Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on kaikkein tappava syöpäsairauksia suurella etäpesäke ja toistumisen korko. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että kasvaimet sisältävät osajoukon varren-, kuten syöpäsolut, joilla on tietyt kantasolujen ominaisuuksia. Tässä olemme käyttäneet Hoechst 33342 väriainetta ulosvirtauksen määritystä ja virtaussytometrialla eristää ja luonnehtia puolella väestöstä (SP) solut ihmisen keuhkosyövän solulinjassa NCI-H460 (H460). Osoitamme, että H460 SP solut satama varsi kaltaisia ​​soluja, koska ne voivat helposti muodostaa kiinnittymisestä riippumaton kelluva pallot, hallussaan suuri proliferaatiopotentiaali, ja osoittaa lisääntynyttä kasvainten muodostumiseen. Tärkeää on, että H460 SP solut pystyivät itse uudistaa sekä in vitro että in vivo. Lopuksi osoitamme, että H460 SP solut valikoivasti ilmaista ABCG2 sekä SMO, kriittinen välittäjänä Hedgehog (HH) signalointia, joka näyttää olevan tärkeä rooli H460 keuhkosyövän soluja sen tukos käyttäen Syklopamiini suuresti estää solusyklin etenemistä. Yhdessä tuloksemme Tuetaan edelleen olemassa keuhkosyövän kantasolujen ja myös sotkea HH signalointi säätelyssä suuria keuhkosyöpä (varsi) soluja.

Citation: Shi Y, Fu X, Hua Y, Han Y, Lu Y, Wang J (2012) Side Population in Human Lung Cancer Cell Line NCI-H460 rikastuu Stem-Like syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (3): e33358. doi: 10,1371 /journal.pone.0033358

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas M. D Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 syyskuu 2011; Hyväksytty: 07 helmikuu 2012; Julkaistu: 13 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Shi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Key hankerahastoon Shanghai Science and Technology Association, Kiina (Grant No.05119554). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

jo pitkään on ollut selvää, että useimmat kasvaimet ovat heterogeenisiä, joka sisältää spektrin fenotyyppisesti erilaisia ​​solutyyppejä. Työ viime vuosikymmenellä osoittaa, että eri ihmisten kiinteitä kasvaimia sisältävät myös toiminnallisesti toisistaan ​​poikkeavia kasvainsolujen osapopulaatioiden possesing korkea Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja voi liuottaa fenotyyppisiä ja histologinen heterogeenisuus vanhemman kasvain kun istutetaan immuunivajaisiin hiirillä. Tällainen osajoukot kasvainsolujen, jotka omistavat parannettu tuumorigeenisen kapasiteetin on toiminnallisesti kutsuttu kasvaimen aloittamista soluja tai syövän kantasoluja (CSC), joka on nyt todettu useimpien kiinteiden kasvainten [1], [2]. Useimmat CSCS on tunnistettu, rikastettu, ja puhdistettiin käyttäen joko solun pinnan markkeri (t), joista CD44 ja CD133 ovat suosituimpia, tai toiminnallisia määrityksiä, jotka ovat puolella väestöstä (SP) [3] – [6] ja Aldeflour määritykset [7], [8]. SP strategia kehitettiin alun perin rikastaa hematopoieettisia kantasoluja [3], ja se perustuu kykyyn kantasolujen, jotka yli-ilmentävät myrkkyjä solun pinnalla pumput ABCG2 ja MDR1 (eli P-glykoproteiini), tehokkaasti pumpata solun läpäisevä väriaine Hoechst 33342, ja näin ollen kahta aallonpituutta FACS juoni esittää kuin Hoechst-negatiivinen populaatio aiheesta ”puolella” (tai häntää). Aldeflour määritys, toisaalta, hyödyntää kantasolujen yli-ilmentävät myrkkyjä entsyymejä aldehydidehydrogenaasit (ALDH) [7], [8], ja siksi, CSC-rikastetun populaation voi tehokkaammin aineenvaihdunta kokeellinen ALDH alustan vapauttaa enemmän fluoroforin.

