) kanssa FGFR-inhibitor-, MEK1 /2-estäjän ja JNK-estäjän käsitellyt solut (näytetään epiteelisolujen ”mukulakivi” morfologia ja voimakas soluadheesiota, katso myös kuvio. 4C). Käytimme itseorganisoituvia karttoja tunnistaa ryhmiä geenejä, joiden ilmentyminen liittyy näihin erillisiä morfologioita, ja tunnistaa 29-geenit, joita liittyy voimakkaita solujen adheesiota ja 23 liittyviä geenejä, joilla on heikko soluadheesiota. Allekirjoitus geenit SW480-solujen, jotka ovat vahvoja soluadheesiota olivat

RAP1GAP

, joka on mukana kokoonpanoon vyöliitos ja

CLDN1

, komponentti vyöliitos, jotka osoittavat, että epiteelisolujen tartunta on säännelty ainakin osittain transkription tasolla. Olemme myös todettu lisääntynyt ilmentyminen transkriptiotekijän geenien

ELF3

ja

HMGCS2

, joiden merkitys toiminnallisten roolien epiteelin erilaistumista [40], [41] tuumorisuppressorit

SYK

ja

TFAP2C

ja Rho säädin

ARHGEF37

. Allekirjoitus geenit SW480-soluja, joilla on heikko soluadheesiota ja mesenkymaaliset morfologia oli rikastettu geenejä, on osoitettu kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden, eli

EDN1

,

IGFBP7

,

MCM5

,

MFI2

ja

TNFAIP8

. Lopulta löysimme myös

TAX1BP3

, jota edellä eristetty meidän fenotyyppisten esiRNA näyttö, mikä viittaa toiminnallista roolia tämän geenin säätelyssä tarttuvuuden ja liikkuvuuteen (Fig. 5A) [33]. Havaitsimme samankaltaista geenisäätelystä kun FGF-reseptorin eston HCT116 koolonkarsinoomasoluissa (joka näkyy menetyksen karan muodossa upon

FGFR3

RNA-interferenssi tai FGF-reseptori esto, ks. S2, S3), syytetään konservoitunut roolia tämän geenin klusterin alavirtaan FGF-reseptorien (Fig. S7).

A-B Microarray-analyysi SW480 jälkeen pieni molekyyli esto FGFR, MEK1 /2, JNK tai PI3K. Keskimääräinen ilmentyminen kolmena kokeet näytetään. Red: Korkea ilmaisu; Sininen: alhainen ilmaus White: Mediaani ilmaus kaikkien profiilit Grey: Genes ilman tai marginaalinen ilmentyminen Klusterit geenejä, joiden toiminta korreloi epiteelin ja mesenkymaalisten fenotyyppejä. Seuraavaa menetelmää käytettiin tunnistamaan nämä geenit: Ensinnäkin, geenit vapautui enemmän kuin 1.3fold (p 0,01), kun SU5402 hoidon kontrolliin verrattuna (DMSO) eristettiin. Toiseksi, nämä geenit ryhmittyneet itseorganisoituvia karttoja, ja kolme klustereita, jotka korreloivat fenotyyppi valittiin. Geenit tilattiin kertamuutosta ilmaisun jälkeen FGFR esto. B arviointi keskeisten geenien osallisena EMT tai stemness. C Quantitative Reaaliaikainen PCR-analyysi

SNAI2

ja

CDH1

jälkeen SU5402 (FGFR Inhibitor) hoitoon. Expression normalisoitiin liuotinkontrolli näytteitä.

Kun arvioimme ilmaus keskeisten modulaattorien EMT, näimme pieni, vaikkakaan ei merkittävästi, vaihtelua ilmaus

CDH1

, mikä osoittaa, että enemmän rajuja muutoksia, jotka näemme E-kadheriinin lokalisointi (kts. 1B, 3A) tapahtuvat pääasiassa kautta posttranskriptionaalisella sääntelyä. Expression of

VIM

ja

TWIST

olivat vain heikosti vaikutti, kun taas muut EMT markkereita havaittiin olevan ei-ilmaistu. Nämä tiedot viittaavat siihen, että SW480-solut eivät läpikäy täydellisen mesenkymaalisten-to-epiteelin siirtymisen jälkeen FGF-reseptorin tai MAPK-eston. Myös ei nähnyt sääntelyä suoliston kantasolujen merkkiaineita, joita on viime aikoina liitetty EMT kasvaimissa (kuvio. 5B) [42], [43], [44]. Asetus on transkription repressori

SNAI2

ja sen kohdegeenin

CDH1

via ERK1 /2 signaaleja on osoitettu aikaisemmin SW480-soluissa [45]. Siksi arvioitiin ilmaus

SNAI2

ja

CDH1

by qRT-PCR, joka voi olla herkempi kuin erilaisia ​​analyysi. Voisimme vahvistaa lievä aktivointi

CDH1

jälkeen SU5402 hoidon, kun taas

SNAI2

oli muuttumaton (kuvio. 5C).

