Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Terapeuttinen vasta-kehitys on yksi nopeimmin kasvavia alueita lääketeollisuudessa. Tuottavan laadukkaita monoklonaalisia vasta-aineita tiettyä terapeuttinen tavoite on ehto menestyksekkäälle lääkekehityksessä. Kuitenkin, koska immuunisieto, mikä vaikeuttaa tuottaa vasta-aineita käyttäen tavanomaisia ​​lähestymistapoja.

Menetelmät /Havainnot

Mixed neljä ihmisen mahasyövän (GC) solulinjoja käytettiin immunogeeninä A /J hiirillä; kuusitoista erittäin positiivinen hybridoomapesäkkeitä valittiin kautta fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu-tehoseulonnan (FACS-HTS) käyttäen yhteensä 20.000 siirtomaiden kuusikymmentäseitsemän 96-kuoppalevyille vastaan ​​eläviä soluja (mixed ihmisen GC soluja versus ihmisen PBMC valvontaa). MS17-57 ja hallita kaupallisia alkalisella fosfataasilla (ALP) mAb: itä käytettiin vahvistamaan kohdeantigeeneja (Ags), joka tunnistettiin Alpit ilmentyy GC solun pinnalla yhdistämällä Western blot, immunosaostus ja massaspektrometriaa (MS).

MS tunnistaa Ags tunnustettu MS17-57 olevan kaksi variantteja eritetyn ALP, palp ja IALP (istukan ja suoliston ALP). Nämä proteiinit kuuluvat hydrolaasientsyymivalmistetta perheen vastaa fosfaatin poistamisek- ryhmiä monenlaisia ​​molekyylejä. Immunofluoresenssivärjäyksen käyttäen MS17-57 osoitti suurempi värjäytymisen ruoansulatuskanavan (GI) syöpä kudoksiin verrattuna normaaliin GI kudoksiin (

P

0,03), ja vahvisti sitoutuminen MS17-57 rajoittuvan toimiva epitooppi ilmentyy syöpäsolun pinnalla. Proliferaatiomääritykset käyttäen palp /IALP ilmentävien GC solulinjojen osoitettiin, että MS17-57 esti solukasvun 32 ± 8%. TranswellTM solumigraation määrityksissä dokumentoitu, että MS17-57 voi estää palp /IALP ilmentävä GI syöpäsolun muuttoliikettä 25 ± 5%. MS17-57 mAb inhiboi kasvaimen kasvua nude-hiirissä.

Johtopäätökset

havainnot osoittavat, että palp ja IALP voidaan ektooppisesti ilmentyy soluväliaineen GI syöpiä, ja että MS17-57 suunnattu palp /IALP voi estää GI syöpäsolujen kasvua ja maahanmuutto

vitro

ja

vivo

. Tämä tutkimus tarjoaa esimerkin tunnistamisen syöpä biomarkkereita edustaa lupaavaa terapeuttista tavoitteet käyttäen mAb saaduilla uudenlainen HTS tekniikkaa.

Citation: Li M, Gao J, Feng R, Wang Y, Chen X, Sun J, et al. (2013) Monoklonaalisten vasta-MS17-57 kohdistus erittyvää alkalista fosfataasi ektooppisesti ilmaistuna pinnalla Mahalaukun syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (10): e77398. doi: 10,1371 /journal.pone.0077398

Editor: Nikki Pui-Yue Lee, The University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: May 1, 2013 Hyväksytty: 03 syyskuu 2013; Julkaistu: 15 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (lupanumeroita 81201596, 81101847, 81172324, 91229106, 31270963); Tärkeimmät hankkeet National Science Teknologia pilari ohjelma Kiina (2011BA203191); Tiede ja tekniikka komissiolle Shanghai kunta (12XD1403700, 12PJ1406300); Research Fund Tohtorikoulutuskeskuksen of Higher Education of China (20110073110071); Key Project Shanghai koulutusvaliokunta (12ZZ105). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kaikki kirjoittajat ovat keksijät vireillä olevan patenttihakemuksen koskien immunisoimalla hiiriä, valmistelee MS17- 57 hybridooma ja käyttö MS17-57 monoklonaalinen vasta-aine syövän hoidossa. Kirjoittajat ilmoittavat, että kaksi tekijää työskentelivät kaupallinen yhtiö, Shanghai MabStar, Inc. Kirjoittajat myös ilmoittaa, että MS17-57 sekä seulontamenetelmä on jätetty patenttihakemus kanssa otsikko ”Generation of anti-ektooppisesti ilmaisi emäksinen fosfataasi mAb, sen menetelmä ja sovellukset ”(a patenttihakemuksia), valtio Intellectual Property Office of kansantasavallan Kiinan (CN201310090565.9). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Muut neljä mAb: itä voidaan patentoitu ja tulokset julkaistaan ​​myös.

