Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

T-solu immunoglobuliini-3 (TIM-3) on perustettu negatiivisena säätelymolekyyli ja sillä on keskeinen rooli siedätyshoitoa. TIM-3 on yliaktiivista loppuun CD8

+ T-solut sekä krooninen infektio ja kasvain. Kuitenkin luonteeltaan TIM-3

+ CD4

+ T-solujen kasvain mikroympäristössä on epäselvä. Tämä tutkimus on kuvata TIM-3 ilmentävien lymfosyyttien sisällä ihmisen keuhkosyöpää kudoksia ja vahvistaa kliininen merkitys TIM-3 ilmentymistä keuhkosyövässä etenemiseen.

Menetelmät

Yhteensä 51 ihmisen keuhkosyövän kudosta näytteet saatiin patologisesti vahvistettu ja vasta diagnosoitu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla. Valkosolujen kasvainkudoksista, distaalinen normaalin keuhkojen kudoksiin, ja ääreisverenkierron mononukleaariset solut (PBMC: t) analysoitiin TIM-3: n pinnalla ilmenemisen virtaussytometrialla. TIM-3 ilme kasvaimen-tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) korreloi kliinis parametreja.

Johtopäätökset

TIM-3 on erittäin säädelty sekä CD4

+ ja CD8

+ TIL ihmisen keuhkosyövän kudoksissa, mutta mitättömän ilmentyy T-solujen potilaiden perifeerisen veren. Taajuudet IFN-γ

+ solut vähennetty TIM-3

+ CD8

+ TIL verrattuna TIM-3

-CD8

+ TIL. Kuitenkin taso TIM-3 ilme CD8

+ TIL jättänyt liittää kliinisiä patologisia parametri. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että noin 70% TIM-3

+ CD4

+ TIL ilmaisi FOXP3 ja noin 60% FOXP3

+ TIL olivat TIM-3

+. Tärkeää on, TIM-3 ilme CD4

+ T-solut korreloivat huono kliinis parametrien NSCLC kuten solmukohtien etäpesäkkeitä ja edennyt syöpä vaiheissa. Tutkimuksemme osoittaa uusi rooli TIM-3 tärkeänä immuuni säädin kasvaimen mikroympäristössä kautta hallitseva ilmaisun säätelijä-T-soluissa.

Citation: Gao X, Zhu Y, Li G, Huang H, Zhang G Wang F, et ai. (2012) TIM-3 Expression luonnehtii Regulatory T Cells tuumorikudok- sissa ja liittyy Lung Cancer Progression. PLoS ONE 7 (2): e30676. doi: 10,1371 /journal.pone.0030676

Editor: Michael P. Bachmann, Carl-Gustav Carus tekninen yliopisto-Dresden, Saksa

vastaanotettu: 13 lokakuu 2011; Hyväksytty: 20 joulukuu 2011; Julkaistu: 17 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Gao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuetaan osittain NSFC (National Natural Science Foundation of China) myöntää 30528008, ohjelma Changjiang Tutkijat ja Innovative Research Team University (IRT0849) ja rahoittama Priority Academic ohjelmasuunnitteluosastolle Jiangsu Higher Education Institution (papD) (BL ja XZ). BL osittain tukee nuorten tutkijoiden palkinnon Cancer Research Institute ja University of Pittsburgh Startup rahastoon. QY tukee Yksitoista-viidennen Mega-Scientific Project ”ehkäisyyn ja hoitoon AIDS, virushepatiitti ja muiden tarttuvien tautien” (2008ZX10003-012). GL ja XG tukee apurahan China Scholarship neuvosto. YZ tukee NSFC avustuksen 31170866, Jiangsu Luonnontieteiden Fund BK2011289 ja Suzhoun sosiaalisen kehityksen Project (SYS201009). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kasvain kehitys indusoi kasvainten vastainen immuunivaste. Tyypin 1 adaptiivista immuunivastetta, välittävät Th1-solut ja CTL-, uskotaan olevan tärkeä osa, soluvälitteisen immuniteetin syöpää vastaan ​​[1]. Se on vakiintunut, kuitenkin, että monet kasvain infiltroivia T-solut ovat tilassa ei vastata, koska immunosuppressivisia kasvain mikroympäristölle [2], [3]. Säätelijä-T-solujen ja sammuminen efektori-T-solujen ajatellaan olevan kaksi T-solun sisäisiä mekanismeja, jotka tekevät tehottomiksi anti-kasvain immuunivasteet [2], [4], [5]. Useita molekyyli polkuja, kuten TGFli, IL-10, jäsenet B7 perheen, ovat mukana perustamassa valtion immunosuppression sisällä kasvain [2], [6], [7], [8]. Ymmärtäminen roolia uusien immuuni estävä reittejä välittämisessä immuunitoleranssia kasvaimen mikroympäristössä pitäisi auttaa parantamaan syövän immunoterapiassa.

