Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Hippo koulutusjakson säätelee elimen koko estämällä solujen lisääntymisen ja edistää solujen apoptoosin, kun sen aktivoitumisen. The Yes Associated Protein 1 (YAP1) on ydin- efektori Hippo polku, joka edistää solujen kasvua transkription koaktivaattori. Ihmisen syövästä YAP1 geeni raportoitu monistettiin ja yli-ilmentynyt useissa kasvaintyypeissä.

Methods

immunohistokemiallinen värjäys YAP1 proteiinia käytettiin arvioimaan ilmentymisen YAP1 haiman kasvainkudoksissa . siRNA oligonukleotideja käytettiin pudotus ilmentymistä YAP1 ja niiden vaikutukset haimasyövän soluja tutkittiin käyttämällä solujen lisääntymistä, apoptoosin, ja ankkuroitumisesta riippumattomaan kasvuun määrityksissä. Wilcoxonin allekirjoitettu-rank, Pearsonin korrelaatiokerrointa, Kendallin Tau, Spearmanin Rho, ja riippumaton kahden otoksen

t

(kaksisuuntainen) testiä käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi tietojen.

tulokset

Immunohistokemiatutkimukset haiman kasvain kudoksissa paljasti YAP1 värjäytymisvoimakkuuksia oli kohtuullisesta voimakkaaseen tumassa ja sytoplasmassa kasvainsolujen, kun taas viereisen normaalin epiteelin osoitti negatiivista heikko värjäystä. Viljellyissä soluissa, YAP1 ilmaisun ja paikannusta moduloidaan solutiheyden. YAP1 yhteensä proteiinin ilmentyminen lisääntyi ydinvoiman jakeiden BxPC-3 ja PANC-1, kun se laski HPDE6 kuin solutiheyden lisääntynyt. Lisäksi hoito haimasyöpä solulinjoissa, BxPC-3 ja PANC-1, jossa YAP1 kohdistus siRNA oligonukleotidien vähentää merkittävästi niiden leviäminen

in vitro

. Lisäksi hoito YAP1 siRNA oligonukleotidien vähentynyt kiinnittämisestä riippumaton kasvu on pehmeä agar haimasyövän soluja, mikä viittaa rooliin YAP1 haimasyövän kasvaimien syntyyn.

Päätelmät

YAP1 on yli-ilmentynyt haimasyövän kudosten ja mahdollisesti on tärkeä rooli kyky muodostaa klooneja ja kasvua haiman syöpäsoluja.

Citation: Diep CH, Zucker KM, Hostetter G, Watanabe A, Hu C, Munoz RM, et ai. (2012) Down-asetus Kyllä Associated Protein 1 Expression Vähentää Cell Proliferation ja kyky muodostaa klooneja haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (3): e32783. doi: 10,1371 /journal.pone.0032783

Editor: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 1. kesäkuuta, 2011; Hyväksytty: 2. helmikuuta 2012 Julkaistu: 01 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Diep et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat National Foundation for Cancer Research, Katz perhe, ja Helios Scholars Program. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kuten yksi kaikkein vaarallisin muodoista ihmisten sairauksien, haimasyövän on yhden vuoden ja viiden vuoden eloonjäämisaste 26% ja 6%: lla [1]. On olemassa kriittinen tarve uusille hoitostrategioita tarjota määrätietoinen vaikutus eloonjäämiseen potilaiden haimasyöpä.

Hippo koulutusjakson säätelee elimen koko estämällä solujen lisääntymisen ja edistää solujen apoptoosin [2], [3] . Komponentit Hippo reitin tunnistettiin geneettisten mosaiikki näytöt

Drosophila

, jotka koostuvat Hippo (HKO) kinaasi, Salvador (Sav) adapteri proteiinia, Wts proteiinikinaasi, matot sovitin proteiinia, ja Yorkie (Yki) ydin- transkription koaktivaattori. Kun reitin aktivointi, HPO ja Sav fosforyloi ja aktivoi Wts yhdessä Mats. Wts fosforyloi Yki inaktivoimiseksi ja säilyttää sen sytoplasmassa. Nisäkkäillä, komponentit Hippo reitin ovat erittäin konservoituneita homologit, jotka sisältävät MST1 /2 (HPO), WW45 (Sav), LATS1 /2 (WTS), MOB1 (matot), ja YAP1 (Yki) [4] – [ ,,,0],8].