FGF9 ilmentyminen korreloi potilaan eloonjäämisen ihmisen paksusuolen syöpä

arvioimiseksi

in vivo

merkitys analyysien, päätimme ilmaus

FGF9

in näyte hiiren ja ihmisen suoliston kasvaimet. Hiiren suolen adenooma, löysimme voimistunutta ilmentymistä

Fgf9

samalla mallia kuin Wnt kohdegeenin

Axin2

. Kun määritetty ilmentymä

FGF9

ihmisen paksusuolen syövän, me ikään löytyy yleistä ilmaisua kasvain epiteelin ensisijainen kasvaimia ja keuhkojen etäpesäkkeet (Fig. 6). Koska meidän näytön, yhdessä meidän myöhemmin toiminnallinen analyysi yleistä FGF signaaleja, osoitti mahdollisen tehtävän FGF9 signaaleja suoliston syöpä, selvitimme suhteelliset ekspressiotasot

FGF9

vuonna joukko 95 ekspressioprofiilit ihmisen paksusuolen syöpä, joka käsittää normaalin paksusuolen (4 profiilit), kehittynyt paksusuolikarsinooma (vaiheittainen T3 /4 kansainvälisen Against Cancer (UICC) kriteerit 41 profiilit), ja etäpesäkkeitä imusolmukkeisiin, maksan ja keuhkojen (50 profiilia) [46]. Löysimme pohjapinta ekspressiotasot

FGF9

normaalissa paksusuolen kudoksessa profiilit ja useimmissa kasvain profiileja, mutta korkea ilmentyminen

FGF9

alaryhmässä 7 paksusuolen kasvainten ja 5 etäpesäkkeitä (kuvio . 7A, cut-off 2-kertainen verrattuna normaaliin kudokseen). Huomattavaa on, että löysimme myös lisääntynyt ilmentyminen

FGFR3

, joka koodaa suuren affiniteetin FGF9 reseptori, 3 primäärikasvain profiilit ja useita etäpesäkkeitä (Fig. 7A). Korkeasta ilmentymisestä

FGF9

pidettiin parien välillä primaaristen kasvainten ja metastaasien, jotka ovat peräisin kolmesta potilaasta, mikä osoittaa, että

FGF9

aktivoitumista kasvaimessa voi säilyä pitkiä aikoja.

Expression of Wnt kohdegeenin

Axin2 /AXIN2

(vasemmalla) ja

Fgf9 Twitter /

FGF9

(oikealla) hiiren ja ihmisen suoliston pahanlaatuisten kasvainten esiintyvyys oli määritetään RNA

in-situ

hybridisaatio. Ylempi paneeli: Adenooma paksusuolen peräisin APC

min hiiri. Middle paneelit: ensisijainen ihmisen paksusuolen syöpä. Alempi paneeli: keuhkometastaasitestissä ihmisen paksusuolen syöpä. Negatiivinen kontrolli hybridisaatio (käyttäen liity asRNA koetin samankokoisia ja CG sisältöä, jota ei ole esitetty) ei tuottanut signaalia. Mittaviivat edustaa 500 um.

Expression of

FGF9

tai

FGFR3

in invasiivisia ja metastaattinen paksusuolisyöpä, joka arvioidaan mikrosiruanalyysillä (n = 95) . Expression kussakin näytteessä on merkitty ympyrä, mediaani ilmentyminen jokaiselle ryhmälle annetaan punainen bar. Numerot

FGF9

kuvaaja osoittaa primaarikasvaimen /etäpesäke parit peräisin samasta potilaasta. B Kaplan-Meier selviytymisen analyysi potilaille tarkastellaan A (ensisijainen kasvaimia seurannan tietoja vain, n = 39). Potilaat ryhmiteltiin korkea ( 2-kertainen mediaani, merkitty vihreällä ympyrä kuvassa. 7A) ja alhainen

FGF9

ja

FGFR3

ilme.

Olemme vihdoin korreloi ilmaus

FGF9

perusterveydenhuollossa kasvain (n = 39) potilaan selviytymisen käyttäen Kaplan-Meier-analyysi. Alaryhmässä, 7 potilaalla on korkea ilmentymisen

FGF9

oli huomattavasti lyhyempi eloonjääminen verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen

FGF9

lauseke (Fig. 7B,

p

= 0,008). Näimme samanlainen tulos, kun mukana potilaat, joilla on korkea ilmentymisen

FGFR3

ryhmässä (Fig. 7B,

p

= 0,006). Havaitut korrelaatio korkea ilmentymä

FGF9

ja lyhyt potilaan selviytymistä voi osoittaa toiminnallisia rooleja FGF9 kasvaimen etenemiseen.

