Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suurin osa munuaiskarsinoomia (RCC) on tunnusomaista lakkaa toimimasta tuumorisuppressorigeenin von Hippel Lindaun (VHL), joka toimii ubikitiinipromoottori ligaasilla varten hypoksia-indusoituvaa tekijä-1α ( HIF-1α). Koska VHL, HIF-1α proteiini vakiintuu ja vaikuttavan kasvainten kehittymiseen. Viimeaikaiset tiedot osoittavat antituumorivaikutuksen tehosta VHL promoottorin RCC soluissa. Tämä tutkimus osoittaa, että N-Myc alavirtaan säädelty geeni 2 (NDRG2) on potentiaalinen säätelijä VHL. NDRG2 on mukana leviämisen ja invaasion syöpäsolujen lisäksi se on usein säädellä vähentävästi munuaissyöpä. Tässä arvioimme vaikutus NDRG2 ilmentymisen vaikutus proliferaatioon ja invaasio ihmisen munuaisten syöpäsoluja. Ihmisen munuaissyövän solulinjaa 786-O ja A498 infektoitiin Ad-NDRG2 tai Ad-LacZ. Yliekspressio NDRG2 ei ainoastaan ​​inhiboi solujen kasvua, mutta myös tukahdutti hyökkäystä. Lisäksi tutkimus osoitti, että tuumorisuppressorigeeniä VHL oli säädelty, kun taas transkriptiotekijä HIF-1a ja endoteelikasvutekijä (VEGF) on säädellä vähentävästi 786-O-solujen tartunnan Ad-NDRG2. Lopuksi, nude-hiirimallissa, kasvaimeen injektioita Ad-NDRG2 joka 3 päivä yhteensä seitsemän kertaa inhiboi merkittävästi kasvua ja angiogeneesiä Ksenosiirretyn 786-O kasvaimia. Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että NDRG2 voi olla osallisena leviämisen ja invaasion vaikuttamalla ilmaus VHL ja HIF-1α. NDRG2 voi olla houkutteleva terapeuttinen kohde munuaissyövän.

Citation: Gao L, Wu G-j, Liu B, Shen M-z, Pan-T-j, Yu C-g, et ai. (2013) Up-asetus pVHL yhdessä Down-asetus HIF-1α by NDRG2 Expression vaimentaa leviämisen ja invaasion in munuaissyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (12): e84127. doi: 10,1371 /journal.pone.0084127

Editor: Georgios Gakis, Eberhard-Karls University, Saksa

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 12 marraskuu 2013; Julkaistu: 20 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Gao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoitus National Natural Science Foundation of China (nro 81230043 ja nro 81272812) ja Kiinan National Key Basic Research Development Program (2009CB521704). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munuaissolukarsinooma (RCC) on kärjessä 10 yleisimpiä syöpäsairauksia sekä miehillä että naisilla [1]. RCC käsittää histologisesti monipuolinen joukko kiinteitä kasvaimia, jotka johtuvat eri osat munuaisen [2]. Valtaosa RCC ovat selkeitä solun munuaiskarsinoomia (CCRCCs), tunnettu lakkaa toimimasta tuumorisuppressorigeenin von Hippel Lindaun (VHL). Viat VHL-geenin ovat yleisin syy familiaalinen CCRCC, ja yli 80%: lla satunnaisia ​​CCRCC on aktiivinen VHL-geenin tai tappio VHL-geenin [3].

VHL on klassinen huoltaja estämällä munuaisten kasvain aloittamista [4-6]. Proteiini VHL koodaama VHL-geeni, on osa E3-ubikitiinipromoottori ligaasit kompleksi, joka sisältää elongin-B, elongin-C, ja Cullin-2 [7,8]. Niistä hyvin dokumentoitu substraatit pVHL on hypoksia-indusoituva tekijä (HIF-1α), joka on transkriptiotekijä, joka ohjaa ilmentymistä hypoksian indusoiman tekijät, kuten pyruvaattidehydrogenaasikinaasi (PDK) -1, endoteelikasvutekijä (VEGF) ja niin edelleen [9,10]. Nämä kohdegeenien olla vaikutusta energia-aineenvaihduntaan, solujen lisääntymisen ja etäpesäkkeiden CCRCC [11]. Normaaleissa happi, HIF-1α sitoo pVHL kautta hydoksyloituneena proliinijäännösten ja on polyubiquitinated mukaan pVHL, joka lopulta johtaa hajoamisen HIF-1α kautta proteasomin. Aikana hypoksia, HIF-1α ei hydroksyloitu ja pakenee pVHL välittämän hajoamisen. Labiilin HIF-1α sitten muodostaa toiminnallisen transkriptiotekijän liittämällä kanssa konstitutiivisesti HIF-1β alayksikön [12]. Yhdessä tämä monimutkainen sitoutuu DNA: han kuviot kutsutaan hypoksiavaste elementtejä säätelemään useita osallistuvia geenejä solujen lisääntymisen, etäpesäke ja angiogeneesiä. Siksi edistämällä hajoaminen HIF-1α, pVHL voi estää HIF-1α stimuloi transkription ja mikä on keskeinen tuumorisuppressoriproteiinia [13]. pVHL menetys on yleinen tapahtuma CCRCC, mikä HIF-1α vakauttamisen ja säätely ylöspäin sen kohdegeenien. On osoitettu, että VEGF ilmentyminen on usein koholla yhdessä HIF-1α säätelyyn ylöspäin monissa ihmisen syövissä [14]. Aikaisempi tutkimus osoitti, että pVHL voi parantaa ilmentymistä ja toimintaa toinen tunnettu tuumorisuppressorin, p53 [14]. Kuitenkin miten pVHL itse säätelee on harvoin raportoitu. Viimeaikaiset tiedot ovat osoittaneet antituumorivaikutuksen tehosta pVHL promoottorin RCC [15].