Samanlainen

Drosophila

malli, nisäkkään Hippo ydinosat muodostavat proteiinikinaasi komplekseja toimii cascade fosfory- YAP1 (tunnetaan myös YAP tai YAP65) ja siirtää sen solulimassa [6], [7], [9], [10]. Koska suuret myötävirtaan kohde Hippo koulutusjakson YAP1 on paradoksi. Kuten onkogeenin, monistamiseen YAP1 geenin lokusta 11q22 on löydetty useissa syöpätyypeissä, mukaan lukien hepatosellulaarinen karsinooma, rintasyöpä, suun okasolukarsinoomia, medulloblastoomien ja ruokatorven levyepiteelikarsinoomien [11] – [15]. Lisäksi yli-ilmentyminen YAP1 proteiinin ja sen tumaanohjaussignaali on havaittu koolonin, maksan, keuhkojen, munasarjojen, ja eturauhasen syövät [6], [12], [16]. Overholtzer ja kollegat raportoitu, että yli-ilmentyminen YAP1 on kuolemattomaksi epiteelisolulinja MCF10A johtanut sen onkogeenisen transformaation [11]. Sen sijaan, YAP1 havaittiin myös vakauttaa ja vahvistaa p73-riippuvaisen apoptoottisen solukuoleman aikana sisplatiinin aiheuttaman DNA-vaurion [17]. AKT, keskeinen toimija useiden solun eloonjäämisreittejä, on osoitettu fosfory- YAP1 jotta tukahduttaa proapoptoottiseen geenin ilmentymisen [18]. Alaryhmässä rintasyöpiä, The YAP1 proteiinin ilmentyminen väheni huomattavasti menettämisen vuoksi Heterotsygotian, ja shRNA knockdovvn YAP1 lisääntynyt liikkuvuus, invasiivisuus ja parannettu kasvaimen kasvua [19]. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen, että YAP1 ilmaisua ja rooli syövän voisi olla solutyypin ja /tai solujen tilanneriippuvaista.

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet selvittämään roolin YAP1 haimasyövän. Tutkimme YAP1 proteiinin ilmentymisen ja lokalisointiin haiman kasvain kudoksissa potilaista otettujen haimasyöpä ja tutkinut fenotyyppiset vaikutukset YAP1 alassäätöä viljellyissä haiman solulinjoissa. Olemme todenneet, että YAP1 yliekspressoituu haimakasvain kudoksissa, ja alas-säätely YAP1 laantunut leviämisen ja kyky muodostaa klooneja viljeltiin haiman syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

haimasyövän solulinjoissa AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, CFPAC-1, HPAF-II, Hs 766T, MIA PaCa-2, ja PANC-1 saatiin American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Solulinjoja ylläpidettiin RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gemini Bio-Products, Woodland, CA), penisilliiniä (100 U /ml), ja streptomysiinillä (100 mg /ml) (Invitrogen). Ihmisen immortalisoitu haimatiehyen epiteelisolulinja, HPDE6, saatiin tri MS Tsao (University of Toronto, Kanada) ja viljeltiin keratinosyyttispesifisestä seerumivapaassa täydennetty naudan aivolisäkeuutteella (30 ug /ml) ja epidermaalinen kasvutekijä (0,2 ng /ml) (Invitrogen) [20], [21]. Ihmisen immortalisoitu haimatiehyen epiteelisolulinja, hTERT-HPNE, saatiin ATCC: stä ja niitä viljeltiin DMEM: ssä, johon oli lisätty 20% FBS: ää [22]. Kaikki solut rutiininomaisesti viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Solulinjaa identiteettien todennettiin aikaisemmin kuvatulla [23].

Tissue Microarray ja immunohistokemia (IHC) B

kudosta mikrosiru (TMA) rakennettiin parafinoidut korttelin 66 ainutlaatuista tapausta haiman ductal adenokarsinoomat, 5 tapausta krooninen haimatulehdus, ja 6 normaali haima näytteitä kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. Kutakin syöpä tapauksessa kaksi kasvain ydintä ja yksi vieressä normaalin ydin lävistettiin varten TMA. TMA lohkot leikattiin 5 pm: n paksuudelta, siirretään vettä vaahdottamalla, ja kuivattiin yön yli huoneenlämpötilassa. Objektilasit poistettiin vaha, vedettömät ja antigeeni haettu-linjan BondMax ™ Autostaineriin (Leica Microsystems, Inc. Bannockburn, IL). Kaikki objektilasit altistetaan lämmölle epitooppisup- haku käyttämällä EDTA perusteella hakea liuosta (Leica) 20 minuuttia. Endogeeniset peroksidaasia ja biotiinin olivat tukossa. TMA Leikkeitä inkuboitiin 30 minuutin ajan 1:125 kanssa YAP1 (H-125), vasta-aine, Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Leikkeet tehtiin näkyviksi käyttäen Bond ™ polymeeri Tarkenna Detection Kit (Leica) käyttäen diaminobentsidiiniä kromogeeni substraattina ja sai aikaisemmin kuvatulla [24]. Wilcoxonin allekirjoitettu-rank-testiä käytettiin vertaamaan tasolle YAP1 ilmaisun välillä kasvain ja sen vieressä normaali näytteitä. Wilcoxonin rank-sum testiä käytettiin vertaamaan YAP1 ilmaisun välillä kasvain ja haimatulehduksen sekä normaali haima näytteitä erillinen ryhmä kohteita. Pearsonin korrelaatiokerrointa käytettiin arvioitaessa ja testata yhdistyksen välillä ydin- YAP1 ilmaisun ja histopatologisia parametrit (kasvaimen, vaihe, ja tauti imusolmukkeisiin), ja herkkyys analyysi suoritettiin käyttäen Kendallin taun ja Spearmanin rho.

