Krooninen sairaus

tiivistelmä

konstitutiivista ilmentymistä korkean riskin HPV E6 ja E7 virus- oncogenes on suurin syy kohdunkaulan syövän. Kattavasti tutkia koostumus HPV16 varhaisen selostukset ja niiden genomista kommentointi, kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma epiteelikudoksissa 40 HPV16-infektio kerättiin analyysiä papilloomaviruksen onkogeenin selostukset (APOT). Havaitsimme eri transkriptio malleja HPV16 onkogeenien etenemisessä kohdunkaulan solumuutoksia kohdunkaulan syövän ja tunnistettu yksi uusi transkriptio. Useita-integraatio tapahtumia kudoksissa kohdunkaulakarsinooman (CxCa) ovat huomattavasti useammin kuin huonolaatuisen levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisia vauriot (LSIL) ja korkea-asteen levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisia vauriot (HSIL). Lisäksi useimmat cellular geenejä tai lähellä näitä integraatio sivustot ovat syöpään liittyvien geenien. Yhdessä tämä tutkimus osoittaa, että multiple-integraatiot HPV-genomin aikana pysyviä virusinfektio, joka näin muuttaa ekspressiokuvioita virus- onkogeenien ja kotouttamiseen liittyviin solun geenejä, on ratkaiseva rooli etenemisessä kohdunkaulan vaurioiden kohdunkaulan syöpään.

Citation: Lu X, Lin Q, Lin M, Duan P, Ye L, Chen J, et al. (2014) Multiple-Integrations HPV16 Genome ja Altered transkriptio Viral Onkogeenit ja Cellular geenit liittyvät kehittämiskeskuksen kohdunkaulasyövän. PLoS ONE 9 (7): e97588. doi: 10,1371 /journal.pone.0097588

Editor: Xuefeng Liu, Georgetown University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. lokakuuta, 2013 Hyväksytty: 21 huhtikuu 2014; Julkaistu: 3. heinäkuuta 2014

Copyright: © 2014 Lu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee avustuksia National Natural Science Foundation of China (81001343, 81172463), Department of Education Zhejiangin maakunnassa (Y200907403) ja Wenzhou Science and Technology Bureau (Y20090103, Y20100175 ja H20100063). Kummeilla kunhan rahoitus kokeiden ja kerätä näytteitä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvien naisten yleisin kuolinsyy maailmassa. Jatkuva infektion korkean riskin ihmisen papilloomaviruksen (HR-HPV), kuten genotyyppi 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, ja 59 ovat välttämättömiä etenemistä kohdunkaulan solumuutoksia [1], ja yli 50% tapauksista johtuu HPV16 [2]. Viral onkoproteiineja, E6 ja E7, HR-HPV: t edistävät kohdunkaulan syövän synnyn inaktivoimalla kaksi suurta solujen kasvaimia estävä proteiineja, p53 ja pRb vastaavasti [3] – [6]. Nämä viruksen onkoproteiineja infektoituneissa soluissa voi myös aiheuttaa kromosomissa epävakautta ja kertymistä mutaatiotapahtumasta [7].

viruksen varhaisen promoottorin lied ylävirtaan E6 ORF, kuten P97 in HPV16 [8], [9] , P99 in HPV31 [10], [11] ja P105 in HPV18 [12], [13], vastaa lähes kaikkien varhaisen geenin ilmentymistä, kuten E6 ja E7. Upstream cis-elementtejä LCR vuorovaikutuksessa solun transkriptiotekijöiden ja viruksen transaktivaattori /repressorin E2 ja säätelevät transkription HPV E6 ja E7-geenit [8], [14]. Lisäksi DNA: n metylaatio [15], vaihtoehtoiset Silmukointi [9], [16], [17] ja varhainen poly (A) site polyadenylaatiosignaali [18], [19] osallistuu myös sääntelyn E6 ja E7-geenin ilmentymisen [19].

