Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tiedetään, että syöpä etenee pystysuuntaisilla geeninsiirto, mutta tämä malli ei ota huomioon, että DNA kiertää eliöt ja että se on biologisesti aktiivisia kun sen sisäänottoa vastaanottajan solut. Täällä vahvistavat aiemmat havainnot kyvystä soluttoman DNA aiheuttavan

in vitro

solutransformaatio ja kasvaimen kehittymisen käsittelemällä NIH3T3 vastaanottaja hiiren solujen seerumin paksusuolen syöpäpotilaiden ja supernatanttia SW480 ihmisen syöpäsoluja. Solutransformaatio ja kasvaimen kehittymisen vastaanottajan solut eivät esiinny, jos seerumin ja supernatantit köyhdytettyä DNA. On myös osoitettu, että horisontaalinen syövän etenemisen välittämä kierrättämällä DNA tapahtuu kautta sisäänotto saaja soluista

in vivo

malliin, jossa immuunivaste on rottia altistettiin paksusuolen syövän synnyn 1,2-dimetyylihydratsiinin oli lisääntynyt määrä koolonikasvainten kun injektoidaan dorsum ihmisen SW480 koolonkarsinoomasoluja lähteenä kiertävän onkogeenisten DNA, joka voisi korvata hoidettaessa näitä eläimiä DNAasi I ja proteaasit. Vaikka osuus biologisesti aktiivisia molekyylejä muu kuin DNA tämän ilmiön esiintyvän ei voida sulkea pois, meidän tulokset tukevat sitä, että syöpäsolut päästävät verenkiertoon biologisesti aktiivisia DNA edistää syövän etenemiseen. Tutkia tarkemmin horisontaalista syövän etenemisen ilmiö välittämä kiertävä DNA tarvitaan selvästi, onko sen manipulointi voi olla rooli syövän hoidossa.

Citation: Trejo-Becerril C, Pérez-Cárdenas E, Taja-Chayeb L Anker P, Herrera-Goepfert R, Medina-Velázquez LA, et al. (2012) Cancer Progression Tukena horisontaalinen geenisiirto käytettäessä

In vivo

Model. PLoS ONE 7 (12): e52754. doi: 10,1371 /journal.pone.0052754

Editor: Brian Lichty, McMaster University, Kanada

vastaanotettu: 23 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 20 marraskuu 2012; Julkaistu: 28 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Trejo-Becerril et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat CONACyT myöntää 34649-M, 50699 ja PAPIIT Unam IN214902. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat kiinnostusta. Co-kirjailija Phillipe Anker on sidoksissa OncoXL. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Nykyinen paradigma syövän etenemisessä on, että se tapahtuu kautta pystysuoraan geeninsiirto; Tämä tarkoittaa sitä, että jälkeläiset aloittamista tuumorisolun perimään geneettiset ja epigeneettiset muutokset johtavat syövän etenemiseen. Tämä malli kuitenkin huomioi, että horisontaalinen tai sivuttainen siirto DNA yhdistää ja muotoilee lähes kaiken elollisen [1] ja että sisällä organismi, kiertävä DNA, kuten eksosomeiksi jotka sisältävät transkriptionaalisesti aktiivinen mRNA ja microRNA, saattavat toimia hormonitoimintaa tai paracrine messenger, voi vaikuttaa toimivuuteen vastaanottajien solujen [2]. Näin ollen on ehdotettu, että solu-free-DNA: ta (kiertävä DNA) voisivat osallistua kehittämiseen etäpesäkkeiden kautta ”passiivinen” transfektiota, kuten sisäänoton tällaisia ​​nukleiinihappoja herkkiä soluja [3]. Vuonna 1994, Anker et ai., Ensin osoittaa, että supernatantissa viljeltyjen koolonisyöpäsolulinja SW480 kykeni muuntamaan vastaanottajan kuolematon hiiren NIH3T3-solut, jotka hankkivat mutatoitunut ihmisen

K-ras

[4]. Transformation näistä vastaanottajan solujen plasma paksusuolen syöpäpotilaiden on raportoitu sekä [5].

Kyky geneettinen materiaali kiertää eukaryooteissa on tunnettu vuodesta 1948 [6], ja että tämä DNA voi olla vapautuu bakteerien ja korkeampien eliöiden ja tehdä vastaanottajan soluihin osoitettiin Anker ja Stroun [7] – [9]. Nämä havainnot johtivat siihen ajatukseen, että DNA voisi toimia messenger [10] – [16]. Tätä näkemystä on tukenut helppous, joka annettiin bakteeri- ja eukaryootti-DNA voi liikkua vapaasti koko eläinten ja kasvien elimissä ja sen kyky tulla yksittäisten solujen luonnostaan, jossa se voi paikantaa isäntäsolun ytimet [12], [17] – [18]. Ottoa verenkierrossa DNA eukaryooteissa osoittaa, että biologiaan vastaanottajan solujen /organismien voitaisiin muuttaa riippumatta siitä, onko se integroitu vai ei [19] – [27].

