Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epigeneettiset geenien, välittämä poikkeava promoottori DNA hypermetylaation ja tukahduttavaa histonimodifikaation, on tunnusmerkki syöpä. Vaikka periytyviä, dynaaminen luonne ja mahdollinen palautuvuus kautta farmakologisia apuneuvoja tehdä tällaisia ​​poikkeavuuksia houkuttelevia kohteita. Koska syövät sisältää useita epigeneettiset poikkeavuuksia, jossa yhdistyvät hoitoja, jotka kohdistuvat eri vikoja voi mahdollisesti parantaa niiden omaa efficacies. 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-CDR), FDA: n hyväksymä lääkeaine myelodysplastisen oireyhtymän, voi estää DNA-metyylitransferaaseja (DNMTs), kun DNA: han sisältyneiden jakautuvien solujen, mikä johtaa globaali demetylaatio. Viime aikoina ensimmäinen histoni demetylaasin, lysiiniä demetylaasi 1 (LSD1), joka demetyloi sekä histoni ja ei-histoni alustoille, on tullut uusi kohde epigeneettiset hoitoa. Käyttäen, klorgyliini, joka on LSD1 estäjä (LSD1i) syöpälääkkeitä solulinjoihin, osoitamme, että klorgyliini työllistää kaksi vaikutusmekanismit riippuen solutyypistä: se voi joko aiheuttaa maailmanlaajuisia DNA demetylaatio tai estää LSD1-ajettu H3K4me2 ja H3K4me1 demetylaatio perustaa aktiivinen chromatin kokoonpano. Tutkimme myös terapeuttista tehoa yhdistämällä 5-atsa-CdR kanssa klorgyliini ja päättää, että tämä kombinatorinen hoito on synergiavaikutukset reaktivoiville poikkeavasti vaiennetaan geenien rikastamalla H3K4me2 ja H3K4me1. Monet uudelleen geenien luokitellaan syöpää kivesantigeenien tai kuuluvat interferoni-signalointireitin, mikä viittaa mahdolliset vaikutukset immunoterapiaa. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että kombinatorinen hoito koostuu DNMT estäjän (DNMTi) ja LSD1i ovat parempi terapeuttinen arvoja ja voisi tehostaa epigeneettiset terapia.

Citation: Han H, Yang X, Pandiyan K, Liang G (2013) synergistinen uudelleen aktivoituminen epigeneettiseltä Silenced Genes yhdistelmämutageneesillä esto DNMTs ja LSD1: syöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (9): e75136. doi: 10,1371 /journal.pone.0075136

Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu: 7. 2013 Hyväksytty: 10 elokuu 2013; Julkaistu: 06 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Han et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: National Institutes of Health (NIH) [RO1CA124518 ja CA138794] GL. XY ja KP tuetaan avokätisesti joita kestä Cancer [2000901485]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

geenien välittämä poikkeava promoottori DNA hypermetylaation ja histonimodifikaation on yksi tunnusmerkkejä syövän. Vaikka tällaiset muutokset ovat periytyviä, niiden dynaaminen luonne ja palautuvuus farmakologisin interventioita niistä houkuttelevia hoitotavoitteet [1]. Viime vuosikymmeninä erilaisia ​​lääkkeitä, jotka kohdistuvat erilaisia ​​epigeneettiset muutoksia on kehitetty tavoitteena aktivoimalla poikkeavasti vaiennettu geenejä, mukaan lukien DNMTi ja histonideasetylaaseja estäjät (HDACi) [2], [3]. Monet heistä ovat osoittaneet lupaavia terapeuttista arvoa hoidettaessa erilaisia ​​syöpäsairauksia, sekä yksittäisinä aineina ja yhdessä muiden hoitojen ja useat on hyväksynyt FDA.

N-päät histonien tehdään erilaisia ​​jälkeisen muutokset translaation tuottaa kopiointia sallivan tai tulenkestävä kromatiinin konformaation riippuen ja sijainti muutos [4], [5]. Esimerkiksi kopiointia ajatellen aktiivisen promoottorit ovat merkitty rikastusta on dimetyloimalla ja trimethylation sekä H3K4 ja asetylointi H3 [6]. Transkriptionaalisesti aktiivinen promoottorit on merkitty rikastuksissa joko trimethylation of H3K9 tai trimethylation of H3K27 [5]. Tasapainoinen aktiivisuus histoni modifioivia entsyymejä, jotka lisäävät tai poistaa tiettyjä muutoksia on kriittinen normaalille solun fysiologian [2]. Syöpäsolut puuttuu usein tätä tasapainoa ja niillä maailmanlaajuista vähentämistä asetylaatiossa ja promoottori-erityisiä väheneminen di- ja trimethylation of H3K4, jolloin poikkeava geenien [1], [7]. Histoni lysiiniä metylaatio pidettiin suhteellisen pysyvä muutos, kunnes löytö ensimmäisen histoni demetylaasin -lysiiniä demetylaasi 1 (LSD1 /KDM1 /BHC10 /AOF2) [8], [9]. Sen jälkeen monet ponnistelut ovat panostettu estäjiä vastaan ​​histoni demethylases.

