Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ergp55 proteiini kuuluu Ets perheeseen transkriptiotekijän. ETS proteiinit ovat erittäin konservoituneita niiden DNA: ta sitova domeeni ja mukana erilaisissa kehitysprosesseja ja sääntelyn syövän aineenvaihduntaa. Tutkia rakenne ja DNA: ta sitovan autoinhibition mekanismi Ergp55 proteiinin olemme tuottaneet täyspitkä ja pienempien polypeptidien Ergp55 proteiinin

E. coli

ja ominaista käyttäen erilaisia ​​biofyysisiin tekniikoita.

Tulokset

Ergp55 polypeptidit sisältävät suuren määrän α-kierteen ja satunnainen kela rakenteita mitattuna pyöreä dichorism spektroskopialla. Täyspitkä Ergp55 muodostaa joustava ja pitkänomainen molekyyli, joka käy ilmi Molekyylimallinnuksen, simuloinnissa ja rakenteellisia ennustaminen algoritmeja. Sitova analyysit Ergp55 polypeptidien kanssa kohde-DNA-sekvenssit E74 ja talousjohtajien promoottorit osoittavat, että enää fragmentit Ergp55 (yli Ets domain) osoitti näyttöä automaattisen eston. Tutkimus paljasti myös osat Ergp55 proteiinia, jotka välittävät auto-esto.

merkitys

Nykyinen tutkimus auttavat suunnittelussa yhdisteitä, jotka vakauttaa esti muodossa Ergp55 ja estävät sen sitoutumisen promoottori DNA: ta. Se edistää kehittämiseen lääkkeiden kohdistaminen Ergp55 eturauhasen syövän hoitoon.

Citation: Gangwar SP, Dey S, Saxena AK (2012) rakennemallinnusominaisuudet ja DNA Binding Autoinhibition Analyysi Ergp55, elintärkeiden Transcription Factor Eturauhassyöpä. PLoS ONE 7 (6): e39850. doi: 10,1371 /journal.pone.0039850

Editor: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 toukokuu 2012; Hyväksytty: 31 toukokuu 2012; Julkaistu: 28 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Gangwar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat avustusta Department of Science and Technology (DST) New Delhi, Intia (No-SR /SO /HS-05/2009). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ets perheen proteiineilla hyvin säilyneitä siivekäs helix-turn-helix DNA: ta sitovan domeenin ja sitoutuvat konsensus-DNA-core-sekvenssin 5′-GGA (A /T) -3 ”[1]. ERG proteiinit kuuluvat Ets perheeseen transkriptiotekijän. Erg geeni on järjestetty uudelleen ihmisen myelooista leukemiaa [2] ja 5-10%: lla Ewingin sarkooma [3]. Molemmissa tapauksissa kromosomitranslokaation tuloksia ilmaisemisessa onkogeenisten fuusioproteiinien koostuu Erg ja jäsenen Tet alaryhmään RNA sitovia proteiineja. Erg proteiini on välttämätön lopullisen hematopoieesin, aikuisten luuydinsiirtopotilailla toiminta ja ylläpito normaalin ääreisveren verihiutaleiden määrä [4]. TMPRSS2-Erg fuusio onkogeeni selostukset havaittiin eturauhasen syöpäsolujen liittyvät merkittävästi aggressiivinen syöpä, metastaaseja ja lisääntynyt todennäköisyydellä kuolemaan [5].

Erg geeni koodaa viisi proteiineja, Erg-1, Erg-2 , Ergp55, Ergp49 ja Ergp38 seurauksena eri liittämiseen, polyadenylaation tai aloituskodonista. Ergp55 isoformi sisältää neljä toiminnalliset domeenit, jotka osallistuvat DNA: ta sitovaa, transkription aktivaation ja negatiivisen säätelyn transaktivaation [6]. Ergp55 proteiini muodostaa dimeerin itsensä ja kahden muun isoformia Ergp49 ja Ergp38 kautta PNT ja Ets domain [7]. Keskeinen verkkotunnus Ergp55 käyttäytyy estävä toimialueen dimerointi- ja sen poistaminen parantaa transaktivointidomainien omaisuus (7). Kriittinen jäämät Ets verkkotunnus Ergp55, jotka välittävät Ergp55-Jun /Fos-DNA kolmen komponentin kompleksin muodostumisen, on tunnistettu ja karakterisoitu [8].