On huomattava, että tällaiset DNA hallinto tekee vaadi erityisiä ajoneuvoja, esimerkiksi liposomien, elektroporaation, ja geeni aseet, voitaisiin helpottaa niiden pääsyä soluihin, jotta se olisi biologisesti aktiivisia. Miten geneettistä materiaalia kiertää ja siirtää osaksi somaattisten solujen korkeampien organismien edelleen kiistanalainen. Vaikka tämä ei ole toisiaan poissulkevia, jotkut kirjoittajat ovat osoittaneet, että tämä tapahtuu kautta oton apoptoottisten elinten [28], kun taas toiset ovat ominaista kiertävä DNA kompleksi DNA /RNA-lipoproteiinin kutsutaan ”virtosome”, joka on spontaanisti vapautuu elävä soluihin [29]. Tässä osoitamme, että kiertävä DNA pystyy ajamaan vaaka- taudin etenemiseen käytettäessä immunokompetenteilla paksusuoli-karsinogeneesissä rottamallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

SW480 (ihmisen paksusuolen syöpä solulinja, joka on pistemutaatio Gly-Val kodonissa 12: n eksonin 1

K-ras

onkogeenin), HeLa (ihmisen kohdunkaulan syövän solulinja positiivinen HPV-18), ja NIH3T3 (hiiren kuolemattomaksi fibroblastit ) hankittiin American Type Culture Collection. Primaariviljelmä esinahan fibroblasteja (BB1) oli peräisin ympärileikkaus esinahka vastasyntyneiden poika alle kirjallista lupaa isältään ja käytetään toisen kanavan.

Supernatantti valmistelu

Kun soluviljelmissä oli yhtymäkohta 80%, supernatantit kerättiin pipetoimalla ja poistettu kaikki jäljellä olevat solut ja solu- roskat sentrifugointivaiheessa 400 x

g

20 min (Biofuge primo R, Heraeus) ja vietiin läpi 0,45 um: n suodattimen ( Sartorius, 16555) poistamaan mahdollisesti saastuttavia soluja. Alikvootit kutakin supernatanttia näytteet ympättiin viljelypulloon ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 120 h puuttumisen varmistaminen eläviä soluja. DNA-analyysi, 50 ml supernatanttia keskittyneet, ensin ultrasuoda- järjestelmä, jossa 40 kDa kalvon huokosten (Amicon, Stirred Ultrafiltration Cell, malli 8010) ja sitten pikatyhjöä laite (Vacufuge Plus, Eppendorf) korkeintaan 10 ml. Väkevöity yläpuolinen neste oli välittömästi kryosäilöttiin -80 ° C: ssa.

entsymaattinen pilkkominen Processed Supernatantit

Viisikymmentä ml käsiteltyjen supernatanttien SW480 (SW) ja NIH3T3 (NH) jaettiin 12,5 ml: n eriä ja inkuboitiin proteinaasi K ja /tai DNAasia I seuraavasti: 1) SW + DNAasi I; 2) SW + proteinaasi K; 3) SW + DNAasi I + proteinaasi K, ja 4) ei entsyymiä. Ohjaus pilkkomiset olivat DMEM + 2% FBS + lohen sperman DNA: ta, ja b) DMEM + 2% FBS + lohen sperman DNA: ta + DNAasi Hajotus suoritettiin 1,5 yksikköä (50 ug) proteinaasi K per mg kokonaisproteiinia sisältämä supernatantti 60 min 37 ° C, minkä jälkeen inaktivoitumisen 80 ° C: ssa 20 min. Sillä DNAasia I, entsyymin konsentraatio oli 12 yksikköä (3,6 Kunitz) per 12 ug DNA: ta sisällön supernatantissa 60 min 37 ° C: ssa ja sitten inaktivointi 65 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Pilkkominen molemmat entsyymit tehtiin saman pitoisuuden ja ajat, mutta pilkkomalla ensin proteinaasi K ja sitten DNAasi jälkeen entsymaattisesti, supernatanttia käytettiin ”passiivinen” transfektiota kuten edellä. Hajoaminen proteiinien ja /tai DNA tarkistettiin geelielektroforeesilla.