LSD1 demetyloi mono- ja dimetyloimalla of H3K4 kautta flaviiniadeniinidinukleotidi (FAD) riippuvainen mekanismi [9], ja näin, on mahdollista tukahduttaa geenin ilmentymistä [10]. Ennen löytö sen demetyloivan kyky, LSD1 tunnettiin yhdistää useita co-repressorin komplekseja, kuten CoREST [11], CtBP [12] ja osajoukko HDAC-kompleksien [13]. Aikana demetylaation prosessi, imiini välituote muodostuu, joka on edelleen hydrolysoidaan tuottamaan metyloimattoman lysiiniä ja formaldehydiä sivutuotteena [9], [14], [15]. LSD1 voi myös demetyloimiseksi useita ei-histoni alustoille, kuten DNMT1, mikä kuulemma tekee siitä vakaamman [16], [17], mikä saattaa osaltaan lisääntynyt maailmanlaajuinen DNA: n metylaatio. Yhdessä LSD1 on kaksi potentiaalista vaikutusmekanismit tukahduttaa geenin ilmentymisen: se voi demetyloimiseksi mono- ja dimetyloitujen H3K4 sekä vakauttaa DNMT1.

yli-ilmentyminen LSD1 on raportoitu useissa maligniteetteja, mukaan lukien akuutti myelooinen leukemia (AML) [18], neuroblastooma [19], rintasyöpä [20], virtsarakon karsinooma, pienisoluinen keuhkosyöpä ja peräsuolen karsinoomat [21], mikä viittaa siihen, että LSD1: n estäjät voivat olla merkittäviä terapeuttista hyötyä lukuisia kasvaimia. LSD1 on todettu estää erilaistumisen MLL [22] ja säädellä epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä siirtymät (EMT) aktivoimiseksi motiliteetin geenejä [23]. LSD1 estäjät voivat edistää erilaistumista korkealuokkaisesta eturauhassyövän solut [24], tukahduttaa virtsarakon syöpä solujen lisääntymistä [25], ja aktivoida poikkeavasti vaiennettu geeni [26]. Katalyyttinen domeenit LSD1 ja monoamiinioksidaaseista jakaa rakenteellisen homologian ja hyödyntää samaa katalyyttinen mekanismi [9]. Siksi monet monoamiinioksidaasin ovat myös LSDi. Yksi tällainen monoamiinioksidaasiestäjä, klorgyliini, voi myös estää lysiini tietyn demethylases [19], [20], [27], [28].

Koska läsnä useita epigeneettisiä poikkeavuuksia syöpäsoluissa, tutkimme yhteenlaskettu terapeuttinen arvo on 5-atsa-CdR ja klorgyliini estävän DNMTs ja LSD1, virtsarakon syöpä (T24), leukemia (HL60) ja peräsuolen syöpä (HCT116) solulinjat. Huomaamme, että klorgyliini käytetään kahta eri toimintamekanismeja kolmessa solulinjoissa tutkittiin. Vuonna T24 ja HL60 solut, klorgyliini yksinään aiheuttaa vähäinen vaikutus aktivoituminen poikkeavasti vaiennettu geenejä verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. Kuitenkin kombinatorinen hoito indusoi synergistisiä vaikutuksia aktivoituminen epigeneettiseltä vaiennettu geenejä. Lisäksi ainoastaan ​​kombinatorinen käsittely johtaa rikastusta of H3K4me2, H3K4me1 ja H3K9 /14 asetylointi promoottorit jopa geenien. Toisaalta, vuonna HCT116-soluissa, klorgyliini yksinään indusoi maailmanlaajuinen DNA demetylaatio ja geenin uudelleenaktivointi. Kuitenkin kombinatorinen hoito ei aiheuttanut synergiavaikutukset geenin uudelleenaktivointi. Huolimatta näyttää erilaisia ​​toimintamekanismeja solussa linjojen kollektiivisesti Tutkimuksemme osoittaa, että kombinatorinen hoito on parempi terapeuttinen arvoja, ja otetaan käyttöön uusi lähestymistapa syövän hallintaan.