Toistaiseksi tertiaarirakennetta kaikki täyspitkät Ets proteiini on ei määritetty. Kuitenkin rakenteet DNA: ta sitovien domeenien useita Ets proteiineja on määritetty käyttäen röntgenkristallografiaa ja ydinmagneettinen resonanssi tekniikoita [9] – [16]. Gonome laajuinen analyysi Ets-perheen DNA-sitovan

in vitro

ja

in vivo

on tutkittu äskettäin [17].

tarkkaa mekanismia, jolla, Ergp55 proteiini vaikuttaa transkriptio ei ymmärretä. Ymmärtää rakenteen ja DNA: ta sitovan autoinhibition mekanismi Ergp55, teimme pyöreä dichorism, molekyylimallitus ja teoreettisen rakenteellinen ennustaminen analyysi Ergp55 polypeptideihin. Ymmärtää DNA sitova autoinhibition mekanismi, sitovat tutkimukset Ergp55 polypeptidien kanssa DNA-sekvenssit E74 ja talousjohtajien promoottorit tehtiin. Tuloksemme osoittivat, että (i) Ergp55 polypeptidejä sisältää suuren prosenttiosuuden α-heliksin ja satunnaisia ​​kelan rakenteet (ii) täyspitkä Ergp55 on joustava ja pitkänomainen molekyyli (iii) pidempi fragmentit kuin kanoninen Ets domeenin Ergp55 osoitti todisteita autoinhibition.

Materiaalit ja menetelmät

rakentaminen Ergp55 plasmidien

täyspitkä Erg

1-479 ja Erg

112-399 geenit kloonattiin pET28a: han (+ ) vektori. ERG

1-399 ja Erg

307-399 geenit kloonattiin pRSETA ja pET21a (+) ekspressiovektori. Kaikki deleetiomutantti geenit monistettiin täyspitkä Erg

1-479 plasmidia käyttäen polymeraasiketjureaktiota.

(A) Kuvassa aminohapposekvensseihin täyspitkä Ergp55 ilman 6XHIS ja lohkaisukohdan. Jäännökset korostettiin mukaan koon Ergp55 verkkotunnuksia, NTD (keltainen), PNT (vihreä), CAE /CD (sininen /syaani), Ets (punainen) ja CTD (musta). (B) Kuvassa tässä Ergp55 konstrukteja käytettiin kokeissa (väritys järjestelmän samat kuin kuviossa. 1A). Leimatut tähteet määritetään järjestys alun ja lopun konstruktioita.

Aestericks

tarkoittavat asemaa 6XHIS eri Ergp55 konstruktioita.

puhdistus Ergp55 polypeptidien

Erg

1-479, Erg

1-399, Erg

112-399 ja Erg

307-399 plasmidit transformoitiin

E. coli

. BL21 (DE3) solut. Soluja kasvatettiin 3 litraan Luria-Bertani-elatusaineessa, joka sisälsi asianmukaisia ​​antibiootteja, 37 ° C: ssa, kunnes OD

600 saavutti 0,6. 0,125 mM IPTG: tä indusoitiin 37 ° C: ssa ja Viljely ravisteltiin 4 h 220 rpm. Solut kerättiin sentrifugoimalla 6000x

g

10 ° minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solut suspendoitiin 50 ml: aan lyysipuskuria, joka sisälsi (25 mM Tris-HCI, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM bentsamidiini-HCl: ää, 0,1% Triton X-100, 5% glyserolia, 3 mM 2-merkaptoetanolia, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia fluoria ja 0,5 mg /ml lysotsyymi) ja hajotettiin sonikoimalla 4 ° C: ssa. Raakalysaattia sentrifugoitiin 25000 x

g

20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti ladattiin Ni-NTA-pylvääseen, joka oli esitasapainotettu sitomispuskuria (25 mM Tris-HCI, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM bentsamidiini-HCl: ää, 5% glyserolia, 2 mM 2-merkaptoetanolia, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja 10 mM imidatsoli). Proteiinit eluoitiin kolonnista eluointipuskurilla (25 mM Tris-HCI, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM bentsamidiini-HCl: ää, 5% glyserolia, 3 mM 2-merkaptoetanolia, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja 250 mM imidatsolia). Eluoidut fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja ladattiin Sephacryl S-200 HR geelisuodatuspylvääseen tasapainotettu ennalta puskurissa (25 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl: a, 3 mM 2-merkaptoetanolia ja 5% glyserolia). Puhdistettujen proteiinien konsentroitiin 10 mg /ml käyttäen Amicon Ultra keskipakoisvoiman suodatinlaitteen (Mw cutoff 10 kD). Proteiinipitoisuus mitattiin UV-säteilyn 280 nm käyttäen ekstinktiokerrointa lasketaan Expasy ohjelmisto (https://us.expasy.org/tools/protparam.html).

kromatogrammissa (A) koko pituus Erg

1-479 (B) Erg

1-399 (C) Erg

112-399 ja (D) Erg

307-399 polypeptidien näytetään. SDS-PAGE-analyysi ja laskettu molekyylipaino on kunkin proteiinin on merkitty kunkin kromatogrammissa.