Serum kerääminen ja valmistelu

Seerumit verestä erotettua kolmesta joilla on pitkälle edennyt paksusuolen syöpä ja terveillä koehenkilöillä. Veri saatiin ääreislaskimoon kahdessa vacutainer putkilla (Becton Dickinson, 368162), joka sisältää hyytymään aktivointi lisäaine ja esteen geeli eristää seerumista. Verta pidettiin 4 ° C: ssa, ja käsitellään 2 tunnin sisällä, ja sentrifugoitiin 1000

x g

20 min (Biofuge primo R, Heraeus) huoneenlämpötilassa; seerumi kerättiin ja johdettiin 0,45 um: n suodattimen (Sartorius, 16555) solujen poistamiseksi. Verinäytteet saatiin kirjallinen suostumus lähteestä potilaista.

Passive transfektointi hiiren NIH3T3-solut

NIH3T3-solut -as vastaanottajan muutosta assays- ympättiin 24-kuoppalevyille ja altistaa ihmisen seerumi tai supernatantit SW480 (pilkottu tai ei) on 01:01 suhteessa (DMEM, jossa on 2% FBS /seerumi tai supernatantti) 14 päivää, virkistävä median välein 24 tuntia [4]. Sen jälkeen, kun 14 päivää altistuksen (vain seitsemän päivää levyt altistetaan seerumia), solut dispergoitiin ja kasvatettiin standardeissa olosuhteissa. Sitten altistetaan solut analysoitiin läsnäolon mutatoidun ihmisen

K-ras

sekvenssien PCR: llä, RT-PCR, ja sekvensointi. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Aktiivinen transfektio (Lipofectamine) B

Yksi päivä ennen transfektiota, NIH3T3-solut ympättiin tiheydellä 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti (kuusi hyvin levyt) 500 ul: aan elatusainetta ilman antibiootteja (DMEM). Transfektiot tehtiin käyttäen 5 ug DNA: ta (joko genomista DNA: ta tai supernatantin DNA: SW480-soluja plus 0,5 ug plasmidia (pEGFP-CMV). Lipofectamine transfektiot tehtiin seuraavien valmistajien ohjeiden mukaisesti (Invitrogen ™, LTX Plus-reagenssia). Soluja inkuboitiin 37 ° C ° C: ssa 24 tuntia, keskipitkällä oli virkeänä ja G418 valinta aloitettiin saada vakaa transfektanttien.

Transformation analyysit

NIH3T3 että passiivisesti transfektoidut käytettiin suorittamaan muunnos määrityksissä. Kontrollina käytimme NIH3T3-solut altistettiin seerumin terveen luovuttajan ja oman supernatantti. ominaisuudet käytetään indikaattoreina pahanlaatuisen muutoksen oli morfologisia muutoksia (focus muodostuminen), ankkurista riippumaton kasvu (soft agaria), ja tuumorigeenisyystesti [30] .

morfologinen analyysi

Transfektoituja NIH3T3-solut tutkittiin pesäkkeet muodostumista ja laskettiin faasikontrastimikroskopiaan.

solujen kasvua pehmeässä agarissa

Foci eristettiin muovista soluviljelylevyille ja laajennettiin pehmytagar analyysiä. Jälkeen trypsinitation solut suspendoitiin DMEM-alustassa, joka sisälsi 0,3% jalo agar ja 15% FBS: ää. Kerros tätä suspensiota levitettiin päälle kerros alustaa, joka sisälsi 0,7% agaria ilman seerumia. Solut maljattiin tiheydellä 5 x 10

5 solua per 10-cm malja. Pesäkkeet pisteytettiin 14 päivän jälkeen kulttuuri (siirtomaa määriteltiin jos sisälsivät vähintään 50 solua).

In

in vivo

Kokeet

tumorigeneesin määritykset suoritettiin 6 -week vanhoja joilta puuttuu kateenkorva BALB /c (nu /nu) naarashiirille (Harlan Laboratories). Kaikissa kokeissa, kuuden hiiren ryhmää injektoitiin ihonalaisesti 2000000 solut suspendoitiin 100 ul: ssa FBS-DMEM: ää. Kasvaimen kasvua seurattiin ja kirjattiin viikoittain. Kasvaimen koko mitattiin elektronisella jarrusatula ja koko volyymin arvioidaan käyttäen kaavojen a × b