N-myc Loppupään Säännellyt Gene 2 (NDRG2), on jäsen NDRG perhe, on hiljattain havaittu kasvaimia estävä. On raportoitu, että NDRG2 ilmentyminen säädeltiin eri karsinoomat, mukaan lukien maksa, haimasyöpä, meningiooma ja eturauhassyöpää. Tutkimukset meidän lab ja muut ovat osoittaneet, että NDRG2 on mukana solujen jakautumisen, apoptoosin, erilaistumista ja stressin vastaus [16-21]. Huomattavaa on, että edellisessä tutkimuksessa hiljaista että NDRG2 voimistunut ilmaisuja p53 ja pVHL samalla alas-säätelee ilmaisuja VEGF ja HIF-1α rintasyövän solulinjoissa [22]. Äskettäin on raportoitu, että NDRG2 on vaimentua on CCRCC kudoksissa verrattuna viereiseen ei-neoplastisia kudoksia [23]. Lisäksi pakko ilmaus NDRG2 estää niiden kasvun selvä munuaissyöpää (CCRCC) solulinjojen ja indusoi solujen apoptoosia [24]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että NDRG2 on tärkeä rooli syövän synnyssä ja CCRCC. Kuitenkin tarkka rooli NDRG2 in CCRCC ei täysin ymmärretä.

Tässä tutkimuksessa yritimme tutkia, onko sääntely suhde NDRG2 ja pVHL. Ensin tarkasteltiin ilmentymisen korrelaatio NDRG2 ja pVHL kasvaimen kudokset CCRCC potilaista. Sitten suoritimme

in vitro

ja

in vivo

kokeita vaikutuksen tutkimiseksi NDRG2 ilmentymisen vaikutus solujen käyttäytymiseen, sekä ilmaus pVHL ja sen loppupään -efektiboksejamme HIF-1α ja VEGF .

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Ihmisen näytteet saatiin kaikilta potilailta, joilla kirjallinen lupa. Molemmat kirjallinen suostumus ja tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board on Xijing sairaalan, neljäs Military Medical University. Käytetyt hiiret tässä tutkimuksessa saatiin neljännen Military Medical University ja pidettiin patogeenivapaissa olosuhteissa. Kaikki toimenpiteet tehtiin protokollien mukaisesti hyväksymän Institutional Review Board on Xijing sairaalan, neljäs Military Medical University ja sopeutui NIH suuntaviivat eettisistä eläinten käyttöä.

Tissue keräys ja immunohistokemia

yhteensä 130 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut näytteet ensisijaisen selkeä cell munuaissolukarsinooma ja niiden viereisten normaalin munuaiskudokset kerättiin patologian osaston of Xijing Hospital, Xi’an, Kiina. Kaikki näytteet saatiin potilailta, jotka antoivat tietoisen suostumuksen käyttää ylimääräinen patologiset näytteet tutkimustarkoituksiin. Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Käyttö ihmisen kudosten tässä tutkimuksessa hyväksyi Institutional Review Board neljännen Military Medical University ja suoritettiin kansainvälisten ohjeiden mukaisesti käyttöön ihmisen kudoksissa. Anti-NDRG2 (1: 500 laimennos) vasta-aineet hankittiin BD Corporation (BD, NY, USA). Anti-HIF-1α (1: 500 laimennus) ja anti-VEGF (1: 1000 laimennos) vasta-aineet olivat Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-VHL-vasta-aine (1: 500 laimennus) oli peräisin Neomarkers Corporation (Taipei, Kiina). Anti-β-aktiini-vasta-ainetta (1: 2000 laimennos) oli Sigmalta (Sigma, USA). Immunohistokemia kit ostettiin Boster Company (Wuhan, CHN).