N-pään proteiinisekvensoinnilla ja ionisuihkuun massaspektrometria vahvistivat identiteettiä ja puhtautta Ergp55 polypeptidejä. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä absorbanssia 280 nm: ssä. Coomassie brilliant blue stained SDS-PAGE-analyysi osoitti, että kaikki Ergp55 polypeptidit puhdistettiin yli 95%: n puhtaudella. Kaikki proteiinit säilytettiin -20 ° C: ssa.

Pintaplasmoniresonanssianalyysi kokeen

Biosensor suoritettiin käyttäen BIAcore 2000 (Biacore Pharmacia Biosensor AB, Uppsala Sweeden) laitteet [18]. Kaikki kokeet suoritettiin 25 ° C: ssa HBS-puskuria, joka sisälsi [10 mM HEPES-puskuria, pH 7,4, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 0,005% P20, kuten pinta-aktiivista ainetta). Koska kaikki Ergp55 polypeptidit sisältävät 6XHIS joko N- tai C-terminaalista, anturi siru, joka sisältää suuren tiheyden immobilisoitua Ni-NTA on ihanteellinen tag immobilisoimiseksi näitä proteiineja. Aluksi virtauksen solujen siru aktivoitiin johtamalla nikkeli- kloridiliuosta sen yli. 40 ui kutakin Ergp55 polypeptidin

esim

., Erg

1-479 (0,14 ug /ul), Erg

1-399 (0,19 ug /ul), Erg

112-399 (0,92 ug /ul) ja Erg

307-399 (0,17 ug /ul) injektoitiin eri virtauskyvetteihin Ni-NTA chip virtausnopeudella 10 ul /min.

luvut (A ) Erg

1-479 (B) Erg

1-399 (C) Erg

112-399 ja (D) Erg

307-399 polypeptidit immobilisoitiin Ni-NTA siru. Kolme pitoisuus (1, 2, 3 uM) DNA-sekvenssin E74 promoottorin injektoidaan kunkin immobilisoidun Ergp55 polypeptidiä.

Eri virtaus solujen Ni-NTA-siru, seuraavat RU yksikkö kutakin Ergp55 polypeptidin immobilisoitu

esim

., Erg

1-479 (2904 RU), Erg

1-399 (2848 RU), Erg

112-399 (2825 RU) ja Erg

307-399 (247 RU), jossa 1 RU vastaa immobilisoituun proteiiniin keskittymisen ~ 1 ug /mm. Sitovat kokeet suoritettiin kolmessa eri pitoisuus [1, 2, 3 uM) DNA-sekvenssin E74 promoottorin (5 ’TACCGGAAGT 3’) HBS-puskurilla ja injektoidaan yli immobilisoidun Ergp55 polypeptidejä virtausnopeudella 10 ul /min. Samanlainen koe suoritettiin käyttäen DNA-sekvenssi CFOs promoottorisekvenssi (5 ’GACAGGATGTG 3’). Sensogram annettiin edetä vielä 4 minuuttia. Regenerointi Bioanturin pinta tehtiin käyttämällä 30 s pulssi 1 mM NaOH: ta virtausnopeudella 10 ul /min. Associate ja dissosiaatio kineettisyysvakioiden laskettiin BIAeveluation 3.0 ohjelmistoa käyttäen yksinkertaista 01:01 Langmuir malli olettaen, että tiheys Ergp55 polypeptidien sensorisirulla eivät olleet riittävän suureksi kahdenarvoisen DNA sitova.

luvut ( A) Erg

1-479 (B) Erg

1-399 (C) Erg

112-399 ja (D) Erg

307-399 polypeptidit immobilisoidaan Ni-NTA siru. Kolme eri pitoisuus (1, 2, 3 uM) DNA-sekvenssin CFOs promoottorin injektoidaan kunkin immobilisoidun Ergp55 polypeptidiä.