2 × (π /6) = V (mm

3) (a = suuri halkaisija; b = pienempi halkaisija ja V = tilavuus). Kokeissa arvioida tuumorigeneesiin kykyä supernatanttia Hela-solua käsittelemättömien eläinten, 6 viikon ikäisiä kateenkorvattomia BALB /c (nu /nu) naarashiiriä käytettiin myös. Eläimet injektoitiin päivittäin vatsaonteloon 500 gl supernatanttia HeLa-solujen 30 päivää. Päivänä 31 eläimet tapettiin. Kateenkorvattomiin Hsd: Rh-

Foxn1

RNU

naarasrotilla ja immunokompetenteilla Hsd: Wistar naarasrotille sekä (Harlan Laboratories) injektoitiin apoptoottisten kappaleiden HeLa-soluista, jotka on saatu sen jälkeen, kun korkean altistumista 24 tuntia sisplatiini 75 uM. Omakotitalo solut kerättiin ja sentrifugoitiin vaihe 400 ×

g

10 minuuttia (Biofuge primo R, Heraeus) PBS: ssä kolme kertaa poistaa mahdolliset jäljellä sisplatiinia. Injektiot apoptoottisten kappaleiden tehtiin joka toinen päivä laskimonsisäisenä injektiona hännän kokonaistilavuudessa 100 ui normaalia suolaliuosta. Hoito kesti 60 päivää. Päivänä 61 rotat tapettiin ja ruumiinavaus suoritetaan makroskooppisesti arvioida kasvaimen muodostumisen. Tärkeimpien elinten (maksa, perna, munuaiset, keuhkot ja kohdun) käsiteltiin H ii) ihon alle 1 x 10

6 SW480-solut (laimennettuna 100 ul normaalia suolaliuosta) kylkeen päivinä 28 ja 49 DMH hoito; iii) paksusuolessa karsinogeeni DMH vatsaonteloon reittiä 20 viikon ajan kuten on raportoitu [31]; iv) kuuri DMH plus SW480-solut; ja v) ryhmä iv plus DNAse I /proteaasi-hoitoa, joka koostui on DNAasi I annoksella 2,3 mg /kg injektiona lihakseen ja sekoitus proteaasien (trypsiini, kymotrypsiini, ja papaiini) injektoimalla vatsaonteloon annoksina 10 mg /kg, 10 mg /kg ja 25 mg /kg vastaavasti, kuten on raportoitu [32]. Sekä DNAse I ja proteaasit sekoitus laimennettiin 100 ul: aan fysiologista suolaliuosta. Injektiot annettiin päivittäin paitsi viikonloppuisin viikko 4 12. Ryhmä vi saanut DMH + DNAse I /proteaaseja. Arvioinnin jälkeen mikro PET-CT (kuten alla on kuvattu) eläimet uhrattiin ja ruumiinavaus 6 kk kuluttua viimeistely 20 viikkoa karsinogeeni (DMH).

arvioimiseksi kohtalo ihmisen SW480-solujen ruiskutetaan immunokompetenteilla eläimiin Hsd: Wistar 6 viikkoa vanhoja naaraspuolisia rottia (Harlan Laboratories) injektoitiin subkutaanisti 10 miljoonan SW480 solujen kylki ja uhrattiin päivinä 1, 2, 3, 7, ja 14 injektion jälkeen poistaa pistoskohdan ja käsitellään tavanomaisesta H E histologista analyysiä. Eettinen hyväksynnät saatiin Institutional tutkimuseettiseltä ja eläinten hoito komitea.

Micro PET-CT

kasvainten muodostumista eläimissä seurattiin molekyylikuvantaminen tekniikoita mikro PET-CT (Albira ARS, Oncovision) ja

18F-FDG. Kasvaimen seuranta toteutettiin viikoilla 15 ja 24 jälkeen hoidon aloittamisesta (DMH). Määrällisesti kasvain aktiivisuuden standardin oton arvo (SUV) laskettiin käyttäen Albira järjestelmän ohjelmistot (Carestream Molecular Imaging, CT, USA). SUV on kvantitatiivinen työkalu PET-TT tutkimukset joka mahdollistaa määrittämisen

18F-FDG keskittyminen tietylle alueelle kiinnostuksen (eli kasvain aktiivisuus). Kasvaimen läsnäolo määriteltiin, kun SUV (kasvain /maksa) suhde oli ≥1.5.

