Krooninen sairaus

tiivistelmä

Genisteiini (GEN) on kasviperäinen isoflavoneja ja voi estää hallitsematon solujen kasvu paksusuolensyöpä estämällä WNT signalointireitin. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli testata hypoteesia, että tehostettu geenin ilmentymisen WNT signalointireitin antagonisti, DKK1 jonka genisteiini hoitoon liittyy epigeneettisiä modifikaatioita geenin paksusuolen syöpäsoluja. Genistein indusoi pitoisuudesta riippuvaa G2 vaiheen pysähtymisen ihmisen koolonisyöpäsolulinja SW480 ja vähentää solujen lisääntymistä. Tulokset useat muut ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa vahvisti kasvua estäviä vaikutuksia genisteiinin. Yliekspressio DKK1 vahvisti osallistumisensa kasvun estäminen. Knockdovvn DKK1 ilmentymisen siRNA hieman aiheuttama solujen kasvua. DKK1 geeniekspressio lisääntyi genisteiiniä SW480 ja HCT15 soluja. DNA: n metylaatio on DKK1 promoottori ei vaikuta genisteiiniä hoitoon kaikissa testatuissa solulinjoissa. Toisaalta, genisteiini indusoi histonien H3 asetylaatio DKK1 promoottorialueen SW480 ja HCT15 soluja. Tämä osoittaa, että lisääntynyt histoni asetylaatio liittyy genisteiinin aiheuttama DKK1 ilmentymistä. Yhdistyksen välillä histoni asetylaatio ja DKK1 geenin ilmentyminen on vahvistettu histonideasetylaasi-inhibiittorin trikostatiini-A (TSA) hoitoon. Lopuksi, genisteiini hoito vähentää solujen kasvua ja proliferaatiota paksusuolen syöpäsolulinjoissa. Vaikutus liittyy lisääntynyt DKK1 ilmentymisen kautta induktion histonien asetylointi on DKK1 promoottorialueen.

Citation: Wang H, Li Q, Chen H (2012) Genisteiini Vaikuttaa histonimodifikaation on Dickkopf liittyvistä Protein 1 (DKK1) Gene in SW480 Human Colon Cancer Cell Line. PLoS ONE 7 (7): e40955. doi: 10,1371 /journal.pone.0040955

Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 15 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 18 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoitettiin osittain NIH /NCI apuraha HC (CA135262) ​​ja Illinois Soija Association. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Soy sisältää erilaisia ​​bioaktiivisia komponentteja, jotka ovat saaneet paljon huomiota niiden kyvystä alentaa syöpäriskiä [1], [2]. Epidemiologiset tutkimukset osoittivat, että kuluttaa korkeampi ravinnon soijatuotteita edistää harvemmin kolorektaalisyövän Aasian maissa [3], [4], [5]. Erityisesti, genisteiini (4, 5, 7-trihydroksi-isoflavonin), luonnollinen isoflavone runsaasti soija, on osoitettu vähentävän paksusuolen syövän riskiä [6], [7]. Nämä tutkimukset tarjoavat vahvaa näyttöä tarvetta tutkia mekanismeja genisteiini n syövän vastaista potentiaalia.

soluviljelmätutkimukset, genisteiini on raportoitu muuttavan solun fysiologiaan useissa koolonsyöpäsolulinjaa. Tuore tutkimus suoritetaan Fan et al. tunnistettu että koolonkarsinoomasoluissa oli muuttunut morfologia, mukaan lukien kromatiinin tiivistyminen ja ydinvoiman pirstoutumisen jälkeen genisteiini- hoidon [8]. Lisäksi korkeammat pitoisuudet genisteiinin of 10 mikromol /l merkittävästi indusoi soluproliferaation inhibointi ja DNA: n fragmentoituminen ihmisen koolonsolulinjassa [9]. Lisäksi koolonsyöpäsolulinjoissa Caco-2 ja SW620, solukuolema indusoitiin soija-uute hoidossa [10]. Siksi genisteiini on tulossa lupaava yhdiste paksusuolen syövän ehkäisyssä ja hoidossa. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme edelleen tutkineet antituumoriominaisuuksia genisteiinin testaamalla solusyklin etenemisen ja soluproliferaatiota useissa peräsuolen syövän solut hoitovasteen kasvavien pitoisuuksien kanssa genisteiinin.