Materiaalit ja menetelmät

Lääkehoito ja viljelyolosuhteet

T24, HCT116 ja HL60 solut, ostettu ATCC, maljattiin 2 x 10

5 solua /100 mm malja, 3 x 10

5 solua /100 mm malja ja 5 x 10

5/25 cm

2 pulloon, vastaavasti. Ne käsiteltiin seuraavana päivänä 1 uM, 0,3 uM tai 0,1 uM 5-atsa-CDR (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), vastaavasti 24 tunnin ajan. Poistamisen jälkeen 5-atsa-CDR-soluja käsiteltiin 10 uM klorgyliini (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), joka päivä 21 päivää. Useita annoksia klorgyliini testattiin: 1 uM, 10 uM ja 100 uM. Klorgyliini alentunut solun kasvun annoksesta riippuvalla tavalla, ja optimaalinen annos klorgyliini (10 uM) määritettiin seuraamalla annos-vaste-käyrä.

Colony Formation

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 1000 solua kuoppaa kohti kanssa tai osoitetun hoidon. Viljelyväliaine vaihdettiin joka 3 päivä. Sen jälkeen, kun 10 päivää inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla. Pesäkkeet, joissa on enemmän kuin 50 solusta, laskettiin mikroskoopilla.

Kromatiini immunosaostus (ChIP) Pitoisuus

ChIP-määritykset suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu, käyttämällä 4 x 10

6 solua per IP [6 ]. Kymmenen ug seuraavia vasta-aineita käytettiin: H3 ja H3K4me2antibodies ostettiin Abcam (Cambridge, MA). Asetyloitu H3, ja IgG-vasta-aineet hankittiin valmistajalta Millipore (Bedford, MA). H3K4me3 ja H3K4me1 vasta-aineet hankittiin Active motiivi (Carlsbad, CA). PCR-alukkeet ovat saatavilla pyynnöstä.

Reaaliaikainen RT-PCR

Yhteensä RNA eristettiin solujen Trizol reagenssilla (Invitrogen) osoitetuissa aikapisteissä. Yksi ug RNA: ta käänteiskopioitiin käyttämällä M-MLV (Invitrogen) ja sattumanvaraisia ​​heksameerejä (Invitrogen). PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen KAPA SYBR® FAST Universal 2X qPCR Master Mix ja Bio-Rad CFX

© 96 Reaaliaikainen PCR havaitseminen systerm. Sekvenssit alukkeilla ovat saatavilla pyynnöstä. Jokaisen PCR-alukkeita, titrauksen tunnettuja määriä DNA sisällytettiin standardina kvantifiointiin.

Infinium

Infinium DNA metylaatiomääritystä suoritettiin USC Epigenome Centerin mukaan valmistajan tekniset tiedot (Illumina, San Diego, CA). Illumina Infinium DNA metylaatiomääritystä (Infinium HumanMethylation450 BeadChip) tutkitaan DNA metylaatiostatuksen 485000 CpG aluetta, jotka kattavat 99% RefSeq geenien ja geenien välinen alueet valitaan metylointi asiantuntijoita. Jälkikäsittelytoimenpiteistä ja beeta-arvon laskennassa tehtiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [29].

Expression Microarray

Expression analyysi suoritettiin Sanford-Burnham Medical Institution (La Jolla, CA) käyttäen Illumina genomi- leveä ilme BeadChip (HumanHT-12_V4_0_R1) (Illumina). Geenien ilmentyminen data prosessoitiin käyttäen Lumi paketin R. Aineisto log2 muunnetaan ja normalisoitu käyttämällä Tukeva Spline normalisointi (RSN) kuten toteutettu lumi pakkauksessa. Vertailuja ohjaus ja käsiteltyjen näytteiden kaikki kolme solulinjaa suoritettiin käyttäen R paketin Limma. Geenit (selostukset), joiden p-arvo alle 0,01 ja kertamuutosta yli 2 suhteessa kontrolliin pidettiin merkittävinä. Oncomine ™ (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI) käytettiin analyysiin ja visualisointiin julkisesti saatavilla geeniekspression data. Downstream verkko ja ontologian analyysi suoritettiin käyttäen MetaCore alkaen GeneGo Inc.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastolliset testit tehtiin käyttäen R-ohjelmiston (R versio 2.15.2, R Development Core Team, 2012). ”Lumi” paketti käytettiin normalisoimaan ja käsitellä geenien ilmentyminen tietoja. Huomautusta ja visualisointi DNA: n metylaatio koettimet tehtiin käyttämällä paketteja kautta Bioconductor ( ”TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene”, ”rtracklayer”, ”Gviz” ja ”IlluminaHumanMethylation450kprobe”). Seuraavat CRAN paketit käytettiin tuottamaan koealojen: ”ggplot2”, ”gplots” ja ”Venn-diagrammi”. Gene ontologia analyysit tehtiin käyttäen DAVID Functional käsinkirjoitustyökalun (Huang da ym. 2009). Chip Aineisto analysoitiin opiskelija t testejä GraphPad Prism versio 5 (GraphPad Software).