Pyöreät dichorism

CD mittaukset rekisteröitiin käyttäen Chirascan

TM CD spektropolarimetrillä (Applied Photophysics) vesihauteessa ylläpitämiseksi vakiolämpötilassa. Ergp55 polypeptidit laimennettiin 0,2 mg /ml 10 mM natriumfosfaattipuskuria, pH 8,0, ja ladattiin 0,1 cm: n kvartsikyvetissä. Aihion kaikissa kokeissa oli 10 mM natriumfosfaattipuskuria, pH 8,0. Lopullinen spektri oli keskimäärin kolme peräkkäisen skannauksen.

(A) CD-spektrit Erg

1-479, Erg

1-399, Erg

112-399 ja Erg

307-399 polypeptidit tallennettu 200 nm 260 nm. (B) lämpötila indusoi piirtyy täysipitkän Ergp55 proteiinia. Juoni (sisempi), joka sisältää keskimäärin jäännös elliptisyytenä lämpötilan funktiona osoittaa denaturaatio α-kierteiden taitettu täyspitkä Ergp55.

lämpödenaturaation tutkimus täyspitkä Ergp55, CD-spektrit rekisteröitiin 10 ° C lisäys alkaen 10 ° C: sta 90 ° C: ssa. Ennen mittausta, näytekyvettiin tasapainotettiin kussakin lämpötilassa. Lämpötilan lukemat otettiin sisällä kyvettipidike yhtyi lämpötilassa vesihauteessa. Kaikki CD data muunnettiin tarkoittaa jäämien elliptisyytenä (astetta. Cm

2 /dmol). Dichroweb server [19] käytettiin arvioimaan määrä johdettua rakennetta Ergp55 polypeptidien CD spektreistä.

Toissijainen rakenne ennustus

SOPMA [20], GOR [21] ja PSIPRED [ ,,,0],22] algoritmeja käytetään ennustamaan sekundaarirakenteen sisältö täyspitkä Ergp55, joka osoitti ~21% α-heliksin, 12-15% β-levyn ja 65-69% satunnaisia ​​kelan rakenteista.

(A) PSIPRED ohjelma-analyysi täyspitkä Ergp55. (B) Rakenteelliset malli täyspitkä Ergp55 jälkeen molekyylimallitus ja simuloinnissa analyysin avulla Gromacs ohjelmaa (C) häiriintyneestä ennuste tehdään DISOPRED (a), NTD (b), PNT (c), CAE /CD (d), ETS ja (e), CTD alueilla Ergp55.

Modeling Ergp55 polypeptidien

Phyre palvelin [23], käytettiin saamiseksi rakenteen täyspitkän Ergp55 proteiinia (1-479 jäämät). Palvelin tuotti rakenne PNT domain (95-221 tähteet) on Ergp55 käyttäen mallin ATE-2YTU (liuos rakenne SAM-PNT domain ihmisen ystävä leukemian integraatio tekijä-1 transkriptiotekijän, ei vielä julkaistu). NMR-liuos rakenne PNT domain (108-201 tähteet) saatiin proteiini tietopankki (ATE-1SVO) [24]. Phyre palvelinkaan tuottivat rakenteen Ets domain (284-412 tähteet) on Ergp55 Mallineelle ATE-2NNY (asetus transkriptiotekijän Ets-1 DNA välittämän homodimerisaation) [13]. NMR-rakenne Ets verkkotunnus Fli1 (306-403 tähteet) saatiin proteiini tietopankki (ATE-1FliA) [25]. Rakenteellinen mallinnus N- terminaalista (1-94 tähteet), Keski-domain (222-283 tähteet) ja C- terminaalista (413-479 tähteet) on Ergp55 ei yritetty puutteen takia panos mallin.

mallintajan [26] ja LOMETS ketjuttaminen [27] ohjelmia käytettiin rakentamaan rakenteeseen täyspitkä Ergp55 käyttäen seuraavat tulot (i) rakennemalli PNT domain (95-221 tähteet) on Ergp55 (ii) rakennemalli Ets domain ( 284-412 tähteet) on Ergp55 (iii) NMR rakenne PNT verkkotunnuksen (108-201 tähdettä) ja Ergp55 ja (iv) NMR-rakenne Ets verkkotunnuksen (306-403 tähdettä) ja Fli1. Energia minimointi suoritettiin mallinnettiin Ergp55 käyttäen Gromacs ohjelmaversio 4.0.5 [28]. 100 vaiheet Jyrkin kunnon ja 500 vaiheet konjugoidun gradientin algoritmeja käytettiin energian minimointi laskentaan.