Kudosten valmistelu ja Mikrodissektiomenetelmiä

formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut paksusuolen kasvaimet (yksi kustakin ryhmästä) alkaen kunkin ryhmän DMH käsiteltyjen rottien leikattiin 5 um: n paksuisia leikkeitä on mikrotomin kertakäyttöinen terä. Sillä mikropreparoinnilla osat poistettiin parafiini kahdessa muutoksia ksyleeniä 10 min, niihin lisätään 100% etanolia, 90% etanolia ja 70% etanolia ja 5 min kummassakin, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H

E6

(5 ’gggggatccatggcgcgctttgaagatccaaca-3′, ja 3’-ggggaattcttatacttgtgtttctctgcgtcg-5 ’), 450 bp: n amplikonin;

E7

(5′-cccgacgagccgaaccacaac-3 ’, ja 3′-gggatgcacaccacggacacac-5’), 300 bp amplikonin; ihmisen

DHFR

(5′-agaaccaccacgaggagc-3 ’, ja 3′-acagaactgcctccgactatc-5’), 120 bp amplikonin; ihmisen

ACTIN

(5′-ggagtcctgtggcatccacg-3 ’, ja 3′-ctagaagcatttgcggtgga-5’), 320 bp: n amplikonin. Ihmisen

RAB30

(5′-gtccattacccagagttactaccg-3 ’, ja 3′-gaccttgttgctggcatattgttc-5’), 130 bp amplikonin;

Alu Yd6

(5′-gagatcgagaccacggtgaaa-3 ’, ja 3′-ttgctctgaggcagagttt-5’), 200 bp: n amplikonin [33].

Ensimmäinen denaturointi 94 ° C: ssa 5 min seurasi 40 sykliä monistusta ja lopullinen laajennus vaihe 5 min 72 ° C: ssa, (

E6

,

E7

ja

Alu Yd6

oli lisäaikaa 30 sekuntia ). Syklit mukana denaturointi 94 ° C 30 sekuntia, 30 sekuntia hehkutus (60 ° C

K-ras

ja

RAB30

, 59 ° C: ssa

ACTIN

ja

DHFR

, 57 ° C: ssa

E6

ja

E7

ja 61 ° C: ssa

Alu Yd6

), PCR-reaktiot suoritettiin 2400 Thermalcycler (Applied Biosystems). Monistustuotteet varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Rotan erityisiä

LINE 1

sekvensseillä monistus suoritettiin 20 ul: reaktioihin, jotka sisälsivät 100 ng templaatti-DNA: ta, 10 mmol /L Tris-HCI (pH 8,3), 40 mmol /L KCI, 1 mmol /l MgCI

2, 200 umol /l kutakin dNTP: tä, 0,25 U Taq-polymeraasia (Applied Biosystems) ja 1 umol /l kutakin aluketta, joka on spesifinen rotan

LINE 1

(5′-aaatcagggactagacaaggctgc-3 ’, ja 3’-cccagccactttgctgaagttgt-5 ’) [34]. Alkudenaturaatio 94 ° C: ssa 5 minuutin ajan seurasi 40 sykliä monistusta ja lopullinen laajennus vaiheessa (5 minuuttia 72 ° C: ssa). Monistussykliä koostui siitä, denaturointi 94 ° C 30 sekuntia, pariutuminen 59 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. PCR-reaktio suoritettiin 2400 Thermalcycler (Applied Biosystems). Monistustuotteet varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla.

RT-PCR

ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi 1-5 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin on 20 ul: n reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 2 ui 10 x PCR-puskuria, 50 ng satunnaisia ​​heksameerejä, 50 mM MgCl

2, 200 ng nM dNTP, 0,1 M DTT: tä, ja 200 U käänteistranskriptaasia, (GeneAmp, Applied Biosystems) 50 min 42 ° C: ssa. PCR-monistus cDNA suoritettiin 20 ul: n reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 100 ng cDNA: ta, 10 mmol /L Tris-HCI (pH 8,3), 40 mmol /L KCI, 1 mmol /l MgCI

2 (

K -ras

v12 ja

RAB30

), ja 200 umol /l kutakin dNTP: tä, 0,25 U Taq-polymeraasia (Applied Biosystems), ja 1 umol /l kutakin aluketta, joka on spesifinen ihmisen

K-ras

v12 (5′-actgaatataaacttgtggtagttggacct-3 ’, ja 3′-caaatcacatttatttcctaccaggacct-5’), ja

RAB30

(5’gtccattacccagagttactaccg-3 ’, ja 3 ”-gaccttgttgctggcatattgttc-5 ’). Alkudenaturaatio 94 ° C: ssa 5 minuutin ajan seurasi 40 sykliä monistusta ja lopullinen laajennus vaiheessa (5 min 72 ° C: ssa). Syklit mukana denaturointi 94 ° C 30 sekuntia, pariutuminen 58 ° C: ssa (

K-ras

v12), ja 56 ° C: ssa (

RAB30

) 30 sekunnin ajan ja pidennys 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Koko amplikonien ja sekvenssi käytetyt alukkeet PCR

K-ras

v12 on 357 bp, ja

RAB30

, 130 bp. PCR-reaktio suoritettiin 2400 Thermalcycler (Applied Biosystems). Monistustuotteet tehtiin elektroforeesi 3% agaroosigeelissä.

