Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Useimmissa tapauksissa kohdunkaulan syöpiä, HPV-DNA on integroitunut genomiin karsinoomasoluja. Tämä mutaatiotutkimukset lisäys muodostaa erittäin spesifinen molekyyli merkki kasvaimen DNA jokaiselle potilaalle. Kiertävä kasvain DNA (ctDNA) on syntymässä markkeri kasvaimen dynamiikka, joka havaitseminen edellyttää erityistä molekyyli- motiivi. Sen määrittämiseksi, onko sekvenssi solun virus- risteykseen voitaisiin käyttää kliinisessä käytännössä spesifinen merkki ctDNA, analysoimme sarja kohdunkaulan syövän potilaiden seerumit.

menetelmät ja havainnot

Serum yksilöitä 16 potilasta diagnosoitu HPV16 /18-liittyvän kohdunkaulasyövän ja joiden viruksen integraation lokuksessa oli aiemmin lokalisoitu, analysoitiin. Juokseva seerumia, otettu eri aikoina aikana sairauden, olivat myös saatavilla kahden näistä tapauksista. ctDNA löytyi 11 ulos 13 potilaalla kasvaimen kokoa suurempi kuin 20 mm diagnoosi ja analyysi peräkkäisten seeruminäytteiden osoitti ctDNA pitoisuus potilaiden seerumissa liittyi kasvain dynamiikkaan.

Johtopäätökset

Kerromme että HPV mutaatiostatuksesta lisäys muodostaa erittäin spesifinen molekyyli merkkiaine ctDNA HPV-liittyvä kasvain potilailla. Tällä alkuperäinen lähestymistapa, ctDNA havaittiin useimmissa kohdunkaulan syövän potilaalla vaiheen I ja ctDNA pitoisuuden havaittiin vastaamaan kasvaintaakkaa. Sen lisäksi mahdollisten prognostisten ja ennustearvo, HPV mutaatio lisäys muodostaa todennäköisesti uuden molekyyli korvike minimaalinen jäljellä taudin ja Subkliinisen uusiutumisen HPV: hen liittyvän kasvain. Tämä on erittäin tärkeää näkökulmasta erityinen anti-HPV terapia.

Citation: Campitelli M, Jeannot E, Peter M, Lappartient E, Saada S, de la Rochefordière A, et al. (2012) ihmisen papilloomaviruksen Mutaatiotutkimukset Insertion: Erityiset Marker kiertävän Kasvain DNA kohdunkaulan syövän Potilaat. PLoS ONE 7 (8): e43393. doi: 10,1371 /journal.pone.0043393

Editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugali

vastaanotettu: 23 helmikuu 2012; Hyväksytty: 20 heinäkuu 2012; Julkaistu: 24 elokuu 2012

Copyright: © Campitelli et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain kumppanuuden La Maison GOYARD ja antelias lahja Ms A. Mauresmo. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tätä työtä tukee osittain kumppanuuden La Maison GOYARD, ylellisyyttä luggage- maker, läpi tapahtuma ”Un Luggage pour Curie”. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Erikoismateriaalityypit ihmisen papilloomavirusten (HPV) tunnustetaan suuret etiologisena tekijä kohdunkaulan neoplasia [1]. Pre-invasiivisia vaurioita, virusgenomien ovat läsnä episomaalisena molekyylien tumassa infektoitujen solujen. Useimmissa tapauksissa invasiivisen karsinooman, mutta HPV-DNA-sekvenssit integroidaan solun genomiin [2], [3], [4]. Virusgenomin integraatio siis on ratkaiseva askel kasvainten synnyssä [5]. Yksi ainutlaatuinen viruksen integraatio sivusto on löydetty yli 80% kohdunkaulan syövistä [6].