GEO hakunumerolla

Kaikki genominlaajuisten data Tutkimuksessa käytettiin on talletettu GEO alle liittymistä numero GSE41754.

tulokset

Kombinatoriset hoitoon DNMTi ja LSDi saa aikaan solujen kasvun esto ja pesäkkeiden muodostumista kuin kumpikaan yksittäinen aineiden

analyysi geenien ilmaisun saadut tiedot Oncomine ™ (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI), havaitsimme, että LSD1 on yli-ilmentynyt virtsarakon syöpä, leukemia ja paksusuoli adenokarsinoomien verrattuna normaalia vastineet (kuvio 1A), mikä viittaa siihen, että yliekspressio LSD1 voi pelata rooli kasvainten synnyssä. Lisäksi se on hyvin osoitettu, että poikkeava DNA: n metylaation on mukana aloittamisen sekä etenemistä oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien kolme syöpien edellä mainittujen [30]. Siksi virtsarakon syöpä solulinja, T-24, joka on leukemiasolulinja, HL60 ja koolonisyöpäsolulinja, HCT116 valittiin tutkia vaikutuksia estämällä LSD1 sekä arvioida terapeuttista tehoa kombinatorisen hoito, joka koostuu LSD1i ja DNMTi.

. Ekspressiotasot LSD1 virtsarakon syöpä, T-solu akuutti lymfaattinen leukemia, paksusuolen adenooma ja niiden normaalit kollegansa saatiin ONCOMINE. Numerot sulut näytteiden määrä käytetään tuottamaan rasiakuvaajien. B-D. Väestön kaksinkertaistaa kertaa ohjaus (musta), klorgyliini käsitelty (keltainen), 5-atsa-CdR käsitelty (punainen) ja kombinatorinen käsittely käsitelty (vihreä) in T24, HL60 ja HCT116-soluissa. Vastaavat luvut tuntia on lueteltu alla olevassa taulukossa kunkin kaavion. E. kvantitointi pesäkkeiden lukumäärä on tuotettu pesäkkeiden muodostumisen määritykset T24 ja HCT116-soluissa sen jälkeen, kun osoitettu hoitoja.

Kaikki solulinjat käsiteltiin seuraavasti: klorgyliini yksin, 5-atsa-CdR yksin, ja kombinatorinen kohtelu klorgyliini ja 5-atsa-CdR. Soluja käsiteltiin 5-atsa-CdR 24 tuntia ennen materiaalin vaihtoa. Sitä vastoin solut, tuore annos klorgyliini jokapäiväistä 21 päivää. Kaikissa kolmessa solutyypeissä tutkittiin, sekä 5-atsa-CDR: n ja klorgyliini hoito yksinään laajennettu solupopulaation kaksinkertaistaa ajan välillä 3 ja 10 tuntia, ja kombinatorinen hoito lisää entisestään kaksinkertaistaa ajan, jopa 16 tuntia (kuvio 1 B, C, D).

arvioimiseksi terapeuttista tehoa klorgyliini, 5-atsa-CdR ja kombinatorisista hoito selviytymisen ja solujen lisääntymistä teimme pesäkkeiden muodostumisen määritykset kahteen kiinnittyvä solulinjat, T-24 ja HCT116-soluissa. Klorgyliini osoitti kohtalainen vaikutus tukahduttamaan kyky T24 ja HCT116-solut muodostavat pesäkkeitä. 5-atsa-CdR huomattavasti tukahdutetaan pesäkkeiden muodostumista ja kombinatorisista hoito edelleen vähentänyt pesäkkeiden (kuviot S1 ja 1E). Tuloksemme osoittavat, että sekä klorgyliini ja 5-atsa-CdR estävät solujen kasvua ja estää pesäkkeiden muodostumista. Lisäksi kombinatorinen hoito edelleen hidastaa väestön kaksinkertaistaa aikaa ja vähentää solujen kyky lisääntyä.

Combinatorial hoitoon DNMTi ja LSDi huomattavasti ylössäätelee useampia geenejä kuin kumpikaan yksittäinen toimihenkilöiden T24 ja HL60-solujen

