Krooninen sairaus

tiivistelmä

Edellinen raportti osoitti, että epidermaalisen kasvutekijän (EGF) edistää syövän etenemiseen. Useat tutkimukset osoittivat, että kasvutekijät voivat indusoida hemioksigenaasi (HO) -1 lauseke, suojaavat solun vahinkoa ja syöpäsolujen lisääntymistä. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet osallistuminen c-Src, NADPH-oksidaasi, reaktiivisen hapen (ROS), PI3K /Akt, ja NF-KB: n signalointireiteissä EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen ihmisen HT-29-koolonsyöpäsoluihin . Hoito HT-29-solujen EGF aiheutti HO-1 ilmaistava pitoisuudesta ja ajasta riippuva käytöstapoja. Treatment of HT-29-solujen kanssa, AG1478 (EGF-reseptori (EGFR) estäjä), pieniä häiritseviä RNA-EGFR (EGFR siRNA), dominantti negatiivinen mutantti c-Src (c-Src DN), DPI (an NADPH-oksidaasi-inhibiittori) , glutationi (AN ROS-inhibiittori), LY294002 (PI3K-estäjä), ja Akt DN inhiboi EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen. Stimulaatio solujen EGF aiheutti lisääntymisen c-Src fosforylaation Tyr406 ajassa riippuvalla tavalla. Treatment of HT-29-solujen EGF indusoitu lisääntyminen p47

phox

translokaation päässä sytosolista kalvoja. EGR aiheuttama ROS tuotanto inhiboitui DPI. Stimulaatio solujen EGF johti kasvuun Akt fosforylaation Ser473, joka inhiboitui c-Src DN, DPI, ja LY 294002. Lisäksi, hoito HT-29-solujen kanssa, dominantti negatiivinen mutantti, lKB (IκBαM) esti EGF indusoimaan HO-1 ilme. Stimulointi solujen EGF aiheuttamaa p65 translokaation päässä sytosolin ytimiä. Treatment of HT-29-solujen EGF indusoitu lisääntyminen KB-lusiferaasiaktiivisuuden, joka inhiboitui c-Src DN, LY 294002, ja Akt DN. Lisäksi EGF aiheuttama paksusuolensyöpä soluproliferaatiota estyi Sn (IV) protoporfyriini-IX (snpp, HO-1-estäjä). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että c-Src, NADPH-oksidaasi, PI3K ja Akt signalointireitteihin tärkeitä rooleja EGF-indusoidun NF-KB: n aktivaation ja HO-1 ilmentymisen HT-29-soluja. Lisäksi yli-ilmentyminen HO-1 välittää EGF-indusoidun paksusuolisyövän soluproliferaatiota.

Citation: Lien GS, Wu MS, Bien MY, Chen CH, Lin CH, Chen BC (2014) epidermaalisen kasvutekijän stimuloi Nuclear Factor -κB aktivointi ja hemioksigenaasi-1 Expression kautta c-Src, NADPH Oksidaasipositiivinen, PI3K ja Akt Human koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 9 (8): e104891. doi: 10,1371 /journal.pone.0104891

Editor: Chuen-Mao Yang Chang Gung University, Taiwan

vastaanotettu 25 maaliskuuta, 2014; Hyväksytty: 29 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 14 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Lien et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki oleelliset tiedot sisältyvät paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia (101TMU-WFH-02-1, 102TMU-WFH-01-1, ja 103TMU-WFH-02-1) alkaen Taipei Medical University-Wan Fang sairaala. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Noin miljoona tapausta paksusuolen syöpä diagnosoidaan maailmanlaajuisesti vuosittain ja kasvava suuntaus esiintyvyys paksusuolen syövän Aasian maissa oli raportoitu viime vuosina [1]. Aiemmat raportit osoittivat, että saanti punainen ja lihajalosteiden liittyy lisääntynyt paksusuolen syövän riskiä, ​​koska punaista lihaa sisältää noin 10 kertaa korkeampi hemin kuin valkoista lihaa [2]. Hemioksigenaasi (HO) soittaa elintärkeä tehtävä fysiologisten rauta homeostaasiin, antioksidanttipuolustuksen, ja syöpäsolujen lisääntymistä [3]. HO katalysoi hemin ja biliverdiini vapauttaen ekvimolaariset määrät hiilimonoksidia, ja samanaikaisesti induktio rauta-ionikomplekseja ferritiini [4]. Kolme isoformia HO ​​(HO-1, -2, ja -3) tunnistettiin [5]. HO-1 on indusoituvan entsyymin aiheuttama kasvutekijät kuten transformoiva kasvutekijä (TGF) -β ja epidermaalinen kasvutekijä (EGF), mikä päärooli tämän entsyymin suojaavat oksidatiivisen vahinkoa [6], [7]. Lisäksi HO-1 on usein erittäin yliaktiivista paksusuolensyöpä verrattuna ympäröivään terveeseen kudokseen, mikä viittaa siihen, että syöpäsolut erittäin ilmentävät HO nauttia kasvuetua ja antaa solujen vastustuskykyä reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) -välitteisen syöpähoitoihin [8] – [10 ].

