Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on erittäin vastustuskykyinen nykyisille solunsalpaajahoitojen, osittain muutosten vuoksi vuonna p53 tuumorisuppressorin kautta. p53 homologia p63 on transkriptiotekijä kehityksen kannalta olennaisen tärkeää ja erilaistumista epiteelipinnoilla. Kuitenkin sen tehtävä syöpä on kiistanalainen ja sen rooli PDAC ei tiedetä. Huomasimme, että ΔNp63α oli pääasiassa ilmaistu p63 muunnos haimasyövän solulinjoissa. ΔNp63α proteiini ja mRNA-tasot olivat korkeita T3M4, BxPC3 ja COLO-357 haimasyöpäsoluissa ja alhainen ASPC-1 ja PANC-1-soluissa. N yli-ilmentyminen ΔNp63α in PANC-1-soluissa ja shRNA välittämä knockdovvn in T3M4 soluissa osoitti että ΔNp63α edistänyt kiinnittymisestä riippuvaisen ja riippumattaman kasvun, motiliteetin ja invaasio, ja parannettu kestävyys sisplatiinin indusoiman apoptoosin. Kasvutekijän reseptorin (EGFR) signalointi väyliä edistää biologisten aggressiivisuutta PDAC, ja huomasimme, että motogenic vaikutuksia ΔNp63α täydennettiin läsnäollessa EGF. Kohdunulkoinen ilmentyminen ΔNp63α johti ylösajon EGFR ja β1-integriini PANC-1-soluissa. Toisaalta ΔNp63α knockdown oli päinvastainen vaikutus T3M4 soluissa. ΔNp63α voimistua EGF-välitteisen aktivaation ERK, Akt ja JNK signalointia. Chromatin immunosaostus ja toimiva toimittaja analyysit osoittivat, että ΔNp63α aktivoituu EGFR transkriptio. 14-3-3σ transkription positiivisesti myös säädellä ΔNp63α ja olemme aiemmin osoittaneet, että 14-3-3σ edistää chemoresistance haimasyövän solulinjoissa. Toisaalta shRNA välittämää knockdovvn 14-3-3σ johti kumotaan ΔNp63α vaikutukset soluproliferaatioon ja invaasiota. Siten p53 homologi ΔNp63α parantaa kasvaimia synnyttävän potentiaalin haimasyöpäsoluissa kautta trans-aktivoitumisen EGFR ja 14-3-3σ.

Citation: Danilov AV, Neupane D, Nagarajan AS, Feofanova EV, Humphries LA, DiRenzo J, et al. (2011)

DeltaNp63alpha-

Mediated induktio epidermaalisen kasvutekijän reseptori Edistää haimasyövän Cell Growth ja Chemoresistance. PLoS ONE 6 (10): e26815. doi: 10,1371 /journal.pone.0026815

Editor: Toru Ouchi, University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 03 lokakuu 2011; Julkaistu: 28 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Danilov ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Sisätautien Junior tiedekunnan Award (Dr. Danilov), joka on Norris Cotton Cancer Center Prouty Pilottihanke Award (Dr. Danilov), Hitchcock Foundation-palkinto (Dr. Danilov), ja National Cancer Institute Grant CA- R37-075059 (Dr. Korc). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tutkimukset ihmisen sairauden osoittavat, että kaikkein perustettu kasvaimia vaaditaan useampi kuin yksi geenivirhe. Haiman adenokarsinooma (PDAC) tulokset peräkkäisten geenimutaatioita [1]. Aktivoivat mutaatiot K-Ras-onkogeenin ja inaktivaation tuumorisuppressorien CDKN2A, p53 ja Smad4 ovat sekaantuneet PDAC kehitykseen ja etenemiseen [2]. Geneettisesti hiiri malleja ovat tukeneet ”double-hitti” hypoteesi jossa käyttöönotto joko mutantin p53-alleelin tai kaksialleelisten poistaminen INK4a /Arf hiirissä johtaa etenemistä haiman intraepiteliaalisten uudisvaurioiden paikallisten invaasiota ja etäpesäkkeiden [3], [4]. p53 mutaatioita esiintyy 60-70% ja PDAC. Sitä vastoin p63, ikivanhan jäsen p53 perhe, on harvoin mutatoitunut syövässä.