YAP1 Immunoblottaus analyysi

Jotta saavutettaisiin tarvittava solutiheys 48 tunnin kuluttua kasvun, BxPC-3, PANC-1 ja HPDE6 soluja siirrostettiin seuraavalla tavalla in T175 cm

2 pulloissa täysin kasvualustat: kaksi miljoonaa solua 20-30%, neljä miljoonaa solua 50-70%, ja seitsemän miljoonaa solua 100%. Solut pestiin DPBS: llä, trypsinoitiin ja laskettiin sitten sen Cellometer Auto T4 (Nexcelcom Biosciences, Lawrence, MA). Neljä miljoonaa solua käytettiin solukomponenttien fraktiointi käyttämällä BioVision Nuclear /Sytosoliset fraktiointi Kit (Mountain View, CA) seuraamalla valmistajan protokollaa. Tuottaa kokosolulysaateista miljoona solut lyysattiin RIPA-puskuriin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 1X proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorin cocktail (Roche) ja inkuboitiin jäissä 30 minuuttia. Uutteet sentrifugoitiin 14000 x g 10 minuuttia 4 ° C: ssa. Proteiinikonsentraatio määritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa (BCA) proteiinimäärityksellä (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Yhteensä 20 ug proteiinia per kaista erotettiin 4-12% NuPAGE Bis-Tris-geelielektroforeesilla (Invitrogen). Blotteja inkuboitiin joko Phospho-YAP1 (Ser127) vasta-aine (Cell Signaling) on ​​1:2000 laimentamisen tai yhteensä YAP1 (H-125), vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) on 1:2000 laimennus yön yli 4 ° C: ssa ja altistettiin sitten anti-kani-lgG-HRP-kytketty vasta-aine (Cell Signaling) on ​​1:3000 laimennuksen huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. PARP (Cell Signaling) on ​​1:2000 laimennus toimi lastaus valvonta tumafraktios-, kun α-tubuliinin (Cell Signaling) on ​​1:2000 laimennus toimi kontrollina kokosolulysaateista ja sytosolifraktion.

siRNA hoitoon ja soluproliferaatiomääritykset

YAP1 ilmentymisen hiljentäminen saavutettiin kaksi YAP1 siRNA duplex oligonukleotidit kohdistuvat kaksi eri alueiden YAP1 transkriptin (Qiagen, Valencia, CA), jonka lopullinen pitoisuus on 20 nM käyttäen siLentfect transfektion -reagenssia (Bio-Rad) mukaan valmistajan protokollaa. SiRNA: t olivat reverse-transfektoitiin inkuboimalla siRNA: t 10 ui seerumitonta RPMI 1640 soluviljelyaineessa (Invitrogen), joka sisälsi 50 ui siLentfect lipidi-reagenssia (Bio-Rad) sekoitus kohti ja järjestettiin 96-kuoppalevyille. SiRNA: t ja transfektioreagenssia annettiin inkuboitua huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Sen jälkeen solut maljattiin siRNA-transfektiolla reagenssiseosta 4800 solua /kuoppa ja seerumin täydennetty lopulliseen konsentraatioon 5% BxPC-3 ja 2% PANC-1. Sillä HPDE6 solulinjan, 6000 solua /kuoppa maljattiin että siRNA-transfektioreagenssi sekoita Sarveiskalvosoluviljelyjen väliaineessa. Levyjä säilytettiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. 24 tunnin kuluttua, transfektioaineen poistettiin jokaisesta kuopasta ja korvattiin tuoreella seerumilla täydennetty kasvualustaa. Solujen elinkelpoisuus määritettiin lisäämällä 100 ui CellTiter-Glo Luminescent Assay (Promega, Madison, WI), kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa yksi tunti, ja luminesenssi tallennettiin Synergy HT mikrolevynlukijaa (BioTek, Winooski, VT).

Apoptoosi ja solusyklin analyysi

Transfektio of YAP1 siRNA osaksi haiman soluihin linjat oli kuvatulla tavalla solujen lisääntymisen tutkimuksissa yllä. Yhdeksänkymmentäkuusi tunnin kuluttua ensimmäisestä transfektion, kaspaasi-3 ja -7 aktiivisuudet määritettiin lisäämällä 100 ui kaspaasi-Glo 3/7 Assay (Promega) kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa yksi tunti, ja luminesenssi tallennettiin Synergy HT mikrolevylukijalla (BioTek). Kaspaasi-aktiivisuutta soluissa, joita käsiteltiin siRNA normalisoitiin kuin solut Vain valvontaa.