merkitys EGR kehityksessä paksusuolen syövän korostettiin viime vuosina [11]. Yhä useammat todisteet osoittavat, että EGF säätelee useita biologisia toimintoja, kuten syöpäsolun etenemistä, solujen lisääntymistä, ja etäpesäkkeiden [11]. EGF-reseptorin (EGFR), on osoitettu osallistuvat paksusuolen syövän kehittymisessä [11]. EGF sitoutuu solunulkoiseen domeeniin EGFR, joka aktivoi alavirran signalointireittien, kuten c-Src ja inositoli-3-kinaasi (PI3K) /Akt reitit [12], [13]. Aiempi raportti osoitti, että yli-ilmentyminen HO-1: lla on suojaava rooli lieventävien soluvaurioita ja syöpäsolujen selviytymisen [6], [7]. Kuitenkin vähän tiedetään miten EGF säätelee induktio HO-1-proteiinin ekspression.

Expression of

HO-1

geeni ensisijaisesti säädellään transkription tasolla aktivoimalla transkriptiotekijät, mukaan lukien ydin- tekijä (NF) -κB, aktivoiva proteiini (AP) -2, ja heat shock-reagoivan elementin (HSE) [14], [15]. NF-KB on tärkeä transkriptiotekijä säätelemiseksi HO-1 ilme [16]. Levossa, NF-KB: n sitoutumista IκBα estää NF-KB tumaansiirtymiseen ja transkription toimintaa [17]. Kuitenkin kasvutekijät indusoivat IKB kinaasi (IKK) aktivointi, IκBα fosforylaation, ja IκBα hajoamista. Tämä prosessi vapauttaa aktiivista NF-KB: n, kanssa, joka sitten pois sytosolin ytimiä, sitomiseksi HO-1-promoottorialueen ja aiheuttaa

HO-1

geenin ilmentymistä [16], [18]. Useat raportit osoittivat, että EGF-indusoidun NF-KB: n aktivoituminen tapahtuu läpi useita EGFR-riippuvainen molekyylejä, mukaan lukien PI3K, proteiinikinaasi C (PKC) ja IKK-signalointireitteihin [19]. Edellisessä tutkimuksessa kävi ilmi, että TGF-β indusoi HO-1 ilmentymisen kautta PI3K /Akt-riippuvaisen NF-KB: n signalointireitin [6]. Kuitenkin vähän tiedetään signaalitransduktion tapahtuma; erityisesti, c-Src, NADPH-oksidaasi, ROS, ja PI3K /Akt reittejä, jotka johtavat NF-KB: n ja ilmentymisen HO-1: EGF: n stimulaatio, ei ole kuvattu hyvin.

Useita tutkimukset osoittivat, että c-Src ja NADPH oksidaasin tärkeä asema asiakkuutta geeniekspressioiden [20], [21]. Aiempi raportti osoitti, että trombiinin aiheuttama HO-1 ilmentymisen ja oli riippuvainen c-Src-välitteinen NF-KB [20]. Äskettäin havaittiin, että NADPH oksidaasin sukupolven ROS tuotanto on puolustava vastaus isäntä apoptoosin ja solutransformaatiota [22]. NADPH-oksidaasi säätelee p47

phox

, joka kykenee tukemaan aktivaation NADPH-oksidaasin [23]. Se tiedetään, että EGF stimuloi NADPH oksidaasin aktiivisuus tuottaa superoksidi, ja syntyy superoksidi nopeasti dismutatoitu H

2O

2, joka johtaa EGF aiheuttamaa fysiologisia reaktioita [24]. Kuitenkin vain vähän tietoa on saatavilla roolista NADPH oksidaasin säätelyssä NF-KB: n aktivaation ja HO-1 ilmentymisen seuraavat EGF stimulaation ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Meidän havainnot osoittivat, että EGF laukaiseminen c-Src, NADPH-oksidaasi, ROS, ja PI3K /Akt signalointireittien NF-KB: llä on tärkeä rooli EGF-indusoitu HO-1 ilmentyminen ihmisen keuh- paksusuolen syöpäsoluja. Lisäksi, HO-1 on osallisena EGF-indusoidun paksusuolisyövän soluproliferaatiota.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