Keuhkosyöpä on kaikkein vaarallisin maligancy maailmassa. Työ aiemmin useita vuosia osoittaa, että sekä pienisoluinen (SCLC) ja ei-pienisoluisessa (NSCLC) keuhkosyövässä sisältävät varsi kaltainen syöpäsoluja [9] – [29]. Kuten useimmissa muissa kasvaimissa, ”keuhkojen CSCS ’on rikastunut, ja puhdistettiin käyttäen solupinnan CD44 tai CD133 tai käyttämällä kahta funktionaalisia määrityksiä edellä. Nämä keuhko CSCS on osoitettu olevan korkea klonaalisia, klonogeeniset, ja usein, Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja olevan yleisesti vastustuskykyisiä terapeuttisia hoitoja. Keuhkosyöpä kantasolut on raportoitu pitkäaikaista kulttuureissa sekä ksenografteissa ja ensisijainen potilaan kasvaimia. Kiinnostaa, tuore tutkimus käyttäen geneettistä hiiri malleja keuhkosyöpään osoittaa keuhkokasvaimia eri geneettinen tausta on erilaiset CSC fenotyypit [30], nostamalla mahdollisuus, että eri potilaiden keuhkojen kasvaimet voivat olla erilaisia ​​CSC fenotyyppejä. Vaikka SP tekniikkaa on käytetty osoittamaan CSCS useita keuhkosyövän solulinjat [10], [11], [13], [25], ei tiedetä, onko kaikki potilaan kasvain- keuhkosyövän solulinjat hallussaan SP, joka rikastuu varsi kaltaisia ​​syöpäsoluja. Täällä edelleen käsitellä tätä kysymystä käyttämällä ihmisen suuren cell suuri karsinooma linja NCI-H460 (H460) ja tuloksemme osoittavat, että H460 solut hallussaan SP, joka on rikastettu kasvaimen aloittamista soluihin.

Tulokset ja keskustelu

Viljellyt ihmisen keuhkosyövän solulinjassa NCI-H460 on SP

värjätään ensin H460-solujen Hoechst 33342, joka on aktiivisesti pursotetaan verapamiili herkkien ABC kuljettajat kantasoluja [3]. Kun havaitsimme värjätyt solut fluoresenssimikroskoopilla, että suurin osa ytimiä, kuten odotettua, ilmenivät sinisinä; kuitenkin pieni määrä ytimiä olivat negatiivisia Hoechst värjäytymistä (Fig. 1, A ja B, nuolet on Hoechst-negatiivinen solu). Sitten määrällisesti SP mukaan kahta aallonpituutta virtaussytometria [3] – [6], [10], [11], [13], [25]. Olemme havainneet, useita riippumattomia H460 kulttuureissa, SP 3,80 ± 0,5% (n = 9), kuten on esitetty kuviossa. 1C. Tärkeää on, että SP oli täysin eliminoitu läsnäollessa verapamiilin (Fig. 1 D), kalsium-salpaaja ja erityinen estäjä ABCG2 ja MDR1 käytettiin kliinisissä Keuhkosyövän hoidossa [31], mikä osoittaa spesifisyyden SP me havaittu H460-soluissa.

A-B, Hoechst värjäytymistä H460 soluja. Huomaa, että vaikka suurin osa soluista oli värjäytynyt tumassa, jotkut solut (merkitty nuolilla) ilmeisesti puuttui ydin- Hoechst värjäystä. C-D, SP fenotyyppejä puuttuessa (C) tai läsnä ollessa (D) Verapamiilin.

SP solut osoittavat suurta proliferaatiopotentiaali ja voi itse uudistaa

Tähän mennessä suurin kantasolujen kaltaisten solujen on osoitettu olevan kyky muodostaa vapaasti kelluva pallojen kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa [4] – [6], [10], [11], [13]. Lisäksi CSCS on raportoitu omaavan korkean proliferaatiopotentiaali. Sen määrittämiseksi, onko H460 SP solut ovat samanlaisia ​​CSC liittyviä ominaisuuksia, ensin viljelty puhdistettu SP ja ei-SP soluja seerumittomassa kunnossa (katso menetelmät). Havaitsimme, että H460 SP solut muodostivat tyypillinen kelluva aloilla, jonka hyötysuhde on 4,8 ± 0,1% (Kuva. 2A), kun taas ei-SP-soluissa enimmäkseen osoittivat kiinnittynyt kasvumalli (Fig. 2B), jossa paljon pienempi palloja muodostavan kapasiteetin (0,8 ± 0,3%). CCK-8 lisääntymiskokeen (katso menetelmä) paljasti myös suurempi proliferatiivinen potentiaali SP-soluissa verrattuna ei-SP-soluissa (kuvio. 2C). Kun ensisijainen SP-soluista peräisin palloja hajotettiin, ja siirrostettiin ne helposti muodostaa toissijaisen aloilla (tuloksia ei ole esitetty). Kun erottaa ensisijaisen SP aloilla viljeltiin täydellisessä väliaineessa, joka sisälsi naudan sikiön seerumia (FBS), yhden viikon, uuden SP-soluja (6,2 ± 0,8%) havaittiin useimpien solujen on ei-SP-solut (Fig. 3A). Jälleen SP fenotyyppi estyi täysin, kun läsnä oli verapamiilia (Fig. 3B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että SP-solut voivat itse uusia