Cell cycle analyysi YAP1 siRNA käsiteltiin haiman solulinjat, kuten aiemmin on kuvattu [23].

Anchorage- riippumaton määritykset

6-kuoppalevyille, 250000 solut (BxPC-3 ja PANC-1) on käänteinen transfektoitiin 20 nM YAP1 siRNA: iden (Qiagen) ja 48 tunnin (ja 72 tuntia proteiinin uutto ja immunoblot analyysi). Solut pestiin DPBS: llä, trypsinoitiin ja laskettiin trypaanisiniekskluusiolla. Kuusituhatta toteuttamiskelpoinen BxPC-3-soluissa ja 3000 elinkelpoisia PANC-1 solut sekoitettiin 1 ml kasvualustaa ja 0,3% agaria ja sitten kerrostettiin 0,5% agar tta 35 mm: n verkossa ruokia. Solujen annettiin kasvaa 21 päivää, ja koko alue lautasen laskettiin. Pesäkkeet suurempi kuin 50 solusta, laskettiin positiivisiksi muuntamista varten. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Solut jäljellä transfektion pidettiin RNA ja proteiini uuttamalla. RNA uuttamalla, RNeasy Mini Kit (Qiagen) käytettiin noudattamalla valmistajan suosittelemaa menetelmää. Yksi mikrogramma kokonais-RNA: ta käytettiin 20 ul: n cDNA-synteesin reaktio (quantas Biosciences, Gaithersburg, MD). Reaktiot suoritettiin 1 ui cDNA: n reaktioseosta, 10 ui SYBR Green /Taq Polymerase master mix (Roche, Indianapolis, IN), 4 ui alukkeet (YAP1, 5′-GCCATTAAAGGCAGCTGTTC-3 ’ja 5’-AGCACTGTGCCAGGTATCAC- 3 ’; GAPDH, 5′-ATTGCCCTCAACGACCACTT-3′ ja 5’-GGTCCACCACCCTGTTGC-3 ’siten, että lopullinen pitoisuus 400 nM), ja 5 ui vettä lopputilavuuteen 20 ui. Bio-Rad MyIQ yksivärinen reaaliaikainen PCR-tunnistusjärjestelmä (Hercules, CA) käytettiin suorittamaan RT-PCR: llä. Kaksivaiheinen vahvistus (95 ° C 30 sekuntia ja 58 ° C 30 sekuntia), toistettiin 40 sykliä. Sen jälkeen kun PCR-reaktio, sulamiskäyrä-analyysi suoritettiin (60 ° C 5 sekunnin ajan) 35 syklin ajan. Aineisto analysoitiin käyttämällä vertailevan C

T-menetelmä [25]. Analyysi kokosolulysaatissa proteiinin ilmentymiseen YAP1 oli kuten aikaisemmin on kuvattu, lukuun ottamatta, että siRNA-hoito oli 72 tuntia.

Tulokset

YAP1 yliekspressoituu haimatiehyen adenokarsinoomat (PDA ) B

arvioimiseksi ekspressiotason YAP1 proteiinin PDA kudoksissa, suoritimme immunovärjäyksessä käyttämällä kudosta mikrosirulla (TMA). Niistä 66 PDA tapaukset sisältämän TMA, 64 tietoja voitiin kasvain värjäystä, joista 33 oli vastaavia normaalin epiteelin. YAP1 vasta-aine osoitti sekä ydin- ja sytoplasmista värjäytymistä, joka on yhdenmukainen tunnetun solun toimintaa YAP1 proteiini – YAP1 on lokalisoitu sytoplasmassa, kun se on inaktivoitu, ja se kulkeutua osaksi tumaan aktivoituna. Olemme arvioineet värjäytymisen intensiteetti sekä ydin- ja sytoplasman YAP1 ja tiivisti tulokset taulukossa 1. Noin 77% (49/64) ja PDA tapauksissa oli positiivinen (sijoitettiin 1+ tai uudempi) ydinvoiman YAP1 värjäytymistä kasvainsoluissa, 63% ( 31/49), josta oli kohtalainen (2 +) tai vahva (3+) värjäys. Sitä vastoin vain 48% (16/33) tapauksista oli positiivista värjäytymistä viereisessä normaalissa epiteelissä, jossa vain 18% (6/33) oli kohtalainen tai voimakas värjäytyminen. Toisaalta, värjäytyminen intensiteetit sytoplasmassa ovat vertailukelpoisia kasvain ja viereisen normaaleissa kudoksissa, joissa oli 56% (36/64) tapauksista oli 2+ tai suurempi värjäytymisen kasvain ja 43% (14/33) oli 2+ tai enemmän värjäytymistä vierekkäisissä normaaliepiteelissä. Analyysi kasvaimen tapauksista yhteensopivat vierekkäisten normaaleissa kudoksissa käyttäen Wilcoxonin rank testi osoitti myös huomattavasti korkeampi ilmentyminen kasvainsoluissa verrattuna viereiseen normaaliin ductal solujen p-arvo 0,0002. Mutta vielä tärkeämpää, ero YAP1 proteiinin tason välillä kasvain ja vieressä normaaliepiteelissä on paljon merkittävämpi tumassa (p-arvo = 0,0007) kuin sytoplasmassa (p-arvo = 0,027), mikä osoittaa, että YAP1 ei ole vain yli-ilmennetään PDA, mutta se on myös erittäin aktivoitu.