Kuusi muunnelmia p63 syntyy kautta transkriptio kaksi erillistä edistäjien ja vaihtoehtoisen silmukoinnin. Isoformien transkriboitu P1 sisältävät täyspitkän trans aktivaatiodomeenina (TAp63α, β ja γ). Transkriptio P2 synnyttää Aminopäästään katkaistu variantteja (ΔNp63α, β ja γ), jonka tarkka merkitys syövän ei ole selvä. ΔNp63 variantti on yli-ilmentynyt useissa eri ihmisen syövissä, mukaan lukien kasvaimet okasolusyöpä alkuperää (pään ja kaulan, keuhko-), rinta- ja virtsarakon [5]. Pään ja kaulan okasolusyöpä ja ”triple-negatiivinen” rintasyöpä soluja, ΔNp63 estää p73-riippuvaista apoptoosia ja siten edistää kasvaimen eloonjääminen [6], [7]. Sen sijaan, downregulation ΔNp63α in urothelial sinoomasolulinjoja edistää syövän invasiivisuus [8], mikä viittaa siihen, että Dn variantti voi toimia solun tyyppi-spesifisellä tavalla.

rooli p63 in PDAC ymmärretään huonosti. Tässä osoitamme, että ΔNp63α variantti ilmentyy muuttuja tasoilla PDAC solulinjoissa, ja osoitettava, että ΔNp63α edistää haiman syöpäsolujen kasvua, muuttoliike, invaasio ja chemoresistance. Via suora transkription aktivaatio, ΔNp63α johtaa säätely ylöspäin kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja 14-3-3σ, herkistävä syöpäsolujen EGF ja parantaa niiden onkogeeninen.

Methods

solulinjat

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa ASPC-1, BxPC3 ja PANC-1; HEK293 ihmisen alkion munuaissoluissa ja H1299 ihmisen keuhkokarsinooma-solut hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). COLO-357 ja T3M4 ihmisen haimasyövän solulinjoissa oli lahja Dr.R.Metzgar (Duke University, Durham, NC). Solulinjoja kasvatettiin RPMI tai DMEM (HEK293), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (täydellinen alusta).

Plasmidi rakentaa

ihmisen ja hiiren ΔNp63α ekspressioplasmidit ja (p53RE)

5-tk-lusiferaasiplasmidin raportoitu aikaisemmin [9]. TAp63α ekspressioplasmidin ostettiin Open Biosystems (Huntsville, AL). PBV-14-3-3σ promoottorin BDS 2 3 x (p53 sitoutumiskohta) -luc plasmidi saatiin Addgene (Cambridge, MA). pGL3-EGFR promoottori (p53 sitoutumiskohtia) -luc plasmidi oli lahja tri L. Pirisi [10]. Sekvenssin modifikaatioita koodaavan DNA-sitovan domeenin ihmisen ΔNp63α ekspressioplasmidin ja sisällä EGFR-promoottori p53 sitoutumiskohdan 1 otettiin käyttäen Quick-Change Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA).

Immunoblottaus

Solut lyysattiin RIPA-puskuriin (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM NaF, 1 mM natriumfosfaatti, 1 mM NaVO3, 1 nM EDTA, 1 nM EGTA, täydennetty proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Indianapolis, IN) ja 1 mM PMSF). Proteiinit analysoitiin immunoblottauksella, kuten aikaisemmin on kuvattu [11]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: p63 (4A4, Millipore, Billerica, MA, 1:500); TAp63γ (Li et al., 2006; 1:1,000), 14-3-3σ (Abcam, Cambridge, MA, 1:500), ERK-2 (C-14; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; 1: 10000), p53 (DO-1; Santa Cruz Biotechnology, 0,4 ug /ml), EGFR (Calbiochem, 1:2,000), lohkaistaan ​​poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), pilkottiin kaspaasi-3, ERK-1/2 , fosfo-ERK1 /2 [T202 /Y204], Akt, fosfo-Akt [S473] (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, 1:1,000), aktiivisen JNK (Promega, Madison, WI), piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun anti- hiiren ja anti-kani-vasta-aineiden (BioRad; 1:5,000).

RT-PCR (RT-PCR) B

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA ). cDNA syntetisoitiin 1 ug RNA: satunnainen hexamer pohjustus käyttäen Superscript III RT Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Semikvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttämällä forward- ja reverse-alukkeita, jotka ovat spesifisiä p63-isoformien, kuten aiemmin on julkaistu [12]. Seuraavat PCR-syklien olosuhteita käytettiin: 94 ° C 3 min, 35 sykliä 94 ° C: ssa 40 sekuntia, 55 ° C: ssa 40 sekunnin ajan, ja 72 ° C 1,5 min; ja 72 ° C: ssa 4 minuutin ajan.

analysointia ΔNp63 ja TAp63 transkriptioekspressiokuvio kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (Q-PCR) suoritettiin 7300 Sequence Detector käyttämällä Universal PCR Master Mix mukaan valmistajan ohjeiden (Applied Biosystems, Foster City, CA), templaatti-cDNA ja geenispesifisiä koettimia (Hs00978339_m1 [ΔNp63]; Hs00978349_m1 [TAp63]; Applied Biosystems). Kaikki näytteet analysoitiin kahtena kappaleena.