Toistaiseksi täyden transkriptio kartta onkogeenis- HPV16 ja HPV18 HPV-tartunnan saaneiden solujen ja lauttaa kudokset on rakennettu [19], [20].

on hyvin tiedossa että integraatio HPV genomeja on keskeinen tapahtuma kohdunkaulan syövän synnyn [21], [22]. Paitsi virusgenomin integraatio aktivoinnissa solu- onkogeenien tai inaktivoimaan solujen kasvain tukahduttava geenejä [23] – [25], HPV-genomin integroitumista isännän genomiin voi muuttaa transkription kuviot sekä virus- ja isäntägeenejä [26]. On raportoitu, että integraatio HPV-genomien voi häiritä viruksen E2-geenin soluihin ja vapauttaa sen estoa viruksen varhaisen promoottorin, joka ohjaa ekspressiota E6 ja E7 [27]. Lisäksi, E6 ja E7-transkriptien cotranscribed solun sekvenssit voivat olla vakaampi, ja siten parantaa niiden ilmentymistaso [28] – [30].

transkriptio kuviot HPV16 kudoksissa kohdunkaulan syövän, on raportoitu [ ,,,0],26], [31]. Oli episomaalisessa HPV varhainen Geenitranskriptikuvion (E7-E1

∧E4) ja useita integroituja HPV selostukset (esimerkiksi E7-E1

∧cellular RNA, E7-E1

∧E4-RNA jne ) in HPV16-tartunnan kudoksiin. Kuitenkin transkription valinta vastauksena ympäristön muutoksiin on dynaaminen prosessi saavuttaa optimaalinen geenien ilmentyminen solujen eloonjäämisen ja syövän syntymistä [32]. Tässä tutkimuksessa käytimme modifioitua tekniikkaa monistamisen papilloomaviruksen onkogeenin selostukset (APOT) [26] kattavasti tutkia rakennetta ja sekvenssit HPV16 E7-sukuisia kopioita ja niiden genomista huomautus 8 LSIL (heikompilaatuisen levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisten vaurioita), 24 HSIL (korkealaatuisesta levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisten vaurioita), ja 8 CxCa HPV16-positiivisia kohdunkaulan biopsianäytteissä.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

kudosnäytteitä ensiarvoisen kohdun kohdunkaulan vauriot, jotka sisältävät dysplastic epiteelin /kasvainsolut kerättiin toisen Affiliated sairaala Wenzhoun Medical University (Zhejiang, Kiina) joulukuusta 2010 huhtikuussa 2012. läsnäolo HR-HPV havaittiin HCII testi, ja seulontaa HPV16 HR HPV–positiiviset näytteet tehtiin HPV-genotyyppien havaitseminen pakki (KaiPu, Guangzhou, Kiina) [33]. Kaikki ne eivät saaneet sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta ja kullekin potilaalle tehtiin kolposkopisesti suunnattu koepala. Talteen biopsianäytettä jakaa kahtia. Yksi annos on annettu standardin histopatologiset diagnoosi, kun taas toinen osa on tallennettu RNAlater (Ambion, Austin, Texas, USA) -80 ° C: ssa myöhempää analyysiä. Pohjalta histopatologisten diagnoosin, näytteet jaettiin LSIL (CIN I, n = 8), HSIL (CIN II, n = 22; CIN III, n = 16) ja kohdunkaulan karsinooma (CxCa, n = 17). Muihin 8 kohdunkaulan kudosten normaali sytologia ja HPV-DNA negatiivisuus kontrolleina saatiin potilaista, joille tehtiin kohdunpoisto vuoksi hyvänlaatuisia gynekologisia sairauksia. Tutkimus on hyväksynyt Medical eettiselle toimikunnalle Toinen Affiliated sairaala Wenzhoun Medical University. Kaikki naiset ilmoitettiin ja antoivat kirjallisen suostumuksensa osallistua tutkimukseen.