TIM-3 ilmentyy Th1, Th17 soluja, ja CD8 T-soluja, mutta ei Th2-solujen [9], [10], [11]. Vuorovaikutusta TIM-3 ja sen ligandi galektiini-9 inhiboi Th1 ja Th17 vasteet [12] ja indusoi perifeeristen toleranssi [13], [14], joka tukee inhiboiva rooli TIM-3 T-solujen vasteita. TIM-3 ilmaisu myös tunnistaa loppuun T-solujen aikana krooninen infektio. TIM-3-ilmentävät CD4

+ ja CD8

+ T-solut tuottavat pienempiä määriä sytokiiniä tai vähemmän proliferatiivinen vastauksena antigeeni. Salpaus TIM-3-signalointireitin palauttaa proliferaatiota ja lisää sytokiinin tuotantoa HIV-1-spesifisten T-solujen [15]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat tukeneet tärkeä rooli TIM-3 T-solujen sammumista syövässä. Tim-3 ja PD-1, toinen merkkiaine T-solujen uupumus, ovat kspressoituvat CD8 TIL hiirissä, jotka kantoivat siirrettyjen kasvainten sekä NY-ESO-1-CD8

+ T-solut potilailla, joilla on edennyt melanooma [4], [5]. TIM-3

+ PD-1

+ T-solut osoittavat vakavin loppuun fenotyypin määritelty epäonnistuminen lisääntyä ja tuottaa IL-2, TNF ja IFN-γ. Blockade Sekä Tim-3 ja PD-1 polkuja on tehokkaasti valvoa kasvaimen kasvua kuin kumman tahansa reitin yksin, mikä viittaa näiden kahden reitin toimivat synergistisesti perustamisessa T-solujen uupumus [4], [5].

tässä tutkimuksessa olemme tutkineet TIM-3 ilmentyminen TIL yhdessäkään pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Olemme havainneet, että TIM-3 ilmentyy sekä CD4

+ ja CD8

+ TIL keuhkosyövässä kudoksissa. Sekä TIM-3

+ CD4

+ ja TIM-3

+ CD8

+ T-solut tuottivat paljon alhaisempia IFN-γ verrattuna in TIM-3

CD4

+ ja TIM-3

-CD8

+ T-soluissa. Mielenkiintoista, TIM-3 ilme CD4

+ T-soluja, mutta ei CD8

+ T-solut korreloivat huono kliinis parametrien NSCLC kuten solmukohtien etäpesäkkeitä ja edennyt syöpä vaiheissa. Silmiinpistävän, noin 70% TIM-3

+ CD4

+ TIL ilmaisi FOXP3 ja noin 60% FOXP3

+ TIL olivat TIM-3

+. Sen sijaan, TIM-3 oli minimaalisesti ilmaistu reuna-CD4

+ T-solut, Tregs, ja CD8

+ T-soluja. Nämä tiedot viittaavat siihen uutta roolia TIM-3 in kasvaimeen liittyvä säätelijä-T-solujen ja sen merkitys ihmisen syövän etenemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

valinta kudosnäytteiden

yhteensä 51 keuhkosyövän kudosnäytteet saatiin patologisesti vahvistettu ja vasta diagnosoitu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla, jotka saivat toimimasta lokakuu 2009 toukokuuhun 2011 Cardiothoracic Kirurgian osasto First Affiliated sairaala, Soochow University esillä olevassa tutkimuksessa . Lisäksi 51 tapauksessa vierekkäisten normaaleissa kudoksissa ei-pahanlaatuinen osa resekoitiin ja valittiin valvontaa. Normaali kudokset olivat vähintään 5 cm päässä näkyvissä kasvainmassan. Autologinen perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC: t) eristettiin kokoverestä Ficoll tiheysgradienttisentrifugoinnilla ennen käyttöä. Tutkimus hyväksyi eettinen komitea ensimmäisen Affiliated sairaala Soochow yliopistosta. Aineisto analysoitiin anonyymisti ja tietoinen suostumus ei ollut tarpeen.