Transient transfektiot adenovirusinfektio ja Lusiferaasimäärityksiä

PANC-1 ja T3M4 soluja transfektoitiin ohimenevästi ExGen 500

in vitro

Transfection Reagent ( Fermentasilta Life Sciences, Glen Burnie, MD) käyttäen yhtä suuria määriä kokeellisen tai kontrolli plasmidin. Soluja inkuboitiin 48 tunnin ajan ja proteiinin ekspressio varmistettiin immunoblottauksella. Ohjaus- ja ΔNp63α-ilmennä adenoviruksen käytettiin, kuten on kuvattu [13]. ASPC-1 ja PANC-1-solut infektoitiin adenoviruksella MOI -5 täydellisessä väliaineessa 24 tunnin ajan.

Lusiferaasimäärityksiä PANC-1-solut kotransfektoitiin kokeellista plasmidi tai valvonnan ja lusiferaasin reportterikonstruktio (PBV-14-3-3σ promoottori BDS 2 3 × (p53 sitoutumiskohta) -luc tai pGL3-EGFR promoottori-luc) yhdessä pCMVβ vektorin (Clontech Laboratories, Mountain View, CA). Määrä DNA kohti transfektio pidettiin vakiona käyttämällä tyhjää pcDNA3.1 vektori. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja lusiferaasin analyysit suoritettiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Suhteellinen valoyksiköitä määritettiin käyttäen luminometriä (LMaxII

384, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) tulikärpäsen lusiferaasi. β-galaktosidaasi-aktiivisuus määritettiin käyttämällä kolorimetristä menetelmää normalisoida transfektiotehokkuuden [14].

Lentivirusvektorikonstruktit shRNA välittämä geenin hiljentäminen

Lentivirus sisältävät shRNA kohdistaminen α-spesifinen, TAp63 erityisiä, kaikki p63-isoformit ja sh ohjaus kuvattiin aiemmin [15]. Lentivirusta-pohjainen 14-3-3σ-kohdistuksen sekä shRNA myös kuvannut meitä aiemmin [11]. Lentivirus- partikkeleita tuotettiin neljä plasmiditransfektiolla [11]. Pudotus p63-isoformien ja 14-3-3σ in T3M4 ja PANC-1-soluissa vahvistettiin Western-blottauksella ja Q-PCR: llä.

3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5 -diphenyltetrazolium bromidia (MTT)

Solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille (3000 solua per kuoppa, 6 syvennystä per näyte) ja viljeltiin puuttuessa tai läsnä ollessa 10 ug /ml sisplatiinia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 48 tunnin ajan. MTT (Sigma-Aldrich) lisättiin lopulliseen konsentraatioon 0,55 ng /ml. Sen jälkeen vielä 4 tunnin inkubaation, absorbanssi 570 nm: ssä määritettiin käyttäen Emax tarkkuus mikrolevynlukijaa (Molecular Devices). Olemme aiemmin havaittu, että haimasyövän solulinjoissa MTT-määritystä korreloi solujen kasvun määritetty kaksinkertaistumista ja [

3H] -tymidiinin määrityksiä [16].

Soft agar määrityksissä

Pehmeä agar määritykset perustettiin kaksitoista-kuoppalevyillä, kukin kuoppa sisältää pohjakerroksen 0,5% Difco agar Noble: a (BD Biosciences), keskikerroksen 0,3% agaria, mukaan lukien 1500-soluja, ja pintakerros 0,3% agaria. Levyjä inkuboitiin 14 päivää. Seuraavaksi 150 ui 5 mg /ml MTT-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 4 tunnin ajan maljat valokuvattiin ja pesäkkeet laskettiin.

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset

soluliikkuvuus arvioitiin

in vitro

haavan paranemista ja TranswellTM muuttoliike määrityksiä. Haavan paranemista määrityksiä, solut kasvatettiin konfluenssiin 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille, ja seerumia 12 tunnin ajan. Saatu yksisolukerros oli naarmuuntunut kanssa 10 ul: pipetin kärjen tuottaa kaksi rinnakkaista haavoja ja niitä inkuboitiin 18 tunnin ajan seerumittomassa väliaineessa (SF; 0,1% naudan seerumin albumiinia) puuttuessa tai läsnä ollessa 1 nM EGF: ää (Millipore). Otettiin valokuvia kunkin kuopan neljässä merkittyihin kohtiin alle 40-kertainen suurennus nollan ja 18 tunnin kuluttua haavoittaen. Haava-alue sovitetun kuvia mitattiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa (National Institutes of Health). Sillä Transwell muuttoliike määrityksiä, solun suspendoitiin 100 ul: aan SF keskipitkän ja sijoitettiin ylempään osastoon Transwell kammiot (8 um huokoskoko, Corning Incorporated, Corning, NY). Sillä invaasio määrityksiä, solut suspendoitiin 500 ui SF keskipitkän ja asetettiin ylempään osastoon Matrigel päällystetyn TranswellTM kammiota (8 um huokoskoko, BioCoat matrigeelin Invasion Chambers, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Molemmissa Transwell määrityksissä, alempi osasto täytettiin 750 ul: SF väliaineen puuttuessa tai läsnä on 1 nM EGF. Sen jälkeen 18-20 h, kalvot kiinnitettiin metanolissa, värjättiin toluidiinisinisellä (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) ja laskettiin valomikroskoopilla.

