Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti. Viimeaikainen edistyminen keuhkosyövän diagnosointiin ja hoitoon on saavutettu vuoksi paremmin ymmärtämään molekyylitason mekanismeja taudin ja tunnistaminen biomarkkerit, jotka mahdollistavat tarkempia syöpähoitojen. Yksi parhaiten tunnettuja esimerkkejä henkilökohtainen hoito on käyttää tyrosiinikinaasin estäjät, kuten gefitinibi ja erlotinibi, että onnistuneen hoidon ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaat valitaan perustuen erityiseen

EGFR

mutaatioita. Siksi luotettava mutaatiot on kriittinen soveltamiseksi asianmukainen hoito. Tässä tutkimuksessa testasimme kaksiportainen mutaation havaitsemisstrategiaa käyttäen reaaliaikaista PCR-määrityksissä kuin validoitu hyvin herkkä menetelmä ja multiplex ligaation riippuva anturi vahvistus (MLPA) -pohjaisen EGFRmut + määrityksessä toissijaiset vakio-herkkyys menetelmä. Yksi lisäetu soveltaa MLPA menetelmä on, että se sallii samanaikaisen havaitsemisen EGFR mutaatioiden ja kopioi-numero muutoksia (eli monistukset) on

EGFR, MET

ja

erbB2-

. Analyysimme osoittivat korkeaa vastaavuutta näiden kahden menetelmän. Kun käyttää tätä kaksitasoinen strategia, me määrittää luotettavasti taajuus

EGFR

mutaatioita ja

EGFR, MET

ja

erbB2

monistuksia yli 200 keuhkosyöpää näytettä. Lisäksi hyödyntämällä samanaikaisesti kopioluvun ja pieni mutaatio analyysit, osoitimme erittäin vahva korrelaatio EGFR mutaatioita ja EGFR monistumiset ja keskinäinen ainutlaatuisuus EGFR mutaatioita /monistamisia MET ja erbB2 monistuksissa. Tuloksemme osoittautui luotettavuutta ja hyödyllisyyttä kaksiportainen EGFR testausstrategiasta.

Citation: Lewandowska MA, Czubak K, Klonowska K, Jozwicki W, Kowalewski J, Kozlowski P (2015) The Use of kaksi- vaiheittainen testaus- strategia Samanaikainen havaitseminen Pieni

EGFR

mutaatiot ja

EGFR

Amplification Lung Cancer. PLoS ONE 10 (2): e0117983. doi: 10,1371 /journal.pone.0117983

Academic Editor: Rafael Rosell, katalaani syöpäinstituutti, ESPANJA

vastaanotettu: toukokuu 16, 2014; Hyväksytty: 05 tammikuu 2015; Julkaistu: 26 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Lewandowska et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat tutkimuksen apurahan 2011/01 /B /NZ5 /02773 National Science Centre (https://www.ncn.gov.pl /). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti. Hoito keuhkosyövän perustuu perinteisesti histopatologinen arviointi, joka erottaa kaksi erilaista keuhkosyöpään: pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joista jälkimmäinen voidaan jakaa levy- karsinooma, iso, adenokarsinooma ja syövät sekavin histologia. Merkittävää viimeaikaisesta edistymisestä Keuhkosyövän hoidossa (erityisesti adenokarsinooman) on saatu aikaan edistystä ymmärrystämme sen patologian; Nykyisen hoitovaihtoehdot ovat erikoistuneet aineita, joka perustuu läsnä tai poissa geneettisen biomarkkerit ( ”henkilökohtainen terapia”), kuten mutaatiot epidermaalisen kasvutekijän reseptori (

EGFR

) [1], tai saada-of- toiminto toiselle siirtäminen tai käännellen joihin anaplastinen lymfooma reseptori tyrosiinikinaasin (

ALK

) [2].

on osoitettu, että tietyt somaattisia mutaatioita kinaasidomeenia

EGFR

herkistää syöpien hoitoon

EGFR

erityisiä tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), kuten erlotinibi tai gefitinibin (tarkistetaan [3]). Yleisimpiä herkistävän

EGFR

mutaatiot ovat L858R eksonin 21 ja in-frame deleetiot eksonissa 19, jotka yhdessä muodostavat yli 80-85% kaikista

EGFR

mutaatioita. Kuitenkin esiintyminen toissijaisen T790M eksonissa 20 syitä kehittynyt resistenssi TKI ja aiheuttaa etenemistä syöpien käsitelty TKI [4,5]. Siksi luotettava havaitseminen

EGFR

mutaatioita on tärkeä tekijä, joka mahdollistaa yksilöllisten keuhkosyöpäpotilaiden.