Various reittejä ja mekanismeja on ehdotettu olevan vastuussa genisteiini- kykyä alentaa syöpäriskiä. IGF-IR signalointia AKT-reitin aktivaation ja solun kasvun säätelyssä jotka liittyvät antituumorivaikutukset genisteiinin [9], [11]. Lisäksi, genisteiini myös hallussaan antioksidanttisia ominaisuuksia matkimalla estrogeenin kautta estrogeenireseptori-välitteisen fosforylaation ERK1 /2 ja aktivointi NFKB-signalointireitin [12]. Lisäksi raportit viimeaikaiset tutkimukset eläimillä osoittivat, että genisteiini esti hormoniriippuvaisen tai riippumattaman syöpäsolujen säätelemällä vuorovaikutuksia D-vitamiinin ja estrogeenin reseptori [13], [14], [15]. Genistein säätelee geenin transkriptiota erilaisissa syöpäsolun riviä epigeneettiset määräyksiä, esim. DNA: n metylaatio ja histonimodifikaation [16], [17], [18]. Genistein muuttaa DNA metylaatio erilaisten geenien rotan ja hiiren malleissa [19], [20]. Kuitenkin taustalla olevia mekanismeja genisteiiniä rooli solujen lisääntymisen tai apoptoosin aikana syövän synnyn edelleen huonosti.

Wingless-int (WNT) signalointireitin käsittää useita kasvutekijöitä, jotka ovat mukana organogeneesin, leviämisen, uudistaminen, solukohtalo- määritys ja solu-soluadheesion [21], [22]. WNT proteiinit sitoutuvat Frizzled reseptoreihin (FRZ) ja LDL-reseptorin kaltainen proteiini (LRP) co-reseptoreihin, jolloin soluliman β-kateniinin stabilointi ja kertymistä. Näin ollen ydin- β-kateniinin kasvaa ja komplekseja TCF /LEF transkriptiotekijöitä, mikä johtaa lisääntyneeseen kohdegeenien transkriptiota, mukaan lukien sykliini-D1 [23]. Poikkeava WNT signalointi on jonkun muun siirryttäessä normaalista paksusuolen epiteelin pahanlaatuisten syöpäsolujen [24], [25]. Genistein raportoitiin äskettäin tukahduttaa WNT signalointia koolonsyöpäsolulinjaa [26], [27], joka tarjoaa yhden potentiaalia mekanismin genisteiini- n syövän vastaista kapasiteettia.

Yksi tärkeimmistä säätelijöinä WNT signalointireitin on sen antagonisti Dickkopf 1 (DKK1). DKK1 estää β-kateniinin-välitteiseen signaalin siirtoon sitoutumalla LRP ja Kremen proteiinit, edistää solujen erilaistumista ja apoptoosia [28], [29], [30], [31], [32]. Äänenvaimennusjärjestelmä tai menetys DKK1 on dokumentoitu erilaisia ​​sairauksia. Kolorektaalisyövässä vaiennetaan

DKK1

ilmentyminen on tiukasti liittyy mikrosatelliittien epävakaus kasvaimen alatyyppejä [33]. On todettu, että kasvain tukahduttava kapasiteettia DKK1 on tukahdutettu jonka hypermetylaatiota sen promoottorin pitkälle edennyt kolorektaalisyöpä [34]. Ihmisen munuaisen karsinoomasolut, kemiallisesti indusoimaan histoni asetylaatio on DKK1 promoottorin johti uudelleen aktivointi DKK1 ilmaisu, joka osoittaa, että sen lisäksi, DNA: n metylaatio, histoni hännän muutoksia voi edistää transkriptiota ohjaa kriittisiä liittyvien geenien syövän kehittymisen [ ,,,0],35].

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet syövän vastaisen ominaisuuksia genisteiinin tunnistamalla sen vaikutuksia syöpäsolujen fysiologiaan ja tutkimalla mekanistinen perusta

DKK1

aktivointia. Erityisesti tämä tutkimus on ensimmäisten joukossa yhdistää genisteiiniksi välittämää epigeneettisellä muutokset

DKK1

on syöpää torjuva ominaisuuksia genisteiinin kolorektaalisyövässä.