DNA Sequencing

alkuperän varmistamiseksi monistetun sekvenssin (ihmisen tai hiiren), PCR-tuotteet sekvensoitiin. PCR amplikonit puhdistettiin käyttämällä isopropanolisaostus- ja sitten sekvensoitiin sekä eteen- että taaksepäin vähintään kaksi toisistaan ​​riippumatonta vahvistusta tuotteita. Puhdistettu DNA laimennettiin ja syklin sekvensoitiin käyttämällä ABI BigDye Terminator Kit v3.1 (ABI, Foster City, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sekvenssointireaktiot elektroforeesilla ABI3100 geneettinen analysaattori. Elektroferogrammit analysoitiin sekä sense- että antisense suuntiin. Saadut sekvenssit vertailtiin

kras

sekvenssi (GenBank DQ893829) ja

RAB30

sekvenssin (GenBank NM_014488).

Southern blot

Merkityt SW480 genomista DNA: ta hybridisoitiin seuraavat solulinjat: SW480 (positiivinen kontrolli); NIH3T3 (negatiivinen kontrolli), ja allas

K-ras

positiivinen solu peräisin olevat kloonit NIH3T3 alttiiksi ihmisen seerumia potilaalta, jolla on paksusuolen syöpä. Kymmenen ug suuren molekyylipainon genomista DNA: ta kunkin DNA-näytettä digestoitiin

Hind III

(New England Biolabs). DNA-fragmentit erotettiin elektroforeesilla 0,8%: isessa agaroosigeelissä, denaturoitua, ja siirrettiin nylon-kalvolle (Amersham). Hybridisaatio suoritettiin liuoksessa, jossa oli BM kemiluminesens- Blotting Kit (Roche Applied Science), joka sisältää DNA-koetinta (100 ng /ml) 20 tunnin ajan 42 ° C: ssa. Blotit pestiin vaativissa-ankarissa olosuhteissa 0,1 x SSC, 0,1% SDS 90 minuutin ajan 65 ° C: ssa, inkuboitiin streptavidiinilla 30 min huoneenlämmössä, lisätty Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Sciences) ja valotettiin 60 sek.

SNP Array Hybridisaatio ja DNA Copy Number Analysis

DNA vanhempien SW480 soluista, DNA eristettiin supernatantista SW480-solujen, ja genominen DNA SB1 soluista (NIH3T3 passiivisesti muunnettava SW480 supernatantti) hybridisoitiin päälle 500K Affymetrix genotyypityksen array asetettu DNA kopiomäärä analyysin jälkeen valmistajan protokollan. Analyysi suoritettiin käyttäen DNA kopiomäärä putki Partek Genomics Suite -ohjelmistoa. Kaikki näytteet verrataan yhteinen normaalin ihmisen DNA kopiomäärä vertailuperusviivan.

FISH

Interphase ytimet ja metafaasikromosomeissa transfektoitujen NIH3T3-solut (SB1) analysoitiin standardin sytogeneettisen valmisteissa, kuten aiemmin kuvattu [35], jossa on konsensussekvenssi ihmisen välissä toistoja. Ihmisen Cot DNA-koetin (joka on istukan DNA, joka on pääasiassa 50-300 bp kooltaan ja rikastettiin toistuvia DNA-sekvenssejä, kuten

Alu

ja

Kpnl

perheenjäsenet) leimattiin nick translation digoksigeniini-11-dUTP (Roche) käyttäen DIG-Nick Translation Mix (Roche) ja detektoitiin käyttäen fluorokromilla konjugoitua antidigoxigenin vasta-aine. Sata tumat analysoitiin mikroskooppisesti.