Johdanto

Ruoansulatuskanavan (GI) syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia ihmisillä, joilla on korkea riski kuolla maailmanlaajuisesti [1]. Kehittäminen terapeuttisten vasta-aineiden tutkimiseksi, arvioida, ehkäistä ja syövän hoitoon on yksi nopeimmin kasvavia alueita tutkimuksen sekä akateemisen areenalla ja lääketeollisuuden [2]. Sukupolvi laadukkaita monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t) syöpää vastaan ​​markkereita terapeuttisina kohteina on tärkeä keino kliinisessä lääkekehityksessä. Jotkut syövän markkereita tunnetaan (esimerkiksi ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori 2 ja verisuonten endoteelin kasvutekijä) tai ovat hyvin kehittyneet, mutta useimmat ovat vielä tuntemattomia tai kehittymättömät [3]. Näin ollen suurta kiinnostusta tuottaa mAb vastaan ​​uusia ja tuntemattomia syöpä tavoitteet. mAb vastaan ​​erityiset kasvainkohteita voidaan kehittää ja tunnistaa käyttäen erilaisia ​​lähestymistapoja, mukaan lukien entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) -korkea throughput screening (HTS), fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) -HTS, ja

in vitro

ja

in vivo

seulontaan.

tunnistaminen uusia syövän biomarkkereiden kasvaimien syntyyn liittyvien, syövän kehitystä, tai syövän ehkäisyyn on edelleen suurta kiinnostusta maailmanlaajuisesti [4,5]. Johtuen edistysaskeleet proteomiikan ja muiden näkökohtien molekyylibiologian, tällaiset tutkimukset ovat yhä helpommin toteutettavissa nykyajan kuin aikaisemmin. Huippuluokan HTS tekniikka on suhteellisen kehittynyttä ja se on hyvin suosittu monilla tieteenaloilla [6,7].

siis ovat tutkineet sukupolven mAbien vastaan ​​potentiaalisesti novel Ags on syöpäsolujen pinnalla käyttämällä FACS- HTS-menetelmällä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että MS17-57 mAb: t voivat tunnistaa istukan ja suoliston alkaliinifosfataasit (palp ja IALP, vastaavasti) kohteina ilmentyy syöpäsolun kalvo. Strategian oli hyödyntää uusi menetelmä FACS-HTS ja hybridoomatekniikkaa käyttäen seosta, jossa oli 4 elävien GI syöpäsolulinjoissa immunogeeninä [8], olettamalla, että ainakin osa mAb tuotetaan todennäköisesti sitoutua konformationaalinen epitooppi (s ) solun pinnalla GI syöpäsoluja. Tiedot osoittivat, että MS17-57 voisivat sitoutua palp ja IALP jotka ektooppisesti ilmentyy solun pinnalla, ja voi neutraloida ALP aktiivisuutta sekä

in vitro

ja

in vivo

. Nämä tulokset viittaavat siihen, että palp ja IALP ilmentyvät GI kasvaimen pinta poikkeavaan syövän solujen aineenvaihduntaa ja signalointireitin, joissa ne voivat edistää syöpäsolujen kasvua ja etäpesäkkeiden. MS17-57 on mAb suurella affiniteetilla ja spesifisyydellä, mahdollisesti edustaa hyödyllinen reagenssi ja mahdollinen perusta uusia terapeuttisia strategia syövän lääkekehityksessä.

tulevissa tutkimuksissa keskitytään molekyylitason mekanismi MS17-57 esto syöpäsolujen lisääntymistä ja muuttoliike sitoutumalla palp /IALP on syöpäsolujen pinnalla, ja selventämiseen solunsisäiset signalointireitit vaikuttaa toiminnan tämän vasta-aineen. Olettaen lisäselvityksiä vahvistavat lupaavia tuloksia kuvattu näissä alustavien tutkimusten, vasta-engineering MS17-57 kuin kimeerisen tai humanisoidun vasta terapeuttista soveltamista voitaisiin toteuttaa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

GI syöpäsolulinjoilla MKN45, BGC823, SGC7901, MKN28, AGS ja GES-1 hankittiin Institute Biokemian ja Cell Biology , Shanghai Institutes for Life Science, Kiina Academy of Science (Shanghai, Kiina) ja riken Bioresource Center (Tsukuba, Japani). GI syöpäsolulinjoja MKN-74 [9] ja TMK-1 [9] olivat: Dr. Gary K. Schwartz (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY, USA), ja KKLS soluihin [10] saatiin tri Yukuta Takahashi (Cancer Research Institute, Kanazawa University, Kanazawa, Japani). Mahalaukun syöpä solulinjoja ST-8 ja ST-9 [11] olivat kohteliaasti drakmaa. Bradley McIntyre ja Paul F. Mansfield, University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX, USA). Kaikki muut solulinjat (SP2 /0, jne) hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC: t) saatiin terveiden vapaaehtoisten kanssa tietoon perustuvan suostumuksen.