Viimeisten 10 vuoden aikana lukuisia menetelmiä eri herkkyyksillä ja erityispiirteitä on käytetty havaitsemiseksi

EGFR

mutaatioita syöpänäytteissä. Näitä menetelmiä ovat Sangerin sekvensoinnin, yksijuosteisen konformaation (SSCP) [6], co-vahvistus alhaisemmissa denaturaatiolämpötilassa-PCR (COLD PCR) [7], immunohistokemia kanssa

EGFR

-mutation spesifisten vasta-aineiden [8] , peptidinukleiinihappo-lukittu (PNA-LNA) PCR-clamp määritykset, reaaliaikaisen PCR: n (RT-PCR) [9], ja seuraavan sukupolven sekvensointi [10]. Kuitenkaan yksikään menetelmistä, joita on käytetty tähän asti ovat ihanteellisia, ja jokainen näistä menetelmistä on rajoituksia, jotka useimmiten liittyvät seuraaviin ominaisuuksiin syöpänäytteissä: (i) hajautetaan tyyppisiä kasvainnäytteestä analysoitaviksi (kirurginen, koepala), (ii) saastumisen normaalien solujen, (iii) geneettinen heterogeenisyys kasvaimia, (v) usein alhainen taajuus analysoidaan mutaatioista, (iv) hajoaminen DNA, ja (v) vahinkoa tai muuttaminen DNA [kahden jälkimmäisen tekijät pätevät myös formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) näytteet, jotka ovat useimmin saatavilla näytteitä]. Vakavimmat ongelmat johtuvat rajoitukset kasvaimen näytteen analysointia ovat vääriä negatiivisia ja vääriä positiivisia virheitä, jotka voivat johtaa luokitteluvirheet ja riittämätön syövän hoitoon. Siksi vähentää osa luokiteltu väärin näytteitä, se on äskettäin ehdotettu näyttöön perustuvan ohjeen kolmen ammatillisen yhteiskunnissa (College of American patologi, International Associations for Study of Lung Cancer, ja Association for Molecular Pathology) että, jos mahdollista,

EGFR

mutaatio testaus on suoritettava kahdella eri menetelmällä (kaksiportainen testaus strategia). Tämä ohje edustaa state-of-the-art molekyyli keuhkosyöpä testaus- ja on yhdessä julkaistiin kolmessa lehdissä [11-13]. Yksinkertaisuuden vuoksi myöhemmin viitataan ainoastaan ​​[11]. Tämä kaksiportainen menetelmä tulisi perustua eri mutaation havaitsemisen periaatteet ja olisi katettava eri valikoimia herkkyys, joka koostuu vakio-herkkyyden ja herkkä menetelmiä.

Tässä tutkimuksessa testasimme yli 200 NSCLC näytettä kanssa käytetään kahta täydentävää menetelmissä rutiininomaisesti käytetty kaupallinen RT-PCR-määritystä (erittäin herkkä menetelmä) [9] ja uuden multiplex ligaation riippuva anturi vahvistus (MLPA) -pohjaisen EGFRmut + määritys (vakio-herkkyys, toissijaiset menetelmä ) [14]. Analyysimme osoitti korkeaa vastaavuutta näiden kahden menetelmiä ja siten osoittautui luotettavuutta ja hyödyllisyyttä EGFRmut + määrityksessä toissijaiset menetelmä

EGFR

mutaatio testaus. Käytön näitä menetelmiä, me tunnettu ja arvioitu taajuus somaattisen

EGFR

mutaatioiden joukko keuhkosyöpä näytteitä Keski-Puolassa. Yksi lisäetu EGFRmut + määritys on, että se mahdollistaa mutaation analyysi ja suhteellinen kopioluvun määrittäminen (eli vahvistus tunnistus) rinnakkain. Käytimme tätä lähestymistapaa löytää erittäin vahva korrelaatio

EGFR

vahvistusta ja esiintyminen

EGFR

mutaatioiden ja määrittää karkea taajuuden Mutanttialleelit meidän analysoiduista näytteistä.