Tutkiakseen maailmanlaajuista muutosta geeniekspressioprofiili jälkeen klorgyliini, 5-atsa-CdR ja kombinatorinen hoito, teimme genominlaajuisten ilmentämistutkimuksissa päivänä 18 jälkikäsittely (D18), käyttäen Illumina HumanHT-12 V4 BeadChip in T24 ja HL60 solut. On hyvin dokumentoitu, että 5-atsa-CdR indusoi välitöntä demetylaatio ja myöhemmät geeni uudelleenaktivointi [31], [32]. On myös todettu, että metylaatio levypalloa ja geenit tulevat uudelleen vaiennetaan upon vieroitusoireista [33], koska DNMT tasot päästä uusiutua. Siksi päätimme suhteellisen myöhään ajankohta arvioida, kombinatorinen hoito voi aiheuttaa jatkuvaa geeni uudelleenaktivointi. Geeni-ilmentymisen muutoksia kaikkien transkriptien jälkeen asianomaiset hoidot esitetään tulivuoren kaavioita (kuvio 2A). Päivänä 18, vuonna T24-soluissa, klorgyliini yksinään eivät merkittävästi ajan säännellä selostukset, kun taas 5-atsa-CdR käsittely lisäsi ilmentymä 30 selostukset. Huomattavaa on, kombinatorinen indusoi huomattavasti enemmän transkriptit (108 selostukset), jotka olivat merkittävästi säädelty (kuvio 2A). Tutkia päällekkäisyyden sääteli transkriptien kun eri hoitoja olemme tuottaneet Venn-kaavio, joka osoittaa, että kaikki transkriptit aiheuttama 5-atsa-CdR myös aiheuttama yhdistelmämuta- käsittely (kuvio 2B). Seuraavaksi verrata maailmanlaajuiseen geeniekspression induktion eroa 5-atsa-CdR ja kombinatorisista hoito, me piirretään havaitun loki2 kertainen muutos kaikille kuulusteli selostukset lavalla. Suurin osa niistä, selostukset ovat synergistisesti ajan säädellään kombinatorinen hoitoon (kuva S2), joka osoittaa, että klorgyliini täydentää kyky 5-atsa-CdR aktivoida geenien T24-soluissa. Lisäksi täydentämällä 5-atsa-CdR, kombinatorinen hoito voi myös aktivoida geenit eivät ole säädelty 5-atsa-CdR yksin. Seitsemänkymmentäkahdeksan geenejä vain ajan säädellään kombinatorinen hoitoa (kuvio 2B), mikä viittaa siihen, että kombinatorinen hoito voi käyttää eri vaikutusmekanismi kuin hoidon 5-atsa-CdR yksin. Mielenkiintoista on, että geenit, jotka ovat synergistisesti ajan säädellään kombinatorinen hoidon rikastetaan tiettyjä toimintoja, kuten immuunivasteen, solun tukirangan remodeling ja solusyklin säätelyssä (kuvio 2C, kuvio S3). Yksityiskohtainen analyysi tehtiin geenit, jotka ovat osa IFN-alfa ja IFN-beeta-signalointireitin. Analyysi paljasti, että kombinatorinen hoito stimuloi useiden geenien ekspression, jotka ovat välttämättömiä tehokkaan immuunivasteen virusinfektioiden (kuvio 2C).

. A. Geenien ilmentyminen log2 ero on piirretty x-akselin, ja -log10 (p-arvo) on piirretty y-akselilla. Koettimet, joita pidetään merkitsevää eroa kahden ryhmän ovat värillisiä punaisella. B. Venn leikkaa määrästä geenien säädelty ilmoitettuun hoitoa. C. Verkko rikastamiseen kaavio sisältäviä geenejä, jotka ovat synergistisesti ajan säädellään kombinatorinen hoitoa. Synergistisesti voimistunut geenit on merkitty punaisella palkit. Muut symbolit käytetyt kuten nähty Metacore verkkosivuilla.

Meillä on myös suoritettu genominlaajuisten ilmentymisen tutkimukset HL60 soluissa. Geenien ilmentyminen muutokset kaikkien transkriptien jälkeen ilmoitettu hoidon näkyvät tulivuori tontteja. Käyttämällä aiemmin perustettu cutoffs tunnistimme ilmentyvät eri selostukset, joka on korostettu punaisella (kuvio 3A). Huomasimme, että vaikka kaikki kolme hoitoa aiheuttanut geenimutaatioita ylössäätö yhdistelmämuta- hoito indusoi enemmän transkriptien, joilla vastaava ilmaisu profiili T24 soluja. Klorgyliini, 5-atsa-CdR ja kombinatorisista hoito säädelty 43, 200 ja 346 selostukset, vastaavasti (kuvio 3B). Vaikka oli huomattavaa päällekkäisyyttä 5-atsa-CdR ja kombinatorisista hoidon kombinatorinen hoito oli tehokkaampi geenin induktion että se sääteli 180 transkriptien, joita ei säädelty 5-atsa-CdR (kuvio 3B) .