Harvest kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) B

Tuumorikudos ja viereisen normaalia kudosta samalta potilaalta jauhettiin ja pilkottiin Kollagenaasikäsittelyn ratkaisu (1 mg /ml kollagenaasia IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) RPMI 1640) 37 ° C: ssa 45 min. Palaset siirrettiin sitten teräksen mesh ja yksisolususpensioita saatiin mekaanisella jauhaa. TIL puhdistettiin edelleen kaltevuus kohti valmistaja protokollaa, pestiin ja suspendoitiin uudelleen Hankin median erilaisten analyysien.

Hiiret

6-8-viikkoisen naaras-C57BL /6-hiiriä käytetään kasvaimen kokeissa. Kaikkia eläimiä ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa eläimen laitos yliopistossa Pittsburgh tai Soochow University. Kaikki eläin työ on hyväksynyt toimielimen eläinten hoidon ja käytön komitea yliopiston Pittsburgh (protokolla numero 0906824). Kasvaimen mallin kokeita, hiiret altistettiin 2 x 10

5 B16F0-soluja i.d. ja kasvaimen näytteet poistettiin analyysiä varten noin päivänä 20, kuten aiemmin on kuvattu [16].

In vitro T-solujen stimulaation

naiivit T-solut puhdistettiin PBMC: istä terveiden luovuttajien käyttäen heikentävien anti-CD45RO-vasta-aineen ja Stemsep® ihmisen T-solujen rikastaminen kit (StemCell tekniikat, Vancouver, Brittiläinen Kolumbia, Kanada). Puhtaus T-solujen oli yli 90%. Soluja stimuloitiin 1 ug /ml levyyn sidotun anti-CD3: n (klooni OKT3) ja 2 ug /ml levyyn sidotun anti-CD28-mAb: iden ja jopa 72 tuntia.

eristämiseen Tregs, PBMC: t värjättiin fykoerytriini-syaniini Dye7 (PECY7) konjugoidulla anti-CD4 mAb (RPA-T4) ja anti-CD25 fykoerytriini (PE) (BC96). MoFlo sytometrillä (Beckman-Coulter, Brea, CA USA) käytettiin eristämään CD4

+ CD25

korkea soluja. Nämä solut stimuloitiin sitten anti-CD3 (1 ug /ml) ja anti-CD28: lla (2 ug /ml), kun läsnä on IL-2 (200 U /ml, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA). 24, 48, ja 72 tuntia myöhemmin, solut kerättiin tarkempaa analysointia varten.

Vasta-aineet ja virtaussytometrinen analyysi

Suoraan konjugoitu anti-humaani-vasta-aineita seuraavia pintamolekyylien käytettiin: anti-CD4 (RPA-T4) ja anti-CD8 (RPA-T8) saatiin Beckman Coulter. Anti-TIM-3 (344823), anti-PD-1 (2H7), ja anti-CD25 (BC96) ostettiin R & D Systems. Seuraavia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä hiiren antigeenejä hankittiin eBioscience (San Diego, CA, USA): CD4 (GK1,5), CD8 (53-6.7), Tim-3 (RMT3-23) ja Foxp3 (FJK-16s) . Virtaussytometrinen analyysi tehtiin käyttämällä FACS virtaussytometria.

solunsisäisen sytokiinin värjäystä, ihmisen TIL kerättiin keuhkosyöpä näytteistä, stimuloitiin levyyn sidotun anti-CD3-mAb: t (1 ug /ml) ja levyjä sidottua anti-CD28-mAb: t (2 ug /ml) 16 tunnin ajan ja inkuboitiin viimeiset 3 tuntia Brefeldin A: n (10 ug /ml, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Solut siirrettiin V-pohjalevy, värjättiin anti-CD4 tai anti-CD8 Hankin puskuria (joka sisälsi 1% FCS), kiinnitettiin sitten kiinnittäminen väliaineessa, minkä jälkeen läpäiseväksi väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) . Seuraavaksi solut värjättiin anti-IFN-γ-vasta-ainetta (4S.B3, Biolegend, San Diego, CA, USA). Solut, jotka tuottavat IFN-γ tutkittiin virtaussytometrillä.