Materiaalit ja menetelmät

valitseminen ja käsittely NSCLC näytteiden molekyylitason analyysi

jälkikäteen tarkistetaan kohortin 239 potilailla, joilla on histopatologisesti vahvistettu NSCLC diagnosoitu 2011-2012 klo Franciszek Lukaszczyk Oncology Center Bydgoszcz (Keski-Puolassa). Ikä potilaiden vaihteli 35: stä 81. Kaikkiaan 239 yksilöitä, jotka läpäissyt laadunvalvontaa vaiheet (mikroskooppinen analyysi ja kasvaimen sisällön pätevyys sekä laadulliset ja määrälliset DNA-analyysi) saatiin seuraavat 143 leikkauksia, 91 hienoksi neula toive ( FNA) menettelyt, ja 5 endobronkiaalinen ultraääni ohjattuja transbronchial punktiomenetelmällä (EBUS-TBNA) menettelyt tai pleuranesteeseen näytteitä. Näytteet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla laadullinen ja määrällinen analyysi kasvainsolujen analysoitiin materiaalin (mukaan lukien macrodissection sisään merkitty näytteitä). Pätevyys biologista materiaalia molekyyli- Analyysi perustui edellä kuvattuja laadullisia ja määrällisiä vaa’at Sytologisten [9] ja histologiset [15] materiaalia. Tietoisen kirjallisen suostumuksensa geenitestien hyväksymä F. Lukaszczyk Oncology Center Bydgoszcz saatiin kaikista potilaista ja tutkimuksen hyväksyi paikallinen eettinen komitea, bioetiikkaneuvoston Ludwig Rydygier Collegium Medicum Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University Torun . Tulokset analysoitiin anonyymisti.

DNA: n eristä-

DNA eristäminen suoritettiin sen jälkeen, kun macrodissection on ilmoitetulla alueella, jonka pathomorphologist. Perimän DNA eristettiin FFPE adenokarsinooma kudoksesta tai Sytologisten tahroja käyttämällä QIAamp FFPE Mini Kit (QIAGEN) mukaan valmistajan ohjeiden seuraavin muutoksin. Olemme suspendoitiin uudelleen pelletti 180 ul: ssa Tissue Lysis Buffer 20 ui proteinaasi K, ja sen jälkeen vorteksoitiin ja jatkuvasti ravisteli solupelletti lyhyin väliajoin inkuboitiin yön yli 56 ° C: ssa. DNA-määrä ja laatu arvioitiin NanoDrop absorbanssi analyysi ja agaroosigeelielektroforeesilla.

mutaatioanalyysi Real-Time PCR

RT-PCR-menetelmässä käytetään mutaation-spesifisiä koettimia voidaan arvioida 29 pistemutaatioiden mukaan lukien T790M mutaatio (EGFR-RT52, Entrogen, Inc., Tarzana, CA). DNA määrä 200-650 ng oli riittävä havaitsemiseksi 29 mutaatioiden näytteissä kohteisiin; Sisäisen valvonnan VIC loisteputki antureista ja

EGFR

fluoresoivat koettimet FAM väriaine-leimattu. Monistaminen käyrät arvioitiin suositusten mukaisesti valmistajan.

Mutaatio ja vahvistusta analyysi MLPA

MLPA analyysi suoritettiin käyttämällä mittatilaustyönä EGFRmut + määritys, joka on aiemmin kuvataan yksityiskohtaisemmin [14]. Tämä määritys samanaikaisesti mahdollistaa havaitsemisen onkogeenisten

EGFR

mutaatioiden ja analyysi kopioluvun (vahvistus tunnistus) on

EGFR

,

MET

, ja

erbB2

. Kaikki reagenssit paitsi EGFRmut + koetinseosta ostettiin muodossa MRC-Holland Amsterdam, Alankomaat (www.mlpa.com). MLPA reaktiot suoritettiin mukaan valmistajan yleisiä suosituksia (MRC-Hollanti), kuten on kuvattu aiemmin [16,17]. Lyhyesti, 5 ui genomista DNA: ta (pitoisuutena noin 20 ng /nl) inkuboitiin 98 ° C: ssa 5 minuutin ajan, jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja sekoitettiin 1,5 ui EGFRmut + koettimien yhdistelmä ja 1,5 ui SALSA hybridisaatiopuskuria. Reaktiota denaturoitiin sitten 95 ° C: ssa 2 minuutin ajan ja hybridisoitiin 60 ° C: ssa 16 tuntia. Hybridisoitu koettimet ligoitiin 54 ° C: ssa 15 minuutin ajan lisäämällä 32 ui ligaatioseosta. Seuraavat lämpöinaktivoinnilla Ligaatioreaktio jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, sekoitettiin 10 ul: aan PCR-seosta (polymeraasi, dNTP: t, ja yleinen alukkeita, joista toinen oli leimattu fluoreseiini), ja alistettiin PCR-monistuksen 35 syklin ajan. MLPA tuotteet laimennettiin myöhemmin 20x in Hidi formamidia, joka sisälsi GS Liz600, jota käytettiin DNA-liima-standardi, ja erotettu kautta kapillaarielektroforeesilla (POP7 polymeeri) ABI Prism 3130XL laite (Applied Biosystems). Saatu elektroferogrammit analysoitiin GeneMarker ohjelmisto v1.91 (2.4.0). Signaali intensiteettiä (korkeuksien) haettiin ja siirrettiin valmistettu Excel levyt (saatavilla pyynnöstä). Kunkin yksittäisen näytteen, signaalin voimakkuus kunkin koetin jaettiin keskimääräisellä signaalin voimakkuuden valvonnan koettimien normalisoida saadut arvot ja tasaamiseksi run-to-run vaihtelua, ja normalisoitu arvo kullekin piikin sitten jaettiin vastaava arvo vertailunäytteitä ja kerrottuna 2. lopullinen MLPA tulosta kunkin näytteen on esitetty bar-juoni, jossa palkit osoittavat suhteellinen kopiomäärä arvo myöhemmin antureista.