FISH-analyysi histologisia osia paksusuolen kasvainten rottien tehtiin seuraavasti: Osat poistettiin parafiini ksyleenillä ja rehydratoitiin arvostellaan etanolia sarjassa. Levyjä, jotka on esikäsitelty 0,2 M HCl: lla, 8% natrium- tiosyanaatti, ja 0,5% pepsiiniä. Jälkeenpäin red-fluoreseiinileimattua

ALU

ihmisen (FISHBright, Kreatech Biotechnology) ja vihreä-fluoreskeiinileimattu

LINE 1

rotta (FISHBright, Kreatech Biotechnology) koettimet lisättiin samanaikaisesti; levyt peitetty peitelaseja ja sinetöity kumi sementtiä. Leikkeitä denaturoitiin ja hybridisoitiin Hybridizer (Life Technologies) 37 ° C: ssa yön yli. Kumi sementti ja peitelasit poistettiin ja leikkeitä pestiin tiukasti käyttäen SSC: 2 x SSC: ssä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, 0,4 x SSC /0,3% NP40: tä 5 minuutin ajan 75 ° C: ssa, ja 2 x SSC /0,1% NP40 4 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tumat vastavärjättiin käyttämällä 4 ’, 6’-diamino-2-fenyyli (DAPI), jonka pitoisuus on 0,1-ug /ml mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää (Vector Laboratories). Analyysit suoritettiin käyttäen Zeiss Axioplan fluoresenssimikroskooppia (Zeiss) rajapinta Cytovision järjestelmään (Applied Imaging).

Tulokset

Solunulkoisilla DNA-muunnoksia ikuistettu Hiiren liittyvät solut DNA Transfer

Cell-viljelmäsupernatantteja ihmisen pahanlaatuisten solulinjojen SW480 ja HeLa (kasvatettiin DMEM: ssä, jossa on 2% FBS: ää), sekä seerumin kolmen pitkälle käsittelemättömän paksusuolen syövän potilaiden ja kaksi tervettä verrokkia selvitettiin elinkykyisten solujen ja roskat sentrifugoimalla ja suodatus (0,45 um suodatin). DNA uutetaan näistä lähteistä, (SW480 ja HeLa supernatantit) oli PCR-positiivisia mutantti ihmisen

K-ras

kodonissa 12, ja

E6

ja

E7

onkogeenien vastaavasti. Kolmen seeruminäytteistä syövän paksusuolen potilaiden kanna

K-ras

kodonissa 12, mikä myös todistettiin DNA: ta niiden parafinoidut ensisijainen kasvaimia. Nämä materiaali (supernatantit ja seerumin paksusuolen syöpäpotilaiden ja terveiden verrokkien oli PCR-positiivinen konstitutiivista ihmisen

DHFR

ja

ACTIN

geenejä (ei kuvassa). Seerumin DNA pitoisuudet seerumissa olivat 2,04, 0,66 ja 0,93 ug /ml potilaille ja 0,28 ja 0,178 ug /ml terveille henkilöille. Supernatantit viisi itsenäistä soluviljelmissä SW480 jotka otettiin 80% cell yhtymäkohta, oli keskimääräinen pitoisuus 0,1875 ± 0,007 ug /ml. ”pasive” transfektioihin supernatanttien kanssa tai seerumi tehtiin seuraavasti: 0,5 ml (seerumi tai supernatantti, joka sisälsi 1,815 ug tai 0,09 ug vastaavasti) lisättiin 0,5 ml: aan alustaa (1:01 suhde) viljeltiin vastaanottajan hiiren kuolematon solujen NIH3T3 (jotka osoittautunut hiiren sytogeneettisen analyysi ja puuttuminen toistuvia ihmisen

Alu Yd6

PCR, jota ei ole esitetty), 24-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä. Medium plus seerumia tai supernatanttia vaihdettiin päivittäin 7 tai 14 päivää (lyhyempi aika seerumin takia rajallinen määrä), siten, solut altistettiin päivittäin 1,815 ug DNA: ta seerumin sisältämän tai 0,09 ug DNA: ta sisältämän supernatantin DNA. Päivänä 8 tai 15 määrä muutosta pesäkkeitä vastaanottajan NIH3T3-solut muovi ja pesäkkeiden muodostumista agar oli ylivoimaisesti parempia sekä seerumin ja supernatantti (verrattuna kontrolliin (NIH3T3-solut altistettiin omaa supernatantti ja normaali seerumi). Niistä perustettu muuttaneet klooneja, 11 27 alttiina SW480 ja 5/9 (alttiiksi seerumista potilaan syöpä) oli