in vitro

.

A-B, puhdistettu SP ja ei-SP-soluja viljeltiin seerumittomassa väliaineessa kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa. SP solut muodostivat tyypillinen kelluvat pallot 4 päivän sisällä (A), kun taas ei-SP-soluissa pääosin perustettu kiinnittynyt kasvu (B). C, SP solut näkyvät suurempi proliferatiivinen kyky kuin ei-SP-soluissa määritettynä CCK-8 Kit (

P

0,05 kaikkina ajankohtina, Student

t

-testi).

A-B, SP uudelleen analyysi, kun SP-aloilla olivat eriteltyjä ja erottaa soluja viljeltiin normaalissa seerumia sisältävää väliainetta yhden viikon ajan. C-D, SP uudelleen analyysi SP-soluista peräisin kasvaimia. E-F, SP uusi analyysi ei-SP-soluista peräisin kasvaimia. A, C, E, ilman verapamiili. B, D, F, verapamiilin kanssa.

H460 SP solut osoittavat korkeampi kasvainten muodostumiseen kuin vastaavat ei-SP-soluissa

Kultakanta analysoimiseksi CSC ominaisuuksien on suorittaa rajoittava laimennuksen kasvaimen siirron kokeet [1], [2] ja verrata tuumorigeenisyyteen yleisesti mitattuna kasvaimen esiintymistiheys, latenssi (eli välinen aika kasvainsolun istutuksen milloin kasvaimia voidaan ensin tunnustelemalla), kasvuvauhti (eli kasvaimen tilavuus), ja päätepisteen kasvaimen painoa. Olemme puhdistettiin H460 SP ja ei-SP-soluissa ja injektoidaan yhä useammat solut Matrigel ihon alle (s.c.) oli liikalihava diabeettinen /vaikea sekamuotoinen immuunivajavuus (NOD /SCID) hiiriä (Kuva. 4A). Olemme havainneet, että SP-solut osoittivat kokonaisuutena korkeampi tuumorigeenisyyden kuin ei-SP-soluissa. Esimerkiksi SP solut regeneroidaan kasvaimia alhaisin solujen määrä (eli 5000) implantoitiin ottaa huomioon, että ei-SP-solut eivät uusiutumaan yhtään kasvainta tähän soluun annoksella (Fig. 4A). SP solut regeneroidaan 6/6 kasvaimia (eli 100%), kun taas ei-SP-soluissa johti 4/6 kasvaimia (67%;

P

= 0,039, Chi-Square testit). Lisäksi SP solut olevien kasvainten lyhyemmällä viiveellä kuin vastaava ei-SP-solut (Fig. 4A;

P

= 0,007). Lisäksi H460 SP-soluista peräisin kasvaimet kasvoivat nopeammin johtaa paljon suurempia kasvaimia kuin ei-SP-soluissa tuotettu kasvaimia (Fig. 4A-C;

P

0,01). Histologisesti, regeneroidun ksenograftikasvaimissa oli morfologiset ominaisuudet suurten keuhkosyöpä. Erityisesti SP tuumorit runsaasti solujen ja mitoottisten, ja se osoitti selvää kapselisakkaridi invaasiota (Fig. 4D, vasemmalla). Sen sijaan ei-SP kasvaimia esiintyi enemmän nekroottinen alueilla (Fig. 4D, oikealla).