EGFR kopiomäärä analyysiä kvantitatiivinen PCR (qPCR) ja pisaran digitaalinen PCR (ddPCR) B

qPCR analyysi suoritettiin käyttämällä MESA GREEN qPCR Mastermix Plus SYBR Pitoisuus (Eurogentec, Seraing, Belgia), mukaan valmistajan yleisiä suosituksia. ddPCR suoritettiin käyttämällä QX200 järjestelmän ja EvaGreen Supermix (BIO-RAD, CA, USA) valmistajan yleisiä suosituksia, kuten aiemmin on kuvattu [18,19]. DdPCR analyysi suoritettiin multiplex muodossa yhteistyössä monistuminen ohjaus-amplikonin ja yksi koe-amplikonit yhdessä reaktiossa. Saavuttaakseen oikea erottaminen pisaran tyyppejä, intensiteetti testin ja ohjaussignaalin sen eriytettiin amplikonien ”pituus ja Pohjustusaineilla pitoisuuksia. Molemmissa menetelmissä samoja PCR-alukkeiden käytettiin: (i) koe-amplikoni varten

EGFR

eksoni 2: forward-aluke GCAGTTGGGCACTTTTGAAG, käänteinen aluke TTCCAAATTCCCAAGGACCA (pitoisuus qPCR-300 nM, pitoisuus ddPCR-100 nM , amplikonin pituus 83 bp); (Ii) koe-amplikoni EGFR eksoni 18: forward-aluke TTGTGGAGCCTCTTACACCC, käänteinen aluke CCTTCAAGATCCTCAAGAGAGC (pitoisuus qPCR-300 nM, pitoisuus ddPCR-100 nM, amplikonin pituus 64 bp); (Iii) kontrolli-amplikoni: forward-aluke GCTGACCTGTTGGCTGAAAA, käänteinen aluke GAATCGCTGTGGCCTTGATG (pitoisuus qPCR-300 nM, pitoisuus ddPCR-200 nM; amplikonin pituus 113 ep). Amplikoneista joko päällekkäin tai läheisesti sijaitsevat seuraaviin MLPA antureista: EGFR_e2, EGFR_e18, ja ctrl_1, vastaavasti. Optimoitu hehkutus lämpötila säädettiin 59 ° C: ssa ja 58 ° C, qPCR ja ddPCR, vastaavasti.

Tulokset

Kaikki 239 näytettä analysoitiin sokeat näytteet kahdella tavalla: (i) kaupallinen RT-PCR (EGFR-RT52; Entrogen Inc.), joka kattaa 29 yleisimmistä onkogeeninen mutaatiot eksonit 18, 19, 20 ja 21

EGFR

(katso lisätietoja valmistajat verkkosivu; https://www.entrogen.com/web2/egfr-mutation-analysis-kit) ja (ii) mittatilaustyönä MLPA määritys (EGFRmut +), joka samanaikaisesti mahdollistaa havaitsemisen monistukset ja pienten mutaatiot

EGFR

(lisätietoja [14]) (Fig. 1). Lyhyesti, lisäksi standardi annos-herkän (DS) koettimia EGFRmut + määritys koostuu myös kahden mutaation-herkkien koettimia. Mutation-herkkä (MS-) antureista ovat tyyppejä DS koettimia, jotka ovat spesifisiä villityypin sekvenssi, mutta päällekkäisiä sivustoja seuraavista mutaatioista: G719A /S /C (G719X) eksonissa 18 (koetin E18), in- frame poistot eksonissa 19 (koetin E19), S768I ja in-frame insertiot eksonissa 20 (koetin e20-1), T790M eksonissa 20 (koetin e20-2) ja L858R eksonissa 21 (koetin E21). Kumman näistä mutaatiot analysoitu näyte aiheuttaa lasku signaalin vastaavan MS- koetin. EGFRmut + määritys sisältää myös kolme mutaation herkkiä (MS +) koettimia, jotka ovat spesifisiä mutanttisekvensseistä. Näistä saadut signaalit koettimien esiintyy vain, jos vastaava mutaatio on läsnä. Kaksi näistä koettimien tunnistavat sekvenssit yleisin

EGFR

mutaatioita (yleisin lukukehyksessä deleetion eksonissa 19, c.2235_2249del15 (koetin e19 +) ja L858R (koetin e21 +)), ja kolmas tunnistaa T790M mutaatio, joka liittyy TKI vastus (koetin e20-2 +). Lisäksi EGFRmut + sisältää muutamia DS koettimia, jotka ovat spesifisiä joko

MET

tai

erbB2

jotka mahdollistavat monistuksia näistä geeneistä voidaan havaita.