Kuvio 1 esittää esimerkkejä ero YAP1 värjäytymistä PDA, viereisten normaaleissa kudoksissa, ja normaali haima. Joissakin normaali haima ja haimatulehduksen kudosten havaitsimme kohtuullisesta voimakkaaseen YAP1 värjäytymistä rakkulasoluissa ja pienet kanavat (kuvio 1 C). Tästä huolimatta yleinen ilmaus YAP1 kasvain on huomattavasti suurempi kuin normaalissa haimassa ja haimatulehdus tapauksissa (p-arvo = 0,011).

A) Negatiivinen heikko sytoplasmista värjäytymistä normaalissa duktaalisessa epiteelissä (valkoiset nuolet) . B) Kohtalainen värjäytymistä (enimmäkseen sytoplasman) normaalissa kanaviin vieressä kasvain (valkoiset nuolet). C) Kohtalainen vahva värjäytyminen normaalissa centroacinar ja pienet ductal solut (valkoiset nuolet); D) Heikko värjäytyminen on adenokarsinooma (mustat nuolet); E) Vahva värjäystä hyvin eriytetty ductal adenocarcinom (mustat nuolet); ja F) vahva värjäytyminen (lähinnä ydin-) huonosti eriytetty adenokarsinooma (mustat nuolet).

Seuraavaksi korreloi aktivoitua ydin- YAP1 ilmaisun tasolla histopatologisia parametrit potilailla, joilla on haimasyöpä. Kuten taulukosta 2, ei ole yhdistyksen välillä ydin- YAP1 ilmaisun ja kasvaimen tai jäljellä tautia imusolmukkeisiin, mutta on olemassa marginaalisesti merkitsevä korrelaatio (r = 0,33 ja p-arvo = 0,068 vuonna Pearsonin korrelaatiokerroin analyysi) välillä ydin- YAP1 taso ja kasvaimen vaiheessa.

tarkastella myös ekspressiotason YAP1 paneelissa kahdeksan ihmisen haimasyövän ja kaksi ikuisti normaalin ihmisen haiman epiteelisolujen ratoihin Western blottauksella (kuvio 2A). Kuusi haimasyövän solulinjoissa (BxPC-3, CFPAC-1, HPAF-II, Hs 766T, MIA PaCa-2, ja PANC-1) oli korkea, kohtalainen proteiinin tasot YAP1. Kaksi haimasyövän solulinjoissa (AsPC-1 ja Capan-1) oli havaittavissa alhaisen YAP1 proteiinitasoja, vastaavasti. Kaksi kuolemattomaksi haiman solulinjoja (HPDE6 ja hTERT-HPNE) oli lievä tai kohtalainen YAP1 proteiinin ilmentymisen. Tämä ilmaus profiili YAP1 haiman solulinjoissa on yhdenmukainen sen kanssa, mitä me havaittu haiman kasvain kudosnäytteitä (taulukko 1).

A) Western blot-analyysi YAP1 proteiinin ilmentymisen paneeli kahdeksan haimasyövän ja kaksi ikuisti (ei-transformoitu) haiman solulinjat. B-E) immunohistokemiallinen värjäys YAP1 haimasyövän ksenografteissa: B) AsPC-1; C) BxPC-3; D) MIA PaCa-2; ja E) PANC-1.

lisätutkimus YAP1 ilmaisun ksenograftikasvaimissa muodostama haimasyövän solulinjoissa osoitti myös samankaltaisia ​​tuloksia. Kuvio 2 esittää differentiaalisen värjäyksessä ja lokalisaation YAP1 ksenograftikasvaimissa neljä haimasyövän solulinjoissa käyttäen immunohistokemia. AsPC-1 kasvain oli hyvin alhainen värjäytyminen YAP1 ja rajoittui sytoplasmaan (kuvio 2B), mikä on sopusoinnussa sen Western blotting tulokset (kuvio 2A). BxPC-3 ja MIA PaCa-2, joka oli kohtalainen tai suuri proteiinin ilmentymisen YAP1 Western blottauksella (kuvio 2A), osoitti kohtalaista voimakkaaseen immunovärjäystä sytoplasmassa ja kohtalainen (joskus voimakas) värjäytyminen tumassa (2C ja 2D, vastaavasti ). PANC-1 oli samanlaiset YAP1 proteiinin ilmentymisen voimakas värjäytyminen sytoplasmassa, joilla on alhainen tai kohtalainen värjäytyminen ytimet (kuvio 2E).

ekspressio ja lokalisointi YAP1 säätelee solutiheys

on raportoitu, että lisääntynyt solujen tiheys voi johtaa aktivointi Hippo reitin ja sen jälkeen takavarikoinnin YAP1 sytoplasmassa [6]. Oletimme, että haiman syöpäsoluissa tällainen sääntely YAP1 lokalisointia solutiheys vähentynyt. Tutustua hypoteesin, arvioimme ekspressiotaso ja lokalisaation YAP1 vaihtelevissa solutihe- solunosien proteiini fraktiointi- ja immunoblottaus.