EGF saatiin PeproTech (Lontoo, UK). LY 294002, diphenyleneiodonium kloridi (DPI), glutationi, ja 2 ’, 7’-dichloroflurorescein diasetaatti (DCF-DA) hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Dominoiva negatiivinen mutantti (DN) IκBα (IκBαM) hankittiin Clontech (Mountain View, CA, USA). pGL2-ELAM-Luc (joka on valvonnassa yhden NF-KB sitoutumiskohta) ja pBK-CMV-LacZ oli ystävällisesti toimittanut Dr. Wan-Wan Lin (National Taiwan University, Taipei, Taiwan). DN Akt (Akt DN) luovutti ystävällisesti Dr. Che-Ming Teng (National Taiwan University, Taipei, Taiwan). PcDNA plasmidi saatiin tohtori M.-C. Chen (Taipei Medical University, Taipei, Taiwan). Ac-Src DN ostettiin Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). Vasikan sikiön seerumia (FCS), penisilliiniä /streptomysiiniä ja Lipofectamine-Plus-reagenssia hankittiin Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA). Sn (IV) protoporfyriini-IX (snpp) hankittiin Frontier Scientific (Logan, UT, USA). Ohjaa pieni häiritsevä (si) RNA, EGFR siRNA, ja vasta-aineita spesifisiä HO-1, c-Src, p47

phox

, Akt1 /2, EGFR, Na

+ /K

+ ATP, p65, IκBα, ja anti-hiiren ja kaniinin vastainen immunoglobuliini G (IgG) konjugoidun piparjuuren peroksidaasit (HRPs) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Akt fosforyloitiin Ser473 ja c-Src fosforyloitiin Tyr416 hankittiin New England Biolabs (Beverly, MA, USA). Lamin A /C ostettiin GeneTex (Ipswich, CA, USA). AG1478 ja BrdU soluproleferaatiomäärityksessä kit ostettiin Merck (Darmstadt, Saksa). Kaikki materiaalit natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ostettiin Bio-Rad (Hercules, CA, USA).

Soluviljely

HT29 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa saatiin American Type Culture Collection (Livingstone, MT, USA), ja soluja pidettiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% FCS: ää, 100 U /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiiniä kostutetussa 37 ° C: ssa inkubaattorissa. Saavutettuaan konfluenssin, solut ympättiin 6-cm: n maljoihin ja Western-blottauksella ja RT-PCR (RT-PCR), päälle 12-kuoppaisille levyille solujen transfektio ja KB-lusiferaasin aktiivisuuden määrityksessä, ja 96-kuoppalevyille että BrdU soluproliferaation ja ROS: n syntyminen määrityksissä.

Western blot-analyysi

määrittämiseksi ilmaisuja HO-1, c-Src fosforyloitiin Tyr416, Akt fosforyloitiin Ser473, c-Src, Akt1 /2, ja EGFR HT-29-solut, proteiinit uutettiin, ja Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [6]. Lyhyesti, HT-29-soluja viljeltiin 6-cm: n maljoille. Saavuttamisen jälkeen yhtymäkohta, kasvualusta poistettiin ja korvattiin 2 ml: lla RPMI 1640 ilman FCS: ää 24 tunnin ajan. Soluja käsiteltiin ajoneuvoon ja EGF, tai esikäsitelty erityisiä estäjien kuten seurasi EGF. Inkubaation jälkeen solut pestiin kahdesti jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja liuotetaan lyysipuskurissa, joka sisälsi 10 mM Tris (pH 7,0), 140 mM NaCl, 2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), 5 mM ditiotreitolia, 0,5% NP-40, 0,05 mM pepstatiinia, ja 0,2 mM leupeptiiniä. Näytteet on yhtä suuret määrät proteiinia (50 ug) altistettiin SDS-PAGE, jonka jälkeen se siirretään polyvinylideenifluoridia (PVDF) kalvo, joka inkuboitiin sitten Tris-puskuroituun suolaliuokseen, jossa oli 0,1% Tween-20 (TBST), joka sisälsi 5% naudan seerumin albumiini. Proteiinit saatiin näkyviin tietty primaaristen vasta-aineiden ja sitten inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita. Immunoreaktiivisuus havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia seuraten valmistajan ohjeita. Kvantitatiiviset tiedot saatiin käyttämällä computing densitometriä tieteellistä kuvantamisjärjestelmien (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).