immunohistokemia värjäys suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Voimakkuutta ja laajuus immunologinen värjäys analysoitiin semikvantitatiivisesti. Jaksoon, joissa merkintää tai joilla on vähemmän kuin 5% leimattuja soluja pisteytettiin 0 Leikkeet sijoitettiin kuin 1, jos 5-25% soluista leimattiin, kuten 2, jos 25-50% soluista leimattiin, ja sen 3 jos 50-75% solut leimattiin. Lopuksi, merkitseminen ≥75% soluista pisteytettiin kuin 4. värjäytymisen intensiteetti pisteytettiin vastaavasti 0 käytetään negatiivista värjäystä, 1 heikosti positiivinen, 2 kohtalaisen positiivisia ja 3 voimakkaasti positiivinen. Peli varten positiivisten solujen prosenttiosuuden ja värjäytymisintensiteettiä kerrottiin tuottamaan immunoreaktiivisia pisteet kullekin näytteelle. Tuote määrän ja intensiteetin tulokset laskettiin niin, että lopullinen pistemäärä 0 ilmoitettu mitään ilmaisua, 1-4 osoitti heikko ilmaisu, 5-8 merkitty maltillinen ilme ja 9-12 osoitti vahvaa ilmaisua. Kuvat kerättiin valomikroskoopilla (Olympus, Japani).

Solulinjat ja reagenssit

Ihmisen munuaissyövän solulinjat 786-O ja A498 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, USA). Solulinjoja ylläpidettiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Sillä hypoksia hoito, soluja viljeltiin hypoksisissa olosuhteissa (1% O

2, 5% CO

2 ja 94% N

2) ja talteen 24 tuntia infektion jälkeen.

Cell kasvun määrityksessä

solut (5 x 10

3 solua per kuoppa) kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaisilla levyillä. Poistamisen jälkeen medium, 40 MOI adenovirusta, joka ekspressoi NDRG2 [24] tai negatiivinen kontrolli LacZ (Ad-LacZ), lisättiin seerumittomassa RPMI 1640, inkuboitiin 2 h, korvattiin tuoreella RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää. Levyjä inkuboitiin sitten 0, 24, 48, ja 72 h. Määrä elinkelpoisia soluja, määritettiin käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) ja lukemalla absorbanssi 490 nm: ssä. Tiedot ovat keskiarvo ± keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Muuttoliike ja invaasio määritykset

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset tehtiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [15]. Invaasiomääritys kanssa Matrigel päällystetty kalvo ja migraatiokokeessa kanssa Matrigel-päällystämättömän kalvon suoritettiin käyttäen 24-kuoppaista kammio järjestelmä (BD Biosciences, Bedford, MA), mukaan valmistajan ohjeiden. Solut trypsinoitiin ja ympättiin ylemmässä kammiossa 2,5 x 10

5 solua /kuoppa seerumia. Vektori kuljettaa LacZ tai NDRG2, on infektiokertoimella (MOI) 40, lisättiin välittömästi solujen maljauksen jälkeen. Medium oli täydennetty 5% FBS: ää (käytetään kemiallis-houkutin) on sijoitettu pohjalle hyvin. Inkubointi suoritettiin 24 tuntia 37 ° C: ssa kostutetussa ilmassa 5% CO

2 ilmakehässä. Solujen annettiin siirtyä huokoisen, Matrigel-päällystetty tai päällystämätön membraani (BD Biosciences). Inkuboinnin jälkeen kammiot poistettiin, ja tunkeutuvat solut pohjassa membraanin kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin Gimsa. Lukumäärä hyökkääviä soluja tai vaeltavien solut määritettiin laskemalla viiden suuritehoisia kentät (x 400) jokaiseen kalvoon ja laskettu keskiarvona solujen lukumäärä näkökenttää kohti. Tiedot ovat keskiarvo ± keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Western blotting -analyysi

Solut (5 x 10

5 solua kuoppaa kohti) kolmena rinnakkaisena 24-kuoppalevyillä . Poistamisen jälkeen medium, 40 MOI Ad-NDRG2 tai Ad-LacZ lisättiin seerumittomassa RPMI 1640, inkuboitiin 2 h, korvattiin tuoreella RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää. Sen jälkeen, kun viljellään 24 tuntia, solut pestiin kylmällä PBS: llä ja välittömästi lyysattiin lyysipuskurissa [1% Triton X-100150 mmol /L NaCl, 100 mmol /l KCI: a, 20 mmol /L HEPES, 10 mmol /l EDTA, 1 mmol /l natriumortovanadaattia, 10 ug /ml aprotiniinia, 10 ug /ml leupeptiiniä ja 1 umol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia] jäällä. Western blotting-analyysi suoritettiin standardin protokollan nitroselluloosakalvoil- (Bio-Rad). Immunoblottausta, membraaneja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa, mitä seurasi 2 tunnin inkuboinnin 1: 2000 laimennos piparjuuriperoksidaasiin (HRP) -sidoksellisia sekundaarisella vasta-aineella. Lopuksi immunoreaktiivisia proteiineja havaittiin kemiluminesenssidetektiojärjestelmää.