Molecular dynamiikkasimulaatioita

10 ns molekyylidynamiikan (MD) simulaatio suoritettiin minimoitu Ergp55 mallin avulla Gromacs ohjelma (versio 4.0.5) kanssa Gromacs43a2 voimakenttä [28]. Ergp55 malli upotettiin kuutiometriä laatikko ulottuu 0,5 nm proteiinin pinnalle ja solvatoitu nimenomaisen SPC vesimolekyylejä. Kloridi ja natrium-ioneja lisättiin neutraloimaan järjestelmiä, jotka sitten simuloitiin määräajoin reunaehdot. Solvatoidut Ergp55 Malli koostuu 4832-proteiinin atomien ympärillä ~390 000 vesimolekyylejä. Ennen käynnissä simulointi, koko järjestelmä oli energia minimoidaan 200 toistojen jyrkimmän laskujen ja tasapainotettiin 20 ps pitäminen proteiinin atomien hillitty. Kaikki rajoitukset poistettiin proteiini ja lämpötila nostetaan vähitellen 10 erillistä vaiheet 5 ps simulaatioita kukin.

Berendsen kytkentä käytettiin ylläpitämään jatkuvaa lämpötilaa 300 K, kytkentävakio τ 0,1 ps. Van der Waalsin vuorovaikutukset mallinnettiin 6-12 Lennard-Jones potentiaalit 1 nm sulku. Coulombin katkaista oli 1,0. Aika askel tuotto oli 2 fs ja koordinaatit tallennetaan joka 5. ps analysointiin MD liikeratoja.

stereokemia simuloitiin Ergp55 mallin tarkistettiin PROCHECK ohjelma CCP4-ohjelmistopakettia [29]. Toissijainen rakenne koostumus mitattiin DSSP ohjelmassa [30] ja rakenteen visualisointi PyMOL ohjelmasta [31].

Tulokset

Rekombinanttisen Ergp55 polypeptidien

Laadimme täyspitkä ja pienemmät polypeptidit (joka sisältää osajoukko ennustettu domeenit) Ergp55 in

E. coli

ja puhdistetaan käyttäen standardi kromatografisia menetelmiä (Fig. 1A-B). Kokoerottelukromatografian aikana, puhdistettu Erg

1-479, Erg

1-399, Erg

112-399 ja Erg

307-399 polypeptidit eluoidaan määriä, jotka vastaavat niiden molekyylipainoja (Fig. 2A-D). Täyspitkä Erg

1-479 eluoitui kokoa 53,8 kD, Erg

1-399 polypeptidi eluoituu 51,1 kD, Erg

112-399 eluoitui 44,9 kD ja Erg

112-399 eluoitui 15,1 kD. ERG

1-479 ja Erg

1-399 polypeptideillä on taipumus hajota, jos ne pidetään 7 päivän ajan 4 ° C: ssa. ERG

112-399 ja Erg

307-399 polypeptidit eivät hajoa ajan mittaan ja vakaampi kuin Erg

1-479 ja Erg

1-399 polypeptidejä.

DNA sitovat tutkimukset käyttäen E74 ja talousjohtajien promoottorisekvenssit

toimivuus puhdistettua Ergp55 polypeptidien arvioitiin DNA: ta sitovan kokeen avulla pintaplasmoniresonanssin tekniikkaa. Havaitut

K

D

arvo Ergp55 polypeptidien DNA-sekvenssi E74 promoottori oli

esim

., Erg

1-479 ~ 704 nM, Erg

1- 399 ~ 217 nM, Erg

112-399 ~ 115 nM ja Erg

307-399 ~ 65 nM (kuvio. 3A-D). Nämä tulokset osoittivat, että Ets verkkotunnus Ergp55 (Erg

307-399) on korkein affiniteetti E74 promoottori DNA-sekvenssin. DNA sitoutumisaffiniteetti pienenee ~ 2 kertainen Erg

112-399 polypeptidi, ~ 3 kertaiseksi Erg

1-399 polypeptidiä ja -10 taittaa täyspitkän Erg

1-479, verrattuna Erg

307-399 polypeptidi (Ets domain). Nämä tulokset osoittavat, että N- ja C-terminaalisten domeenien suhteen Ets domain ovat mukana automaattinen estämällä DNA sitoutumisen Ergp55 proteiiniin.