RNA ja DNA Isolation tipranaviiria

Yhteensä RNA koepalanäytteistä edellä kuvattu eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Kalifornia ., USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Poistamaan jäljellä DNA saastuminen, RNA valmistetta käsiteltiin RNaasittomalla DNaasi I (Takara, Dalian, Kiina) mukaan valmistajan protokollaa. Puhdistettu kokonais-RNA liuotettiin RNaasittomaan veteen ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Pitoisuus ja puhtaus kokonais-RNA kvantitoitiin UV-spektrofotometrillä 260 nm: ssä ja 280 nm: ssä ja 1% agaroosigeelielektroforeesilla. Vain RNA-näytteet, joiden A260 /A280-suhde 1,8-2,0 ja korkea eheys käytettiin edelleen koetta.

Käänteinen transkriptio ja PCR monistaminen Transcripts

APOT määritys edellä raportoidun perustui sisäkkäistä PCR-reaktiot [26], jotka voivat vain vahvistavat runsas selostukset ja jättää selostukset melko pienet näytteissä. Näin muutetun APOT määritystä käytettiin monistamaan HPV-onkogeenin transkriptit. Alukkeet nämä reaktiot suunniteltu mukaan Klaes R, et ai [26]. Kokonais-RNA (1 ug) käänteisesti transkriptoitiin käyttäen oligo (dT)

17-aluketta, joka on kytketty kytkijäsekvenssin

RT

[34] mukaisesti valmistajan protokollan käänteistranskriptaasin Kit (TOYOBO, Japani) . Tarkistaa, ensimmäisen juosteen cDNA: n laatu, PCR: llä käyttäen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) spesifisen alukkeita suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [35]. Ensimmäisen juosteen cDNA: n käsitti viruksen onkogeenin sekvenssit monistetaan sen jälkeen PCR: llä käyttäen

p1

-HPV16E7 spesifistä aluketta (5′-CGGACAGAGCCCATTACAAT-3 ’) ja linkkeri

p0

(5′-GACTCGAGTCGACATCG-3 ’) kuin käänteinen aluke; ja PCR-monistus suoritettiin reaktio 50 ul. Eri aiemmista selvityksistä, PCR syklit nostettiin 35, ja kaikki näytteet vain suorittaa yhden kierroksen PCR-reaktion. Voit tarkistaa spesifisyyden Tässä menettelyssä ”miinus-RT” ohjaus, jossa käänteistranskriptaasi jätettiin pois reaktiot suoritettiin myös rinnakkain.

Sequence Analysis of Transcripts

APOT vahvistus tuotteet olivat visualisoidaan 2,5% agaroosigeelielektroforeesilla. PCR-tuotteet kohteisiin leikattiin geelistä ja uutetaan käyttämällä DNA agaroosigeelillä elpyminen Kit (TianGen, Peking, Kiina). Vastaava amplimeres kloonattiin kloonausvektoriin (transgeeniset, Peking, Kiina) ja DNA-sekvenssianalyysi toteutettiin käyttäen ABI 3730 XL Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA) standardimenetelmien mukaisesti. Sekvensointi tulokset analysoitiin käyttämällä BLASTN ohjelmaa saatiin National Center for Biotechnology Information, USA. Lisäksi kromosomaalisen integraation sivustot todenneessa käyttämällä National Center for Biotechnology Information (BLAST) ja Euroopan molekyylibiologian laboratorion (EBI). Lisäksi hauras sivustoja ja geenien integraatio kohtaa määritettiin käyttäen NCBI hauras sivustokartan katsojan ja UCSC Blat työkalu.