A) Kartta

EGFR

geenin kannoista RT-PCR-amplikonit (EGFR-RT52) ja MLPA antureista (EGFRmut + määritys) osoitti (pystyviivat kartan alla). Mutaatio herkkä EGFRmut + koettimet on merkitty punaisella. Sijainnit onkogeenisten

EGFR

mutaatiot on merkitty ylle. B) RT-PCR-tuloksiin, jotka edustavat (ylhäältä) (i) Vertailunäytteen (näyte ilman mutaatioita tai vahvistusta), (ii) näytteen yleisimmät lukukehyksessä poisto eksonissa 19 (c.2235_2249del15) , (iii) näyte sekä L858R eksonissa 21 ja T790M eksonissa 20, ja (iv) näyte saatetaan lukukehyksessä poisto eksonissa 19 (c.2235_2249del15) ja

EGFR

vahvistusta. Kussakin kuvaaja, limittyvät tulokset 8 RT-PCR-reaktioissa, jotka kattavat 29

EGFR

mutaatioita on esitetty. Punaiset viivat osoittavat positiivinen vahvistus-käyrät spesifisten

EGFR

mutaatioita (muistutti käyrää), ja vihreä peruslinjan edustaa ei-vahvistetun signaalin puuttumisen vuoksi arvioidun mutaation analysoitu näyte. C) MLPA elektroferogrammit analysoitujen näytteiden RT-PCR: llä (paneeli B). Koetin tunnukset on merkitty alla elektroferogrammit. Tähdet osoittavat valvontaa koettimia; vaaleanpunainen nuolenpäät osoittavat pienentää signaalin MS- antureista ja lisäsi signaalin MS + antureista, vastaavasti; ja musta arrowheads osoittavat vahvistetuista signaaleista

EGFR

erityisiä koettimia. D) Bar koealojen vastaa Elektrofe- esitetty paneeli C ja edustaa normalisoitua kopioluvun arvon (y-akseli) kunkin koettimen (x-akseli). Vaaleanpunainen arrowheads osoittavat pienempi kopiomäärä arvoa MS- antureista ja lisääntynyt kopiomäärä arvoa MS + koettimia vastaavasti.

Ominaisuudet havaitun mutaatioiden

Yhteensä havaitsimme 30 mutaatiota 29 ulos 239 näytettä (12,1%). Sekä L858R ja T790M löydettiin yksi näyte. Niistä tunnistetut mutaatiot olivat 16-frame deleetiot eksonissa 19 (53%), 9 vaihdot L858R (30%), 2 vaihdot L861Q (7%), yksi substituutio G719X, yksi-kehyksen lisääminen eksonissa 20 ja yksi substituutio T790M (S1 Taulukko; esitetty taulukossa 1). Mutaatiot olivat paljon useammin naisilla 22/68 kuin miehillä 7/142 (24,4% vs. 4,7%, vastaavasti; p 0,0001). Tapahtua jakamalla mutaation taajuuden iän [ 55 (13%), 55 (11,9%)] ja näytteen tyyppi [FFPE (11,9%), Sytologisten näytettä (12,5%)] eivät osoittaneet merkittäviä vaikutteita näistä tekijöistä mutaatioon taajuus (taulukko 1). Myös ei havaita vähenemistä mutaation taajuus näytteet alhaisempi kasvainsolujen (PTC). Huomaa kuitenkin, että vain pieni osa (noin 5%) ja analysoitiin näytteistä oli PTC≤30%.