Tulokset

Genistein hoito valikoivasti indusoi DKK1 Gene Expression mutta ei Alter DKK1 promoottori metylaation

tutkimiseksi korrelaatio DNA metylaatio klo

DKK1

promoottori CpG-saarekkeen ja vaikutus genisteiinin hoidon

DKK1

ilme, reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin mittaamiseksi

DKK1

mRNA ilmaisun ja metylaatiospesifisen polymeraasiketjureaktio (MSP) ja bisulfiitin sekvensointi (BSF) ja

DKK1

promoottorialue tehtiin tutkia promoottorin metylaatiostatus (Fig. 1). Ensinnäkin

DKK1

geenin ilmentyminen analysoitiin saatavilla koolonsyöpäsolulinjoissa tutkia vaikutukset genisteiinin hoitoon. Niistä tutkituissa solulinjoissa, SW480 ja HCT15 solut osoittivat induktion DKK1 geenin ilmentymisen genisteiinin (Fig. 1A). Analyysi DNA: n metylaation

DKK1

promoottorialueen vahvisti, että DKK1 geenin ilmentyminen yleensä on kääntäen verrannollinen metylaation tason alueen testattu (-159 /+ 109, Fig. 1B, 1C ja 1D) . Erityisesti, RKO, SW48, ja DLD-1-solut osoittivat erittäin korkea, jos ei ole täydellinen, metylaatio alueen (Fig. 1 C, 1D). Tämä hypermetylaatio on kääntäen verrannollinen tason DKK1 geenin ilmentymisen kuvion. 1A. Sillä DKK1-ilmentämissolulinjat HCT15, HT29, ja SW480 on vielä vähän DNA: n metylaatio havaittiin (Fig. 1 C ja 1 D). Vielä tärkeämpää on, genisteiini käsittely ei muuta DNA-metylaation

DKK1

promoottorialue missään testatuissa solulinjoissa, riippumatta siitä, kuinka DNA-metylaation alueella (Fig. 1 C ja 1 D).

SW480, DLD-1, HCT15, HT29, RKO ja SW48 soluja käsiteltiin genisteiini- 2 d ennen näytteen keräämistä tarkempaa analysointia varten. A) Suhteellinen DKK1 mRNA ilmaisun. mRNA: n ekspressio analysoitiin RT-PCR: ää. Data normalisoitiin sisäisen valvonnan L7a. Kolme riippumatonta solu- näytteet analysoitiin ja esitetään keskiarvona ± SEM. Tähdellä (*) osoittaa tilastollista merkittävyyttä verrattuna ohjata samassa solulinjassa (p 0,05). B) Kaavamainen piirustus DKK1 promoottorialueen. Rekki edustaa CpG-saarekkeen sisällä promoottorialueen. Pystysuorat pylväät osoittavat yksittäisten CpG sivustoja. Musta arrowheads osoittaa sijainnit alukkeiden käytettiin PCR monistuksia varten bisulfiittimodifiointi Sequencing (-159-109). Nuolet edustavat kannat käytetyt alukkeet PCR-monistuksia MSP (-60~ + 73). C) MSP on DKK1 promoottorialueen HCT15, HT29, RKO ja SW48. Y-akselilla on metylaation tason ja arvot lasketaan prosentteina M /(M + UM). Kun ei nähnyt, virhe baarit ovat sarakkeita. D) bisulfiittimodifiointi sekvensointi DKK1 promoottorialueen SW480 ja DLD-1-soluissa. Jokainen avoin ympyrä edustaa metyloimaton C sisällä CpG kun ympyrä edustaa metyloitu C sisällä CpG. Jokainen rivi ympyröitä, edustaa yksittäistä kloonia käytettiin sekvensointiin.

Genistein annoksesta ja ajasta riippuvaa aiheuttama DKK1 Gene Expression

Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin mittaamiseksi

DKK1

mRNA ekspressiotasot vastauksena eri genisteiiniksi annokset ja altistuksen kertaa. Kaiken

DKK1

ekspressio lisääntyi genisteiiniä annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 2A). 2 d genisteiinin hoidon,

DKK1

mRNA: n ekspressio oli 3-kertainen ja 8-kertainen jälkeen 50 ja 75 umol /l genistein hoitoja vastaavasti, verrattuna ei-genisteiinin ohjaus (p 0,05, kuva 2A). MRNA taso

DKK1

vuonna SW480-soluissa lisäsi myös genisteiini- hoito (75 mikromol /l) on ajasta riippuva tavalla (Kuva. 2B) ja saavutti 10-kertainen induktio d 4 verrattuna tasolle, että DMSO-kontrollin.