. Geenien ilmentyminen log2 ero on piirretty x-akselin, ja -log10 (p-arvo) on piirretty y-akselilla. Koettimet, joita pidetään merkitsevää eroa kahden ryhmän ovat värillisiä punaisella. B. Venn leikkaa määrästä geenien ajan säädellään ilmoitettu hoitoon. C. Expression tila saadaan ONCOMINE 20 geenien, joiden ekspressio synergistisesti uudelleen vuonna HL60 soluissa, ääreisveren mononukleaarisissa ja krooninen lymfaattinen leukemia.

arvioimiseksi toiminnallinen merkitys geenien synergisesti sääteli yhdistelmämuta- hoito me kartoitettiin Oncomine ™ -tietokannan (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI). Opiskelusta geenien ilmentyminen krooninen lymfaattinen leukemia näytteitä verrattuna normaaliin ääreisveren mononukleaarisissa näytteitä, huomasimme, että useat geenit näissä kategorioissa olivat alas-säännelty leukemiat verrattuna normaaleihin soluihin (kuvio 3C), mikä viittaa siihen, että nämä geenit ovat mahdollisia tuumorisuppressoreilla leukemia. Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että muutokset geenien ilmentyminen liittyy muutoksia solujen kasvun esto ja kombinatorisista hoito on enemmän syvempi vaikutus vähentää solujen kasvu verrattuna hoitoon yksittäisinä aineina, tulokset ovat linjassa maailmanlaajuisen ilme tutkimuksissa . Lisäksi, kombinatorinen hoito saa aikaan synergistisen vaikutuksen jopa-geenin ilmentymisen säätelemiseksi sekä T24 ja HL60-soluja. Lisäksi monet näistä geeneistä ovat mahdollisia seurauksia immunoterapiaa, kuten syövän kives antigeeni geenit ja geenien interferoni koulutusjakson, mikä viittaa toteutettavuus yhdistämisen epigenetic hoidon ja immunoterapia hoidettaessa syöpäsairauksia. Erityisesti meidän tiedot osoittavat myös, että muutoksia geenien ilmentyminen ovat yhdenmukaisia ​​solukasvuneston; yhdistelmämuta- hoidot up-regulation huomattavasti enemmän geenejä, jotka ovat mahdollisesti kasvain tukahduttava, mikä johtaa suurin vaikutus solujen kasvu joukossa kaikki hoidot.

Gene ylössäätöä aiheuttama kombinatorinen hoito johtuu muuttunut histoni muutoksia ei demetylaatio vuonna T24-soluissa

Sen tutkimiseksi, DNA demetylaatio vastasi säätely ylöspäin enemmän geenien kun kombinatorisista hoitoa teimme maailmanlaajuinen DNA: n metylaatio -tutkimukset Illumina Infinium HumanMethylation450 alustalla, joka sisältää yli 450.000 CpG sivustoja , joka kattaa promoottorialueille, 5’UTR, 3’UTR, geeni kehon ja ensimmäinen eksonia. Koska sekä T24 ja HL60 näytti synergististä geeni ylössäätöä takia yhdistelmähoito, valitsimme T24 edustajana solulinja tutkia syy geenin induktion. DNA metylaatio tasolla kunkin kuulusteltiin CpG raportoidaan beta-arvo välillä 0 (ei metyloitu) 1 (täysin metyloitu). Tiheys tontti, joka sisältää kaikki koettimista array, syntyi osoittaa globaalin DNA metylaatio profiileja jokaista käsittelyä (kuvio 4A). Koettimet voidaan karkeasti jakaa kahteen ryhmään valvonnassa perustuu bimodaalisen jakautumisen beeta-arvot a hypometyloidut ryhmä (beeta-arvo 0,2) ja hypermetyloitunut ryhmä (beeta-arvon 0,8) (kuvio 4A). Ohjaus- ja klorgyliini käsitellyt solut osoittivat hyvin samankaltaisia ​​metylaatio profiileja. Sen jälkeen, 5-atsa-CdR hoito, huippu edustaa hypermetyloitunut koettimien siirtynyt kohti pienempiä beeta-arvot, mikä osoittaa, että 5-atsa-CdR indusoi globaali demetylaatio. T24-solut altistettiin 5-atsa-CdR käsittely osoitti hyvin samanlainen metylaation profiili kuin solut altistetaan kombinatorisista hoitoon (kuvio 4A). Vaikka DNMT1 on raportoitu mahdollisena alustana LSD1 [16], meidän tiedot osoittavat, että klorgyliini ei indusoi demetylaatio sisään T24-soluissa.

. Tiheys tontteja kullekin hoidolle kaikissa 450000 CpG sivustoja. X-akseli edustaa beeta arvot vaihtelevat välillä 0 (ei metyloitu) 1 (erittäin metyloitu). B. Heatmap CpG antureista kuuluvien geenien, jotka ovat synergistisesti ajan säädellään kombinatorinen hoitoa. Taso DNA: n metylaatio kunkin koetin kussakin näytteessä edustaa käyttämällä väriskaala näkyy legenda. C. ChIP tulokset histonimodifikaation normalisoinnin jälkeen syöttää. Virhepylväät edustavat keskihajonta 3 riippumattomasta kokeesta.