A, taulukko esitys Tuumorigeenisuustutkimuksissa H460 SP ja ei-SP-soluissa. Kolme parametrit kasvaimien eli kasvaimen esiintymistiheys, latenssi, ja volyymi (*

P

0,01) on esitetty. Kaikki eläimet lopetettiin (termi.) 28 päivää istutuksen jälkeen. B, SP solut regeneroidaan suurempi kasvaimia kuin vastaavat ei-SP solujen jokaisen solun annoksella. C, Gross kasvain kuvia, kun kasvaimet kerättiin päivänä 28 jälkeen s.c. injektio SP ja ei-SP-soluja NOD /SCID-hiiriin. D, edustaja HE-värjätään fotomikrograafeja SP ja ei-SP kasvaimia.

Se oli yllättävä ja mahdollisesti mielenkiintoista, että ei-SP soluja, 50.000 ja 100.000, myös regeneroitu kasvaimet vaikka kasvaimet olivat pienempiä (Fig. 4B-C). Koska ei-SP-solut eivät muodostaneet kasvaimia 5000-soluissa (kuvio. 4A), helpoin selitys olisi, että ei-SP solupopulaatio voi olla kontaminoitunut pienellä määrällä SP-solujen, jotka aiheuttavat kasvaimia, kun suuria määriä kuin SP soluja istutettiin. Vaihtoehtoisesti ei-SP solut voisivat ”de-erilaistua” takaisin SP soluja alhaisella nopeudella, että in vivo joissakin ei-SP solut muutettiin SP soluja, jotka sitten johtivat kasvaimia. Tämä jälkimmäinen skenaario äskettäin osoitettiin muiden useissa viljellyissä kasvainsolun järjestelmiä [32]. Alkaa tutkia näitä eri mahdollisuuksia, olemme analysoineet SP koostumus sekä SP ja ei-SP-soluissa tuotettu H460 kasvaimia. Havaitsimme, että SP kasvaimia sisälsi 8,4 ± 0,6% SP-soluissa (kuvio. 3C-D), kun taas ei-SP kasvaimia sisälsi 1,4 ± 0,2% SP-soluissa (kuvio. 3E-F). Vaikka nämä tulokset eivät voi varmasti erottaa saastuminen muuntaminen, he tarjoavat selityksen, miksi ei-SP-soluissa edelleen aiheutti kasvaimia – se johtui siitä, että ei-SP kasvaimet sisälsivät SP-soluissa.

Euroopan kantasolu markkereita ABCG2 ja SMO ovat erittäin ilmaistu SP-soluissa

SP fenotyypin Veren kantasolut välittyy pääasiassa ABCG2 joidenkin osallistuminen MDR1 tai monilääkeaineresistenssi proteiini 1 [31]. Monet CSC-rikastettu SP: n yli-ilmentävät ABCG2 [4], [6]. Siksi analysoitiin ABCG2 mRNA-tasoja ja havaittiin, että verrattuna tavalliseen FBS viljeltiin yksisolukerroksen H460-solut (Fig. 5A, kaista 1), sekä aloilla (Fig. 5A, kaista 2) ja puhdistettua SP-solut (Fig. 5A, kaista 3) ilmaisi huomattavasti ABCG2 mRNA taas puhdistettu ei-SP H460-solujen käytännössä puuttui ABCG2 lauseke (Fig. 5A, kaista 4). Samoin SP kasvaimet (Fig. 5A, kaista 7) ilmaisi myös suurempia ABCG2 kuin vastaava ei-SP kasvaimia (Fig. 5A, kaista 8). Kvantitatiivinen esitys on esitetty kuviossa. 5B.

, edustaja RT-PCR geeli kuvia. M, merkki; kaista 1, NCI-H460-soluissa normaalisti viljeltiin seerumia sisältävässä väliaineessa; kaista 2, H460 aloilla; kaista 3, puhdistettu SP solut; kaista 4, puhdistettu ei-SP-soluissa; kaista 5 Tomatidine kontrolliryhmä; kaista 6, syklopamiiniin koeryhmä; kaista 7, SP kasvaimet; kaista 8, ei-SP kasvaimia. B, kvantitatiivinen esittely ABCG2 ja SMO mRNA-tasot määritettynä densitometrillä (

P

0,001, paitsi ABCG2 mRNA kaista 6 vs. kaista 8 ja SMO mRNA kaista 1 vs. kaista 5 ja kaista 4 vs. kaista 6).