analyysi FOXP3 ilmaisun, TIL ensin värjättiin anti-CD4-PECY7, anti-CD25-PECY5 ja anti-TIM-3-PE tai anti Pd-1-PE, kiinnittämisen ja permeabilisaation jäl-, soluja inkuboitiin FITC-konjugoidun anti-humaani-FOXP3 (259D, BioLegend, San Diego, CA, USA), joka perustuu valmistajan suositusten ja alistettiin virtaussytometria-analyysi.

tilastollinen

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism 5.0 ohjelmistopaketti (GraphPad Software, Inc., San Diego, USA). Studentin t-testi, yksisuuntainen ANOVA ja pienin merkitsevä ero (LSD) -t testiä käytettiin tarvittaessa. P-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävinä.

Tulokset

Koska TIM-3 on osallisena T-solujen uupumus, päätimme tutkia sen ilme TIL keuhkosyövässä yksilöitä. Valkosolujen kasvainkudoksista, distaalinen normaalin keuhkojen kudoksiin, ja PBMC: t analysoitiin TIM-3: n pinnalla ilmenemisen virtaussytometrialla. Ei-spesifistä värjäytymistä kontrolloitiin isotyypin kontrolli-IgG-vasta-ainetta (kuvio S1). Enemmän kuin 90% CD4

+ solut olivat positiivisia CD3- jälkeen, kun puhdistusmenetelmä ja valinta lymfosyyttien portin aikana virtaussytometria-analyysin. Meidän keuhkosyöpä potilasryhmässä, olemme havainneet, että TIM-3 ilmentyi keskimäärin noin 30% CD4

+ TIL ja CD8

+ TIL (kuvio 1A ja 1B). Prosenttiosuus TIM-3

+ CD4

+ ja TIM-3

+ CD8

+ TIL distaalisessa normaalin keuhkojen kudoksia pienentää noin 18% ja 15% vastaavasti (kuva 1A ja 1B) . Sen sijaan, oli vähäinen ekspressio TIM-3 T-solut veren näistä potilaista (kuvio 1A ja 1 B). Siksi TIM-3 ilmentyminen oli nimenomaan säädelty T-soluissa normaalissa keuhkojen kudoksia ja edelleen lisääntynyt syöpäkudoksessa. Tuore raportti osoitti, että PBMC eristetään kehittynyt melanoomapotilaalla, murto-osa PD-1

+ NY-ESO-1-CD8

+ T-solujen koekspressoi TIM-3 ja PD-1 ja näiden solut olivat huonosti kuin TIM-3

Pd-1

+ ja TIM-3

Pd-1

– kollegansa [4]. Sitten tutki PD-1 ja TIM-3 ilme TIL keuhkosyöpään kudoksista. PD-1 ilmentyi yli 65% TIL: issä sekä normaalin ja syövän keuhkojen kudoksiin (kuvio 1C). Suurin osa TIM-3

+ TIL olivat PD-1

+ keuhkoissa kudoksissa. Sitä vastoin 10% T-solujen periferaalisen veren olivat positiivisia PD-1 (kuvio 1C). Niinpä huomasimme, että suuria määriä TIM-3

+ PD-1

+ T-solut rikastuneet keuhkosyöpä kudoksissa. Tämä on sopusoinnussa sen kanssa, että monet T-solujen syöpä kudoksiin ovat vääristyneet todennäköisesti johtuu sammumiseen tai anergiaan.

Kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) kerättiin keuhkosyöpään kudoksista, viereisten normaaleissa kudoksissa, ja ääreisverenkierron monouclear solut (PBMC: t) kokoverestä potilailla. Sitten solut värjättiin CD4, CD8, TIM-3 ja PD-1. A. Edustavia dot-tontteja osoittavat TIM-3 ilme CD4

+ ja CD8

+ T-solujen eri kudoksissa keuhkosyöpäpotilaita. Lymfosyytit aidatulla analysoitaessa CD4 ja CD8 T-soluja. Enemmän kuin 90% CD4

+ tai CD8

+ -soluja CD3

+. B. Yhteenveto tuloksista prosenttiosuus (%) TIM-3 ilme CD4

+ ja CD8

+ T-solujen keuhkosyöpäpotilaiden näkyvät. Rekit kuvaavat keskimääräinen prosenttiosuus TIM-3 ilme CD4

+ ja CD8

+ T-soluja. Virhe palkit: s.e.m. C. Dual ilmentyminen TIM-3 ja PD-1 aidatulla CD4

+ ja CD8

+ T-solujen on esitetty. P-arvot laskettiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA.