Tulokset

erityisyys APOT määrityksen HPV16 onkogeeni transkriptien

periaate APOT määritys on 3 ”nopean cDNA-päiden monistamisen (RACE) PCR-määritys, että saavutetaan vahvistus ja kloonaus välisen alueen yhden lyhyen sekvenssin cDNA-molekyylin ja sen tuntematon 3′-päähän [34]. Yleensä integroitu selostukset peräisin E6- ja E7-oncogenes kattaa virussekvensseistä niiden 5′- päistä ja isännän genomin sekvenssit niiden 3′- päissä [26]. Odotettu koko saatujen tuotteiden episomina johdettuja transkripti on 1050 emäsparin [26] amplimerit että näkyvissä koko poikkeaa 1050 emäsparin voidaan siis johdettu integroituneen HPV-genomin. Todistamaan spesifisyyden modifioidun APOT määritys, cDNA HPV16-positiivisia CaSki- solu sisältää integroidun HPV16-genomin ja HPV-negatiiviset normaali kohdunkaulan kudoksissa, samoin kuin ”miinus-RT” valvontaa, jossa käänteistranskriptaasi jätettiin pois reaktiot olivat käyttää. Vahvistetut tuotteet cDNA HPV16-positiivisia CaSki- solu oli samanlainen kuin edellinen raportin [26], kun taas mitään RT tuote saatiin normaalista kohdunkaulan kudoksissa ilman HPV-DNA ja ”miinus-RT” ohjaus (kuva 1). Nämä tiedot osoittivat, modifioitu APOT määritystä voidaan erityisesti havaita transkriptien johdettu integroituneen HPV-genomin.

Amplified tuotteita CaSki-solujen (A), HPV16-positiivisia CxCa (B), HPV-negatiivinen normaali kohdunkaulan kudoksissa (C) ja ”miinus-RT” valvontaa RNA, joka eristettiin HPV 16-positiivisen näytteen (D), jonka APOT määrityksen erotettiin 2,5% agaroosigeeleillä. V:

Lane 1-3

kolme erilaista niitä siirrostetaan CaSki- soluja (positiivisena valvonta); B:

Lane 1-3

kolme erilaista CxCa näytteitä; C:

Lane 1-3

kolme erilaista normaali kohdunkaulan kudoksissa (negatiivisina kontrolleina); D:

Lane 1-3

oli vastaten näytettä B, vastaavasti; M: 250 emäsparin DNA-tikkaat.

Ominaisuudet HPV16 onkogeenin selostukset kudoksissa CIN-muutos ja kohdunkaulan karsinooma

analysoida HPV16 onkogeeni selostukset, 40 HPV16-positiivisia kohdunkaulan yksilöt (LSIL, n = 8; HSIL, n = 24; CxCa, n = 8), jossa hyvälaatuista RNA valittiin joukosta 63 kerätyt näytteet tässä tutkimuksessa. Yhteensä 133 selostukset sisältävän viruksen fragmentteja löydettiin. Näistä selostukset, 64-fragmentit oli HPV16 E7-E1 * sekvenssit niiden 5′- päistä ja liittyy välittömästi polyA niiden 3′- päihin (kuva S1). Lisäksi oli neljä erilaista häiriöiden E1 alueen nt 880, 949, 1054 ja 1234 (kuvio S2). Selostukset sisältävät E1-silmukointidonori signaalin nt 880 [36] voisi kuulua mahdollisten episomaaliset kuvio, kun taas transkripti, joka typistää nt949 saattaa johtua sisäisistä Pohjamaalauksessa oligo dT [37]. Muita selostukset joka typistää nt 1054 ja 1234 eikä sisälsi polyA-sekvenssit, eikä polyadenylaatiokohtana kuuluvat virus- tai isäntä, niin nämä selostukset nähtiin mahdollisia integroituja malleja. Lisäksi olemme myös löysi toisen transkripti, joka on E7 ORF saumattu nt 880 E4-akseptorisilmukointikohtien sivustolla osoitteessa nt 3358 ja sen jälkeen saumattu päässä E4-silmukointidonori signaalin nt 3632 L1-akseptorisilmukointikohtien sivuilla osoitteessa 5639, ja lisäksi lopetetaan poly A (kuva S1). Tässä transkriptio, E4 ORF ei häiriinny. Puute silmukointidonoripaikan signaalin nt 5815 tässä transkriptio osoittaa, että HPV16-genomin häirinnyt nt 5815 voi myös osallistua virusgenomin integraatio.