ominaisuus klonaalisuuden spesifisyys ja stabiilisuus ajan HPV-DNA viemistä genomiin karsinoomasoluja muodostavat hyvin erityinen geenimerkkiä kasvaimen DNA. Viimeaikaiset tiedot ovat osoittaneet, että mutantti-DNA voitiin havaita veren potilailla, joilla on kasvaimia, ja että määrä verenkierrossa kasvaimen DNA (ctDNA) liittyi kasvaimen dynamiikka [7]. Tämä avaa suuria näkymiä käytöstä ctDNA kuin kasvain biomarkkereiden syöpäpotilailla [8]. Vuonna pitkälle kohdunkaulan syöpä, useat tutkimukset ovat raportoineet näyttöä kiertävän HPV-DNA (c-HPV-DNA) [9], [10], [11] tai liikkeitä HPV-RNA [12]. Nämä tutkimukset osoittivat, että oli mahdollista havaita virusnukleiinihapoilla veressä potilaiden kohdunkaulan syöpä, mutta puutteen vuoksi herkkyys [10], [13], [14] ja kyseenalainen spesifisyys [11], [13] data oli vähän kliinistä vaikutusta. Tässä yhteydessä olemme suunnitelleet tutkimuksen, jossa arvioidaan arvoa insertiomutaatiolla HPV DNA merkkiaineena havaitsemiseksi ja kvantifiointia ctDNA diagnoosin seerumissa potilailla, joilla on invasiivisen kohdunkaulan syövän. Lisäksi olemme tutkineet vaihteluita ctDNA pitoisuuden aikana tauti. Lisäksi verrata herkkyys alkuperäistä ja erityisiä analyysilla, joka perustuu havaitsemiseen HPV-DNA-sekvenssit, me tarkasteltiin myös c-HPV-DNA käyttäen alukkeita sijaitsee E7 HPV16 /18-geenin.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja kasvaimia

Vuodesta sarja HPV16 (14 tapausta) tai HPV18 (2 tapausta) kohdunkaulansyövän kertynyt vuosien 2001 ja 2011, päätimme viruksen lisäys lokuksen DIPS- PCR-menetelmällä [15]. Vuonna 16 tapauksessa seerumin yksilöitä otettu diagnoosi ennen hoitoa olivat saatavilla. Kahdessa näistä tapauksista, ylimääräisiä peräkkäinen seerumia aikana otettujen taudin oli myös saatavilla. Neljätoista kasvaimet olivat invasiivisia squamous kohdunkaulan ja kaksi rauhas. Mukaisesti Ranskan asetuksen kaikki potilaat ilmoitettiin ja ei vastustanut niiden biologisia näytteitä käytetään tutkimukseen. Virus- kuorma, Tuumorinäytteiden määritettiin kvantitatiivisen PCR: n (qPCR) käyttämällä alukkeita suunniteltiin E7 HPV16 /18-geenin, kuten aiemmin on kuvattu [6]. Koska integroitu HPV-DNA-sekvenssit voivat esittää monistuksen lisäyskohta lokuksessa, mutaatiostatuksesta insertion kopiomäärän arvioitiin myös qPCR käyttämällä alukkeita ja reagenssit esitetään taulukossa S1.

KLK3

geenin asema otettiin kaksi kopiota varten.

DNA seerumin analyysejä

DNA eristettiin 200 ui seerumista QIAamp Min Eluoidaan Virus Spin Kit (Qiagen® , Courtaboeuf, Ranska) seuraten valmistajan ohjeita. Eluutiovaihe suoritettiin 25 ui mukana puskuria. Eristetty DNA mitattiin käyttämällä Real-Time kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR), joka perustuu Long ryhmittyneinä Nuclear elementit (LINE) sekvenssin havaitsemiseksi [16]. Laimennokset normaalia ihmisen DNA: ta käytettiin standardeja ja PCR suoritettiin 25 ul: Sybr® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Villebon-sur-Yvette, Ranska), alukkeiden yhdistelmä (1 uM) ja 2 ui eluoitua DNA: ta kanssa seuraavat sykliolosuhteita: 15 min 95 ° C: ssa ja 45 sykliä (15 s, 95 ° C, 15 s, 61 ° C; 1 min, 72 ° C), jota seurasi dissosiaation vaiheessa (15 s, 95 ° C; 15 s , 60 ° C, 15 s, 95 ° C). RT-qPCR käyttäen Sybr®Green (Applied Biosystems) on suunniteltu spesifisesti monistamaan solu-virus risteykseen DNA-sekvenssit (eluoitiin DNA 2 ui) tai HPV16 E7-DNA (eluoitiin DNA 2 ui) 400 nM kutakin aluketta: n lopulliseen tilavuuteen 25 ui. Kukin sarja alukkeita testattiin sarjalaimennoksia (50 ng /ul 0,5 pg /pl) vastaavia kasvaimen DNA Tris-EDTA-puskuria, jossa thermocycler olosuhteissa 15 minuuttia 95 ° C: ssa ja 45 sykliä (15 s, 95 ° C , 1 min, 62 ° C), jota seurasi dissosiaation vaiheessa (15 s, 95 ° C; 1 min, 60 ° C; 15 s, 95 ° C). Alukesekvensseissä ja MgCl