Kuten kuviossa 3 on esitetty, pienemmillä solutiheydet (20-70%), Yhdistyneessä YAP1 proteiini oli läsnä sekä sytoplasmassa ja tumassa kahden haimasyövän solulinjoissa, BxPC-3, ja PANC-1, kun taas kuolemattomaksi normaalissa haimatiehyen epiteelisolulinja, HPDE6, YAP1 ei ollut havaittavissa sytosolifraktion. Kun solut tuli 100% konfluentteja, suhteellinen ydin- YAP1 proteiinin tason (suhde ydin- YAP1 vs. yhteensä YAP1) kasvoi BxPC-3 ja PANC-1, mutta ei HPDE6 (kuvio S1). Vaikka soluliman YAP1 proteiinin taso kasvaa, kun solut tulevat konfluenteiksi kaikissa kolmessa solulinjoissa, kasvu HPDE6 on merkittävin. Tämä osoittaa, että suhteellisesti enemmän YAP1 edelleen aktivoitu (fosforyloitumaton) syövän solulinjoissa kuin kuolemattomaksi normaalissa HPDE6 solulinja, kun solut tulevat konfluentteja. Taso fosfo-YAP1 (p-YAP1) proteiinia, joka on vain havaitaan kokosolulysaatissa ja sytosolifraktion solulinjoissa, myös vahvistaa erot YAP1 solusijaintipaikan välillä syöpäsolulinjoilla ja HPDE6. p-YAP1 ei havaittu sytosolifraktion alhainen konfluentteja HPDE6 soluissa ja oli dramaattinen kasvu, kun soluista muuttui 100% konfluentteja. Syöpäsoluissa, toisaalta, p-YAP1 esiintyy pieninä solutihe- ja kasvaa, kun solut tulevat enemmän konfluentteja. Nämä tulokset osoittavat, että YAP1 ilmaisun ja lokalisointi ei ole niin tiukasti solutiheys säätelee syöpäsoluissa kuin normaaleissa soluissa, mikä viittaa siihen, että YAP1 on voitu väärin säädellystä haiman syöpäsoluissa.

solujen tiheys kasvaa, haiman syöpäsolun linjat, BxPC-3 ja PANC-1, vastaus deaktivointi YAP1 kuin transkription kofaktorina sytosolientsyymien sitomiseen on vähäisempinä HPDE6. Solut uutetaan lisäämään solutihe- 48 tunnin kuluttua alkuperäisestä kylvö. PARP toimii kuormituksen valvonta tumafraktios-. α-tubuliinin toimii kuormituksen valvonta koko solulysaateista ja sytosolifraktio.

siRNA knockdovvn YAP1 vähentää solujen lisääntymistä, indusoi apoptoosia, ja hidastuu ankkurista riippumaton kasvu haimasyövän solulinjoissa

analysoimiseksi edelleen roolia YAP1 kasvainten synnyssä, tutkimme vaikutus YAP1 hiljentäminen siRNA oligonukleotidien haiman solujen lisääntymistä, apoptoosin, ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. BxPC-3 ja PANC-1-solut käänteisfaasi-transfektoitiin kaksi siRNA oligonukleotidien kohdistaminen eri alueilla YAP1 mRNA-sekvenssin. AllStars Negative Control siRNA (Neg siRNA) ja AllStars Death ohjaus siRNA (Qiagen) käytettiin kontrolleina verrata siRNA transfektion vaikutuksia soluproliferaatioon ja transfektion tehokkuus.

Yli ajan kuluessa 96 tuntia, solut käsiteltiin YAP1 siRNA oli merkittävä väheneminen kasvun verrattuna Solut Vain ja negatiivinen siRNA (neg siRNA) kontrolli. Kuviossa 4 Neg siRNA oli minimaalinen vaikutus proliferaatioon BxPC-3 ja PANC-1 verrattuna käsittelemättömiin solut vain ohjaus. Kuitenkin molemmat YAP1 siRNA sekvenssit olivat merkittävästi tukahdutti lisääntymistä sekä BxPC-3 ja PANC-1. Yhdeksänkymmentäkuusi tunnin kuluttua siRNA hoidon, siRNA sekvenssi YAP1_1 esti kasvua BxPC-3 ja PANC-1-soluissa 69% ja 53%, vastaavasti (p 0,01) ja siRNA-sekvenssin YAP1_2 esti kasvua 34% ja 33% , vastaavasti (p 0,05). YAP1 siRNA-sekvenssejä ei ole merkittävästi vähentää proliferaatiota HPDE6 (kuvio S2A).