RNA ja RT-PCR

monistamiseksi ihmisen paksusuolen syöpäsolu HO- 1-mRNA: n, spesifisiä alukkeita syntetisoitiin. HO-1 Käytetyt alukkeet olivat: sense 5′-CTG TGT AAC CTC TGC TGT TCC-3 ’ja antisense 5′-CCA CAC TACCTG AGT CTA CC-3’. p-aktiinin mRNA-tasot käytettiin sisäisenä kontrollina. Β-aktiini Käytetyt alukkeet olivat: sense 5′-GAC TAC CTC AAG ATC CT-3 ’ja antisense 5′-CCA CAT CTG CTG GAA GGT GG-3’. HT-29-solut ympättiin 6-cm: n maljoihin. Saavuttamisen jälkeen konferenssi, väliaine aspiroitiin ja korvattiin ruselatusaineeseen puuttuu FBS: ssa yön yli, minkä jälkeen soluja stimuloitiin EGF eri aikavälein. Kokonais-RNA puhdistettiin käyttämällä TRI-reagenssia (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA), ja RT-PCR suoritettiin käyttäen RT-PCR-kittiä (Epicentre, Madison, WI, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden, käyttäen 10 ui kokonais-RNA: ta templaattina. Yhtä suuret määrät (10 ug cDNA) kunkin PCR-tuotetta PCR-monistettiin Tag-polymeraasin 35 sykliä, jotka koostuivat 30 s 95 ° C: ssa, 30 s 58 ° C: ssa, ja 1 min 72 ° C: ssa. Monistettu cDNA ajettiin 2% agaroosigeeleillä ja visualisoitiin etidiumbromidilla. RT näytteet myös käyttää tuottamaan β-aktiini-PCR-tuotteet, ja niiden määrä käytettiin sisäisenä kontrollina.

transfektio ja KB-lusiferaasianalyysissä

HT-29-soluja (2 x 10

5) ympättiin 12-kuoppalevyille, ja solut transfektoitiin seuraavana päivänä käyttämällä Lipofectamine Plus-reagenssia, joka sisälsi 0,5 ug pGL2-ELAM-Luc ja 0,5 ug pBK-CMV-Lac Z: 24 tunnin kuluttua väliaine imettiin ja korvattiin tuoreella RPMI 1640 vailla FCS, ja sitten soluja stimuloitiin EGF (0.3~10 ng /ml) vielä 24 tunnin ajan ennen kuin korjattu. Vaikutusten arvioimiseksi osoitettujen inhibiittorit, lääkkeet lisättiin soluille 20 min ennen kuin lisättiin EGF. Vaikutusten arvioimiseksi c-Src DN ja Akt DN solut kotransfektoitiin pGL2-ELAM-Luc ja pBK-CMV-Lac Z: Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin lusiferaasin määritystä (Promega, Madison, WI, USA), ja normalisoitui pohjalta Lac Z ilmaisua. Taso induktio lusiferaasiaktiivisuudeksi verrattiin suhteena solujen kanssa ja ilman stimulaatiota.

Analyysi p47

phox

translokaatio

havaitsemiseksi p47

phox

translokaatio, sytosolisia ja kalvo fraktiot erotettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Lyhyesti, HT-29-soluja käsiteltiin EGF: llä osoitettujen pitoisuuksien tai eri aikavälein. Inkubaation jälkeen solut laitettiin jäihin, huuhdeltiin PBS: lla, suspendoitiin uudelleen homogenointipuskuriin (20 mM Tris-HCl, 0,5 mM EGTA, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,5 mM PMSF, ja 10 ug /ml leupeptiiniä (pH 7,5) ) ja sonikoitiin. Lysaatti erotettiin sytosolisia ja membraanifraktioiden sentrifugoimalla 40000 x

g

45 min. Tasoilla p47

phox

proteiinin sytosolin ja membraanin fraktiot määritettiin Western blot -analyysillä. α-tubuliinin ja Na

+ /K

+ ATP käytettiin vastaavasti sisäisten kontrollien sytosolisen ja membraanifraktioiden.

Analyysi p65 translokaation

havaitsemiseksi p65 translokaatio HT-29-soluja käsiteltiin EGF: llä osoitettujen pitoisuuksien tai eri aikavälein. Sytosolin ja ydin- proteiinin fraktiot erotetaan sitten kuten aiemmin on kuvattu [25]. Lyhyesti, HT-29-solut pestiin jääkylmällä PBS: llä, ja pelletoitiin. Solupelletit suspendoitiin uudelleen hypotoniseen puskuriin (10 mM HEPES (pH 7,9), 10 mM KCI, 0,5 mM DTT, 10 mM aprotiniini, 10 mM leupeptiiniä, 20 mM PMSF: ää) 15 minuutin ajan jäissä, ja vorteksoitiin 10 s. Tumat pelletoitiin sentrifugoimalla 15000 x

g

1 min. Sisältäviä supernatantteja soluliman proteiinit kerättiin. Pelletti, joka sisälsi ytimiä suspendoitiin uudelleen hypertoninen puskuriin (20 mM HEPES (pH 7,6), 25% glyseroli, 1,5 mM MgCl

2, 4 mM EDTA: ta, 0,05 mM DTT, 10 mM aprotiniini, 10 mM leupeptiiniä, 20 mM PMSF: ) 30 minuuttia jään päällä. Sisältäviä supernatantteja ydin- proteiinit kerättiin sentrifugoimalla 15000 x

g

2 min. Proteiini tasoja p65 on sytosolisten ja ydin- fraktiot määritettiin Western blot -analyysillä. α-tubuliinin ja Lamin A /C käytettiin vastaavasti sytosoliin ja ydinvoiman sisäistä valvontaa.