Keskustelu

Täällä me sitoutui keskittynyt seulomaan geenit, joiden ilmentymistä tarvitaan ylläpitämään mesenkymaaliset, mahdollisesti metastaattisen fenotyypin SW480 paksusuolen syöpäsoluissa, ja eristyksissä useita ehdokkaita. Monet näistä geeneistä voidaan yhdistää suuren signalointireittien tai ovat sekaantuneet EMT ja syövän etenemiseen ennen. Löysimme HMG-box transkriptiotekijä-geenin

TCF7L1

(tunnetaan myös nimellä

TCF3

), joka voi lähettää Wnt /β-kateniinin signaalit [29]. Mielenkiintoista on, että niihin liittyvät transkriptiotekijän TCF7L2 (tunnetaan myös nimellä TCF4) tarvitaan lähettämään Wnt /β-kateniinin signaalin ja säilyttää kantasolujen suolessa [47], [48]. Perheenjäsenen

TCF7L1

on kuitenkin myös ilmaistu paksusuolen crypt ja paksusuolen syövän (Fig. S8). Tuloksemme siis viittaavat siihen, että

TCF7L1

voi olla vielä tunnistamaton rooli siirto kasvaimeen liittyvien β-kateniinin signaaleja.

Havaitsimme myös

PTCH

,

GLI2

ja

Gli3

, jotka koodaavat osia Hedgehog signalointireitin. Mahdollisia rooleja Hedgehog signaalien paksusuolensyöpä etenemisen ja etäpesäkkeiden ovat kiistanalaisia ​​[49], [50]. Tulokset myös näyttö tukee roolin Hedgehog-signaalien moduloinnissa soluadheesion paksusuolen syöpäsoluissa.

Yllättäen näytön tuotti myös kolme geeniä, jonka inaktivointi edistetään enemmän kara-muodossa fenotyypin. Kaksi näistä,

BICC1

ja

MAGI1

on osoitettu ennen vaaditaan kokoonpanoon E-kadheriinin välittämiä solun kiinnitysalueisiin [51], [52]. Havainto funktionaalisten roolien näiden geenien ylläpitämiseksi jäljellä solu-solu kontakteja tuumorisoluissa voivat viitata yleinen roolia näiden geenien säätelyyn soluadheesion kuin ennen.

FGF signaalit ovat sekaantuneet valvonnassa suoliston soluliikkuvuus ja paksusuolen syövän etenemisen ennen. Esimerkiksi FGF1 ja FGF2 on osoitettu edistävän kulkeutumista suolen epiteelisolujen [53], ja erityisiä isomuotoja FGFR3 voi välittää kasvua ja migraatiota koolonkarsinoomasoluissa [54]. Meidän näyttö tunnistimme

FGF9

geeninä osallisina säätelyyn paksusuolensyöpä soluadheesion. Käyttämällä pieni molekyyli-inhibiittorit ja aktiivisuusmääritysten keskeisten signaalimuuntajia, huomasimme, että MAPK Cascade ja Rho-GTPaasit ovat kriittisiä välittämiseen FGF signaaleja, jotka ohjaavat soluadheesiota ja potevilla koolonkarsinoomasoluissa, kun PI3K kaskadi ei ole. SW480 paksusuolen syövän solut sisältävät hyvin kuvattu sarja mutaatioita, kuten aktivoiva

KRAS

(G12V) mutaatio [55]. Tuloksemme siis merkitse sitä, että onkogeeninen mutaatiot KRAS eivät täysin irrottaa MAPK aktiivisuutta alkupään ärsykkeitä, mutta voi sen sijaan voimistaa RTK signaalitransduktion. Potilaiden, terapian menestys käyttäen VEGF ja EGF-reseptorin estäjät riippuu ratkaisevasti puuttuessa loppupään KRAS tai BRAF mutaatioita [25].

Viimeaikaiset malleja syövän etenemisen tarkoita hallitsemattoman aktivaation kehitys- signalointireittien ja alkion geeniekspression ohjelmia, jolloin koordinoitu menetykseen soluadheesion, voitto soluliikkuvuus ja hankinta kantasolujen piirteitä etäpesäkekasvainten soluissa [42], [43], [44]. Meidän näyttö tunnistaa useita kandidaattigeenejä että voisi olla rooli näissä prosesseissa.