Lisäksi oli 64 virus- selostukset suoraan kytketty isäntä genomiin sekvenssit ja ne olivat kaikki alkoi alusta eteenpäin-aluketta (p1) nt 729. Nämä HPV16 onkogeenin integroitu transkriptit voitaisiin jakaa kolme erilaista (kuvio 2). Näistä selostukset, tyyppi A on HPV16 E7-E1

* sekvenssit niiden 5′- päihin ja suoraan kytketty isäntä genomin sekvenssejä. Oli kuitenkin kaksi erilaista integrointi sivustoja E1-alue (at nt880 ja nt1107) tämäntyyppisessä (kuva S3). Sivusto at nt880 sisälsi E1-silmukointidonorin signaali kun sivuston katkaistu nt1107 ehkä todennäköisemmin linearize viruksen pyöreä genomin integroitumaan isännän genomiin. Transcript tyyppi B on E2 ORF järkkymässä nt2870 ja B-tyypin sekvenssin säveltää HPV16 E7-E1

∧E2

* sen 5′- päistä ja isännän genomin sen 3’päissä. Transkriptipitoisuuksissa C-tyypin, E1

∧E4 lopetuskodoni häiriintyy viruksen integraation ja koko E1

∧E4 ORF ilman lopetuskodoni on fuusioitu kehyksessä isäntä sekvenssin. Näistä kolmesta malleja, selostukset tyypin A ja C oli raportoitu Wentzensen N, et al. [31]. Kuitenkin transkriptio tyypin B ei ollut aiemmin raportoitu syövän esiasteita ja kohdunkaulan syöpä.

tyyppi A esitetään E1-sekvenssit saumattu suoraan solun reunustavan sekvenssin; Tyyppi B osoittaa E1 saumattu E2, E2 fuusioitu solun sekvenssi; Tyyppi C esittää E1 saumattu E4, jossa E4 törmätä solun järjestyksessä.

▴ on kaksi integrointi sivustoja E1 (data kuvassa S3). Laatikot sisällä viiltää edustavat kuuden nukleotidin välillä E7 ja E1gene.

Lisäksi HPV16 onkogeenien ilmi varsin erilaisia ​​transkriptio kuvioita kudoksissa LSIL, HSIL ja CxCa (kuvio 3, 4 ja taulukko 1). Näistä 3 transkription kuviot havaittu omassa potilailla, A-tyypin ja B-tyypin olivat muita yleisemmin kuin Type C, joka havaittiin lähes kaikissa patologinen tyyppejä, kun taas C-tyypin havaittiin vain näytteitä CxCa, joiden havaitseminen taajuudella 75% (taulukko 1 ja kuva 4). Kaikki potilaan näytteet näytetään A-tyypin, mutta kaikki CxCa näytteissä oli tyypin B ja C-tyypin (kuvio 4). Yhdenmukainen olettamus mahdollisten integraation virusgenomin myöhemmissä vaiheissa syövän kehittymisen [38], [39], esiintyvyys fuusio transkriptien olivat korkeammat HSIL ja CxCa kuin LSIL.

HPV16-positiivisia kliinisiä näytteitä LSIL, HSIL ja CxCa alistettiin APOT määrityksen ja erotettiin 2,5% agaroosigeeleissä,

Lane 1-5

tarkoittaa viittä eri näytettä kussakin patologinen tyyppi. M: 250 emäsparin DNA Tikkaat.