Seuraavaksi tutkimme metylaatiotasot geenien, jotka olivat merkittävästi ajan säädellään kombinatorinen hoitoon. Lämpökarttana syntyi havainnollistamaan metylaatiotasoilla koettimien, jotka sijaitsevat promoottorin alueet (koettimet sijaitsevat 1500 bps transkription aloituskohdasta) näiden muuttunut merkittävästi geenien kunkin käsittelyn jälkeen (kuvio 4B). Ohjaus- ja klorgyliini käsitellyt solut osoittivat hyvin samankaltaisia ​​metylaatio profiileja muutaman koettimia, jotka joko saanut tai menettänyt metylointi jälkeen klorgyliini hoidon (delta beeta-arvo 0,2). Kuitenkin kombinatorinen hoito ei aiheuttanut edelleen demetylaation koettimet olivat hypermetyloitunut perin. Vertaamalla 5-atsa-CdR hoidon kombinatorisista hoidon 0 antureista oli delta beeta-arvo on suurempi kuin 0,2, mikä vahvistaa, ettei merkittävää muutosta metylaatio johtuen kombinatorisista hoitoon (kuva 4B). Puolueettomasti valitsimme kaksi geeniä, IFI27 ja PAGE2B, jotka synergistisesti uudelleen yhdistelmämutageneesillä hoito, tutkia muutoksia DNA: n metylaatio kunkin hoidon jälkeen (kuva S4 A ja B). Molemmat geenit on useita koettimista Infinium alustalla. Promoottori on IFI27 on metyloimaton; Toisaalta, promoottori PAGE2B on metyloitu. Kuten tiedot osoittavat, nämä kaksi geeniä osoitti samanlaista DNA metylaatiotasoilla jälkeen joko kombinatorinen hoidon tai 5-atsa-CdR hoitoa. Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että geenit, jotka ovat merkittävästi ajan säädellään kombinatorinen käsittely puuttuu vastaava demetylaation muutos verrattuna soluihin, käsiteltiin 5-atsa-CdR yksin, mikä viittaa siihen, se aktivoi geenejä riippumaton DNA: n metylaation muutosten T24-soluissa.

Tutkitaan muita mahdollisia mekanismi edelleen geeni uudelleenaktivointi aiheuttama yhdistelmämuta- hoito, päätimme tutkia muutoksia histonimerkkien joka voisi liittyä havaittu ilme muuttuu. Ensin satunnaisesti valittu 8 geenit riippumatta metylaatiostatus kontrolliryhmässä, (CT45A4, GTSF1, TKTL1, PAGE2B, IFI6, IFI27, IFIT1 ja HIST1H2BK) varastoalueelta 92 geenejä, jotka olivat merkittävästi ajan säädellään kombinatorinen hoitoa, ja validoitu meidän ilmaisun array tulokset RT-PCR ilmoitetuilla päivää (kuvio S5).

Kun vahvistus array tulosten valitsimme 6 ulos 8 geenien ja tutkinut muutoksia tiettyihin histonimerkkien: H3K4me1, H3K4me2 ja H3K4me3 suorittamalla ChIP määrityksiä klo promoottorit näiden geenien. Sekä H3K4me1 ja H3K4me2 on raportoitu suoraan substraattien LSD1 [9]. Niistä geeneistä valittu, promoottorit kolme näistä geeneistä, CT45A4, GTSF1 ja PAGE2B, ovat metyloidut T-24-soluja, ja loput ovat metyloimattomia. Verrattuna kontrolliin, ei rikastusta of H3K4me1 ja H3K4me2, LSD1 tavoitteet, havaittiin promoottorit kaikkien valittujen geenien upon klorgyliini käsittely (kuvio 4C). Sekä 5-atsa-CdR kohtelu ja kombinatorisista indusoi rikastusta of H3K4me1 ja H3K4me2 klo promoottorien metyloitu geenien (kuvio 4C). Rikastamista tasot olivat huomattavasti korkeammat upon kombinatorisista hoito, mikä viittaa klorgyliini täydentää 5-atsa-CdR perustaa aktiivisen kromatiinirakenteeseen klo metyloituja geenejä.