Koska on osoitettu, että antigeenispesifisen TIM-3

+ CD8

+ T-solut ovat toiminnallisesti loppuun kroonisen infektio ja syöpäpotilailla, päätimme tutkia, TIM-3 merkitty myös huonosti T-solujen TIL keuhkosyövässä kudoksissa. TIL-soluja stimuloitiin anti-CD3: lla ja anti-CD28: ssa 16 tuntia ja analysoitiin IFN-γ tuotannon virtaussytometrialla. Olemme havainneet, että keskimäärin 5% TIM-3

-CD8

+ TIL ovat IFN-γ

+ upon ex vivo stimulaatio anti-CD3 (kuvio 2A, 2C). Sen sijaan, taajuus IFN-γ tuottajien väheni merkittävästi TIM-3

+ CD8

+ TIL (kuvio 2A, 2C). Siten meidän tiedot ovat sopusoinnussa ajatus, että TIM-3 pistettä funktionaalinen sammuminen CD8 T-solujen ihmisen syövän kudoksissa, vuonna säilytettävä viimeisten tietojen avulla elinsiirtoa hiiren kasvainmuoto [5].

TIL kerättiin keuhkosyöpä kudosta. Sitten soluja stimuloitiin levyyn sidotun anti-CD3-mAb: t (1 ug /ml), ja levyyn sidotun anti-CD28-mAb: t (2 ug /ml) 16 tunnin ajan ja inkuboitiin viimeiset 3 tuntia Brefeldin A: n (10 ug /ml ). Solut tuottavat IFN-γ tutkittiin solunsisäisen sytokiinin värjäystä ja virtaussytometria. (A ja B). Edustavia pistekuvioita yhdeltä potilaalta osoitti prosenttiosuus TIM-3

+ IFN-γ

+ ja TIM-3

IFN-γ

+ sisällä CD8

+ tai CD4

+ T soluosastoon. Esitetyt tiedot edustavat kuutta toisistaan ​​riippumatonta koetta. C. keskimääräinen prosenttiosuus IFN-γ tuottavien CD8

+ tai CD4

+ T-solujen joukossa TIM-3

+ ja TIM-3

– jakeet on esitetty.

lisäksi CD8

+ TIL, TIM-3 todettiin ilmentyy CD4

+ TIL ihmisen keuhkosyöpä (kuva 1) sekä hiiren istutetut kasvain [5]. Tim-3 myös ilmentyy voimakkaasti Th1 ja Th17 solujen ja tärkeitä toiminnan estäminen näiden solujen [10]. Olipa TIM-3 pistettä CD4

+ T-solu toimintahäiriö ei kuitenkaan ole varmaa. Sen jälkeen määritetään selvittämällä taajuus IFN-γ tuottavien CD4

+ TIL suhteen TIM-3 pinnalla ilmaisua. Olemme löytäneet noin 2% TIM-3

CD4

+ TIL olivat IFN-γ tuottajien upon ex vivo stimuloimalla anti-CD3 (kuvio 2B). Sen sijaan prosenttiosuus IFN-γ

+ solujen väheni merkittävästi TIM-3

+ CD4

+ TIL (kuvio 2B ja 2C).

On hyvin tunnettua, että sääntelyn T-solut ovat vallitseva populaatio CD4

+ T-solujen joukossa TIL [3]. Koska Tregs ovat myös toiminnallisesti anergiseksi, päätimme sitten onko TIM-3 ilmentyy säätelijä-T-solujen joukossa TIL käyttäen FOXP3 kuin merkki. Yllätykseksemme joskin noin 17% CD4

+ TIL olivat FOXP3

+ Tregs, noin 70% TIM-3

+ CD4

+ TIL olivat FOXP3

+ (Fig. 3A). Lisäksi noin 60% FOXP3

+ CD4

+ TIL ilmaistu TIM-3 niiden pinnoilla (Fig. 3A). Siten TIM-3

+ CD4

+ T-solut olivat pääasiassa Tregs ja useimmat Tregs kuluessa keuhkosyöpään TIL erittäin säädelty TIM-3 ilme. Mukaisesti nämä tiedot, kaikki FOXP3

+ CD4

+ TIL ilmaista PD1 (Fig. 3B). Toisin kuin korkean ilmentymisen TIM-3 TIL, minimaalinen ekspressio TIM-3 löydettiin ole tavanomaisten T-solujen eikä Tregs perifeerisen veren (tuloksia ei ole esitetty).