immunofluoresenssimäärityksellä

786-O-solut ympättiin lasipeitinlevyille. Poistamisen jälkeen medium, 40 MOI Ad-NDRG2 tai Ad-LacZ lisättiin seerumittomassa RPMI 1640, inkuboitiin 2 h, korvattiin tuoreella RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää. Levyjä inkuboitiin sitten edellä kuvatulla tavalla 24 tuntia. Läpäiseväksi tekemisen jälkeen (0,5% Triton X-100), kiinnitys (4% formaldehydiä), ja estää (10% normaalia vuohen seerumia ja 0,5% Triton X-100), hiiren anti NDRG2, VHL, HIF-1α: n ja VEGF monoklonaalinen vasta-aine oli lisätään soluja yön yli 4 ° C: seen. Sitten solut värjättiin FITC-konjugoidulla tai Cy3-konjugoitu vuohen anti-hiiri-polyklonaalista vasta-ainetta 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan pimeässä. Fluoresenssin värjäytymisen intensiteetti tutkittiin sitten immunofluoresenssimikroskopialla.

ELISA

Solut (5 x 10

5 solua kuoppaa kohti) kolmena rinnakkaisena 24-kuoppaisilla levyillä. Poistamisen jälkeen medium, 40 MOI Ad-NDRG2 tai Ad-LacZ lisättiin seerumittomassa RPMI 1640, inkuboitiin 2 h, korvattiin tuoreella RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää. Esikäsitelty väliaine on 24 soluviljelmien analysoitiin VEGF käyttämällä kaupallisia sandwich ELISA (Endogen, Woburn, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kukin näyte testattiin kahtena kappaleena. Tiedot ilmaistiin VEGF (pg /ml).

Kasvunestymistutkimus määritykset

in vivo

Kuusi viikkoa vanhoja BALB /C kateenkorvattomissa (nu /nu) hiirten toimittivat Experimental Animal Center of neljännen Military Medical University (Xi’an, Kiina). Kaikki protokollat ​​hyväksyttiin eläinten hoidon ja käytön komitea neljännessä Military Medical University ja tehtiin noudattaen eläinten hoito sääntöjen esitetty yliopiston (Luvan numero: 10001). Kaikki pyrittiin vähentämään käytettyjen eläinten määrää ja minimoida niiden kärsimyksiä. 786-O-solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen steriiliin PBS: ään. 786-O-solut (5 x 10

6 solua) 0,2 ml injektoitiin subkutaanisesti vasemman kyljet 6 viikon ikäisiä nude-hiirissä. Kun keskimääräinen kasvaimien koko oli 200 mm

3, kaikki hiiret jaettiin kolmeen ryhmään satunnaisesti (Ad-NDRG2, Ad-LacZ ja PBS Kontrolliryhmät, n = 10 per ryhmä). Kasvaimensisäistä injektiot adenovirus (1 x 10

9 pfu 100 ul PBS) tehtiin joka 3 d yhteensä seitsemän kertaa. Kasvaintilavuudet lasketaan mittaharppimittauksilla pituuden (a) ja leveys (b) leesioiden seuraavan kaavan avulla: V = ab

2/2. Kasvukäyrän sitten johdettu näistä tiedoista. Ehdot Hiiriä tarkkailtiin päivittäin, ja hiiren eloonjääneiden tallennettiin koko koeajan. Hiiri lopetettiin katkaisemalla kaula, kun ilmeni, kuihtuminen, joka luonnehdittiin yleisesti tila sairauden, mukana menetys kehon rasvattomaan massaan ja rasvan massa, heikkous, väsymys, hitaus, jyrkästi heikkeni syömisen, askites ja ruokahaluttomuus [25]. Kaikki uhrit suoritettiin nukutuksessa (130 mg ketamiinia /8,8 mg ksylatsiinia /painokilo). Sitten kasvain näytteet poistettiin valmistautua parafiinileikkeillä histologista värjäystä. Ilmentymistasojen NDRG2, pVHL, HIF-1α, VEGF-proteiinin ympättiin kasvaimissa todettiin käyttäen histologia ja immunohistokemia kuten edellä on kuvattu.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS ohjelmistoversio 19.0. Vertailut ryhmien välillä tehtiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA ja Fisherin testiä. Kaplan-Meier käyrät ja log-rank testejä käytettiin eloonjäämisen analysointia.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Expression of NDRG2, pVHL ja HIF-1α normaaleissa munuaisten kudoksiin ja CCRCC kudosten