solujen kasvun käyrät A) BxPC-3 ja B) PANC-1 transfektoitiin YAP1 siRNA oligonukleotideja. Riippumaton kahden otoksen

t

testiä (kaksisuuntainen) käytettiin laskemaan tilastollisen merkitsevyyden 96-tunnin kohdalla verrattuna Neg siRNA. * Osoittaa p 0,05, ja ** tarkoittaa p 0,01. C) kaspaasi-Glo 3/7 Assay (Promega) käytettiin tason määrittämiseksi apoptoosin haimasyövän transfektoiduissa soluissa YAP1 siRNA oligonukleotidien 72 tunnin jälkeen. ** Tarkoittaa riippumaton kahden otoksen

t

testiä (kaksisuuntainen) p-arvo 0,01 verrattuna negatiiviseen siRNA kontrolli (neg siRNA).

vaikutuksen arvioimiseksi YAP1 estoa apoptoosin, mittasimme kaspaasi-3 ja kaspaasi-7 haiman syöpäsoluissa käsitelty siRNA. Kuten on esitetty kuviossa 4C, 72 tuntia transfektion jälkeen, sekä YAP1 siRNA-sekvenssejä indusoiman kaspaasi 3/7 aktiivisuutta yli 2-kertainen (p 0,05) verrattuna negatiiviseen siRNA ohjaus BxPC-3, kun taas toinen sekvenssi (YAP1_1) merkitsevästi indusoidun kaspaasiaktiivisuus (p 0,05) PANC-1. Kumpikaan ei kuitenkaan YAP1 siRNA järjestyksessä merkittävästi indusoi kaspaasi 3/7 aktiivisuus HPDE6 soluissa (kuvio S2B). Tämä havainto viittaa siihen, että pudotus on YAP1 ekspression indusoi kaspaasi-riippuvaista apoptoosia haiman syöpäsoluissa.

Seuraavaksi vaikutukset YAP1 eston solusyklin jakautuminen tutkittiin (taulukko S1). Molemmat YAP1 siRNA-sekvenssejä aiheutti huomattavan kasvun G0 /G1 solupopulaation sekä BxPC-3 ja PANC-1, verrataan negatiiviseen siRNA valvontaa. Vuonna HPDE6 kaksi siRNA sekvenssit ei aiheuttanut johdonmukaista vaikutusta solusyklin jakeluun verrattuna Neg siRNA (taulukko S1).

Koska havaitsimme merkittävää vaikutusta soluproliferaatioon, halusimme harkita jos YAP1 knockdown siRNA poistaisi kiinnittymisestä riippumatonta kasvua haiman syöpäsoluja. BxPC-3 ja PANC-1-soluja käsiteltiin siRNA sekvensseillä 48 tuntia ja otettiin talteen trypsinoimalla. Yhtä suuri kuin elävien solujen lukumäärä kussakin käsittelyssä oli ympätään sitten pehmeällä agarilla. Jälkeen 21 päivää, pesäkkeet laskettiin kustakin ryhmästä, ja sitten normalisoidaan Solut vain valvonta- ja edustaa prosentteina pesäkkeiden. Sekä YAP1_1 ja YAP1_2 siRNA tukahdutettiin kyky muodostaa klooneja pehmeässä agarissa BxPC-3 (95%, p 0,01) ja PANC-1 (60%, p 0,05) (kuvio 5A). Toisin kuin vastaavia estävä vaikutus solujen proliferaatiomäärityksessä (kuvio 4A ja 4B), väheneminen pesäkkeiden muodostuminen oli paljon suurempi BxPC-3-soluja (~95%) kuin siihen, PANC-1-soluja (-60%). Tämä ero on sopusoinnussa tason YAP1 mRNA: ta ja proteiinia vähentäminen siRNA oligonukleotidit solulinjoissa (kuvio 5B ja 5C). Kuten kuviossa 5C, alennettua proteiinin ilmentymistä YAP1 siRNA on dramaattisempi BxPC-3-soluissa kuin PANC-1-soluissa.

A) Prosenttia pesäkkeiden suhteen solut Vain valvontaa pehmytagar jälkeen 21 päivän kasvua alkuperäisestä kylvö. p-arvot laskettiin vertaamalla YAP1 siRNA (YAP1_1 ja YAP1_2) muuttamisesta Neg siRNA (itsenäinen kaksisuuntaisia ​​

t

testi, kaksisuuntainen). B) qPCR analyysi YAP1 mRNA: n ekspression sen jälkeen, kun 48 tunnin siRNA transfektion. C) Western blotting-analyysi YAP1 ilmaisun jälkeen siRNA-hoidon 72 tuntia. Näytteitä Kunkin solulinjan erotettiin ja analysoitiin samalla blot. * Osoittaa p 0,05, ja ** tarkoittaa p 0,01.