Formaldehydi silloittumisen, kromatiinin immunosaostus (chip) ja PCR-amplifikaatio

DNA-histoni silloittumisen, 2 x 10

6-soluja inkuboitiin 1% formaldehydiä täydellisessä väliaineessa 10 minuutin ajan. Solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja hajotettiin SDS Lysis Buffer (Millipore) täydellisenä proteaasiestäjäseostabletit (Roche). Proteiini lysaatit sonikoitiin, jolloin saatiin kromatiinin fragmentteja ~500 bp arvioituna agaroosigeelielektroforeesilla. Sen jälkeen kun esi-selvitys-, proteiini lysaatit inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli 2 ug p63α vasta-aineita (H-129, Santa Cruz) tai kaniinin IgG isotyyppispesifisessä kontrollivasta-aineita (Santa Cruz). Immunokompleksit pestiin, ja DNA puhdistettiin käyttämällä ChIP Assay Kit (Millipore) ja QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR-olosuhteet ja alukkeet 14-3-3σ konsensus sitoutumiskohdista 1 ja 2 on raportoitu aikaisemmin [17]. Seuraavia PCR-alukkeita ja olosuhteita käytettiin EGFR-promoottori p53 sitoutumiskohdan: forward-aluke 5 ’GGCCGCTGGCCTTGGGTC 3’; reverse-aluke 5 ’GCCGTGCGCGGTGGTTG 3’; 1 sykli 94 ° C 5 min, 43 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 55 ° C 30 sekuntia, 72 ° C: ssa 50 sekuntia, minkä jälkeen 1 sykli 72 ° C: ssa 10 min. PCR suoritettiin käyttämällä HotStarTaq-polymeraasia (Qiagen), jossa käytetään Q-Ratkaisu EGFR-PCR-määrityksessä.

Cisplatin-indusoitua apoptoosia

haimasyöpä soluja inkuboitiin 24 tuntia täydellisessä elatusaineessa puuttuessa tai läsnä ollessa 5 tai 10 ug /ml sisplatiinia ensimmäisen 2 h, 6 h tai koko 24 h. Sekä kelluvat ja tarttuvat solut kerättiin ja alistettiin immunoblottaus.

Tulokset

ΔNp63α ilmentymistä haimasyövän solulinjoissa

Huomasimme, että p63 oli differentiaalisesti ilmaistu haimasyövän solulinjoissa . p63-proteiinin tasot olivat korkeimmat T3M4 ja BxPC3 soluja, välituotteena COLO-357 ja alle määritysrajan tason ASPC-1 ja PANC-1-solut (Fig. 1A). Koska p63-vasta-ainetta (klooni 4A4) tunnisti kaikki kuusi tiedossa isoformeja p63 vertasimme p63 mRNA transkriptipitoisuuksissa edellä solulinjoissa. Kaikki solulinjat ilmensivät alhaisia ​​TAp63 mRNA: ta (Fig. 1 B). Sen sijaan ΔNp63 mRNA transkriptit suhteellisen koholla BxPC3, COLO-357, ja T3M4 solut (Fig. 1 B).

, Proteiinitasot p63, 14-3-3σ, TAp63γ ja p53 haimasyövän solulinjoissa.

B

, mRNA ilmaus TAp63 ja ΔNp63 isoformit p63 haimasyövän solulinjoissa. Kokonais-RNA eristettiin PDAC solulinjojen käänteiskopiointiin ja alistettiin reaaliaikainen PCR-koettimilla, jotka ovat spesifisiä Dn ja TA isoformien p63. Tulokset normalisoitiin 18S tasolle, ja ilmaistaan ​​keskiarvona kahden itsenäisen kokeen tehdään kaksoiskappaleita joka saatiin samanlaisia ​​tuloksia.

C

, mRNA: n ekspressio p63 silmukointivariantit haimasyövän solulinjoissa. Tasot normalisoitiin glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) arvot.

edelleen selvittämiseksi, onko tietty silmukoivat p63 ilmaistaan ​​haimasyövän solulinjoissa, käytimme semikvantitatiivinen RT-PCR- joissa p63 silmukoivat-spesifisiä alukkeita (taulukko S1). Olemme vahvistaneet, että TAp63α mRNA-transkriptien ilmaistiin suhteellisen alhainen ja samalla tasolla kaikissa viidessä solulinjoissa. Sen sijaan ΔNp63α mRNA-transkriptien vasta ilmaistu BxPC3, COLO-357, ja T3M4 soluja, kun taas ΔNp63γ mRNA oli tuskin havaittavissa BxPC3 ja T3M4 soluja (Fig. 1 C). Vaikka p63α voidaan havaita tietyn PCR eristetty havaitseminen p63β mRNA-transkriptien on epäluotettava, koska sen C-terminus ei ole ainutlaatuinen (Fig. S1). Meidän kokeissa ilmentyminen ΔNp63β mRNA transkriptin korreloi ΔNp63α ilme, johtunee epäspesifisten monistamiseen ΔNp63α. Koska olemme havainneet p63-proteiinin maahanmuuttoa ~68 kDa, ja ΔNp63β proteiini kulkeutuu at ~52 kDa [18] – [20], päättelimme, että ΔNp63α oli pääasiassa ilmaistu p63 variantti haiman syöpäsoluja.