Tällä promoottorit metyloimatonta geenien, ei 5-atsa-CdR eikä klorgyliini yksin lisääntynyt rikastamista aktiivisen chromatin markkaa; kuitenkin kombinatorinen hoito edelleen indusoi rikastusta on H3K4me2 ja H3K4me1. Tutkimme myös tasoa H3K4me3, joka ei ole välittömänä kohteena LSD1, mutta on aktiivinen Histonimerkki, rikastettu edistäjiä metyloitumattomien geenejä. Klorgyliini aiheuttama dramaattisin rikastaminen H3K4me3 varten IFI27 kontrolliin verrattuna. 5-atsa-CdR kohtelu ja kombinatorisista hoito osoittivat verrattavissa rikastusta of H3K4me3 kaikille valituille geenit, vahvistavat, että geeni uudelleenaktivoinnin aiheutettiin rikastusta of H3K4me2 ja H3K4me1, kaksi kohdistu suoraa LSD1. Lisäksi olemme tutkineet rikastusta on H3K9 /14 asetylointi koska ne tiiviisti korreloi geenien ilmentyminen [34]. Havaitsimme, että klorgyliini käsittely ei muuttanut tasoa asetylointi nähty ohjaus, sopusoinnussa havaittujen ekspressiotasoja. 5-atsa-CdR aiheuttama rikastumista asetylointi ja kombinatorisista hoitoa entisestään rikastamisen tasolla promoottorit metyloitua geenien sekä IFI27 (kuvio 4C). Yhdessä tuloksemme osoittavat, että T-24-solut, yhdistelmägeenien hoito indusoi edelleen geeni uudelleenaktivointi ei läpi DNA demetylaatio. Kiinnostaa, se rikastusta of H3K4me2 ja H3K4me1 ovat keskeisiä aktivoivan muutokset, jotka johtavat geeni uudelleen aktivoituminen.

Klorgyliini indusoi DNA demetylaatio vuonna HCT116-soluissa

Olemme suorittaneet genominlaajuisten ilmentymisen analyysi päivänä 20 post kohtelu HCT116-soluissa tutkia maailmanlaajuisten muutosten geenien ilmentymisen kunkin hoidon jälkeen. Mielenkiintoista, kaikki kolme hoitoa: klorgyliini, 5-atsa-CdR ja kombinatorisista hoidon aiheuttama merkittävä geeni ylössäätöä sekä alassäätöä (kuva S6). On huomattavaa päällekkäisyyttä (348 selostukset) kaikkien kolmen hoitokerran (kuvio 5A), mikä viittaa siihen, että kaikki hoidot voivat käyttää samanlaisia ​​toimintamekanismeja uudelleenaktivoinnissa vaiennetaan geenejä. Tämä saattaa myös selittää puute synergistisen vasteen HCT116-soluissa.

. Venn leikkaa geeneistä, jotka ovat ajan säädellään ilmoitettu hoitoon. B. Density tontteja kullekin hoidolle kaikissa 450000 CpG sivustoja. X-akseli edustaa beeta arvot vaihtelevat välillä 0 (ei metyloitu) 1 (erittäin metyloitu). C. Venn leikkaavat koettimista, jotka demetelyloitiin ilmoitettu hoitoon. Päällekkäisyys kaksi ympyrää edustaa yhteisiä antureista, joita demetelyloitiin molemmat hoidot.

Vaikka klorgyliini ei indusoi DNA demetylointi T24-soluissa, tutkimme onko merkittävän geeni ylössäätöä huomioitava kaikki kolme hoitoa in HCT116 johtui DNA demetylaation tekemällä maailmanlaajuinen DNA metylointianalyysi päivänä 20 hoidon jälkeen. Tiheys juoni osoittaa, että sekä 5-atsa-CdR hoidon ja kombinatorinen indusoi merkittäviä demetylaation, jolla samanlaisia ​​globaali metylaatio profiileja (kuvio 5B). Toisin kuin T24 soluja, klorgyliini aiheuttama kohtalainen DNA demetylointi HCT116. Päivänä 20, 21049 koettimia demetelyloitiin klorgyliini hoitoa, kun taas 59834 antureista jäi demetyloituneiksi jälkeen 5-atsa-CdR hoitoa. On huomattava päällekkäisiä demetyloiduksi antureista näiden kahden hoitojen (kuvio 5C). Klorgyliini ensisijaisesti demetyloi ei-CpG saarialueilla (kuvio S7A). Koska HCT116-solut ovat korkeammat metylaatiotasoilla ei-CpG-saarekkeen alueilla kuin T24-soluissa (kuvio S7b), tämä voi antaa selityksen sen tehosta HCT116. On osoitettu, että DNMT1 on substraatti LSD1 ja LSD1-inhibiittorien on mahdollista epävakautta DNMT1, jolloin maailmanlaajuinen demetylaatio [16]. Meidän laboratorio on aiemmin osoittanut, että DNMT1 näkyvämmäksi ylläpitää ei-CpG-saarekkeen metylaation [35], vahvistaa hypoteesia, että klorgyliini indusoi demetylaation horjuttamalla DNMT1.