Integrointi sivustoja ja luonnehdinta solun viereisen sekvenssin

tunnistaa yksittäisiä kromosomipaikoissa, kaikki 64 fuusio-transkriptien joka sisältää viruksen ja solun sekvenssit analysoitiin edelleen BLASTN vertailuja koko genomin tietokannasta. Tuloksemme osoittavat, että kaikki kromosomit, paitsi CHR 21 ja X, integroitiin HPV16-genomi, joka vahvistaa aiemmissa raporteissa, ettei etuoikeutettu HPV Integraatiokohdan nähtiin valinnassa ihmisen kromosomi [40]. Joissakin loci, kuten 1p36.22, 1p36, 2p24, 2q33, 5q31.1, 5q31, 6p24, 8p23, 10q22.1, 13q22.1, 19q13 ja 19p13.3, on raportoitu aiemmin [31], [41] – [45] (taulukko 2). Näistä integraatio tapahtumia, neljätoista 40 näytteet omasivat useita integraatio sivustoja (taulukko 2). Vaikka paikallinen DNA uudelleenjärjestelyjä voi tapahtua usein ja nopeasti sen jälkeen, kun integraatio [43], huomasimme, että solun viereiset sekvenssit 11 kudoksista kartoitettu eri kromosomeihin, että niissä on useita toisistaan ​​riippumattomia integraatiot näistä näytteistä. Lisäksi olemme havainneet, että multiple-integraatio tapahtumia olivat merkitsevästi korkeammat CxCa kudoksissa (75%) kuin kaulan kudosten LSIL (50%) ja HSIL (53,8%). Seulonta kaikki integraation loci osoittaa, että 35 63 kartoitettiin integraation sivustot sijaitsivat tai lähellä hauras sivusto jossa etäisyys 26 emäsparin 5 Mbp (taulukko 2). Niistä 22 kartoitettu hauras sivustoja, FRA13A löytyi 4 itsenäistä näytteissä. Kaksikymmentäkaksi selostukset eivät liittyneet mihinkään hauras päällä.

Matkapuhelinverkko viereiset sekvenssit virus-solufuusio transkriptien tutkittiin edelleen tunnettuja geenejä. Useimmat näistä fuusioitunut transkriptien oli solun sekvenssin koodaavan suunnan tunnettuja geenejä ja kolmekymmentä transkriptien oli solun sekvenssi intronin alueelle ja 8 transkriptit fuusioitiin tunnetta eksonin sekvenssin ennustettu geenien (taulukko 2). Näistä ennusti geenit,

AMICA1

,

DAPK1

,

EBAG9

,

PIBF1

vaikutti kahdesti,

MRPS31

neljä kertaa ja

PRDX5

jopa kuusi kertaa viruksen integraation. Samaan aikaan, lähin isäntägeenejä kunkin integraatiokohdan suuntaan transkription analysoitiin myös (taulukko 2). Näistä ennustettu geenit integroidaan tai suljettu Integraatiokohdan tunnistimme useita kasvaimeen liittyvien geenien, kuten

PRDX5

,

CD28

,

ROCK2

,

RHOH

,

TIMP-3

ja

DAPK1

jne Kuten taulukosta 1, selostukset kirjoita D ja E havaittiin vain CxCa ja suurin osa niiden integrointi loci sijaitsivat tai lähellä hauras sivustoja FRA13C, FRA22B, FRA2I ja FRA13A. Geenit, jotka liittyvät selostukset tyypin D ja E olivat oncogenes (

CD28

ja

EBAG9

), tuumorisuppressorigeeneille (

TIMP-3

) tai kasvaimen liittyvien geenien (

PIBF1

ja

MRPS31

).

keskustelu

integrointi HPV-genomin osaksi isäntäkromosomeihin edustaa varhain klonaalinen tapahtuma antaa ylimääräistä valikoivaa etua laajentamiseen kasvaimen. Viral transkriptit on havaittu, että APOT määritys [26], [31], [42] – [45]. Vaikka APOT määrityksessä on joitakin etuja havaitseminen selostukset kromosomi integraation päällä, on olemassa useita rajoituksia. Ensinnäkin on vaikea monistaa hyvin pitkä integrointi-johdettu transkriptien, jotka aliarvioi kasvainten määrä integroitu HPV-DNA [45]. Toiseksi APOT on yksi tyyppi sisäkkäisiä PCR, jotka voivat osaltaan vahvistamaan selostukset korkeasti ja sivuuttaa ne on vähäisempää. Kolmanneksi On raportoitu, että sisäinen poly Primaarivaste voisi korvata oligo (dT) alukkeen tietyissä rajoissa, ja generoidaan joukko ankkuroitu oligo (dT) alukkeita cDNA-synteesiä varten. Nämä sekvenssit aiheuttama sisäinen pohjustus keskeytti tuottavan täyspitkän cDNA ja sekava analyysi vaihtoehtoisen silmukoinnin [37]. Meidän muunnettu APOT määrityksessä havaitsemaan transkription mallia kohdunkaulan kudosten, teimme monia virus- selostukset liitetty poly A tai isännän genomin sekvenssejä HPV16-tartunnan kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma epiteelikudosten. Huomasimme, että oli paljon viruksen transkriptien suoraan päättyi poly-A niiden 3′- päissä. Lukuun ottamatta raportoitu E1-silmukointidonoripaikan signaali päällä (nt 880), katkaisu sivustoja nt1054, 1234 ja 5815 eikä sisälsi sisäisen polyA-sekvenssit eikä polyadenylointisignaaleja pitäisi olla mahdollisia uusia integraatteja ja tarvitsevat tarkempaa analysointia. Viruksen-solufuusio transkriptio tyypin A ja C on raportoitu aiemmin [26], [31], [41]. Tyyppi C transkriptio, integrointi häiriöitä E4 lopetuskodonin johtaisi E4 käyttää isäntä lopetuskodoni. Tässä tutkimuksessa olemme myös huomannut, että jotkut kohdunkaulan syöpä näytteet sisälsivät kaikki kolme transkriptien olivat virus-solu fuusio dokumenttinsa.