Kasvaimia synnyttävä keuhkosyövän soluja, mukaan lukien SP-solujen on osoitettu ensisijaisesti ilmaista itseuudistumisen molekyylit, kuten Oct-4, Nanog, Bmi-1, ja c-Kit: [14], [ ,,,0],16], [17], [22], [29], Notch signalointi komponentit [18], [28], ja Wnt /β-kateniinin [23]. Kehittyvät viittaavat siihen, että Hedgehog (HH) signalointireitin voi myös olla kiinteästi mukana keuhkosyövän kehittymisessä ja etenemisessä [33], [34]. Aktivointi HH signalointi vaatii transmembraaniproteiini smoothened (SMO) kriittisenä välittäjänä HH signaloinnin [35] ja ABCG2 voi toimia alkupään sääntelyä Hh-signalointireitin suojella stemness SP osaston [36]. Siksi määritettiin mRNA- tasoja SMO samassa joukko näytteitä, jotka käytettiin ABCG2 analyysiä. Silmiinpistävän, hyvin paljon ABCG2, SMO mRNA-tasot olivat merkittävästi koholla H460 aloilla, SP-soluja, ja SP-soluista peräisin kasvaimia (Fig. 5A-B). Tietääksemme tämä havainto voi edustaa aivan ensimmäinen yhdistää SMO yli-ilmentymisen CSC rikastettua keuhko- syöpäsoluja.

SMO estäjä Syklopamiini estää H460 soluproliferaatiota

HH signalointireitille on liitetty ylläpito kantasolut tai esi monissa aikuisen kudoksissa. Tämä polku säätelee solujen lisääntymistä, kudosten napaisuus, ja solujen erilaistumista normaalin kehityksen. Tärkeää on, epänormaali HH reitin aktivointi, kuten korkean tason SMO ilmaisun, voi olla rooli ylläpitämistä kapasiteetin kasvain kantasolujen, suosimalla itseuudistumiseen, ja lisääntyminen niiden jälkeläisten [36], [37]. Sen määrittämiseksi, ovatko HH signalointi on rooli H460-soluissa, käytimme Syklopamiini, steroidista alkaloidi, joka estää SMO aktiivisuutta. Kontrollina Syklopamiini käytimme rakenteellisesti alkaloidi, Tomatidine, joka ei vaikuta SMO toimintaa ja HH signalointi. Verrattuna Tomatidine, Syklopamiini näytti vähentävän alhainen endogeenisten tasojen SMO mRNA: ta (Fig. 5A, kaistat 5 ja 6). Verrattuna vehikkelikontrolliin ja Tomatidine ryhmä, Syklopamiini annoksesta ja ajasta riippuvalla inhiboi kasvua H460-soluja, kun sitä käytetään 2-40 umol /l (Fig. 6A-E). Solusyklin analyysi osoitti, että Syklopamiini, 20 umol /L, aikariippuvainen aiheutti H460 soluja pidättämään G1 /S-vaiheen solusyklin (Fig. 6F). Erityisesti syklopamiinihoidon lisäsi G1 solut ~71% 24 h ~93% 96 h, kun taas vähentynyt S-vaiheessa olevien solujen 18%: iin 24 tuntia 2% 96 h (Fig. 6F). 96 h, hieman lisääntynyt apoptoosi (eli ~ 2%) havaittiin myös (Fig. 6F). On syytä huomata, että sekä ajoneuvon ja Tomatidine kontrolliryhmien osoitti myös ajasta riippuva nousu G1-vaiheessa olevien solujen, ja aika liittyvän vähentyneen S-vaiheessa olevien solujen (Fig. 6F), mikä johtuu todennäköisesti siitä, että kaikki solut viljeltiin enintään 96 h ilman täydennystä media. Siten sammuminen kasvutekijöiden ja ravinteiden aiheuttama osittainen solusyklin pysähtymisen kontrolliryhmiin. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että HH signalointi on elintärkeä H460-soluissa ja saarto HH signaloinnin dramaattisesti aiheuttaa solusyklin pidätyksen. Koska SMO ilmentyy edullisesti CSC-rikastettua SP ja aloilla (Fig. 5), me otaksua, että HH signalointi asettaa sen vaikutukset todennäköisesti keuhkojen CSCS.

A-C, edustaja fotomikrograafeja H460 soluja 72 h käsittelyn jälkeen ajoneuvon ohjaus (A), Tomatidine (B), tai Syklopamiini (C). Alkuperäinen maginifications: × 200. D, Syklopamiini annosriippuvaisesti esti H460 solujen lisääntymistä (

P

0,05, yksisuuntainen ANOVA). E, ajan kuluessa Syklopamiini inhibition H460-soluja (

P

0,05, yksisuuntainen ANOVA). Syklopamiinia käytettiin 20 umol /l. F, vaikutukset Syklopamiini on solusyklin H460-soluissa.