kasvaimia aiheuttavalle vaikutukselle of ΔNp63α haiman syöpäsoluissa

tutkia biologisia vaikutuksia ΔNp63α vuonna PDAC, me manipuloitu ilmaisunsa PANC-1 ja T3M4 soluja, joilla oli matala ja korkea endogeenisten tasojen ΔNp63α, vastaavasti (kuvio. 1) . PANC-1-soluja transfektoitiin ohimenevästi ΔNp63α-ilmentävällä vektorilla (PANC-1ΔN), joka on TAp63α-ilmentävällä vektorilla (PANC-1TA) tai kontrolli-plasmidi. Lentiviruksen-välitteisen shRNA käytettiin alas-säädellä p63-geenin isoformien T3M4 soluissa. Kaksi eri shRNA sekvenssit, yksi komplementaarinen sekvenssin sisällä p63 DNA: ta sitovan domeenin (sh DBD), ja siten on suunnattu kaikille isoformeja p63, ja toinen komplementaarinen sekvenssin sisällä steriilissä alfa-motiivin verkkotunnuksen (SAM) ja siten suunnattu TAp63α ja ΔNp63α ( sh p63α) määritettiin vähentää ΔNp63α proteiinin ja transkriptin tasot T3M4 soluissa (Fig. 2A). Vaikka shRNA kohdistaminen trans aktivaatiodomeenina (sh TAp63) vähensivät TAp63 transkriptipitoisuuksissa, tämä ei kääntää havaittavaa muutosta koko p63-proteiinin tasot (Fig. 2A), joka vahvistaa havaintomme, että ΔNp63α muunnos vallitsee haimasyövän solulinjoissa .

, T3M4 solut infektoitiin GFP-proteiinia ekspressoivien virusten, tai p63-spesifinen shRNA täydentäviä DBD, TA ja α-tietyillä aloilla p63. Koko solun proteiini lysaatit altistettiin immunoblottauksella (yläpaneeli). Totaali-RNA eristettiin, käänteistranskriptoidaan ja alistettiin reaaliaikaisen PCR-koettimien spesifisiä Dn ja TA isomuotoa p63. Tulokset normalisoitiin 18S tasoilla (alapaneeli). Knockdown p63-isoformien rutiininomaisesti aikana seuraavissa kokeissa.

B

, ΔNp63α stimuloi kiinnittymisestä riippumatonta kasvua PANC-1-soluissa pehmeässä agarissa määrityksen (vasemmalla ja alhaalla paneelit) ja proliferaatiota in MTT määrityksessä (oikea paneeli). PANC-1-soluja transfektoitiin ohimenevästi ΔNp63α-ilmentävällä vektorilla, TAp63α tai kontrollivektorilla. Cell maljattiin pehmeälle agarille tiheydellä 1500 /kuoppa 12-kuoppalevyllä, neljä syvennystä per näyte. Pesäkkeet laskettiin sen jälkeen, kun 14 päivää inkuboinnin jälkeen. MTT-määritys Solut maljattiin 96-kuoppalevyille, kuusi kuoppaa näytettä kohti. MTT lisättiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 48 tuntia. Tiedot ovat keskiarvo ± SE neljästä itsenäisestä kokeesta. *, P 0,001 verrattuna kontrolli.

C

, alassäätely ΔNp63α hidastaa leviämisen T3M4 solujen klonogeeniset määrityksessä. Käyttökuntoon ΔNp63α osittain palauttaa proliferatiivinen kyky. Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 500 solua /kuoppa. 14 päivää myöhemmin, levyt vahvistetaan 3:01 metanoli: jääetikkaa ja värjättiin 2% kristalliviolettia. Tiedot ovat keskiarvo ± SE kolmen erillisen kokeen tehdään kolmena kappaleena. *, P 0,01 verrattuna ohjaus (sh ctrl).

D-F

, vaikutus p63 on soluliikkuvuus mitattuna haavan paranemista määrityksissä in PANC-1 (

D

) ja T3M4 solut (

E, F

). Soluja inkuboitiin seerumivapaassa (SF) olosuhteet puuttuessa tai läsnä ollessa 1 nM EGF: ssa 18 tuntia tehtyään tyhjästä. Kvantitatiivinen analyysi kuvien suoritettiin. Kohdunulkoinen ilmentyminen hiiren ΔNp63α in sh p63α T3M4 solut johti osittaiseen palauttamiseen soluliikkuvuus (

F

); vastaavat ΔNp63α proteiinin tasot on esitetty alla. Tiedot ovat m ± SE vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Edustavia kuvia näytetään (suurennus x 40). *, P 0,001 verrattuna ohjaus (sh ctrl).