Voit selvittää, onko asetus välillä NDRG2 ja pVHL olemassa CCRCC, me ensin havainnut ilmaus NDRG2 ja niille pVHL ja HIF-1α 130 CCRCC näytteitä ja pariksi normaaleissa kudoksissa. Kuten on esitetty taulukossa 1 ja kuviossa 1, nopeus NDRG2 positiivisen ilmaisun CCRCC kudosnäytteiden oli 30,0% (kuvio 1A ja 1B), joka oli merkittävästi pienempi kuin normaalin munuaistoiminnan kudoksessa 60,0% (kuvio 1G ja 1H) (

P

= 4,40 x 10

-9). Ja nopeus pVHL positiivisen ilmaisun CCRCC kudosnäytteiden (kuvio 1 C ja 1 D) oli myös merkittävästi pienempi kuin normaalin munuaistoiminnan kudoksessa (kuva 1I ja 1J) (26,9% vs. 66,2%,

P

= 3,02 × 10

-10). Päinvastoin määrä HIF-1α positiivista ilmentymistä CCRCC kudosnäytteiden (kuvio 1E ja 1F) oli merkittävästi korkeampi kuin normaali munuaisten kudoksessa (kuvio 1K ja 1L) (55,4% vs. 33,7%,

P

= 0,006). Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa 1 M ja 1 N, ilmentymistasojen NDRG2 korreloivat positiivisesti niiden kanssa pVHL in CCRCC kudosnäytteiden (

r

= 0,749,

P

= 3,25 x 10

-5), kun taas ilmentymistaso NDRG2 negatiivisesti korreloivat kuin HIF-1α in CCRCC kudosnäytteiden (

r

= -0,331,

P

= 1,85 x 10

-3).

Ryhmä

alakonserni

Negative (%) B Positiivinen (%) B

χ

2

P

arvo

NDRG2 CCRCC tissue91 (70,0) 39 (30,0) 23.64

P

= 4,40 x 10

-9normal munuaisten tissue52 (40,0) 78 (60,0) pVHLCCRCC tissue95 (73,1) 35 (26,9) 40.21

P

= 3,02 x 10

-10normal munuaisten tissue44 (33,8) 86 (66,2) HIF-1αCCRCC tissue58 (44,6) 72 (55,4) 8,18

P

= 0,006 normaali munuaisten tissue81 (62.3) 49 (37,7) Taulukko 1. Expression of NDRG2, pVHL ja HIF-1α normaaleissa munuaisten kudosten ja CCRCC kudoksissa.

CSV Lataa CSV

edustaja fotomikrograafeja immunohistokemiallisella värjäyksellä NDRG2, pVHL ja HIF-1αin normaali munuaisten kudosten ja CCRCC kudoksiin. (A ja B) NDRG2 ilmentymisen CCRCC kudoksissa (200-kertainen suurennus). (C ja D) pVHL ilmentymisen CCRCC kudoksissa (200-kertainen suurennus). (E ja F) HIF-1α ilmentymisen CCRCC kudoksissa (200-kertainen suurennus). (G ja H) NDRG2 ilmentymistä normaalissa munuaistiehyessä (200-kertainen suurennus). (I ja J) pVHL ilmentymistä normaalissa munuaistiehyessä (200-kertainen suurennus). (K ja L) HIF-1αexpression normaalissa munuaistiehyessä (200-kertainen suurennus). (M) ilmentyminen tasolla NDRG2 korreloivat positiivisesti kuin pVHL. (N) ilmentyminen tasolla NDRG2 korreloivat negatiivisesti kuin HIF-1α. Kappaleiden lukumäärä näkyi ”mittakaavassa”. Erot eri ryhmien analysoitiin Pearsonin korrelaatiokerrointa ja kaavio muodostui SPSS19.0 ohjelmisto.

NDRG2 yliekspressio estää leviämisen ihmisen munuaissyöpäsoluissa

in vitro

vaikutusten tutkiminen NDRG2 ilmentymisen vaikutus kasvuun ihmisen munuaissyöpäsoluissa, käytimme Ad-LacZ tai Ad-NDRG2 tartuttaa 786-O-solujen ja A498-solut. Infektion jälkeen 24 h, voimakas ilmentyminen NDRG2 proteiinin 786-O-solut (kuvio 2A) ja A498-soluja (kuvio 2B) vahvisti Western blot -analyysillä käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​NDRG2. Inhibition solujen proliferaatiota mitattiin MTT-määrityksellä 12, 24, 36, 48, 60 ja 72 h infektion jälkeen. Kuten kuviossa 2C ja 2D, Ad-LacZ ei ollut merkittävää vaikutusta soluproliferaatioon joko solulinjoissa verrattuna kontrolliryhmään (