Havaitut

K

D

arvo Ergp55 polypeptidien talousjohtajien promoottorisekvenssi olivat

esim

., Erg

1-479 ~ 232 uM, Erg

1-399 ~ 196 uM, Erg

112-399 ~ 38 uM ja Erg

307-399 ~ 0,45 uM (kuvio. 4A-D). Nämä tulokset osoittavat myös, että Ets domeeni on korkein affiniteetti DNA-sekvenssien CFOs promoottorin. Sekä N- ja C-terminaalisten domeenien suhteen Ets domain osallistuvat inhibitioon CFOs DNA sitoutumisen Ergp55 proteiiniin.

CD mittaukset Ergp55 polypeptidien

tunnistamiseksi sekundääristruktuurin sisällön Ergp55 polypeptidit, pitkälle UV CD-spektroskopiaa, käytettiin (Fig. 5A). CD-data saatiin de-poimutettu käyttäen DICHROWEB web-palvelin [19] ja prosenttiosuus, α-heliksin, β-levyn ja satunnaisia ​​kela rakenteet arvioitiin. CD-spektrit täyspitkän Erg

1-479 (Fig. 5A), havaittiin kaksi minimiä noin 208 nm ja 222 nm, joka on ominaista α-kierteisen rakenteen. Dekonvoluutio tietojen ennustaa ~35% α-heliksin, 15% β-levyt ja 49% satunnaisia ​​kela rakenteiden täyspitkä Ergp55. CD data Erg

1-399 polypeptidi ennustaa -25% α-heliksin, 17% β-levyt ja 57% satunnaisia ​​kela rakenteita, mikä osoittaa vähemmän α-heliksin ja β-arkin rakenne verrata täyspitkä Erg

1-479 rakenne.

Jos Erg

112-399 polypeptidiä, CD data arvioi ~29% α-heliksin, 15% β-levyt ja 55% satunnaisia ​​kela rakenteita. Tämä polypeptidi sisältää vähemmän α-heliksin, samanlainen β-arkin rakenne verrattuna täyspitkä Erg

1-479. ERG

307-399 polypeptidiä, CD data arvioi ~31% α-heliksin, 10% β-levyt ja 59% satunnaisia ​​kela rakenteita, mikä on vähemmän α-heliksin ja β-arkin rakenne verrata täyspitkä Erg

1-479 rakenne. Kuitenkin nämä arvot ovat lähellä sekundaarirakenne sisällön kiderakenne Ets domeenin Fli-1 (35,7% α-heliksin, 4,1% β-arkki, 60,2% satunnainen coil). ETS verkkotunnus Fli-1 on lähin homologinen Ets verkkotunnus Ergp55 [32].

lämpöstabiilisuus täyspitkä Ergp55

arvioimiseksi lämpöstabiilisuuden täyspitkä Ergp55, paljon UV CD-spektri proteiinia mitattiin 10-90 ° C (Fig. 5B). On selvää, spektreistä, että sekundaarinen rakenne Ergp55 denaturoi kuin lämpötila kohosi. Kun keskimääräinen jäännös elliptisyydestä 222 nm on piirretty lämpötilan, käännepiste sigmoidisten käyrä T

m 45 ± 2 ° C täyspitkä Ergp55.

Molekyylimallinnus ja dynaaminen simulointi täyspitkä Ergp55

toissijainen rakenne ennustaa täyspitkä Ergp55 käyttäen PSIPRED ohjelma esitetään (Fig. 6A). Mallintaja ja automaattinen päänvienti LOMETS ohjelmia oli käytetty täyspitkä Ergp55 mallia käyttäen (i) rakenne 95-221 jäämiä Ergp55 Mallineelle ATE-2YTU (ei julkaistu), jossa on 57% sekvenssi-identiteetti (ii) rakenne 284- 412 tähdettä Ergp55 käyttäen mallin ATE-2NNY [13], jossa on 40% sekvenssi-identiteetti ja (iii) NMR rakenne 108-201 jäämien Ergp55 ja (iv) NMR-rakenne 306-403 jäämien Ets domeenin Fli-1, jossa 90 % sekvenssi-identiteetti. Energia minimointi ja simulaatioita analyysi tehtiin rakennettiin Ergp55 malli, joka tuotti joustavan ja pitkänomaisen rakenteen (Fig. 6B). Ergp55 rakenne pysyi hyvin vakaana koko simulaation ajan, mikä vahvistetaan kaikki, joita käytetään yleisesti analysoimaan MD simulointi.