määrittäminen ROS tuotanto

ROS määritettiin edellä kuvatulla [26]. Lyhyesti, HT-29-solut ympättiin 96-kuoppalevyille RPMI 1640, joka sisälsi 10% FCS: ssa yön yli. Seuraavana päivänä väliaine aspiroitiin ja korvattiin tuoreella RPMI 1640 vailla FCS. 24 tunnin kuluttua solut käsiteltiin ROS-herkkien DCF 15 min, ja sitten stimuloitiin EGR: n osoitetut pitoisuudet tai eri aikavälein. Vaikutuksen määrittämiseksi DPI (10 uM), lääke lisättiin soluihin 20 min ennen kuin lisättiin EGF. Fluoresenssi määritettiin Varioskan Flash fluoresenssilevylukijaa (Thermo Electron Corporation, Marietta, OH, USA), jossa eksitaatio 485 nm ja emissio 528 nm: ssä.

BrdU-solujen lisääntymisen määrityksessä

HT -29-soluja (7,5 x 10

3 solua /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille RPMI 1640, joka sisälsi 10% FCS: ää. Seuraavana päivänä väliaine aspiroitiin ja korvattiin tuoreella RPMI 1640 vailla FCS: ssa yön yli. Soluja esikäsiteltiin snpp (3 uM) 20 minuutin ajan, ja sitten stimuloitiin EGF: ää (10 ng /ml) vielä 48 tunnin ajan. BrdU lisättiin soluihin viime 2 h inkuboinnin. Poistamisen jälkeen merkintöjä väliaineen, solut kiinnitettiin ja DNA denaturized. Sisällytetty BrdU leimattiin monoklonaalisella anti-BrdU-vasta-aineen ja vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta, joka oli konjugoitu peroksidaasilla. Immuuni- komplekseja havaittiin myöhemmin substraatin reaktiota ja kvantifioidaan mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa.

Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvo ( SEM) vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) ja sen jälkeen, kun se on tarkoituksenmukaista, Dunnettin useita-vertailujen testiä käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi välisen eron avulla.

p

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

EGF indusoi HO-1 ilmentymisen HT-29-solujen

Useat tutkimukset osoittivat, että HO-1 ilmentymisen tärkeä suojella aganist syöpäsolun kuoleman. Ihmisen HT-29 koolonsyöpäsoluihin valittiin tutkimaan signaalien kulkureiteillä EGF HO-1 ilme. Hoito EGF (1~10 ng /ml) 18 h indusoi HO-1-proteiinin ilmentymisen konsentraatiosta riippuvalla tavalla (kuvio. 1A); tämä induktio ilmennyt myös ajasta riippuva tavalla, alkaa 8 tuntia ja saavuttaa maksiminsa 12~18 h (Fig. 1 B). 18 tunnin kuluttua hoidon 10 ng /ml EGF: ää, HO-1-proteiini oli kasvanut 185 ± 11% (Fig. 1 B). Seuraavaksi määritetään, onko EGR voi aiheuttaa HO-1-mRNA ilme. Käsittelyn jälkeen, induktio HO-1-mRNA oli alkanut 2 tuntia ja saavutti maksimin 4 tunnin kuluttua EGF: ää (10 ng /ml) jälkeen (kuvio. 1C). Kuten edellä on mainittu, EGFR on tarpeen EGF vastauksia. Tutkia, EGFR on osallisena EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen, AG1478 käytettiin. Kuviossa 1D on esitetty, että esikäsittely HT-29-solujen kanssa, AG4178 (10 uM) estivät täysin EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen (

n =

3). Edelleen vahvistaa roolia EGFR EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen, EGFR siRNA käytettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 1E, transfektio EGFR siRNA (25 nM) myös estivät täysin EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen (

n

= 3) (Kuva. 1 E). Vahvista tulokset EGFR siRNA kokeilussa käytetään myös EGFR siRNA tukahduttamaan EGFR-proteiinin ilmentymistä in HT-29-soluja. Huomasimme, että EGFR siRNA selvästi esti EGFR proteiinin ilmentymisen (Fig. 1 F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että EGFR on mukana EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen HT-29-soluja.