Keskustelu

Alun perin löydettiin Drosophila kuin voimakas reitti tuumorisuppressiogeeneksi, Hippo polku säätelee negatiivisesti solujen kasvun kautta kinaasikaskadin ja johtaa inaktivoimiseksi Yki (YAP1 nisäkkäillä) [6], [7], [9], [10]. Reitti ja sen komponentit ovat erittäin konservoituneita nisäkkäillä, ja useita tutkimukset ovat osoittaneet, että polku on pakottavia roolit solukasvun säätelyssä, lisääntymistä, eloonjääntiä ja yhdistymisvapauden maligniteettien [26] – [33]. Koska ydinvoiman efektori transkription, YAP1 on tullut houkutteleva kohde tutkimuksen nisäkkäiden pahanlaatuisia kasvaimia. Tutkimuksessamme olemme havainneet, että YAP1 on yli-ilmentynyt haiman kasvaimia ja syöpäsolulinjoissa. Alas-säätely YAP1 vähentynyt solujen elinkelpoisuuteen, jakaantumiseen, ja ankkurista riippumaton kasvu viljellyissä soluissa.

solunosasijaintia YAP1 haiman kasvaimia ja viljellyissä solulinjoissa korosti häiriöstä Hippo reitin. Kun reitin aktivointi, YAP1 inaktivoituu kautta fosforylaation LATS1 /2 ja näin ollen jäädä sytoplasmaan [6], [7]. Meidän immunovärjäystä tutkimuksissa, YAP1 värjäytyminen on yleensä voimakkaampi sytoplasmassa kuin tumassa, ja tuumorin on huomattavasti suurempi osuus solujen positiivisia YAP1 värjäytyminen tumassa kuin viereisen normaalin (77% vs. 48%). Vaikka merkittävä osuus vierekkäisten normaalitapauksissa värjättiin positiivinen YAP1, yleinen ilmentymistaso on merkittävästi korkeampi kasvaimen (taulukko 1). Värjäytyminen YAP1 normaaleissa haima kudoksissa rajoittuu asinussolut ja pienet kanavat, mikä on sopusoinnussa aiemman tutkimuksen [34] ja todennäköisesti edustaa normaalia toimintaa YAP1 ylläpitämisessä kudoksen homeostaasiin.

Kuten edellisessä tutkimuksessa [6] ja meidän on havaittu, YAP1 proteiinin ilmentymistä moduloidaan lisäämällä tiheys. Alhaisella tiheydellä, YAP1 proteiinin ilmentyminen on vähäistä, mutta solutiheys kasvaa YAP1 ilmentyminen lisää vastaavasti. Kuviossa 3, joka on hitaampi liikkuva vyöhyke havaittiin haimasyövän solulinjoissa immunoblot kokonaismäärän YAP1 kun solutiheys saavutti 100% koko solulysaatista ja ydin- jakeet. Oletamme, että hitaammin liikkuva vyöhyke havaitaan tumafraktios- ei johdu fosforylaation tiedetään säätelevän YAP1 lokalisointi, vaan translaation jälkeisen modifikaation tiedossa tällä hetkellä [35] – [38]. Tulevia tutkimuksia, solutiheys on huomattava, suhde YAP1 proteiinin ilmentymisen. Haiman solulinjoissa, YAP1 proteiinin ekspressio ja lokalisointi säätelee solujen tiheys, mutta tällainen asetus näyttivät vähenivät merkittävästi syöpäsoluissa verrattuna normaaleissa tiehyen epiteelisoluissa (kuvio 3). Mielenkiintoista on, että vaikka näemme korkea YAP1 värjäytymistä sekä tumassa ja sytoplasmassa PDA kudoksissa, ydin- YAP1 proteiinin taso oli enemmän merkittävää kasvua kuin sytoplasmisen YAP1 verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa (taulukko 1). Tämä ehkä osoittaa, että sen lisäksi, ylössäätelyyn YAP1 proteiinin ekspression, komponentit Hippo reitin, jotka säätelevät YAP1 lokalisointi (fosforylaatio), voidaan myös väärin säädellystä haimasyövän. Itse asiassa, LATS1 /2-kinaasien ylävirtaan YAP1 on osoitettu olevan alas-säädellä useita syöpätyyppejä, mukaan lukien pehmeän kudoksen sarkooma [39], astrosytooma [40], ja rintasyövän [41], [42]. Viimeksi Zhou et al. raportoitu menetys aktiivisen MST1, toinen kinaasi ylävirtaan YAP1, ihmisen maksasolukarsinoomat (HCC) ja ovat tuumoria tukahduttavan siirtogeenisissä hiirimalleihin [43] – [45].