G ja H

, vaikutus ΔNp63α on hyökkäyksen Matrigel kammioissa. PANC-1 (

G

) tai T3M4 (

H

) maljattiin Matrigel kammioissa (5 x 10

4 /ml) ja inkuboitiin ilman (SF) tai läsnä 1 nM EGF 18 tuntia. Vaikutus oli normalisoitiin hyökkäystä valvonnan SF olosuhteissa. *, P 0,001 verrattuna ohjaus (sh ctrl).

Koska ankkurista riippumaton kasvu on tunnusmerkki pahanlaatuisten solujen, tutkimme onko ΔNp63α vaikuttaa ankkurista riippumaton kasvu ja solujen lisääntymistä in PDAC. PANC-1ΔN, mutta ei PANC-1TA soluissa ilmeni kohonneita pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa määrityksissä ja kasvanutta solujen MTT määrityksissä (Fig. 2B). Koska T3M4 solut eivät kykene muodostamaan pesäkkeitä pehmeässä agarissa, proliferaatiota tutkittiin klonogeeniset määrityksessä. Verrattuna kontrolli solujen lisääntymistä T3M4 solujen väheni vastauksena shRNAs jotka kohdistuvat DBD tai α-erityinen C-päässä ja muuttumaton vastauksena sh TAp63 (Fig. 2C). Ohimenevä yliekspressio hiiren ΔNp63α cDNA, joka kuljettaa hiljainen mutaatio alueella kohteena oleviin α-spesifinen shRNA, johti osittaiseen pelastamiseen proliferatiivinen kyky sh p63α T3M4 soluja, verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu kontrollivektorilla (Fig. 2C ).

ΔNp63α on tunnettua säätää tarttumista ohjelman maitorauhasen epiteelisoluissa ja keratinosyyteissä [15]. Kun otetaan huomioon soluadheesion kasvaimen invaasio ja etenemiseen, me tutkittiin vaikutuksia ΔNp63α on liikkuvuuteen ja invasiivisia valmiuksia haiman syöpäsoluja. In arpeutumisprosessit määritykset, PANC-1ΔN soluista osoitti parannetun potevilla SF olosuhteissa, kun taas yli-ilmentyminen TAp63α ei ollut vaikutusta (kuva. 2D). Koska aktivointi EGFR reitin liittyy lisääntynyt kasvaimen aggressiivisuus ja laski eloonjäämisen PDAC [21], pyrimme määrittää vaikutus EGR liikkuvuuteen. EGF stimulaation lisätä maastamuuttoa in PANC-1ΔN ja ohjaus soluja (Fig. 2D). Samoin T3M4 solut, jotka ilmentävät sh p63α, mutta ei sh TAp63, oli vähemmän liikkuvuuden sekä lähtötilanteessa ja EGF (Fig. 2E). Ohimenevä yliekspressio hiiren ΔNp63α vuonna T3M4 soluissa, jotka ilmentävät sh p63α johti osittaiseen pelastamiseen motiliteettia fenotyypin (kuvio. 2F). Manipulointi ΔNp63α ekspressiotasoja ollut vaikutusta hyökkäyksen haimasyövän solujen Matrigel kammiot SF olosuhteissa (Fig. 2G, H). Kuitenkin stimuloitaessa EGF johti dramaattiseen kasvuun invasiivisia valmiutta PANC1-Dn-soluissa (kuvio. 2G). Yhdenmukainen Edellä esitettyjen havaintojen shRNA välittämää tukahduttaminen ΔNp63α, mutta ei TAp63, vähensi kykyä T3M4 solujen hyökätä läpi Matrigel vastauksena EGF stimulaation (Fig. 2 H).

Yhdessä tuloksemme osoittavat että ΔNp63α parantaa pesäkkeitä muodostavien, proliferatiivisia ja invasiivisia kapasiteetti haimasyövän soluja.