A, HT-29-soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien EGF 18 tuntia, ja sitten HO-1 ja a-tubuliinin proteiinin tasot määritettiin. Immunobloteissa edustavat kolmea koetta, jotka on esitetty keskiarvona ± SEM. *

p

0,05, verrattuna kontrolliryhmään. B, Soluja inkuboitiin eri aikavälein EGF (10 ng /ml), ja sitten HO-1 ja α-tubuliinin proteiinin tasot määritettiin. Immunobloteissa edustavat kolmea koetta, jotka on esitetty keskiarvona ± SEM. *

p

0,05, verrattuna kontrolliryhmään. C, Soluja käsiteltiin eri aikavälein EGF (10 ng /ml). Kokonais-RNA valmistettiin, ja RT-PCR suoritettiin, kuten on kuvattu ”Materiaalit ja menetelmät”. Taces edustavat Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta. D, Soluja esikäsiteltiin 30 min ajan 10 uM AG1478 ja sitten stimuloitiin 10 ng /ml EGF: ää vielä 18 tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen, HO-1 ja α-tubuliinin proteiinin tasot määritettiin. Immunobloteissa edustavat kolmea koetta, jotka on esitetty keskiarvona ± SEM.

* p

0,05 verrattuna EGF hoitoon. E, Solut transfektoitiin lyhytaikaisesti 25 nM ohjaus siRNA (con siRNA) tai 25 nM EGFR siRNA: ssa 24 tuntia ja sitten stimuloitiin EGF: ää (10 ng /ml) vielä 18 tunnin ajan. Solut lysaatit valmistettiin ja sitten immunoblotattu vasta HO-1 tai α-tubuliinin. Immunobloteissa edustavat kolmea koetta, jotka esitetään keskiarvona ± S.E.M.

* p

0,05 verrattuna EGF hoitoon. F, Solut transfektoitiin lyhytaikaisesti 25 nM ohjaus siRNA (con siRNA) tai 25 nM EGFR siRNA: ssa 24 tuntia. Kokosolulysaateista valmistettiin ja sitten immunoblotattu vasta-aineita EGFR tai α-tubuliinin. Jälkiä edustavat Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta.

c-Src on osallisena EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen HT-29-solujen

tutkia c-Src, alavirran proteiini EGFR [12], saattaa olla ratkaiseva merkitys EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen, c-Src DN plasmidia käytettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, transfektio HT-29-solujen kanssa, c-Src DN (0,5 ug) esti EGF-indusoitu kasvu HO-1 ilmentymisen 91 ± 6% (

n

= 3). Lisäksi taso c-Src-proteiini ilmentyy erittäin c-Src DN plasmidi transfektoitiin HT-29-soluja verrattuna pcDNA-plasmidi transfektoitiin HT-29-solut (Fig. 2B). Asetus c-Src aktivoituminen tapahtuu seurauksena fosforylaation useita sivustoja tiettyjä tähteitä, kuten Tyr416 [25]. Seuraavaksi tarkastellaan lähemmin c-Src fosforylaation Tyr416 EGF stimulaation HT-29-soluissa käyttäen anti-fosfo-c-Src-vasta-aineen Tyr416. Kuvio 2C esittää, että hoito HT-29-soluja, 10 ng /ml EGF: ää indusoi kasvua fosforylaation c-Src on Tyr416 ajassa riippuvalla tavalla. Fosforylaatiota c- Src at Tyr416 aloitettiin 0,5 min ja säilyi kunnes 30 minuutin kuluttua EGF stimulaation (Fig. 2C, yläpaneeli). Proteiini taso c-Src ei vaikuttanut EGF stimulaation (Fig. 2C, alapaneeli). Nämä tulokset viittaavat siihen, että c-Src aktivointi tarvitaan EGF-indusoidun HO-1 ilmentymisen.

A, HT-29-soluja transfektoitiin ohimenevästi 0,5 ug pcDNA tai 0,5 ug dominantti negatiivinen mutantti c- src (c-src DN) 24 tuntia. Soluja käsiteltiin EGF: llä (10 ng /ml) vielä 18 tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen, HO-1 ja α-tubuliinin proteiinin tasot määritettiin. Immunobloteissa edustavat kolmea koetta, jotka on esitetty keskiarvona ± SEM.

* p

0,05 verrattuna EGF hoitoon. B, solut transfektoitiin lyhytaikaisesti joko 0,5 ug: lla pcDNA tai 0,5 ug c-Src DN 24 tuntia. Tasot c-Src tai α-tubuliinin proteiinin ilmaisuja määritettiin Western blot-analyysi. Jälkiä edustavat Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta. C, HT-29-soluja inkuboitiin 10 ng /ml EGF: ää varten 0~30 min. Solulysaatit valmistettiin ja c-Src Tyr416 fosforylaatio määritettiin immunoblottauksella käyttäen fosfo-c-Src Tyr416-vasta-ainetta. Immunobloteissa edustavat kolmea koetta samanlaisin tuloksin.