TIL kerättiin keuhkosyöpä kudosta. Sitten solut värjättiin CD4, TIM-3, ja FOXP3 (A) tai CD4, PD-1 ja FOXP3 (B). Lymfosyytit aidatulla analysoitaessa CD4 ja CD8 T-soluja. Prosenttiosuus kunkin populaation sisällä CD4

+ T soluosastoon osoitettiin. Esitetyt tiedot edustavat viittä riippumatonta koetta.

Koska TIM-3 osoitettiin voimistuvan T-soluissa in vitro -viljelyn läsnäollessa TCR stimulaation [10], päätimme tutkia Tregs voitaisiin edistää ilmaista TIM-3. Kontrollina, ihmisen CD4

+ ja CD8

+ T-soluja stimuloitiin anti-CD3: lla ja anti-CD28: ssa 72 tuntia. 24 tunnin välein, tutkimme TIM-3 ja PD-1 ilme. Sekä PD-1 ja TIM-3 oli voimistunut noin 48 tuntia ja edelleen ylös-säänneltävä 72 h sekä CD4

+ ja CD8

+ T-solut (Fig. 4A ja 4B). Sitten testataan onko TIM-3 voi olla samalla säädellään ylöspäin säätelijä-T-soluissa. Me rikastettu ihmisen Tregs eristämällä CD4

+ CD25

high T-solujen fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS). Sitten me stimuloi nämä T-solut anti-CD3: n ja anti-CD28: n läsnä ollessa IL-2: ssa 72 tuntia. Ilmaisu TIM-3 ja FOXP3 tutkittiin 48 h ja 72 h. TIM-3 ilmentyy vähäpätöinen sekä stimuloimattomissa naiivi CD4

+ T-solujen ja Tregs (tietoja ei ole esitetty). Verrattuna stimuloimattomasta T-soluihin, TIM-3 ilmentyminen oli merkitsevästi ajan säännelty 48 tuntia ja vielä nostaa 72 h (Fig. 4C). 72 h noin 25% FOXP3

+ T-solut olivat TIM-3-positiivisia (Fig. 4C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että TIM-3 on säädelty sekä perinteiselle T-soluissa ja Tregs stimuloitaessa TCR: n kautta.

(A ja B). Ihmisen naiivi T-solut puhdistettiin PBMC terveyden luovuttajien. Sitten soluja stimuloitiin levyyn sidotun anti-CD3 ja anti-CD28-mAb: llä. 24, 48 ja 72 tuntia myöhemmin, solut kerättiin ja värjättiin CD4, CD8, TIM-3 ja PD-1. Ekspressio PD-1 ja TIM-3 analysoitiin virtaussytometrialla porteilla CD4

+ (A) tai CD8

+ (B) T-soluja. C. CD4

+ CD25

high T-solut oli eristetty ääreisveren FACS. Nämä solut stimuloitiin sitten anti-CD3 ja anti-CD28: n läsnä ollessa IL-2 (200 U /ml). 24, 48 ja 72 tuntia myöhemmin, solut kerättiin ja värjättiin CD4, TIM-3 ja FOXP3. Ilmaisu TIM-3 CD4

+ FOXP3

+ T-solujen on esitetty. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Koska TIM-3 ilmentyy voimakkaasti TIL eristettiin keuhkosyöpää kudoksista, me määritetään sitten onko TIM-3 ilmaisu oli kliinistä merkitystä korreloimalla TIM-3 lauseke kliinisiä patologisia parametreja. Olemme löytäneet prosenttiosuus CD4

+ ja CD8

+ T-solujen sisällä TIL ei liittynyt kliinisiä patologisia parametreja. Suhde CD4 versus CD8 myöskään osoittanut mitään kliinistä merkitystä (taulukko 1). Lisäksi, taajuus TIM-3 CD8-T-solut eivät osoittaneet mitään kliinistä merkitystä (taulukko 2). Sen sijaan korkeampi taajuus TIM-3

+ CD4

+ TIL osoittivat merkittävää yhteyttä imusolmuke etäpesäke ja kehittyneempi syöpä vaiheessa (taulukko 2). Siten TIM-3 ilme CD4

+ TIL liittyy keuhkosyöpään etenemiseen.