A) SW480-soluja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla genisteiinin 2 d. mRNA: n ekspressio analysoitiin RT-PCR: llä. X-akseli osoittaa genistein pitoisuuksien ja y-akseli osoittaa suhteellisen mRNA: n ekspression taso. Data normalisoitiin sisäisen valvonnan L7a. Tähdellä (*) osoittaa tilastollista merkittävyyttä verrattuna 0 mikromol /l genisteiini- (

p

0,05). B) aikakäyrä

DKK1

ilmaisun SW480 seuraavissa genistein hoitoa. SW480-soluja käsiteltiin 75 mikromol /l genisteiinin ja näytteitä päivä 1, 2, 3 ja 4 hoidon. Data normalisoitiin sisäisen valvonnan L7a. Kolme riippumatonta kokeet suoritettiin, ja esitetään keskiarvona ± SEM. Kun näkymätön, virhepalkkien ovat sisällä baareissa. Tähdellä (*) osoittaa tilastollista merkittävyyttä verrattuna d 1 75 mikromol /l genisteiini- (

p

0,05). C) DKK1 proteiinin ilmentymisen. Kokosoluproteiinikuviot uutteet kerättiin SW480-solujen ja western blot-analyysi DKK1 suoritettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Häpeäpilkku Länsi-analyysi on esitetty ja kvantifiointiin on keskiarvo ± SEM 3 itsenäisestä näytteistä. Aktiini käytettiin lastaus ohjaus. Tähdellä (*) osoittaa tilastollista merkitystä vertailuryhmän 0 mikromol /l genisteiini- (

p

0,05).

induktio

DKK1

varmistettiin mittaamalla sen ekspressiotaso in SW480-soluissa (kuvio. 2C). DKK1 proteiinin ilmentyminen oli 3-kertainen induktio 75 umol /l genisteiinin hoidon SW480-soluissa sen jälkeen, kun 4-d hoitoon verrattuna kontrolliin.

Genisteiini Inhibioitu solusyklin etenemistä in SW480 Solut

vaikutuksen tutkimiseksi genisteiinin solusyklin etenemiseen SW480-solujen DNA-sisällön SW480-solujen mitattiin alueen fit-analyysi sen jälkeen, kun virtaussytometria-analyysi. Histogrammit osoittivat, että väestö solujen G1 oli merkittävästi vähentynyt 75 mikromol /l genisteiinin hoitoa verrattuna ei-genisteiini ohjaus, jossa laskua solujen S vaiheessa (Fig. 3A). Toisaalta, genisteiiniä hoito johti kertyminen solujen G2 /M-vaiheen SW480-soluissa.

SW480-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla genisteiinin 2 d ennen näytteen keräämisen. A) edustaja DNA histogrammit genisteiinin hoidon 0 ja 75 umol /l virtaussytometrialla. Y-akseli edustaa suhteellista DNA-sisältöä ja x-akseli esittää solusyklin vaiheissa. B) Solusyklianalyysiä genisteiinin käsiteltyjen solujen. Prosenttiosuus soluja G1 (•), S (▴) tai G2 /M (▪) on esitetty. Data edustaa keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. C) WST-1 runsaudenmäärityksessä. WST-1 signaaleja kustakin kuopasta luettiin 450 nm absorbanssi vasten viittaus aallonpituudella 630 nm. Absorbanssi muutettiin todellisten solujen määrä käyttämällä standardia syntyy sarjalaimennoksia tunnettu määrä soluja. Kolme riippumatonta solu- näytteet analysoitiin ja esitetään keskiarvona ± SEM. Tähdellä (*) osoittaa tilastollista merkitystä verrattuna 0 umol /l genisteiinin (

p

0,05).

vaikutukset genisteiinin solusyklin etenemisen analysoitiin edelleen käsittelemällä solujen genisteiiniä pitoisuuksina 1-75 umol /l. Solujen prosenttiosuus eri vaiheissa laskettiin suhde porteilla solujen koko solupopulaatio. Genisteiini pitoisuus on yli 5 umol /l lisäsi solujen prosenttiosuus on G2 /M-vaiheessa merkittävästi (p 0,05), jolla on korkein kertymistä havaittiin 75 umol /l genisteiinin (p 0,05, Fig. 3B). Tulokset osoittavat, että solujen prosenttiosuus G1 faasi poistettiin seuraavat 75 umol /l genisteiinin hoidon (Fig. 3B). Prosenttiosuus S-vaiheen solujen väheni merkitsevästi (p 0,05) seuraavat 50 ja 75 umol /l genisteiini- hoitojen jälkeen ohimenevän lisäyksen 25 mikromol /l genisteiini- verrattuna ei-genisteiini ohjaus. Yhdessä solusyklin etenemisen SW480-soluissa on säännelty genisteiiniä annoksesta riippuvalla tavalla.