ΔNp63α ylössäätelee EGFR ja herkistää haimasyövän soluja vaikutuksia EGF

verrattuna normaaliin haima, EGFR proteiini ja mRNA ilmennetään korkeilla tasoilla haimasyövän [22]. EGFR mRNA ilmaisu ennustaa vähentynyt selviytymisen ja huono vaste kemoterapialle potilaalla on PDAC [23]. Työmme, ΔNp63α dramaattisesti voimistaa haimasyövän soluliikkuvuus ja invasiivisia kyvyt läsnäollessa EGR. Selittää tätä ilmiötä, tutkittiin vaikutusta ΔNp63α on EGFR tasoilla. Olemme todenneet, että suunniteltu ilmentymistä ΔNp63α in PANC-1-solujen parannettu EGFR, kun taas kohdunulkoinen TAp63α ei ollut vaikutusta (Fig. 3A). Tämän mukaisesti havainnon, huomasimme, että EGFR tasot laskivat T3M4 soluissa reaktiona shRNA välittämää tukahduttaminen ΔNp63α (Fig. 3B), osoittaen näin suora korrelaatio ΔNp63α ja EGFR haimasyövän solulinjoissa. Jos haluat tutkia, mitä vaikutuksia ΔNp63α ilmentymisen vaikutus EGFR signalointi, arvioimme aktivointi loppupään kinaasien kun EGF stimulaatiota. Hoito PANC1-Dn-solujen EGF aikaan voimakkaampaa fosforylaatioon ERK, Akt ja JNK (Fig. 3C). Näissä soluissa, kaikki kolme kinaasien osoittivat tehostettuun aktivointi jo 10 minuutin kuluttua solujen stimulaation, ja ERK toiminta kesti 60 minuuttia.

, ektooppinen ilmentyminen ΔNp63α tuloksia lisääntynyt ilmentyminen EGFR ja β1-integriini PANC-1-soluissa. Sen jälkeen soluja inkuboitiin 48 tunnin ajan, koko proteiinin lysaatit altistettiin immunoblottauksella. Edustava kuva kolmen itsenäisen kokeen näkyy.

B

, alassäätely ΔNp63α vuonna T3M4 soluissa johtaa vähentynyt ilmentyminen EGFR ja β1-integriini. Edustava kuva kolmen itsenäisen kokeen näkyy.

C

, PANC-1ΔN ja PANC-1 ohjaus-soluja stimuloitiin EGF aikana osoitetun ajanjaksoina. Proteiini lysaatit altistettiin immunoblottauksella. Edustava kuva kolmen itsenäisen kokeen on esitetty.

Seuraavaksi käytimme tyrosiinikinaasin estäjä väittää, että vaikutukset ΔNp63α oli välittämien EGFR kautta. Erlotinibi on reversiibeli estäjä EGR signalointi, joka on yhteydessä ATP-sitoutumiskohta reseptorin. Inkuboinnin PANC-1-solujen kanssa 1 uM erlotinibin vaimensi ΔNp63α-välitteisen parantamiseksi pesäkkeen muodostumisen, liikkuvuuteen ja invaasiota (Fig. S2), mikä sulkee pois mahdollisuuden ei-spesifinen vaikutus. Sitä vastoin, p63-proteiinin tasoa ei vaikuttanut, kun soluja inkuboitiin joko EGF: llä tai erlotinibi (tuloksia ei ole esitetty).

Aiemmat raportit ehdotti, että ΔNp63α pystyy säätelemään soluadheesion proteiinien nisäepiteelisoluissa [15]. Koska integriini välittämä tuumorisolun vuorovaikutusta soluväliaineen on ratkaiseva rooli määritettäessä invasiivisia fenotyyppi PDAC, me tutkimme, ΔNp63α vaikuttanut integriinin ilmentymisen haiman syöpäsoluja. Kohdunulkoinen ilmentyminen ΔNp63α in PANC-1-solujen lisääntyneen ekspression β1-integriini, kun taas ilmaus α3- ja α5-integriinien pysyi muuttumattomana (kuvio. 3A). Toisaalta, shRNA-välitteisen tukahduttaminen ΔNp63α johti vähenemiseen β1-integriinin T3M4 soluissa (Fig. 3B).

Näin ollen, ΔNp63α edistää onkogeeninen haimasyövän soluja, ainakin osittain, kautta säätelyä EGFR ja β1-integriini.

ΔNp63α myötävaikuttaa kemoterapian resistenssin haimasyöpäsoluissa

Koska PDAC on tunnetusti kestävät kemoterapeuttisten aineiden, tutkimme roolia ΔNp63α kemoterapiassa vastarintaa. Aiemmin on osoitettu, että sisplatiini aiheuttaa hajoamista ΔNp63α stimulaation kautta lKB-kinaasin [24]. Yhdenmukaisia ​​tietoja, inkubointi haimasyövän solulinjoissa, joissa 10 ug /ml sisplatiinia johti hajoamista endogeenisen ΔNp63α. Tämä vaikutus sisplatiinin oli ilmeistä 6 tunnin kuluttua inkubaation ja sen mukana kasvanut apoptoosin kaikissa testatuissa solulinjoissa (Fig. 4A). Sitten tutkimme, ektooppinen ilmentyminen ΔNp63α edesauttaisi vastustuskykyä sisplatiinin aiheuttaman apoptoosin PDAC. PANC-1-soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan täydellisessä väliaineessa, jota oli täydennetty 5 ug /ml sisplatiinia 2, 6, tai 24 tuntia. PANC-1ΔN solut osoittivat lievä vaimeneminen apoptoosin verrattuna ohjaus soluihin, mikä ilmenee vähentyneenä PARP ja kaspaasi pilkkominen (Kuva. 4B). Tämä lasku sisplatiinin indusoiman apoptoosin korreloi kasvu elinkelpoisuuden PANC-1ΔN soluja määritettiin MTT-määritys, kun taas PANC-1TA solut ilmensivät hieman vähennetty eloonjäämistä (Fig. 4C). Sitä vastoin, T3M4 solut, jotka ekspressoivat sh p63α olivat herkistyneet sisplatiinin indusoiman apoptoosin, kuten on osoitettu lisääntyneen pilkkomalla PARP ja kaspaasi (Fig. 4D). Siten ΔNp63α vaimentaa herkkyyttä haimasyöpäsoluissa sisplatiinia.