osallistuminen NADPH oksidaasin ja ROS EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen HT-29-solujen

c-Src voisi aktivoida määrä signaalien kulkureiteillä, kuten NADPH oksidaasin [27]. Aikaisempi tutkimus osoitti, että HT-29-solut pääasiallisesti ilmaisi NADPH oksidaasin 1 [28]. Sen määrittämiseksi, ovatko NADPH oksidaasin on keskeinen rooli EGF-indusoitu HO-1 ilmaisu, NADPH oksidaasin estäjä, DPI [29], käytettiin. Kuvio 3A osoittaa, että EGF-indusoitu HO-1 ekspressio inhiboitui DPI (3 ja 10 uM), jonka pitoisuus-riippuvaisella tavalla. Kun HT-29-soluja käsiteltiin 10 uM DPI, EGF-indusoitu HO-1 ekspressio inhiboitui 86 ± 13% (

n =

3) (Fig. 3A). Aikaisempi tutkimus osoitti, että induktio p47

phox

translokaation päässä sytosolin kalvoihin johti lisääntymiseen NADPH oksidaasin aktiivisuus [27]. Seuraavaksi me yrittäneet selvittää, onko EGF aktivoi NADPH-oksidaasin tutkimalla translokaatio p47

phox myynnissä maassa sytosolista membraanijakeen käyttäen Western blot-analyysi. Stimulaatio solujen 10 ng /ml EGF: ää varten 0~30 min johti translokaatio p47

phox myynnissä maassa sytosolifraktion kalvoon osa alkaa 3 minuutin ajan, vaikutus säilyi 10 minuutin ajan, ja laski 30 min (Kuva. 3B). Lisäksi olemme havainneet, että solujen inkubointi EGF: llä (1~10 ng /ml) tuotti konsentraatiosta riippuvaisen nousun translokaatiota p47

phox myynnissä maassa sytosolifraktion kalvoon osa (Fig. 3C). Aiemmassa tutkimuksessa todettiin, että NADPH-oksidaasi-syntyvän ROS osallistuu signalointireitin, joka johtaa induktioon HO-1 ilmentymisen käsittelemällä savukkeen savu-uutteen [29]. Sen tutkimiseksi, ROS voi välittää EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen, glutationi käytettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 3D, solujen käsittely glutationi (3~10 mM), inhiboitui merkittävästi EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen. Kun soluja käsiteltiin 10 mM glutationi, EGF-indusoitu HO-1-ekspressio vaimenee 91 ± 6% (

n

= 3). (Fig. 3d). Nämä tulokset viittaavat siihen, että NADPH-oksidaasin ja ROS osallistuvat EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa.

HT-29-soluja esikäsiteltiin 30 min ajan 3~10 uM DPI (A) ja 3 ~ 10 mM glutationia (D) ja sitten stimuloidaan 10 ng /ml EGF. Jälkeen 18 h inkubaation, HO-1 ja α-tubuliinin proteiinin tasot määritettiin. Immunobloteissa edustavat kolmea koetta, jotka on esitetty keskiarvona ± SEM.

* p

0,05 verrattuna EGF hoitoon. HT-29-soluja käsiteltiin 10 ng /ml EGF: ää varten osoitetun aikavälein (B) tai käsiteltiin eri pitoisuuksilla EGF (C). Sytosolin ja membraanin fraktiot eristettiin sitten, ja proteiinin tasot p47

phox

on sytosolin ja membraanin fraktiot määritettiin Western blot -analyysillä. Na

+ /K

+ ATP ja α-tubuliinin käytettiin vastaavasti kalvo ja soluliman sisäistä valvontaa. Tyypillisiä jälkiä edustavat kolmea koetta samanlaisin tuloksin.

NADPH oksidaasin on mukana EGF-indusoitu ROS tuotanto HT-29-solujen

Edellisen raportin osoitti, että EGF indusoi kasvu ROS sukupolven HT-29-solujen [30]. Seuraavaksi tutkimme roolia NADPH oksidaasin EGF-indusoidun ROS tuotanto. Kuvio 4A ja 4B osoittavat, että hoito HT-29-solujen EGF indusoitu lisääntyminen ROS sukupolven ajasta ja pitoisuudesta riippuvainen tavat (Fig. 4A, 4B). 20 minuutin kuluttua hoidon 10 ng /ml EGF: ää, ROS tuotanto oli kasvanut 62 ± 5% (

n

= 3) (Fig. 4B). Lisäksi, solujen esikäsittely DPI (10 uM) inhiboi merkittävästi EGF-indusoitu ROS: n syntyminen 85 ± 8% (

n

= 3) (Fig. 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että NADPH-oksidaasi välittää EGF-indusoitu ROS: in HT-29-soluja.