vertailu RT-PCR ja MLPA mutaation havaitsemisen menetelmiä

On no kultakanta menetelmää mutaation havaitsemiseksi syöpänäytteissä, kun tietty mutaatio voi selittää hyvin alhainen osa analysoitiin DNA. Näin ollen arvioida laadun MLPA-pohjainen EGFRmut + määrityksessä, vertasimme sen rutiininomaisesti käytetty ja hyvin vahvistettu RT-PCR-menetelmällä. Suora vertailu tulosten RT-PCR ja MLPA osoitti erittäin vastaavuutta näiden kahden menetelmän (98,7% yhtäpitävät tulokset) sekä 100%: n spesifisyys (ei vääriä positiivisia) ja 90% herkkyys (27 ulos 30 mutaatioiden havaittu) n EGFRmut + testi. Niistä 3 mutaatioita, joita ei ole havaittu, että EGFRmut + määrityksessä olivat kaksi tapausta kanssa L861Q substituutio, joka ei kuulu EGFRmut + koettimia (Fig. 1A), ja yksi G719X mutaatio näytteessä on alhainen PTC (15%). Lisäksi joukossa näytteet analysoitiin MLPA olivat 4 sokkonäytteet 3 eri mutaatiota. Kaikissa tapauksissa tulokset kahtena näytteistä oli yhtäpitävät. Lisäksi on huomattava, että MS + antureista (signaali esiintyminen) mutaatioiden tunnistamiseksi helpommin ja paremman luottamuksen kuin MS- antureista (signaali vähennys). MS + antureista mahdollisti varmoja mutaatiot, vaikka ne mutaatiot muodostavat hyvin pieni osa analysoitiin DNA (~ 10%) näytteissä, joissa PTC≤30%. Esimerkiksi L858R mutaatio, joka kuuluu sekä MS + ja MS- koettimina, kolme näytettä, ei voitu havaita lasku signaalia MS- koetin mutta helppo havaita esiintyvän alhaisen mutta selvä signaali MS + koetin. Alempi herkkyys MS- koettimien johtuu enimmäkseen suhteellisen korkea signaalin vaihtelu DS koettimet syöpänäytteissä. Suurempi MLPA signaali vaihtelusta syöpänäytteissä on havaittu aikaisemmin ja tulokset lähinnä geneettisen heterogeenisyyden syöpänäytteissä [20] ja heikomman laadun ja usein hajoaminen DNA-näytteiden eristetyn FFPE kudoksista [21-25].

monistaminen EGFR, MET ja erbB2 ja sen suhdetta mutaatiofrekvenssi

lisäetu MLPA määritys on, että lisäksi mutaatioiden tunnistamiseksi, se myös tietoja suhteellinen kopiomäärä kaikista analysoitiin sekvenssit /antureista . Sen avulla karkea arvio osa havaittujen mutaatioiden analysoiduista näytteistä ja mahdollistaa havaitsemisen kopioluvun muutoksia (monistuksissa) on analysoitu geeneistä:

EGFR

,

MET

ja

erbB2

. Määrittely suhteellinen kopiomäärä 3-4 kuin ”voitto” ja ≥4 kuin ”vahvistus”, tunnistimme 12 (5%), 17 (7%) ja 2 (1%) näytteiden voitot ja 7 (3%) , 11 (5%) ja 3 (1%) näytteiden amplifikaatioita

EGFR

,

MET

, ja

ErbB2

, vastaavasti (S1 Taulukko ja Fig. 2 ). Jakauma kopioluvun amplitudi oli samanlainen kaikissa 3 geenejä, joilla on suurimmat monistuksiin yli 10 kappaletta. Kuten tapauksessa mutaatiot, havaitsimme paljon korkeampi taajuus

EGFR

voitot /monistukset naisilla kuin miehillä (18% vs. 2%, tässä järjestyksessä; p 0,0001). Samanlainen suuntaus ei havaittu

MET

(13% vs. 11%, vastaavasti), ja kääntynyt, mutta ei merkittävä suuntaus havaittiin

erbB2

(1% vs. 3%).

A) Esimerkkejä

EGFR

(näytteet v-vi),

MET

(näytteet vii-viii) ja

erbB2

(näytteet ix-x) vahvistus havaita EGFRmut + määrityksessä. B) ominaisuudet näytteiden

EGFR

,

MET

ja

erbB2

voitot /monistuksissa. Näytteet on esitetty kuviossa. 1D (ii-iii) ja kuviossa. 2A (vi-x) on esitetty ensimmäisessä sarakkeessa. Sukupuoli ja

EGFR

mutaatio tilan kunkin näytteen on esitetty toisen ja kolmannen sarakkeen, vastaavasti. Pylväät 4-6 esittävät kopiomäärä arvoja

EGFR

,

MET

ja

ErbB2

, vastaavasti. Tummansininen solut osoittavat monistuksissa (kopiomäärä ≥4), ja vaaleansininen solut osoittavat voitot (kopioluku 3-4). C) tiheys

EGFR

mutaatioita näytteissä, joissa

EGFR

vahvistus,

EGFR

voitto ja normaali

EGFR

kopioluvun.