Genisteiini Inhibioitu Cell Proliferation in SW480 ja useita muita Colon Cancer Cell Lines

Solujen proliferaatio testattiin WST-1-määritys, joka osoitti, että genistein hoidot vähensi solujen lukumäärät SW480-solujen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 3C). Klo genisteiini pitoisuus on yli 15 mikromol /l solumäärät merkittävästi vähentynyt verrattuna ei-genisteiini ohjaus (p 0,05). Tämä anti-proliferatiivista vaikutusta genisteiiniä on vahvistettu useissa paksusuolen syöpäsolulinjoissa (kuvio S1). AnneksiiniV-propidiumjodidilla määrityksessä ei osoittanut mitään muutosta millä tahansa genisteiinin hoitoja, mikä osoittaa, että genistein ei vaikuta apoptoosin määrä (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että kasvua estävästi genisteiinin on yleistettävissä yhteinen ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa.

sykliini D1 mRNA Expression Vähentynyt seuraavat Genistein Käsittely SW480 Solut

solusyklikontrollin geenejä

p21

,

sykliini D1

ja

c-MYC

ovat korreloi voimakkaasti solukasvun säätelyssä. Perustuen Edellä esitettyjen tietojen, solusyklin pysähtymisen esiintyi G2 SW480 soluissa genistein hoitoa. Jotta voitaisiin edelleen tutkia vaikutukset genisteiini on solusyklin etenemisen, mRNA ilmaus solusyklikontrollin geenien

p21

,

sykliini D1

ja

c-MYC

mitattiin reaaliaikainen RT-PCR: llä. Tuloksemme osoittivat, että ilmentyminen

sykliini D1

laski huomattavasti (p 0,05), 50 ja 75 umol /l genisteiinin kontrolliin verrattuna (Fig. 4, p 0,05). Ilmaisu on

p21

ja

c-MYC

ei vaikuttanut tahansa genisteiinin hoitoja. Vähentynyt ilmentyminen

sykliini D1

hyväksyy solusyklin tietoja virtaussytometrialla osoittaa, että solusyklin eteneminen estyi genistein hoitoon.

SW480-soluja käsiteltiin 0, 1, 5 , 15, 25, 50 tai 75 umol /l genisteiinin 2 d. MRNA ekspressiotasot

p21, sykliini D1

ja

c-MYC

mitattiin RT-PCR: llä. L7a käytettiin sisäisen valvonnan. Kolmen erillisen kokeen analysoitiin ja esitetään keskiarvona ± SEM. Tähdellä (*) osoittaa tilastollista merkittävyyttä verrattuna Control 0 mikromol /l genisteiini- (

p

0,05).

yli-ilmentyminen DKK1 Inhibioitu solusyklin etenemisen ja proliferaatiota in SW480 solut

tutkimiseksi mahdollinen rooli

DKK1

solusyklin etenemisen, SW480-solut transfektoitiin pCMV-XL5 plasmidi sisältää ihmisen

DKK1

. Yliekspressio

DKK1

varmistettiin RT-PCR-analyysi mRNA: n ja Western blot-analyysi proteiinin (Fig. 5A ja 5B). Analyysi

sykliini D1

ilmaisu osoitti, että yli-ilmentyminen DKK1 indusoi samanlaisia ​​tukahduttaminen geenin ilmentymisen, kun genisteiinin hoitoon (Fig. 5A). Yliekspressio

DKK1

lisäsi merkittävästi solujen prosenttiosuus, että G2 /M-vaiheessa verrattuna vektorisäätö (p 0,05, Fig. 5C), vaikkakin vähemmässä määrin verrattuna genisteiiniksi hoitoon. Samaan aikaan solujen prosenttiosuus G1 faasi väheni merkittävästi soluissa, jotka yliekspressoivat DKK1 (p 0,05), eikä ollut mitään merkittävää muutosta solujen määrä S-vaiheessa. Tulokset WST-1-määritys osoitti, että yli-ilmentyminen

DKK1

laski proliferaatiota SW480-solujen, vaikkakin paljon vähemmässä määrin verrattuna genisteiiniksi hoitoon (p 0,05, Fig. 5D). Kaiken yliekspressio

DKK1

tuottivat samankaltaisia ​​vaikutuksia estämällä solun etenemistä ja solujen lisääntymistä samoin kuin genisteiinin hoitoon, mikä viittaa rooliin DKK1 näissä solutapahtumia.

pCMV vektorin, joka sisältää ihmisen

DKK1

geeniä käytettiin solujen transfektoimiseksi ennen näytteen keräämistä analyysiä varten. Tyhjät pCMV vektoria käytettiin kontrollina yli-ilmentymisen kokeita. Kolme riippumatonta solu- näytteet analysoitiin ja esitetään keskiarvona ± SEM. A) mRNA ilmentymä