, sisplatiinin vaikutusta ΔNp63α in PDAC. Soluja inkuboitiin 10 ug /ml sisplatiinia ensimmäisenä 6 tai kokonaan 24 tunnin aikana. Apoptoosi arvioitiin seuraamalla PARP pilkkominen.

B-D

, vaikutus ΔNp63α sisplatiinilla indusoitua apoptoosia PANC-1 (

B, C

) ja T3M4 solut (

D

). Soluja inkuboitiin 5 ug /ml sisplatiinia aikana osoitetun ajanjaksoina. Solut pelletoitiin 24 tunnin kuluttua inkubaation, proteiinien eristetty ja ajettiin SDS-PAGE-geelillä. Apoptoosi arvioitiin seuraamalla PARP ja kaspaasi-3 pilkkominen. Edustava kuva vähintään kolmen itsenäisen kokeen näkyy. PANC-1-soluja inkuboitiin 10 ug /ml sisplatiinia ensimmäisen 12 tunnin tai koko 48 tuntia. MTT-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Tiedot ovat keskiarvo ± SE kolmen itsenäisen kokeen.

ΔNp63α ylössäätelee 14-3-3σ haimasyövän solulinjoissa

Seuraavaksi tutkittiin mekanismeja ΔNp63α välittämää chemoresistance in PDAC . Olemme aiemmin osoittaneet, että 14-3-3σ dramaattisesti parantaa vastustuskykyä sisplatiinin indusoiman apoptoosin haimasyövän solulinjoissa [11]. Westfall et ai. osoittivat, että ΔNp63α toimii transkription repressori on 14-3-3σ promoottorin ihmisen orvaskeden keratinosyyttejä [25]. Sen sijaan havaitsimme, että ilmaus ΔNp63α korreloi 14-3-3σ proteiinin ilmentymistä haimasyöpäsoluissa (Fig. 1A). Lisäksi hiljentäminen ΔNp63α oli mukana väheneminen 14-3-3σ proteiinin tasolla T3M4 soluissa (kuvio. 2A). 14-3-3σ on p53 transkription kohde, mutta BxPC3, PANC-1 ja T3M4 solujen tiedetään kantavan mutantti p53, jonka transkriptionaalinen aktiivisuus on viallinen [26], kun taas COLO-357-solut ilmentävät alhaisen p53-proteiinin tasoa (Fig. 1A) . Siksi 14-3-3σ ilme ei todennäköisesti ole riippuvainen p53 PDAC.

Voit selvittää ΔNp63α moduloi 14-3-3σ ilmentymistä haimasyöpäsoluissa toimme ΔNp63α cDNA kautta adenoviruksen infektion ASPC- 1 ja PANC-1-solut, jotka ilmentävät alhaisia ​​14-3-3σ ja ΔNp63α. Havaitsimme kasvu 14-3-3σ proteiinin tasot ΔNp63α yli-ilmentävät solut verrattuna kontrolliin-infektoituneissa soluissa (kuvio. 5A). Tämä ΔNp63α-välitteisen kasvu 14-3-3σ ei liittynyt muutoksia proteiinin tasoja muiden 14-3-3-isoformien (Fig. 5A). Sen sijaan, manipulointi 14-3-3σ tasojen PANC-1 ja T3M4 solut eivät ole vaikutusta ΔNp63α (Fig. 5B ja 5C).

A, ASPC-1 ja PANC-1-soluja infektoitiin adenoviruksella, joka sisältää joko tyhjän vektorin tai täyspitkä ΔNp63α, ja kokosolu-proteiinin lysaatti valmistettiin 48 tuntia infektion jälkeen ja tutkittiin anti-ΔNp63α ja 14-3-3σ ja muut 14-3-3 isoformit.

B

, yli-ilmentyminen 14-3-3σ ei ollut vaikutusta ΔNp63α tasoilla. PANC-1-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla (Sham) tai täyspitkän ihmisen 14-3-3σ cDNA, joka oli merkitty HA.

C

, hiljentäminen 14-3-3σ ei vaikuta ΔNp63α.