HT-29-soluja inkuboitiin eri aikavälein EGF (10 ng /ml) (A) tai niitä inkuboitiin EGF: n ( 1~10 ng /ml) 20 min ajan, ja sen jälkeen ROS tuotanto määritettiin. Tiedot edustavat kolmea koetta, jotka esitetään keskiarvona ± S.E.M. *

p

0,05, verrattuna kontrolliryhmään. C, HT-29-soluja esikäsiteltiin 30 min ajan 10 uM DPI ja sitten stimuloitiin 10 ng /ml EGF: ää. 20 minuutin kuluttua inkubaation ROS tuotanto määritettiin. Tiedot edustavat kolmea koetta, jotka esitetään keskiarvona ± S.E.M.

* p

0,05 verrattuna EGF hoitoon.

PI3K /Akt osallistuu EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen HT-29-solujen

Aikaisempi tutkimus osoitti, että PI3K /Akt tärkeä rooli HO-1 ilme [31]. Ymmärtää yhteys HO-1 ilmentymisen EGR ja sen PI3K /Akt signalointireitin, PI3K-estäjä (LY 294002) ja Akt DN, käytettiin. Kuten on esitetty kuviossa 5A, EGF-indusoitu HO-1 ekspressio inhiboitui 10 uM LY 294002 85 ± 8% (Fig. 5A). Lisäksi transfektio HT-29-soluja, 0,5 ug: n Akt DN inhiboi myös EGF-indusoitu HO-1 ilmentymisen 78 ± 8% (kuvio. 5B). Lisäksi taso Akt-proteiinia ekspressoidaan voimakkaasti Akt DN plasmidi transfektoitiin HT-29-soluja verrattuna pcDNA-plasmidi transfektoitiin HT-29-solut (Fig. 5C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PI3K /Akt-signalointireitin on tarpeen EGF-indusoidun HO-1 ilmentymisen. Ser473 jäännös fosforylaatiota Akt jonka PI3K-riippuvaisen signalointireitin aiheuttaa entsymaattinen aktivointi [32]. Vahvista tärkeä rooli PI3K /Akt in HO-1 ilmentymisen, päätimme Akt Ser473 fosforylaation vastauksena EGF. Kuten on esitetty kuviossa 5D, hoito HT-29-soluja, 10 ng /ml EGF: ää johti ajasta riippuva fosforylaatio Akt Ser473. Akt Ser473 fosforylaation korkeimmillaan 5~10 min, ja sitten oli laskenut 20 min kuluttua EGF hoidon (Fig. 5D, yläpaneeli). Proteiini tasot Akt1 /2 ei vaikuttanut EGF: n jälkeen (kuvio. 5D, alapaneeli).

HT-29-soluja esikäsiteltiin 30 min ajan 10 uM LY 294002 (A) tai transfektoitiin ohimenevästi 0,5 ug pcDNA tai 0,5 ug vallitsevan negatiivisen mutantin Akt (Akt DN) (B) 24 tuntia. Soluja stimuloitiin sitten EGF: ää (10 ng /ml) vielä 18 tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen, HO-1 ja α-tubuliinin proteiinin tasot määritettiin. Immunobloteissa edustavat kolmea koetta, jotka on esitetty keskiarvona ± SEM.

* p

0,05 verrattuna EGF hoitoon. C, solut transfektoitiin lyhytaikaisesti joko 0,5 ug: lla pcDNA tai 0,5 ug Akt DN 24 tuntia. Tasot Akt tai α-tubuliinin proteiinin ilmaisuja määritettiin Western blot-analyysi. Jälkiä edustavat Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta. D, HT-29-soluja inkuboitiin 10 ng /ml EGF: ää varten 0~60 min. Solulysaatit valmistettiin ja Akt Ser473 fosforylaatio määritettiin immunoblottauksella käyttämällä fosfo-Akt-Ser473-vasta-ainetta. Immunobloteissa edustavat kolmea koetta samanlaisin tuloksin.

c-Src, NADPH oksidaasin, ja PI3K välittävät EGF aiheuttama Akt fosforylaation Ser473 HT-29-solujen

Seuraavaksi tutki roolit c-Src, NADPH oksidaasin, ja PI3K in EGF-indusoidun Akt Ser473 fosforylaation. Kuten on esitetty kuviossa. 6, transfektio HT-29-solut, joilla on c-Src DN (0,5 ug) heikennettyä EGF-indusoidun Akt Ser473-fosforylaation (kuvio. 6A). Olemme edelleen tutki NADPH oksidaasin ja PI3K välittävät Akt fosforylaation. Huomasimme, että EGF-indusoidun Akt Ser473 fosforylaation myös inhiboi DPI (10 uM) (Fig. 6B). Samoin EGF aiheuttama Akt Ser473 phosphohrylation myös inhiboi LY294002 (10 uM) (Fig. 6C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että aktivaatio c-Src, NADPH-oksidaasi, ja PI3K tapahtuu ylävirtaan Akt EGF-indusoitu signalointireitin.

HT-29-soluja transfektoitiin ohimenevästi 0,5 ug pcDNA tai 0,5 ug Kuten on esitetty kuviossa.