HPV16 transkriptio kuvioita LSIL, HSIL ja CxCa olivat merkittävästi erilaiset. Olemme havainneet, että C-tyypin transkripti havaittiin vain näytteissä CxCa ja satunnaisen integraation sivustoja olemassa meidän kudosnäytteistä. Samanlaisia ​​Aiempien raporttien [31], [38] – [42], [46], [47], meidän tutkimus osoittaa, että HPV integraatio ei ole etuuskohteluun sivusto ihmisen genomin. Paitsi kromosomi 21 ja X, muut kromosomien ovat alttiita HPV16 integraatiota. Noin 55% integraatiot sijaitsevat tai lähellä hauras sivusto. Eroaa aiemmista raporteista [42], [45], huomasimme, että integraatio tapahtumia esiintyy usein useita kertoja huomattavasti enemmän kohdunkaulan syövän kuin LSIL ja HSIL. Nämä tiedot eivät ainoastaan ​​tarjoa biologista tukea epidemiologisia havainto, että pysyvä infektion tietyntyyppisiin HR-HPV on tärkeä syy kohdunkaulan syöpä [1], mutta myös osoittavat, että myöhemmät valinta ja mutaatioiden vielä-to-en- tunnistettu avain solua sääteleviä geenejä, edistää edelleen etenemistä kohdunkaulan syövän.

integrointi ei vain muuttaa transkription kuvio merkitystä säädeltyyn ilmentymisen viruksen onkogeenien, mutta vaikuttaa myös ilmentymisen vastaanottavan geenin viruksen genomin integroitumista. Integraatio muuttaa ilmaus isäntä geenien integraatio sivustoja, vaikka tämä tapahtuu sisällä intronisekvenssejä [43], [45]. Tutkimuksessamme olemme määritelleet laaja syöpään liittyvien geenien integraatio sivustoja ja reunustavan sekvenssin alueita. Useimmat geenien integraatio sivustoja liittyivät kasvainten kehittymiseen, ja yhdeksäntoista geenit olivat yhteydessä kohdunkaulan syöpään. Jotkut niistä toimivat tuumorisuppressoreilla (kuten

miR-34a

,

MSH2

,

WWOX

ja

TIMP-3

,

et al

) tai onkogeenien (kuten

ROCK2

,

CD28

,

EBAG9

ja

ANGPT1

,

et al

). Mielenkiintoista, useimmat niistä ei raportoitu aikaisemmissa asiakirjoissa [31], [45].

MiR-34a

, tärkeä tuumorisuppressorin, säätyy alas kohdunkaulan syövän [48], [49]. On raportoitu, että onkoproteiini E6 HPV16 ja HPV18 voi estää ilmentymisen kasvaimen heikentävän

miR-34a

by epävakautta p53 ja johti solujen lisääntymisen [50]. Häiriöitä

miR-34a

geeni voisi edelleen tulkita ilmiö pienentää ilmentymisen

miR-34a

kohdunkaulan syöpä.