DKK1

ja

sykliini D1

säännöllisesti ja

DKK1

-transfected SW480-soluissa. MRNA: n ilmentyminen analysoitiin RT-PCR: llä. Data normalisoitiin sisäisen valvonnan L7a. B) DKK1 proteiinin ilmentymistä säännöllisesti soluissa ja transfektoitujen SW480-solujen. Kokosoluproteiinikuviot Uutteet otettiin talteen transfektoiduista SW480-solujen ja western blot-analyysi DKK1 suoritettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Edustava blot näkyy ja kvantifiointiin on keskiarvo ± SEM 3 itsenäisestä ruokia. Aktiini käytettiin lastaus ohjaus. C) Solusyklianalyysiä säännöllisen ja

DKK1

-transfected SW480-soluissa. Tuloksena saatiin virtaussytometrialla. Y-akseli edustaa% aidatulla soluista ja x-akseli esittää eri solusyklin vaiheissa, kuten G1, S ja G2 /M. D) WST-1 runsaudenmäärityksessä vuonna vektorivälitteisten ja

DKK1

-transfected SW480-soluissa. WST-1-signaalit muunnettiin todellisten solujen määrä käyttämällä standardia syntyy sarjalaimennoksia tunnettu määrä soluja. Data normalisoitiin kontrolloida genisteiiniksi hoitoon ja vektorina DKK1 transfektion vastaavasti. Tähdellä (*) osoittaa tilastollista merkittävyyttä verrattuna vastaavaan verrokkiryhmään (genisteiiniä valvoa; DKK1 vektori;

p

0,05). Sillä knockdovvn DKK1, siRNA-dupleksit ihmisen DKK1 geeni transfektoitiin SW480 soluihin. Salatut sekvenssit käytettiin ohjaus siRNA. E) mRNA ilmentymä

DKK1

ja

sykliini D1

hallinnassa siRNA (N /S SI) ja

DKK1

siRNA (DKK1 si) hoidetun SW480-soluissa ohjaus ja genisteiini hoitoja. MRNA: n ilmentyminen analysoitiin RT-PCR: llä. Data normalisoitiin sisäisen valvonnan L7a. F) WST-1 runsaudenmäärityksessä hallinnassa siRNA ja

DKK1

siRNA SW480-soluissa. WST-1-signaalit muunnettiin todellisten solujen määrä käyttämällä standardia syntyy sarjalaimennoksia tunnettu määrä soluja. Tähdellä (*) osoittaa tilastollista merkittävyyttä verrattuna Ohjaus 0 mikromol /l genisteiini- (

p

0,05). Kiinnike merkitsee tilastollista eroa N /S si ja DKK1 si ryhmää hoidettiin genisteiini- (p = 0,002).

knockdovvn DKK1 vuonna SW480 Solut osittain päinvastaiseksi muutokset Cellular Profile aiheuttaman Genistein Treatment

sen tutkimiseksi, muutokseksi solun ominaisuuksien SW480 aiheuttama genisteiiniä riippuu

DKK1

geeniekspressiota, siRNA kohdistaminen DKK1 transfektoitiin SW480 soluihin seuraa genistein käsittely. Reaaliaikainen RT-PCR osoitti, että siRNA vähentää tehokkaasti DKK1 ilmaisua SW480 sekä ohjaus ja genistein hoitoja (p 0,05, Fig. 5E). Lisäksi vähentäminen

sykliini D1

mRNA ilmentyminen genisteiini- käsittely kuin ei-spesifisiä siRNA käsiteltyjä soluja (N /S si) poisti knockdovvn DKK1 (DKK1 si, kuvio. 5E). Samaan aikaan, vaikka kasvua estävä vaikutus päässä genisteiiniä havaitaan sekä N /S siRNA ja

DKK1

siRNA ryhmiä, knockdovvn DKK1 huomattavasti leviämisen SW480-solujen verrattuna ohjaus siRNA genistein hoidossa (p 0,05, Fig. 6B). Sen sijaan, oli minimaalinen PolII sitova sisällä

DKK1

geenin DLD-1-soluissa, mikä vahvistaa vaimennettu geenin transkriptiota DLD-1-solut (Fig. 6B).