Lisäksi ihmisen FOXP3

+ TIL, selvitimme Tim-3 ilme hiiren Foxp3

+ TIL. Käytimme B16 malli, koska Tim-3

+ CD4

+ TIL äskettäin kuvattu tässä mallissa [5]. Sisällä B16 kasvain, löysimme noin 50% Foxp3

+ CD4

+ TIL ilmaistu Tim-3 (Fig. 5). Sen sijaan Foxp3

CD4

+ TIL ilmaistuna vähäinen tasoja Tim-3 (Fig. 5). Tim-3 ilmentyi minimiverotasot pernassa ja imusolmukkeissa CD4

+ T-solujen riippumatta Foxp3 ilmaisun (Fig. 5). Siten Tim-3 on pääasiassa läsnä osajoukko Foxp3

+ CD4

+ säätelijä-T-solujen sekä ihmisen ja hiiren kasvaimissa.

6-8 viikon ikäiset C57BL /6-hiiriä ympättiin 2 x 10

5 B16F0-solujen id, kasvainnäytteet, perna, ja imusolmukkeet poistettiin, kun kasvainten koot oli noin 15 mm halkaisijaltaan päivänä 20. TIL pernasoluja, ja imusolmukkeiden solut eristettiin analyysiä varten virtaussytometrillä cytometry. Tim-3 ilme hiiren CD4

+ Foxp3

+ tai CD4

+ Foxp3

– T-soluissa esitetään. Esitetyt tiedot edustavat viittä riippumatonta koetta.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tutkimme TIM-3 ilmentymisen TIL: issä NSCLC yksilöitä. Löysimme korkeita TIM-3 ilme sekä CD4

+ ja CD8

+ TIL. Tärkeää on, vaikka TIM-3 pinta ilme on raportoitu osoittavan toiminnallisesti anergiseksi tila CD8

+ TIL, huomasimme, että TIM-3 ilme CD8

+ TIL jättänyt yhdistää kliinis parametrit keuhkosyöpä, kuitenkin taajuus TIM-3 ilme CD4

+ TIL ei liittävät imusolmuke etäpesäke ja kehittyneempiä syövän vaiheessa. Tarkempi analyysi paljasti, että TIM-3

+ CD4

+ T-solut olivat pääasiassa FOXP3

+ ja valtaosa FOXP3

+ CD4

+ T-solut ilmaisivat TIM-3. Tutkimuksemme osoittaa uusi rooli TIM-3 kasvaimen mikroympäristössä kautta hallitseva ilmaisun säätelijä-T-soluissa.

On mielenkiintoista, että olemme löytäneet ilmentymistä TIM-3 suuri osa Tregs sisällä keuhkosyövän kudoksiin. Meidän data mining paljasti myös, että Tim-3-mRNA ilmentyi luonnon Foxp3

+ CD4

+ T-soluja, jotka on adoptiivisesti siirretty Rag1 hiirissä ja Foxp3 tarvitaan Tim-3: n ekspressio näissä Treg-soluja (kuvio S2) [17], mikä viittaa siihen, Tim-3 ilmentymisen Tregs saattaa olla olennainen osa Foxp3-säänneltyjen verkon sisällä luonnollinen Tregs. Olemme lisäksi osoittaneet, että TIM-3 ei ilmentävät konstitutiivisesti Tregs ihmisen ääreisverenkierron mutta voidaan indusoituu TCR stimulaation. Syy siihen, että TIM-3 ilmentyy voimakkaasti FOXP3

+ CD4

+ TIL ehkä johtuen jatkuvasta stimulaatiosta kasvaimeen liittyviä antigeenejä sisällä kasvainpaikkaa.

tarkka rooli TIM-3 kasvain soluttautuminen Tregs ei ole vielä tiedossa. Tuloksemme viittaavat siihen, että TIM-3