2 pitoisuudet esitetään taulukossa S1. Herkkyys PCR-määritys oli yhtä suuri tai suurempi kuin 5 pg /ul validoida alukesarjat. Jotta voitaisiin lisätä herkkyyttä havaita, 10 rinnakkaista RT-qPCR tehtiin kunkin seeruminäytteen havaitsemiseksi ctDNA ja c-HPV-DNA. Määrä ctDNA 200 ui: aan seerumia vastasi summa ctDNA havaittu kunkin positiivisen jäljitellä. Pitoisuus ctDNA lopulta ilmaistu kopiota /ml seerumia.

Tulokset

Kliinisesti FIGO vaiheet olivat Ib IVa ja yksi tapaus oli lantion uusiutumisen kohdunkaulan SCC (taulukko 1). Tuumorin koko vaihteli 10-120 mm. Käytettävissä okasolusyöpä antigeeni (SCC) arvot vaihtelivat välillä 1,1 ng /ml 17,4 ng /ml (kynnys positiivisuus: 1,5 ng /ml). HPV-DNA integroitiin eri loci (taulukko 1). Virusmäärä kasvaimen yksilöitä vaihteli 0,5-160 HPV16 genomeja solua kohden (0,8 10

06-24 10

6 HPV16 kopiota /ug DNA: ta). Pitoisuus verenkierrossa isäntä-DNA vaihteli välillä 6 10

1-77 10

3: sta /ml seerumia (taulukko 1). Pystyimme tunnistamaan ctDNA 11: ssä 16 potilaalla diagnosoitiin invasiivisen kohdunkaulan syövän. Kolme negatiivinen tapauksissa vastasi varhaisessa vaiheessa (Ib) karsinooma, joiden koko vaihtelee 10-20 mm (taulukko 1). Seerumin ctDNA vaihteli 5-890 kopiota /ml seerumia, joka edustaa 0,01%: sta 25% verenkierrossa isäntä-DNA. c-HPV-DNA havaittiin 13/16 tapauksissa kolme alkuvaiheessa tapausta pysyy negatiivisena. Arvot vaihtelivat 5-8,5 10

3: sta /ml seerumia (taulukko 1). Kolme eniten arvoa (8,5, 3,5 ja 3,4 10

3: sta /ml) vastasi tapauksissa korkea viruskuormaa Tuumorinäytteiden, mikä viittaa siihen, että DNA on peräisin episomaalisesta molekyyleistä havaittiin myös määrityksessä.

ctDNA dynamiikka analysoitiin juokseva seerumia kahdella potilaalla. Ensimmäinen potilas oli yhdistettyjä kemosädehoito seurasi kohdusta ja emättimestä brakyhoito ja leikkaus (kuva 1, tapaus nro 6). CtDNA arvo pieneni hoidon aikana ja oli nolla loppuun mennessä hoidon jolloin täydellisen histologisen vasteen havaittiin on kohdunpoisto yksilö. Kaksi kuukautta myöhemmin potilaan kehittämä 8 mm maksan etäpesäke ja ctDNA tuli jälleen havaittavaksi. Lisääntyvää ctDNA havaittiin myöhemmin, kun potilas vatsan solmuun toistumisen. Sama dynamiikka havaittiin toisella potilaalla hoidettu yksinomaan kemosädehoito (kuva 1, tapaus nro 13). Kiinnostava aikana seurannan, kun taas lantion MRI ei osoittanut mitään merkittäviä muutoksia, nousua ctDNA havaittiin. Pian tämän jälkeen potilas esitti vatsan pahenemisvaiheen, johon liittyi korkea ctDNA. Sama dynamiikka havaittiin c-HPV-DNA.