A) kaavamainen piirros

DKK1

geenin. Musta nuolenpäät edustavat alukkeita käytettiin PCR testata kolme alueiden ChIP määrityksessä: promoottori, koodaus ja 5 ’ylävirtaan ohjaus. Täytetyt laatikot edustavat eksonin

DKK1

geeni, kun taas avoin laatikko edustaa

DKK1

promoottori. Mustat viivat edustavat intronit. B) ChIP analyysi suhteellisen proteiinin runsaus sisällä eri alueilla

DKK1

geenin SW480 ja DLD-1-soluissa. Immunosaostettiin DNA analysoitiin reaaliaikainen PCR. Spesifisten vasta-aineiden, joita käytetään immunosaostus on merkitty x-akselille. Epäspesifiseen kaniinin lgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina. Tulokset esitettiin graafisesti suhteessa arvoon 25% panos-DNA. Kolmen erillisen kokeen analysoitiin ja esitetään keskiarvona ± SEM. Tähdellä (*) osoittaa tilastollista merkittävyyttä verrattuna Control käyttäen samaa vasta-ainetta solussa viiva (p 0,05).

Voit selvittää lisääntynyt transkriptio tasolle

DKK1

geenin vasteena genisteiiniksi on moduloitu muutokset kromatiinin rakenteen, vasta-aineita asetyloitu, metyloidut tai fosforyloitu histonien käytettiin chIP määrityksessä. Histonimodifikaation kolmea edustaja alueet

DKK1

geeni tarkasteltiin ensin SW480-soluissa jälkeen genisteiini hoidon käyttäen DLD-1-solujen negatiivisena kontrollina. Kohonneita asetyloitu histoni H3 promoottori ja koodaavat alueet

DKK1

havaittiin SW480-soluissa jälkeen genisteiini- hoidon (p 0,05, Fig. 6B, H3Ac), ilman merkittäviä asetylointi histonien DLD-1-soluissa ennen tai jälkeen genisteiini- hoidon (Fig. 6B). Runsaasti muiden asetyloitu histoni testattu, asetyloitu histoni H4, eivät vaikuttaneet genisteiiniä hoito joko solulinjoissa (H4Ac). Vaikka oli paljon korkeampi dimetyyli-histoni H3 lysiinin 4 SW480-soluissa verrattuna DLD-1-soluja, genisteiini hoito ei vaikuta metylaatiostatuksen tämän histoni H3 jäännös (Fig. 6B, H3K4Me2). Fosforylaatiota histoni H3 seriini 10 tutkittiin myös ja tulos osoitti, että oli vaatimaton väheneminen eri alueilla

DKK1

geenin genisteiiniä kohtelu kaikissa testatuissa solulinjoissa (p 0,05, Fig. 6B, H3S10p). Yhteenvetona aktiivinen transkriptio

DKK1

geeni liittyy lisääntynyt histoni H3 asetylointi sen geenin alue, joka todennäköisesti johti rekrytoinnissa PolII sen promoottorin.

DKK1 mRNA Expression aiheutettiin histonideasetylaasi (HDAC) estäjää SW480 Solut

TSA on histonideasetylaasi- (HDAC) estäjä, joka on vuorovaikutuksessa useimmat HDAC perheenjäsenten ja indusoi asetylointi histonien. Vaikutusten vahvistamiseksi genisteiinin aiheuttaman histoni asetylaatio on

DKK1

transkriptio, käsittelimme SW480-solujen joukon TSA pitoisuuksien ja vertasimme tuloksia genisteiiniksi hoitoon. MRNA: n ilmentyminen

DKK1

lisättiin merkittävästi TSA hoito annoksesta riippuvalla tavalla, joka on samanlainen tulos havaittiin genistein hoitoon (p 0,05, Fig. 7).

DKK1

mRNA-tasolla analysoitiin SW480 käsitellyissä soluissa 50, 100 tai 200 nmol /l TSA (TSA50, TSA100, ja TSA200, vastaavasti) ja 1 d. Genisteiini käsittely tehtiin kuten aiemmin on kuvattu. mRNA: n ekspression taso analysoitiin RT-PCR: ää. Kolme riippumatonta solu- näytteet analysoitiin ja esitetään keskiarvona ± SEM. Arvot eri kirjaimet eroavat (

p

0,05).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tarkoituksena on tunnistaa mahdollisia mekanismeja antituumorivaikutukset genisteiinin. Havaitsimme, että molemmat mRNA ja proteiini tasoilla DKK1 olivat voimistuvan genistein hoitoa. Tuloksemme osoittivat, että genisteiini indusoi solusyklin pysähtymiseen ja esti solujen lisääntymistä in SW480 paksusuolen syöpäsoluissa. Tämä vahvistettiin myöhemmin useissa muissa koolonsyöpäsolulinjaa. Sekä yli-ilmentäminen ja pudotus on