+ Tregs keuhkosyövässä kudoksia voidaan saada luonnollisista Tregs kroonista TCR stimulaation kasvaimen antigeenejä. PD-1-ligandi B7-H1 ja TIM-3 ligandit kuten galektiini-9 ja apoptoottisten solujen kasvainkudoksen voi olla tärkeää säilyttää lukumäärä ja tehtävät TIM-3

+ PD-1

+ Tregs. Elinsiirtoketjussa ympäristössä, Tim-3 osoitettiin säännellä allospesifinen Treg aktivointi [14]. Osoitettiin, että Tim-3-Tim-3L-herkkä polku oli mukana toiminnallinen sukupolven luovuttajaspesifinen Tregs annettaessa toleranssia kasvattava hoitojen [14]. Tämän mukaisesti ajatuksen, Tim-3 on viime aikoina raportoitu ekspressoituvan noin 15% Foxp3

+ Treg soluja pernassa aikana allo-elinsiirron [18]. Tutkimuksemme, paljastamalla korkea TIM-3 ilme Tregs sisällä ihmisen kasvain, viittaa siihen, että TIM-3 saattaa olla suora rooli toiminnallisen kypsymisen kasvaimen soluttautua Tregs toimittamalla signaalin sisällä Tregs tai voi olla tärkeää säilyttää immunosuppressiivisen tehtävä näiden Tregs kasvaimen mikroympäristössä.

lisäksi luonnollinen Tregs, TIM-3 ja PD-1 voi myös olla rooli sukupolven mukautuva Tregs. Itse asiassa, PD-1-ligandi on osoitettu olevan osallisena sukupolven adaptiivisen Tregs kasvaimen tyhjennys imusolmukkeiden [19]. Galektiini-9: n osoitettiin vaatimattomasti lisätä Foxp3 ilmentymistä in vitro mallissa Tregs induktion TGF-β [18], [20]. Olipa Tregs löytyy meidän tutkimuksissa mukautuva tai luonnollista Treg tehdään lisätutkimuksia.

TIM-3 on tullut lupaava kohde syövän immunoterapiassa [21]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat keskittyneet roolista TIM-3 ilme CD8

+ T-solut ääreisverenkierron sekä kasvaimiin [4], [5]. Nämä tutkimus elegantisti osoittivat, että TIM-3 pistettä toiminnallisesti loppuun CD8

+ T-solujen ja todennäköisesti vastuussa epäonnistumisesta immuunitutkimusohjelmasta ja kasvaimen rokotuksen. Tutkimuksemme osoittaa, että ilmentyminen TIM-3 CD4

+ TIL-solujen merkitsevästi yhteydessä huonompi kliinisiä patologisia parametreja keuhkosyöpä. Siksi TIM-3 todennäköisesti merkittävä rooli tuumorin etenemisessä ylläpitämällä kasvain immunosuppressiivisen ympäristöön Tregs. Edelleen luonnehdinta TIM-3 ilmentymistä ja toimintaa erilaisissa TIL alaryhmiä pitäisi parantaa tietämystä taustalla mekanismeja TIM-3-välitteisen immunosuppressio sisällä kasvain mikroympäristön.

tukeminen Information

Kuva S1.

TIM-3: n ekspressio virtaussytometrialla. Kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) kerättiin keuhkosyöpä kudoksista, vieressä normaaleissa kudoksissa, ja perifeerisen veren monouclear solut (PBMC: t) kokoverestä potilailla. Sitten solut värjättiin CD4 ja TIM-3 tai CD4 plus kontrolli IgG-vasta. Solujen lymfosyyttien portin analysoitiin edelleen CD4 ja TIM-3: n ekspressio.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0030676.s001

(PPT)

Kuva S2.

Tim-3 ilmentymistä natiivi Tregs ja riippuvuutta Foxp3. NCBI GEO profiilitietokanta tiedustellessa Tim-3 ilmentymisen Tregs. Yksi tulos osoitti, että Tim-3 on säädellä vähentävästi Foxp3 puutteellinen natiivi Tregs kuten kuvassa. DataSet Record GDS2525.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0030676.s002

(PPT) B

Kiitokset

Tekijät Kiitokset Drs. Olivera Finn, Larry Kane, ja Lujun Chen lukemiseen käsikirjoituksen ja hyödyllistä keskustelua.