MSH2

on DNA mismatch korjaus proteiinia, ja liittyy DNA korjaukseen liittyvän reitin [51], [52]. Vähentynyt ilmentyminen MSH2 saattaa olla riskitekijä alkuvaiheessa kohdunkaulan syöpä [53].

ROCK2

, tärkeä signalointi molekyyli, voi edistää kohdunkaulan syövän etäpesäkkeiden säätelemällä ja aktivoimalla ilmentymistä ja toimintaa moesiini proteiinin kautta RhoA /ROCK2 reitin [54]. Lisäksi syöpään liittyvien geenien, geenien integraatio sivustoja ja reunustavan sekvenssin alueet voivat olla myös hyödyllisiä virus- genomin integroitumista.

FANCM

joka on DNA translokaasi ja erittäin liittyvät DNA-replikaatioon säätelee tarkistuspiste signalointi ja replikaatiohaarukan eteneminen [55], [56]. Muita geenejä, kuten

COX6B1

liittyy solujen apoptoosin [57] ja

ESRRA

on myös raportoitu liittyvän kohdunkaulasyövän [58]. Lisäksi, joukossa 45 integraatio tapahtumia, 13 tapahtumat johtivat antisense transkription koodaavien sekvenssien, kuten

PRDX5

,

EBAG9

ja

CD28 jne

. Nämä integraatiot ovat yleensä katsota ei kiinnosta. Kuitenkin tunnetta sekvenssit liittyivät DNA ennalleen tai kasvainten kehittymistä ja saattavat vaikuttaa sekä isäntä ja viruksen geenien ilmentymisen kehittämisen aikana kohdunkaulan syövän. Eniten integrointi antisense-orientaatiossa oli geeni, joka koodaa peroxiredoxin 5 (

PRDX5

), suojaava emzyme oksidatiivista stressiä vastaan ​​[59], [60]. Sen muuttunut ilmentyminen johtuu HPV16 integraatio voi olla merkittäviä virologisen seurauksena yhdessä integroitumista DNA korjaus geenit, kuten FANCM ja MSH2. Säätelyä

EBAG9

ilmentymistä on havaittu useita pahanlaatuisia kasvaimia [61]. Synergistinen stimulaatio tekijä

CD28

joka ylläpitää immuuni homeostaasiin on rooli kasvaa herkkyys kohdunkaulan syövän [47].

Yhteenvetona muutokset transkription kuviot HPV 16 varhaisten geenien matkan varrella kanssa etenemistä kohdunkaulan intraepiteliaalisten neoplasian kohdunkaula syöpä ja viruksen genomin integroitumista isännän kromosomiin. Muutos tai valinnan transkription kuviot ja integraatio ilmenemistä isäntägeenejä integraatio sivustoja ja reunustavat solujen sekvenssialueisiin saattaa kaikki osallistua synnyssä HPV16 aiheuttamien syöpien.

tukeminen Information

Kuva S1 .

tyypit virussekvensseistä liittyy poly-A niiden 3′- päissä. Tyyppi I luokan näkyy E1-sekvenssit suoraan päättyi poly A; tyypin II luokan osoittaa E1 saumattu E4 ja sitten L1 ja päättyi poly-A-sekvenssien.

▴ on useita katkaisu sivustoja E1 (data kuvassa S2).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0097588.s001

(TIF) B Kuva S2.

Eri katkaisu sivustoja E1 alueen tyypin I luokan on neljä katkaistu sivustoja E1, 880, 949, 1054 ja 1234, vastaavasti.

doi: 10,1371 /journal.pone.0097588.s002

(TIF) B Kuva S3.

Useat saumattu luovuttajan sivustoja E1. A-tyyppisessä kaksi integrointi sivustoja E1, 880, ja 1107, vastaavasti. Kiinteä laatikot tarkoittaa solujen sekvenssit.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0097588.s003

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme Zhi-Ming Zheng NIH ja Kong -Nan Zhao varten hyödyllisiä kommentteja ja tarkistuksia.