P

arvoon 24, 36, 48, 60 ja 72 h on 0,55, 0,61 , 0,96, 0,98 ja 0,60 vastaavasti 786-O-solut;

P

arvo on 0,60, 0,68, 0,60, 0,15 ja 0,60 vastaavasti A498-soluissa). Kuitenkin, solujen lisääntyminen estyi merkittävästi Ad-NDRG2-tartunnan 786-O-solut (

P

arvoon 24, 36, 48, 60 ja 72 h on 048, 1,54 x 10

-4, 2,01 × 10

-4, 2,15 x 10

-4 ja 4,32 x 10

-6 vastaavasti 786-O-solut) ja Ad-NDRG2-tartunnan A498-solut (

P

arvo on 0,47, 0,43, 2,20 x 10

-4, 4,08 x 10

-4 ja 1,70 x 10

-6 vastaavasti A498-soluissa), vastaavasti, verrataan Ad-LacZ ryhmä.

(A ja B) Expression tasot NDRG2 proteiinin Ad-NDRG2-tartunnan 786-O ja Ad-NDRG2-tartunnan A498 solut vastaavasti tutkittiin Western-blottauksella. (C ja D) kasvu 786-O, ja A498-solut estyi yli-ilmentyminen NDRG2 72 tunnin inkubaation jälkeen. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA. *** Osoittaa

P

0,001, verrattuna Ad-LacZ ryhmä.

NDRG2 yli-ilmentyminen estää hyökkäys ja kulkeutumista ihmisen munuaissyöpäsoluissa

in vitro

edelleen vaikutuksen arvioimiseksi NDRG2 ilmentymisen vaikutus metastaattinen aktiivisuus, suoritimme

in vitro

Matrigel kuorrutettu siirtokuoppaan invaasio määrityksiä sekä muuttoliike määrityksiä kahden eri ihmisen munuaissyövän solulinjoissa, 786-O ja A498. Edustavia mikroskooppikuvia otettiin alapinnan transwell suodattimen, ja solut, jotka tunkeutuivat tai siirtää värjättiin Gimsa. Kuten on esitetty kuviossa 3A ja 3B, invasiivista potentiaalia, joka määritetään solujen kykyä hyökätä Matrigel este, merkittävästi tukahdutti Ad-NDRG2 infektion 786-O-solut (

P

= 1,46 x 10

-5

vs

Ad- LacZ ryhmä) ja A498-solut (

P

= 2,23 x 10

-5

vs

Ad- LacZ ryhmä) . Kuitenkin, ei ollut merkittäviä eroja Ad LacZ ryhmän ja kontrolliryhmän sekä 786-O-solut (

P

= 0,79) ja A498-solut (

P

= 0,58). Lisäksi yliekspressio NDRG2 näissä solulinjoissa merkittävästi tukahdutti niiden läpi kulkeutumista siirtokuoppaan verrattuna Ad-LacZ infektio (

P

= 1.19 x 10

-5 786-O-solujen ja

P

= 1,09 x 10

-3 A498-soluissa, vastaavasti) (kuvio 3C ja 3D). Mutta ei ollut merkittäviä eroja Ad LacZ ja kontrolliryhmien molemmissa solulinjoissa (

P

= 0,73 786-O-solujen ja

P

= 0,94 varten A498-solut) B

(A ja B) toinen hyökkäys kyky arvioitiin käyttäen TranswellTM päällystetty Matrigel. Määrä hyökkäsi solujen laskettiin viidessä random korkean tehon kentät (400-kertainen suurennus). Histogrammi edustaa määrällisesti solujen hyökkäsi. (C ja D) Siirtyminen kyky arvioitiin käyttäen TranswellTM päällystämättömän kanssa Matrigeliä. Määrä siirtynyt solujen laskettiin viidessä random korkean tehon kentät (400-kertainen suurennus). Histogrammi edustaa määrällisesti soluista, jotka kulkeutuivat. Tiedot ovat keskiarvo ± keskihajonta (SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA. ** Tai *** osoittaa

P

0,01 tai

P

0,001, tässä järjestyksessä, verrattuna Ad-LacZ ryhmä.