93% jäämät Egp55 mallin hajallaan suosituimmuusasemassa alueella ramachandran-kuvaaja ja Prosa Z- pisteet -4,87. DISOPRED [33] analyysi Ergp55 malli osoitti, että N-pään (1-118 tähdettä) ja C-terminaalista (397-479 tähdettä) ovat pitkälti epäjärjestyksessä (paitsi N-pään 4-23 tähdettä) ja jäljellä Ergp55 rakenne (119-396 jäämät) oli tilattu (Fig. 6C). Strukturoitujen PNT verkkotunnuksen sisältää kolmannen asteen järjestely neljä α-heeliksit ominainen suuri joukko SAM verkkotunnuksen [34]. ETS verkkotunnuksen koostuu neljästä α-helices ja fourβ-levyt, ominaispiirre Ets proteiinit. N-terminaalinen domeeni, 15 jäännöksen venyttää ennustetaan muodostavan α-heliksin ja 3 jäännös pitkä kierre (219-221 tähteet) on havaittu in CAE /CD verkkotunnus Ergp55. Osuuksilla jäämien C-pään domeeni Ergp55 ennustetaan olevan vain satunnaisia ​​kelan rakenne.

N- terminaali ja C-terminaali verkkotunnus Ergp55 on sijoitettu poispäin Ets domain. DNA sitova uraan Ets domain on alttiina liuottimelle ja vapaa sitomaan promoottori-DNA-sekvenssit. CAE /CD domain on sijoitettu PNT ja Ets toimialue säännellään toimintaa Ergp55. N- terminaali ja C-pääaluetta Ergp55 on sijoitettu alueelle, joka ei estä DNA: ta sitovaa aktiivisuutta Ets domain ja osansa transkription aktivaation ja lokalisointia Ergp55.

Keskustelu

Nykyisissä tutkimuksessa olemme ilmaisseet täyspitkä ja pienempien polypeptidien Ergp55 in

E. coli

. Yhdistelmät kahden kromatografian vaiheet (Ni-NTA affiniteetti ja kokoekskluusiokromatografia) on saatu yli 95% puhdasta Ergp55 polypeptidit perustuen massaspektrometrialla ja SDS-PAGE-analyysi. Ennen rakenteelliset tutkimukset, aktiivisuus puhdistettiin Ergp55 polypeptidien tarkastettiin sitovia, joissa käytetään DNA-sekvenssit E74 ja talousjohtajien promoottorit. Pinta-plasmoniresonanssin tekniikkaa käytettiin sitoutumisen analyysissä. Nämä tulokset osoittivat, että Ergp55 polypeptidit tuotetaan

E. coli

olivat hyvärakenteiset ja sitovat spesifisesti DNA-sekvenssit E74 ja cFos promoottorit eri kantoja.

DNA: ta sitovaa autoinhibition of Ergp55.

Jos E74 promoottorisekvenssin, seuraava

K

D

arvot havaittiin Ergp55 polypeptidejä (i) Erg

307-399, 65 nM (ii) Erg

112-399, 115 nM (iii) Erg

1-399, 217 nM ja (iv) täyspitkä Erg

1-479, 704 nM. Vertailu (i) ja (ii) osoitti, että N-pään alueen (PNT + CAE /CD verkkotunnuksia) edellisen tupakansavulle domain estää E74 DNA sitoutuminen Ets domain. Vertailu (ii) ja (iii) osoitti näyttöä lisääntyneestä DNA: ta sitovaa esto antamalla NTD domain Erg

1-399 polypeptidiä. Vertailu (iii) ja (iv) osoittavat, että lisäämällä CTD domain Erg

1-399 polypeptidi osoittivat parannettu esto DNA sitoutumisen Ets domain. Nämä tulokset osoittavat, että E74 DNA: ta sitova ja Ergp55 on vaikuttaa negatiivisesti CAE /CD, PNT ja NTD domeenit sijaitsevat N-pään ja CTD domeeni sijaitsee C-päätteen alueen poistumisen Ergp55.

CFOs promoottori-DNA-sekvenssi, seuraavat

K

D

arvot saatiin Ergp55 polypeptidejä (i) Erg

307-399, 0,4 uM (ii) Erg

112-399, 37 uM (iii) Erg

1-399, 196 uM ja (iv) täyspitkä Erg

1-479, 232 uM. Nämä tulokset osoittavat, että talousjohtajien promoottorisekvenssi sitoutuvat eri affiniteetilla Ergp55 polypeptidejä kuin E74 promoottorisekvenssin, mutta mekanismi DNA: ta sitovaa inhibitio oli samanlainen kuin havaittiin tapauksessa E74 promoottorin DNA-sekvenssin.