K-ras

mutaation todistettu PCR hyödyntäen spesifisiä alukkeita monistamiseen ihmisen

K-ras

. Samoin 8/24 kloonit altistettiin HeLa oli PCR-positiivisia

E6

ja

E7

HPV-onkogeenien. tuumorigeneesiä määritykset

nu /nu

nainen hiiret osoittivat suurempia ja nopeampia kasvava kasvaimia poolista klooneja ”passiivisesti” transfektoitu supernatantin SW480 (SB1 pool) ja paksusuolen syövän seerumi (CCP) verrattuna vanhempien SW480-solujen (+ Ctr), hiiren NIH3T3 alttiina normaaliin seerumin (NS), sekä vanhempien NIH3T3 (-Ctr) (Fig. 1 A, B). Nämä tulokset vahvistavat aiemmat huomautukset transformointikyvystä kyky supernatantissa SW480-solujen samoin kuin potilaiden plasmassa syöpä [4], [5]. Southern hybridisaatio näistä NIH3T3-transformoidut altaat klooneja (SB1 pool) vastaan ​​genomista DNA SW480 soluista osoitti selkeitä hybridisaatiosignaaleja, mikä vahvistaa horisontaalinen siirto ihmisen DNA vastaanottajalle hiiren soluja (Fig. 1 C). Edelleen, FISH analyysi passiivisesti transformoitujen hiiren soluja (SB1) lähettämän myönteisiä signaaleja ihmisen toistuvat sekvenssit (Fig. 1 D), jossa vahvistetaan, että solutransformaatiota liittyi DNA: n siirto.

Kasvaimen kasvu nude-hiiriä ” passiivisesti ”transformoidut solut. Nopeampi ja suurempi kasvaimen kasvua havaittiin SB1 allas ja keskusvastapuolten allas (NIH3T3 alttiina supernatantista SW480-solujen ja seerumin potilaan paksusuolen syöpä, vastaavasti). SW480-soluja käytettiin positiivisena kontrollina, kun taas NIH3T3 ja NIH3T3 alttiina normaalia seerumia osoitti olennaisesti lainkaan kasvua. B. Edustavia kuvia hiirissä kustakin ryhmästä. C. Southern blot -hybridisaatio SB1 ja keskusvastapuolten altaat solujen vastaan ​​genomi-DNA SW480-solujen. Lane SW480-solut ovat positiivisen kontrollin ja NIH3T3, negatiivinen yksi. Selvä hybridisaatiosignaaliin on havaittu vain SB1 ja keskusvastapuolten kaistaa. D. FISH-analyysi toistuvien ihmisen sekvensseillä. Positiivinen kontrolli on ihmisen lymfosyyttejä ja hiiren solujen negatiivisen kontrollin. SB1 solut osoittaa vahvaa signaalia. E. Kasvaimen kasvu on samanlainen NIH3T3 aktiivisesti transfektoitu genomi-DNA SW480-soluja (Neo-Geno) ja aktiivisesti transfektoitiin DNA: ta supernatantista SW480-soluja verrattuna ei kasvanut NIH3T3 (-Crt) ja transfektoitiin tyhjällä-vektorilla . Positiivinen kontrolli, SW480-soluissa.

Sen osoittamiseksi, että transformoivan kyvyn supernatantin asuu DNA, 5 ug puhdistettua DNA: ta SW480 supernatantti ko-transfektoitiin eukaryoottinen pNeo vektori käyttäen lipofektamiinia (aktiivinen transfektio). Useita genetecin vastustuskykyisten kloonien perustettiin. Pooli näistä klooneista saattoi muodostaa kasvaimia

nu /nu

naarashiirillä (Fig. 1 E). Päinvastoin, ”passiivinen” transfektio käyttämällä 5 ug puhdistettua DNA: ta (uutettu soluviljelmäsupernatantille) ja lisättiin päivittäin 14 päivää NIH3T3-soluihin) ei voinut muuttaa NIH3T3-solut ja myös onnistuttu siirtämään DNA-sekvenssit vastaanottajan soluja (arvioituna PCR mutantti ihmisen

K-ras

ja

Alu Yd6

, jota ei ole esitetty).

DNA-köyhdytettyä Supernatantti ei muunnos ikuistettu hiiren soluja

on osoitettu, että solutonta DNA kiertää kompleksina DNA /RNA-lipoproteiini (virtosome), joka on spontaanisti vapautuu elävien solujen [29], ja tämä kompleksi voisi suojata DNA: n hajoamisen kierrättämällä nukleaaseille. Tämän tutkimiseksi, tuore supernatantti SW480-solujen oli alttiina DNAse I, ja proteinaasi K, ja molempien kanssa ja sitten DNA uutettiin ja elektroforeesi. Tulokset osoittivat, että DNAse en onnistunut sulattamaan DNA täysin. Samoin, altistuminen supernatanttia proteinaasi K vain lievästi digestoitu DNA. Kuva. Kuva. Kuva.