asetus ilmentymisen pVHL, HIF-1α ja VEGF säätely ylöspäin NDRG2 in 786-O-solujen

ymmärtää molekyylitason mekanismi, jonka avulla NDRG2 estää 786-O-solujen lisääntymistä ja invaasio, analysoimme vaikutus NDRG2 ilmentymistä koskevat pVHL, HIF-1α ja sen tavoite VEGF, joka tärkeitä rooleja solujen lisääntymisen ja invaasiota munuaisten syöpä . Me tartunnan 786-O-solujen Ad-NDGR2 ja tutkittiin pVHL, HIF-1α ja VEGF ilmentyminen western blot-analyysi. Tämän seurauksena olemme paljastaa lisääntynyt pVHL ilmaisua ja vähentää HIF-1α ja VEGF verrattuna kuin kontrolliryhmän ja Ad-LacZ ryhmä 786-O-solut (kuvio 4A). Samaan aikaan, käytimme immunofluoresenssimäärityksellä edelleen vahvistaa säätely ilmentymisen pVHL, HIF-1α ja VEGF yliekspressio NDRG2. Epäsuoralla immunofluoresenssilla merkinnät osoitti heikkoja signaaleja sekä NDRG2 ja pVHL kontrolliryhmässä ja Ad-LacZ ryhmä 786-O-solut, kun taas oli voimakkaampaa värjäytymistä NDRG2 ja pVHL Ad-NDRG2-tartunnan 786-O-solut. Lisäksi signaalit HIF-1α ja VEGF-ohjaus ja Ad-LacZ ryhmässä olivat vahvempia kuin Ad-NDRG2 ryhmä (kuva 4B).

(A) 786-O, Ad-LacZ-786-O ja Ad-NDRG2-786-O-soluja inkuboitiin alla normoksia ja hypoksia 24 tuntia. Inkuboinnin jälkeen solut analysoitiin Western blot-määrityksellä. p-aktiini-proteiinin tasot käytettiin latauskontrollina. (B) infektion jälkeen 786-O-solujen 40 MOI Ad-NDRG2 mukaisesti normoksia 24 tuntia, proteiinin tasot NDRG2, pVHL, HIF-1α: n ja VEGF soluissa mitattiin käyttämällä immunofluoresenssimäärityksellä (400-kertainen suurennus).

VEGF tuotanto estyy NDRG2 yli-ilmentyminen

Voit testata, onko NDRG2 ilme vaikuttaa VEGF tuotantoa munuaissyöpäsoluissa, käytimme Ad-NDRG2 tartuttaa 786-O ja A498 solut ja mittasi VEGF tasot soluviljelyelatusainetta alle normoxic tai hypoksinen olosuhteet. Tulokset ELISA testi osoitti, että Ad-NDRG2 ryhmä 786-O-solujen, verrattuna Ad-LacZ osoitti merkittävästi vähentynyt VEGF eritystä joko normoxic (kuva 5A) (

P

= 7,32 x 10

-8) tai hypoksinen olosuhteet (kuvio 5B) (

P

= 9,95 x 10

-8). Samaan aikaan VEGF-erityksen A498-solujen väheni myös merkittävästi alle NDRG2 yliekspressio kunto riippumatta normoksia (kuvio 5C) (

P

= 6,12 x 10

-7) ja hypoksia (kuvio 5D) (

P

= 0,005). Mutta Ad-LacZ infektio ei ole vaikutusta VEGF tuotantoa verrattuna kontrolliryhmään joko normoksia (

P

= 0,55 786 O-solut;

P

= 0,91 varten A498-solut) tai hypoksia (

P

= 0,94 varten 786 O-solut;

P

= 0,90 A498-solut).

(A ja B) 786-O, Ad-LacZ-786-O ja Ad-NDRG2-786-O-soluja inkuboitiin normoksia ja hypoksia 24 tuntia. Inkubaation jälkeen media analysoitiin VEGF-tasot ELISA-määrityksellä. (C ja D) A498, Ad-LacZ- A498 ja Ad-NDRG2- A498-soluja inkuboitiin alla normoksia ja hypoksia 24 tuntia. Inkubaation jälkeen media analysoitiin VEGF-tasot ELISA-määrityksellä. Tiedot olivat keskiarvo ± keskihajonta (SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA. ** Tai *** osoittaa

P

0,01 tai

P

0,001, tässä järjestyksessä, verrattuna Ad-LacZ ryhmä.

Suppression kasvaimen kasvua nude-hiirimallissa kasvaimensisäisiä ruiskuttamalla Ad-NDRG2

vaikutusten tutkiminen Ad -NDRG2 kasvaimen kasvuun

in vivo

injektoimme adenovirusta (1 x 10

9 pfu 100 ul PBS) Ad-NDRG2, Ad-LacZ tai PBS 3 päivän välein osaksi ennalta laadittujen ihmisen 786- O munuaisten syöpäkasvainten (noin 200 mm

3) kasvatettu nude-hiirissä. Kuten kuviossa 6A, Ad-NDRG2 ryhmä saavutti jatkuva ja merkittävä tuumorin kasvun verrattuna Ad-LacZ ryhmä (