yhteistoiminnassa toimiva DNA estävä alue ( 468-510 tähdettä) tunnistettiin C-terminaali Ets-1-transkriptiotekijän [34]. Mikäli ERM ja PEA3 transkriptiotekijöitä, kaksi verkkotunnuksia sijaitsevat N- ja C-terminaalista suhteessa niiden ETS- domain estämällä DNA sitoutumisaffiniteetti [35] – [38]. Yksi verkkotunnus vastaa tähteeseen 280-360 jäämiä ERM transkriptiotekijän, mukana esto ERM DNA: ta sitovan kapasiteettia. Nämä alat ovat runsaasti proliinijäännösten yleensä puuttuu α-kierteisen rakenteita. Mekanismi, jolla kaksi domeenia yhteistoiminnassa estävät ERM DNA: ta sitova on erilainen kuin havaittu tapauksessa Ets-1-transkriptiotekijän. DNA sitova aktiivisuus Ets domain riippuu autoinhibitorinen moduuli [39]. Affiniteetti Ets verkkotunnuksen Ergp55 ja E74 ja talousjohtajien promoottori-DNA oli yhdenmukainen sen havainnon saatu siinä tapauksessa, että edellä transkriptiotekijöiden.

Pyöreät dichorism analyysi Ergp55 polypeptidien.

pyöreä dichorism tekniikka oli käytetään tunnistamaan toisen ja kolmannen asteen rakenteet Ergp55 polypeptidejä. Täyspitkä ja pienempiä Ergp55 polypeptidit sisältävät suuria α-kierteisen ja satunnainen kela rakenteita. CD data arvioi 35% α-heliksin ja 49% satunnaisia ​​kela rakenteiden täyspitkä Ergp55 proteiinia. Tutkimukset lämpöstabiilisuuden ja lämpötilan vaikutus täyspitkä Ergp55 proteiini osoitti, että proteiini tehtiin muutos sekundaarirakenteen kuumennettaessa. Sekundaarinen rakenne on jälleen jäähdyttämisen jälkeen proteiinia 80 ° C: sta 20 ° C: ssa. Lyhyt Lämpötilan muutos on todennäköisesti ole mitään vaikutusta sekundäärirakenteeseen Ergp55 proteiinin.

Mallinnus ja simuloinnissa täysipitkän Ergp55.

molekyylimallitus ja simuloinnissa analyysi osoitti, että täyspitkä Ergp55 hankkii joustava ja erittäin pitkänomainen rakenne. Vain PNT ja Ets verkkotunnukset ovat rakenteeltaan proteiinia ja pitkä joustava alueita havaitaan N- ja C-terminuksessa Ergp55. Rakenne PNT domeenin Ergp55 koostuu neljän kierteen kimppu Sam rakenne (34). ETS verkkotunnus Ergp55 on järjestetty hyvin siivekäs helix-turn-helix kanssa järjestelmän α

1β

1β

2α

2α

3β

3β

4α

4 [40] – [41]. Keskeinen CAE /CD verkkotunnuksia sisältävät yhden pienen kierteen asemassa 220. Toissijainen ja epäjärjestyksessä ennustaminen analyysi Ergp55 myös tukee havaintoa havaittu mallinnus ja simuloinnissa tutkimuksia Ergp55. Kaikki nämä havainnot tukevat joustavaa, ei-globularity ja erittäin pitkänomainen rakenne Ergp55 proteiinin.

Yhteenvetona olemme tunnettu rekombinantti täyspitkä ja pienempien polypeptidien Ergp55 tuotettujen

E. coli

. Ergp55 polypeptidit puhdistettiin yli 95%: n puhtaudella määritettynä massaspektrometrian ja SDS-PAGE-analyysi. Rakenteellinen Tässä esitetyt tiedot osoittivat todisteita joustava ja erittäin pitkänomainen rakenne täyspitkän Ergp55 proteiinia. Sitova analyysi käyttäen DNA-sekvenssit E74 ja talousjohtajien promoottorit osoittavat, että enää fragmentit Ergp55 (yli kanoninen Ets domain) osoitti todisteita autoinhibition.

Kiitokset

Tekijät Kiitokset Sita R. Meena ja Pratibha niiden ehdotukset nykyisen projektin. Tunnustamme apua kehittynyt instrumentointi tutkimuksen laitos (AIRF) ja Keski-instrumentointi laitos (CIF) Jawaharlal Nehrun yliopisto antaa meille mahdollisuuden toteuttaa CD kokeilu. Kirjoittajat kiittää SPR laitteet laitoksen AIIMS, Delhi antaa meille mahdollisuuden suorittaa DNA sitomiskokeissa.