Yhteenvetona, tässä tutkimuksessa esitämme näyttöä siitä, että H460 ihmisen suuren keuhkosyövän solulinjassa sisältää havaittavissa SP. Lisäksi osoitamme, että H460 SP solut satama varsi kaltaisia ​​soluja, koska ne voivat helposti muodostaa kiinnittymisestä riippumaton kelluva pallot, hallussaan suuri proliferaatiopotentiaali, ja osoittaa parantunutta kasvaimen uudistava kapasiteettia. Tärkeää on, että H460 SP solut näyttävät pystyä itse uudistaa in vitro (osoituksena jatkomaljausta pallo solujen tavanomaisessa viljelyväliaineessa, Fig. 3A) ja in vivo (osoituksena SP kasvaimet sisältää pienen prosenttiosuuden SP solujen enemmistön on ei-SP-soluissa, Fig. 3C). Lopuksi osoitamme, että H460 SP solut valikoivasti ilmaista ABCG2 sekä SMO, kriittinen välittäjänä HH signaloinnin, joka näyttää olevan tärkeä rooli H460 keuhkosyövän soluja sen tukos käyttäen Syklopamiini suuresti estää solusyklin etenemisen. Yhdessä tuloksemme tukevat edelleen läsnäolo varren kaltaisten syöpäsoluja viljellyissä keuhkosyövän solulinjoja ja myös sotkea HH signalointi säätelyssä suuria keuhkosyöpä (varsi) soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki kokeet tehtiin mukaan Institutional eettiset ohjeet. Kaikki eläimiin liittyviä tutkimuksia hyväksynyt Tongji yliopiston Institutional IACUC komitea. NOD /SCID-hiirten (Luvan numero: SYXK20070005) at SPF tasolla käytettiin kasvainsolujen istutuksen kokeiluja tässä tutkimuksessa. Kaikki muut tutkimukset tässä esitettyjen oli tutkijan käynnistämän eikä vaadi hyväksyntää muiden sääntelyelinten.

Solulinjat ja eläimet

Ihmisen suuren keuhkosyövän solulinjaa NCI-H460 oli ostettu Shanghai Institutes for Biological Sciences, CAS (Shanghai, Kiina) ja ylläpidettiin alustassa suosittelemia ATCC. Kaikki alustat täydennettiin 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Invitrogen-Life Technologies). Soluja inkuboitiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa mukana 5% CO 2. Soluja ylläpidettiin rutiinisti 75-cm

2 kudosviljelypulloihin (Corning Incorporated, USA) ja kerättiin käyttäen 0,25% trypsiiniä, kun he olivat logaritmisessa kasvuvaiheessa SP analyysiä. Liikalihava diabeettinen /sekamuotoinen immuunipuutos (NOD /SCID) hiiriä ostettiin Shanghai SLAC Laboratory Animal Co Ltd

SP analyysi

perus- protokolla perustui Goodell et al [3 ]. Lyhyesti, NCI-H460 Solut suspendoitiin uudelleen 1 x 10

6 /ml esilämmitettyä DMEM (Invitrogen-Life Technologies). Hoechst 33342 väriaine lisättiin lopulliseen konsentraatioon 5 ug /ml läsnä tai poissa ollessa verepamil (50 umol /l, Sigma), ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 90 minuutin ajan ajoittain ravistellen. Lopussa Inkuboinnin jälkeen solut pestiin jääkylmällä HBSS (Invitrogen-Life Technologies), sentrifugoitiin alas 4 ° C: ssa, ja suspendoitiin uudelleen jääkylmään HBSS. Propidiumjodidia (Sigma) lopulliseen konsentraatioon 2 ug /ml lisättiin soluihin portille elinkelpoisia soluja. Solun valmisteet suodatettiin 40 um: n solusiivilän, jolloin saatiin yksisolususpensio. Virtaussytometriset analyysit ja lajittelu suoritettiin Fluorescence soluerottelijaa (FACS, Beckman Coulter Eepokset Altra).