P

arvo on 0,002, 1,54 x 10

-6, 1,77 x 10

-6, 9,7 x 10

-11, 8,69 x 10

-12 ja 1,35 x 10

-9 at Day6, 9, 12, 15, 18 ja päivä 21 vastaavasti). Kaplan-Merier selviytymisen analyysi osoitti, että kasvaimeen injektio Ad-NDRG2 pidensi merkittävästi hiirillä eloonjäämisajan (

χ

2 = 11,75,

P

= 0,003) (kuvio 6B). Merkittäviä eroja ei havaittu kontrolliryhmässä ja Ad-LacZ ryhmä (

χ

2 = 4,67,

P

= 0,122), ja tulokset olivat yhtäpitäviä

in vitro

määrityksissä. Sen jälkeen, kun hiiret tapettiin, tuumorit poistettiin analyysiä varten ekspression NDRG2, pVHL, HIF-1α: n ja VEGF. Immunoleimaus VEGF ja HIF-1a olivat pienemmät kasvaimet irrotettiin hiiristä Ad-NDRG2 ryhmä. Lisäksi NDRG2 ja pVHL ekspressiotasot Ad-NDRG2 ryhmä oli kasvanut dramaattisesti, kun HIF-1α ja VEGF-määrät vähenivät verrattuna Ad-LacZ ryhmä (NDRG2,

P

= 6.47 x 10

-8 ; pVHL,

P

= 1,55 x 10

-8, HIF-1α,

P

= 0,0001, VEGF,

P

= 6.07 x 10

-7). Ei ollut merkittävää eroa ohjaus ja Ad-LacZ ryhmät (NDRG2,

P

= 0,98; pVHL,

P

= 0,94; HIF-1α,

P

= 0,78; VEGF,

P

= 0,69) (kuvio 7A ja 7B).

(A) Kasvaimen kasvukäyrä. Kasvaimen kasvu arvioitiin 3 päivän välein, kunnes päivä 21 hoidon mittaamalla kaksi kohtisuorassa halkaisijat ja laskemalla tilavuus mm

3. Tilastollinen analyysi arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA. ** Tai *** osoittaa P 0,01 tai P 0,001 verrattuna Ad-LacZ ryhmä. (B) Kaplan-Meier käyrä näkyy Control, Ad-LacZ ja Ad-NDRG2 ryhmiä, joissa kukin ryhmä koostuu kymmenen hiirtä. Oli merkitsevä ero Ad-NDRG2 ja Ad-LacZ hoitoja. Tilastollinen merkittävyys arvioitiin käyttäen log-rank testejä. ** Osoittaa

P

0,01 verrattuna Ad-LacZ ryhmä.

(A) kasvaimensisäisenä ilmauksia NDRG2, pVHL, HIF-1a ja VEGF arvioitiin immunohistokemia (200-kertainen suurennus) on parafinoidut 786-O kasvain kohdat. Kuvat ovat näytetään. (B) Integroitu optinen tiheys (IOD) arvot NDRG2, pVHL, HIF-1α: n ja VEGF-proteiinin ilmentyminen kasvainten arvioitiin. ImagePro Plus ohjelmisto käytettiin analysoimaan IOD arvot positiivisen alueilla immunohistokemiallisella värjäyksellä ja tuloksena histogrammit esitetään. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD. *** P 0,001.

Keskustelu

Vaikka kirurginen resektio ja adjuvanttihoito käytetään yleisesti hoitoon munuaisten syöpäpotilaille, yleinen eloonjäämisaste munuaissyövän vaatii parannusta. On tunnettua, että RCC on resistentti Radio-, hormono-, ja kemoterapia [26]. Siksi kehittäminen biologisten hoitojen munuaissyövän tarvitaan kiireesti. Esiintyminen ja kehittäminen munuaissyövän riippuu ilmaus useiden liittyvien geenien, kuten HIF-1α, PDK1, VEGF ja niin edelleen [27].

Monet tutkimukset ovat nyt osoittaneet, että HIF-1α up-säätelee ilmentymistä PDK1 ja VEGF [28]. Lisäksi PDK1 ja VEGF ilmaisun lisääntyvät RCC [29,30]. PDK1 tiedetään fosforyloida ja aktivoida joitakin proteiinikinaasien, jotka kuuluvat AGC perheen proteiinikinaasien. Yksi proteiinikinaasien on proteiinikinaasi B (PKB, joka tunnetaan myös Akt). PDK1 aktivoi Akt fosforyloimalla Ser /Thr jäännös aktivoinnin silmukka. Akt-reitillä on poikkeuksellisesti aktivoitu CCRCC ja mukana leviämisen ja etäpesäkkeiden [31]. Ja VEGF on tärkeä keskellä kaikki angiogeenisten tekijöiden ja edistää sekä kasvaimen kehittymisen ja hyökkäys RCC [32]. HIF-1α ovat myös usein yli-ilmentynyt munuaisten syöpä, joka korreloi huonon kliinisen ennusteen [33].