Keskustelu

Me raportoimme tässä, että käyttämällä HPV integraatio mutaation molekulaarinen merkkiaine, ctDNA voitu havaita seerumissa eniten potilaat diagnosoidaan invasiivisen kohdunkaulan syöpä yli Ib ja että määrä ctDNA heijastuu kasvain dynamiikkaa. Koska virus integraatio sivusto on yksilöllinen kullekin potilaalle, tämä merkki on hyvin erityinen, paljon enemmän kuin SSC merkki [17]. Mitä herkkyys, voisimme havaita ctDNA 11 ulos 13 (85%) potilailla, joilla on vaiheen II-IV kasvaimet, nopeudella pääosin suurempi kuin 12% [9], 18% [13], 20% [14] ja 50% [ ,,,0],11] positiivisuuden toistaiseksi raportoitu c-HPV-DNA. Käytäntö 10 jäljittelee havaitsemiseksi ctDNA kussakin seeruminäytteen voi selittää lisääntynyt herkkyys meidän määrityksen. Esimerkiksi suurin osa positiivisen tapauksissa alle 50% toistojen toimitti näyttöä ctDNA. Kuitenkin 2 13 tapausta, joiden kasvaimen kokoa 20 mm, ei ctDNA löytynyt taas c-HPV-DNA havaittiin. Molemmat tapaukset vastasivat kasvaimiin matalalla HPV paikoilleen kuormituksen (≤1 copy /solu). Sen sijaan, kohdunkaulansyövän solut usein satama free HPV-genomien, jotka julkaistiin myös yleiseen verenkiertoon, mikä lisää nopeutta havaitseminen kiertävän viruksen DNA: ta. Kuitenkin tämä etu voidaan tasapainottavat riski väärän positiivisuutta. Esimerkiksi määritykset perustuvat havaitsemiseen HPV DNA vääriä positiivisia hinnat 13,5% terveillä henkilöillä ja 33% CIN3 potilaista [11]. Lisäksi, usein eroja HPV-genotyyppien havaittu kohdunkaulan syövän ja seerumissa samoista potilaista on myös raportoitu [13]. Nämä ongelmat olisi poistettava riittävä valvonta spesifisyyden ja kliiniseen tarkoitukseen, c-HPV-DNA-analyysi voi edustaa käyttökelpoinen vaihtoehto, jossa tunnistus tai käyttää viruksen-soluliitos sekvenssit on vaikeaa.

analyysi peräkkäisiä seerumia osoitti dynamiikkaa tulokset: pitoisuus ctDNA laskenut alle hoitoon ja lisääntynyt aikaan uusiutumisen. Positiivisuus ctDNA edeltää radiologisen uusiutumisen yhdessä tapauksessa ja siihen liittyi 8 mm maksan etäpesäke toinen. Kasvain DNA voidaan helpommin vapautua kasvainkudoksen vastaa taudin uusiutumiseen tai etäpesäkkeiden kuin primäärivamma. Se voisi myös johtua verenkierrossa olevia kasvainsoluja. Erityinen ja määrällinen molekulaarinen merkkiaine on ctDNA voidaan käyttää kulun seuraamiseksi kohdunkaulan syövän. Hoidon alussa, ctDNA voi auttaa arvioimaan taudin ennustetta ja kasvaimen herkkyys hoidon. Suuremmat tulevaisuutta koskevia tutkimuksia on tarpeen vahvistaa tämän apuohjelman. Seuranta-aikana, ctDNA keskittyminen voi olla erittäin spesifinen korvikemarkkerilta minimaalinen jäljellä tauti ja piilevä uusiutumisen. Tämä on erittäin tärkeää näkökulmasta erityinen anti-HPV hoito [18], jonka potentiaali tehokkuus on pitkälti riippuvainen kasvain massa. Näitä lähestymistapoja voitaisiin helposti laajentaa muihin HPV-liittyvien kasvainten, peräaukkokanavaan ja pään ja kaulan alueen syöpä, esim. Lokalisaatio HPV Integraatiokohdan ei tällä hetkellä arvioitu kliinisessä työssä. Uudet teknologiat kuten Next Generation Sequencing [19], mutta pitäisi helpottaa tätä määritystä ja tarjoavat optimaalisen molekulaarinen kasvainten muokata käsittelyyn potilaista. Lisäksi herkkyys havaita ctDNA voidaan helposti lisätä, vain analysoimalla suurempi määrä seerumia ja /tai lisäämällä tehokkuutta PCR-määritys, esimerkiksi käyttämällä digitaalista PCR [20] .Nämä ennakoiden helpottaa arvioinnin käytön ctDNA kliinisen onkologian ja parantavat biologista seurantaa hoidetuista potilaista kohdunkaulan syöpä.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Alukkeet sekvenssit ja reagenssit havaitsemiseksi ct-DNA: ta.

doi: 10,1371 /journal.pone.0043393.s001

(DOC) B

Kiitokset

kiittää F Radvanyi varten hedelmällisiä keskusteluja ja Ms A. Le Cunff ja Z. Maciorowski avusta valmistelussa käsikirjoituksen.