Kasvain soluistutusryhmä kokeita

FACS-puhdistettu SP ja ei-SP H460 soluja mixted kanssa Matrigel (Becton Dickinson), ja sen jälkeen ihon alle (sc) ruiskutetaan NOD /SCID-hiiriin. Hiiriryhmät inokuloitiin SP-soluja tai ei-SP-soluja 5 x 10

3, 5 x 10

4 ja 1 x 10

5, vastaavasti. Kasvaimen kasvua seurattiin viikoittain ja yksittäisten kasvainten tilavuudet mitattiin käyttämällä digitaalista paksuuden ja arvioida kaavalla V = 1 /2AB

2 (a ollessa pitkä halkaisija ja b lyhyt halkaisija kasvaimen). Lopussa kokeissa, hiiret tapettiin 4 viikkoa ja kasvaimet kerättiin, mitataan, ja valokuvattiin. Sisäelinten kuten keuhkojen ja maksan huolellisesti havaittiin etäpesäkkeitä kyhmyt ja tuumorisektioiden tutkivat mikroskoopilla. Lopuksi, kasvaimet pilkottiin myös tehdä yhden solususpension SP uudelleen analyysiä.

Sphere muodostumisen määritykset seerumittomassa viljelmistä

SP ja ei-SP-soluja viljeltiin serum- vapaa DMEM-F12 (Invitrogen-Life Technologies), jota oli täydennetty 20 ng /ml epidermaalinen kasvutekijä (EGF), 10 ng /ml emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF), 5 ug /ml insuliinia (kaikki Sigmalta). Solut (1000 /kuoppa) maljattiin 96-kuoppaisille viljelylevyille 200 ui elatusainetta ja 20 ui elatusainetta kuoppaa kohti lisättiin 2 päivän välein. Pallojen lukumäärä (Φ 150 pm) kunkin hyvin arvioitiin 5 päivän viljelyn.

RT-PCR-analyysi

Solut kerättiin ja uutettiin kokonais-RNA ja valmis RT- PCR käyttämällä PrimeScript ™ RT-PCR Kit (Takara, Kioto, Japani). Syklin parametrit ABCG2, SMO, ja GAPDH cDNA: t olivat 30 sekuntia 94 ° C: ssa, 30 s 58 ° C: ssa (ABCG2 ja GAPDH) tai 55 ° C: ssa (SMO), ja 45 sekuntia 72 ° C: ssa 35 sykliä, vastaavasti. Alukkeet RT-PCR olivat seuraavat: ABCG2 (F) 5′-CACCTTATTGGCCTCAGGAA-3 ’, ABCG2 (R) 5′-CCTGCTTGGAAGGCTCTATG-3′, SMO (F) 5’-TTACCTTCAGCTGCCACTTCTACG-3 ’, SMO (R) 5’-GCCTTGGCAATCATCTTGCTCTTC-3 ’, GAPDH (F) 5′-ACGACCACTTTGTCAAGCTC-3′, ja GAPDH (R) 5’-GGTCTACATGGCAACTGTGA-3 ’.

soluproleferaatiomäärityksessä

Solujen proliferaatio määritykset suoritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japani). Solut maljattiin 96-kuoppalevyille 5 x 10

4 solua per kuoppa ja viljeltiin kasvualustassa. Syklopamiinia ja Tomatidine (kaikki Sigmalta), lisättiin vastaavasti pitoisuutena 20 umol /l, ja sopivassa kasvatusväliaineessa lisättiin kontrollinäytteestä. CCK-8, lisättiin kuhunkin kuoppaan 24, 48, 72 ja 96 h, ja sen jälkeen, kun ylimääräinen 4-h viljelyn jälkeen kunkin kuopan absorbanssi määritettiin ja kasvu-käyrä piirrettiin. Solu- syklin profiilit analysoitiin virtaussytometrialla.

Tilastollinen analyysi

Data olivat yleensä esitetään keskiarvona ± SD ja tilastollisia eroja koeryhmien välillä analysoitiin Studentin

t-

testi, yksisuuntainen ANOVA, tai lineaarinen regressio tilastollisin ohjelmistoja SPSS11.5 ja luonteen mukaan tietojen analysoitu.

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä kaikissa tapauksissa.

Kiitokset

Olemme kiitollisia Dr. Guoping Zhang (alkaen Institutes of Biomedical Sciences, Fudanin yliopiston, Shanghai, Kiina) apua virtaussytometrialla mittauksiin.