Kuten kuviossa. 2, voitot ja amplifikaatioita

EGFR

,

MET

ja

ErbB2

olivat toisensa poissulkevia. Olemme kuitenkin havaittu erittäin vahvan yhteyden esiintymisen

EGFR

mutaatioita ja

EGFR

vahvistusta (Chi square testi trendin; p 0,0001). Yhtä lukuun ottamatta kaikki syöpä näyte (90%) ja

EGFR

vahvistusta ja 7 ulos 12 näytettä (58%) ja

EGFR

voitto oli

EGFR

mutaatio.

huolellinen tarkastelu MLPA tuloksia

EGFR

monistuksissa (katso esimerkit kuvassa. 1 ja Fig. 2) osoittaa, että signaali laskua MS- antureista ja signaalin lisäystä MS + antureista (osa mutatoidun kopiota) on suunnilleen sama tai jopa suurempi kuin kasvu

EGFR

kopioluvun. Tämä tulos viittaa siihen, että kaikki monistettu kopioiden

EGFR

mutantissa näytteet sisältävät mutaation (eli että vain mutanttialleelin läpi vahvistus), ja että mutaatiot esiintyvät varhain aiheuttava tapahtuma, mikä

EGFR

vahvistus hyötyä syövän. Huomaa, että kaikki näytteet sisältävät jonkin verran normaalia DNA, joka voi litistää havaitut kopiomäärä muutoksia ja naamio vaikutus näytteissä alemman tason vahvistusta.

Tämä havainto sai meidät sekvensoida eksonit 18-21 (koodaa tyrosiinikinaasidomeeniin) näytteissä, joissa

EGFR

voitot /monistuksia johon ei tunneta

EGFR

mutaatio löydettiin. Sekvensointigeelit analyysi ei paljastunut uusia kvenssivariantit joka voisi olla onkogeeniset mutaatioita tai laukaista

EGFR

vahvistusta.

Replikointi EGFR kopioluvun analyysi (vahvistus tunnistus) käyttämällä qPCR ja ddPCR

vahvista tulokset

EGFR

kopioluvun analyysi me analysoitiin uudelleen paneelin syöpänäytteissä, mukaan lukien kaikki näytteet, joissa

EGFR

vahvistus, jossa käytetään qPCR ja ddPCR. Molemmat menetelmät perustuvat täysin eri periaatteella kuin MLPA. QPCR on menetelmä hyödyntää reaaliaikaisen kvantifioinnin PCR-tuotteen, yleisimmin käytetty tarkastusta kopioluvun variantteja, jonka tunnuksena sekä normaali (ei-syöpä) ja syöpä näytteitä (esim. [26,27]). DdPCR on uusi kvantitointimenetelmä, joka perustuu absoluuttiseen laskenta testattujen ja viite DNA-molekyylejä, kloonaamalla monistettu tuhansissa vesi-öljy pisaran-reaktiot (emulsio PCR). Hyödyllisyys ddPCR kanssa EvaGreen dsDNA-sitova väriaine tarkkaan kopioluvun arvio äskettäin osoitettu useissa tutkimuksissa [18,19,28]. Käytön sekä qPCR ja ddPCR signaalit kahden testin-amplikonista, joka sijaitsee eksonissa 2 ja eksonissa 18

EGFR

, analysoitiin vastaan ​​signaalin ohjaus-amplikoni (vastaten MLPA koetin ctrl_1). Analyysi suoritetaan osoitti, että tulokset molempien qPCR ja ddPCR korreloivat erittäin hyvin suhteellinen kopiomäärä arvot määritetään käyttämällä MLPA (korrelaatiokerroin R = 0,941 ja R = 0,927, vastaavasti), ja että signaalit näytteiden

EGFR

vahvistus olivat hyvin erillään signaalien näytteistä ilman vahvistusta (S1 Kuva.). On kuitenkin huomattava, että sitä ei voida sulkea pois, että joitakin näytteitä rajatilaisesta kopioluku arvot voidaan luokitellut väärin. Joitakin eroja absoluuttisessa signaaliarvojen, määräytyy MLPA, ja viittaus menetelmät voivat johtua erilaisista sarjaa säätelyalueita käytetään normalisointia ja siitä, että MLPA on multiplex menetelmä ja se mittaa kopiomäärä useita kohtia olevan geenin kiinnostaa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin

MET

ja

erbB2-

(tuloksia ei ole esitetty).

Keskustelu

On hyvin tunnettua, että taajuus

EGFR

mutaatiot erilainen yhtäältä väestössä. Mutaatiofrekvenssi on korkein aasialaisilla (45-52%); pienempi eurooppalaisista (24%), Afrikkalainen amerikkalaiset (20%) ja latinot (17%); ja alhaisin White australialaiset (7%) ([11,29] ja viittaukset sisällä). Myös eurooppalaisten keskuudessa, eri taajuuksilla

EGFR

mutaatioita on raportoitu: esim. 17% Espanjassa [30] ja 10% Etelä-Saksassa [31]. Tässä tutkimuksessa perustuu kattavaan analyysiin huomattava määrä keuhkoadenokarsinooma näytteitä, olemme tunnettu ja määritelty taajuus

EGFR

mutaatioita Puola potilaalla (12,1%). Analyysimme osoitti paljon suurempi (4.8x) tiheys

EGFR

mutaatioita naisilla kuin miehillä (24% vs. 5%, tässä järjestyksessä). Havaitsimme tilanne on samankaltainen myös