DKK1

vahvisti osallistumista DKK1 inhibitioon solusyklin etenemisen ja solujen lisääntymistä. Tuloksemme osoittivat, että lisääntynyt DKK1 ilmentyminen saattaa olla yksi syy, joka aiheutti solusyklin pysähtymiseen ja soluproliferaation inhibointi, jonka genisteiiniä hoitoon. Lisäksi vertailu

DKK1

ilmentävillä soluja kuten HCT15, HT29 ja SW480, sekä

DKK1

-repressed soluja kuten RKO, SW48 ja DLD-1 osoitti, että geeni transkriptiota

DKK1

on kääntäen verrannollinen sen promoottorin metylaatiostatuksen. Genistein ei vaikuta DNA: n metylaatio on

DKK1

promoottori. Toisaalta ja mikä tärkeintä, olemme tehneet havainnon, että genisteiini indusoi histonien asetylointi sisällä

DKK1

geeni ja tämä korreloi aktivoitumisen sen geenin transkription.

syövän vastaisen roolit genisteiini, johon kuuluvat apoptoosin estyminen solusyklin etenemistä, solujen lisääntymistä ja invaasiota, tukos angiogeneesin ja metastaasin eri syöpien on hyvin dokumentoitu [7], [36], [37], [38]. Molekyylitason mekanismeja näiden syövän vastaisen toimintoja genisteiinin kuuluvat modulaatioina solusyklin estäjät, apoptoosin säätelyyn liittyvien geenien, samoin kuin IGF-IR ja PI3K /AKT signalointi [11], [39], [40], [41]. Work ryhmämme on osoittanut, että genistein esti toinen kriittinen polku paksusuolensyöpä kehittämiseen, WNT /β-kateniinin reitin, häiritsemällä promoottori metyloinnin geenejä. Erityisesti, genisteiini indusoi

WNT5a

ilmentymistä vähentämällä metylaation geenin promoottorialue [27]. Genistein esti myös WNT /β-kateniinin reitin aktivoimalla toinen WNT antagonisti,

sFRP2

, demetyloimalla CpG-saarekkeiden geenissä [26]. Nykyinen tutkimus laajeni osaamista sisällyttää DKK1 kuin toinen tekijä WNT signalointi joka välittää vastauksen genisteiini hoitoon. Koska repressori syöpäsolujen kasvua, DKK1 on tärkein antagonisti, joka häiritsee WNT polku ja downregulates ilmentymistä alavirran kohde-geenejä, mukaan lukien sykliini-D1 [28], [42], [43].

ilmaus DKK1 hiljennettiin promoottoriaktivoinnilla hypermetylaation pitkälle edennyt paksusuolen syövän (Dukes C ja D) [34]. DLD-1 solulinja Dukes C, pitemmälle paksusuolen syöpä, demetylaation DKK1 geenin 5-atsa-2′-deoksisytidiini, joka on DNMT estäjä, uudelleenaktivoitu DKK1 ilmaisun [34], [44] . Koska genisteiini on osoitettu aktivoivan geenien kautta CpG demetylaatio [19], me testattiin ensin mahdollisuus DKK1 promoottorin demetylaatio genisteiiniä. Tuloksemme vahvistivat, että metylaatio tasolla promoottori-CpG-saarekkeen on kääntäen verrannollinen geenin ilmentymisen DKK1. Solulinjoissa kanssa hypermetyloitunut promoottorialueen, mukaan lukien DLD-1, RKO, ja SW48, oli minimaalinen, jos ei ole vaimennettu DKK1 geenin ilmentymistä. Lisäksi genisteiini hoito ei muuta hypermetylaatiota alueen näissä soluissa, eikä se indusoi mitään geeniekspressiota. Toisaalta, DKK1 oli metyloitumattomia alkuvaiheessa paksusuolen syövän (Dukes B) ja siihen liittyvät solulinjojen SW480 [34] ja HCT15. Sekä MSP ja bisulfiitti sekvensointi vahvisti, että DNA: n metylaatio oli hyvin vähän, jos lainkaan, solulinjoissa. Lisäksi hypometylaatio ei muuta genistein hoitoa. Siksi DNA demetylaatio hylättiin mekanismina induktioon DKK1 geenin ilmentymisen genisteiiniä näissä solulinjoissa.

On raportoitu, että genisteiini myös moduloi muita epigeneettisiin markkereita chromatin tasolla [16], [45 ], [46].