EGFR

voitot /monistuksia, joka osoitti vieläkin suurempaa yliedustus (9x) naisilla kuin miehillä (18% vs. 2%, tässä järjestyksessä). Vaikka korkeampi taajuus

EGFR

mutaatioita naisilla kuin miehillä on havaittu monta kertaa aiemminkin, yliedustus

EGFR

mutaatioita naisilla havaittu tutkimuksessamme on, mukaan tietomme, yksi korkeimmista toistaiseksi raportoitu (pois lukien tutkimukset, joissa on hyvin pieni määrä näytteitä /mutaatioiden) ([11,29] ja viittaukset sisällä). Tieto asujaimisto- erityinen ominaisuus ja taajuus mutaatiot ovat tärkeitä epidemiologiset tekijöitä, jotka saattavat vaikuttaa asianmukaisilla diagnosoinnin ja hoidon menettelyjä optimaalisia erityisesti väestön.

Molecular syövän diagnosticians puuttua monipuolinen heterogeenisen kasvain materiaalia päivittäin. DNA eristetään kirurgisesti resektoitiin kasvaimista (tuore tai FFPE) ja ohuella neulalla ja endobronkiaalinen ultraääni transbronchial neula-ilmanotto soluissa. Kukin näistä histologisten tai Sytologisten näytteet voivat olla erilaisia ​​ja joskus hyvin alhainen PTC, ja ne on usein merkittävä määrä DNA hajoamista (erityisesti FFPE näytettä). Lisäksi formaliinia kiinnitys voi vahingoittaa DNA: ta ja aiheuttaa sekvenssimodifikaatioita. Kaikki nämä tekijät aiheuttavat erilaisia ​​esineitä, jotka voivat aiheuttaa sekä väärien positiivisten ja väärien negatiivisten tulosten.

Tässä tutkimuksessa testasimme EGFRmut + MLPA määritys (vakio-herkkyys menetelmä) kuin toisen tasomenetelmä ja verrattiin tuloksemme kanssa on validoitu hyvin kaupallinen RT-PCR-määritystä (erittäin herkkä menetelmä). Nämä kaksi menetelmät perustuvat täysin eri periaatteita. RT-PCR, mutaation havaitseminen perustuu hybridisaatio TaqMan mutaation-koettimia, mutta MLPA, mutaation havaitseminen perustuu ligaation ja sen jälkeen vahvistus villityypin tai mutaatio-spesifisiä koettimia. Tuloksemme osoittavat, että EGFRmut + on vankka määritys, joka osoittaa suurta toistettavuus, spesifisyys ja herkkyys. Pieni määrä havaitsematta mutaatioita oli joko eivät kuulu MLPA koettimia (n = 2), tai esiintyi näytteessä on alhainen PTC (n = 1). EGFRmut + määritys pystyimme havaitsemaan mutaatioita kaikenlaisia ​​näytteistä (Sytologisten ja histologinen, tuore ja FFPA) ja antoi meille mahdollisuuden havaita mutaatioita näytteitä eri PTC (20-90%). On kuitenkin huomattava, että MS + koettimet mahdollistavat vakaampi mutaation havaitseminen kuin MS- antureista tehdä ja että laatu MLPA tulosten yleensä alemmat syöpänäytteissä kuin ituradan DNA-näytteitä. Alempi laatu syöpä MLPA tulosten johtuu edellä mainitut ominaisuudet syöpänäytteissä ja on raportoitu ja käsitelty aiemmin [23-25,32]. Muita tekijöitä, jotka tekevät MLPA määritys houkutteleva kuin toissijaiset

EGFR

mutaation tunnistusmenetelmä ovat pieni määrä DNA: ta (50-100 ng) analyysi edellyttää (ei ylimääräisiä näytteen erottamista tai valmistusta tarvitaan, ja sama DNA-näyte voidaan käyttää sekä RT-PCR ja MLPA analyysi), lyhyt läpimenoaika ( 2 päivää), ja edullisia (noin $ 5 plus-alkukustannukset koetinsynteesimenetelmiä, noin $ 3.000) rakennetaan. Kun kyseessä on rutiininomaisesti käytetty määrityksissä, kustannukset koettimen synteesi voidaan jättää huomiotta, koska määrä syntetisoitu koettimien riittää satoja tuhansia analyysejä.

Lisäksi

EGFR

mutaation havaitseminen The EGFRmut + määritys mahdollistaa myös havaitsemisen

EGFR

,

MET

ja

erbB2

vahvistusta. Vaikka tiedot eivät ole ratkaisevia, on ehdotettu, että

EGFR

vahvistus voi olla merkki tai muokkaaja herkkyys TKI hoitoon (tarkistetaan [11]).