Lukuun ottamatta SP2 /0-myeloomasolujen ja mAb hybridoomasolut, kaikki solut viljeltiin MD6, kotitekoinen, seerumittomassa elatusaineessa peräisin alkaen Dubecco modifioidussa Eaglen väliaineessa (Gibco BRL, Rockville, MD, USA), jossa oli 5% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) (Sigma, St. Louis, MO, USA), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Myelooma- ja hybridoomasolut kasvatettiin samalla tavalla, mutta ilman naudan sikiön seerumia. Myelooma ja hybridoomasoluja kasvatettiin suspensiossa. GI syöpäsolut kasvatettiin noudattamaan kudosviljelykolveissa 5% FBS /MD6 keskipitkällä.

Patient Kudokset

tuore kasvain näytteet ja viereisten noncancerous kudokset (limakalvon) seitsemän GC leikkauspotilaiden olivat saatu Department of Surgery of Shanghai Ruijing sairaalassa Shanghai, Kiina. Nämä potilaat eivät olleet saaneet solunsalpaajahoidosta tai sädehoidon ennen leikkausta. Institutional Review Board protokollia havaittiin, ja eettinen hyväksyntä tutkimuksen myönsi Research eettiselle toimikunnalle Ruijing sairaala, Shanghai Jiaotong yliopiston School of Medicine. Tietoon kirjallinen suostumus oli saatu kaikille osallistujille (myös vapaaehtoisilta luovuttajilta) mukana tutkimuksessa.

tuore kudokset värjättiin MS17-57 sekä isotyyppikontrolli mAb. Sitova signaalit vahvistetaan, leimattu fluoreseiini-isotiosyanaatti, ja laskettiin FACS-HTS.

Hiiret

Male A /J-hiiriä (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) 6- 8 viikkoa vanha hankittiin Nanjing Experimental Model animal Center, Nanjing University, Nanjing, Kiina, ja ylläpidetään eläin laitoksen Shanghai MabStar, Shanghai, Kiina. Ylläpitäminen A /J hiiret ja kokeellisia toimenpiteitä hyväksyttiin Shanghai Eläinten hyvinvointi ja Research eettiselle toimikunnalle, Science and Technology komitean Shanghai kunnallishallinnon, Kiina ja lisenssin numero on SYXK (Hu) 2009-0087.

Mies JAX karvattomia hiiriä vuotiaita 4-8 viikkoa ostettiin Shanghai Experimental Model Animal Center ja ylläpidettiin Experimental Animal Center of Shanghai Ruijing sairaala. Nämä nude-hiiriä käytettiin kokeisiin, joissa ksenografteja ihmisen mahasyövän (GC) ja menetelmät ovat samankaltaisia ​​kuin Sela ryhmä on aikaisemmin kuvattu [12]. Ylläpitäminen JAX nude-hiirten ja kokeellisia toimenpiteitä hyväksyttiin Shanghai Eläinten hyvinvointi ja Research eettiselle toimikunnalle, Science and Technology komitean Shanghai kunnallishallinnon, Kiina ja lisenssin numero on SYXK (Hu) 2011-0113.

Live Cancer Cell Rokotukset

Jokainen A /J hiiriin ruiskutettiin ihon alle 5-10 sivustoja sekä kerran vatsaonteloon (ip) noin 5-10×10

6 solua (yhtä suuret määrät MKN45, BGC823, SGC7901, ja MKN28 solut) fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS, pH 7,4). Kolme hiiret sijoitettiin kohti kokeellista erää. Kaksi viikkoa myöhemmin hiiriin ruiskutettiin jälleen, yhteensä kolme immunisaatiota sekä yksi i.p. booster kolme päivää ennen fuusiota koetta.

Kolmen päivän kuluttua tehosteannoksen, pernasolut kerättiin kirurgisesti immunisoidusta hiiren tapettiin CO

2 hengitysteitse ja kaikkia pyrkimyksiä pienentämiseksi ryhdyttiin eläinten kärsimystä; pernasolut fuusioidaan myeloomasolujen kanssa SP2 /0-solut [13,14] 50% polyetyleeniglykolia (pH 7,4), fuusio ratkaisu tuottaa mAb hybridoomien. Fuusioitunut hybridoomasoluja pidettiin hypoksantiini-aminopteriini-tymidiini-väliaineessa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ja 280 ui /kuoppa fuusioituneiden solujen (noin 1-2 x 10

4 pernan solua /kuoppa) jaettiin osiin kuusikymmentäseitsemän 96-kuoppaisille, tasapohjaisille kudosviljelylevyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa inkubaattorissa 5% CO

2 10 päivää. Samaan aikaan neljä GI syöpäsolulinjoja kasvatettiin irtotavarana useita pulloihin.

Fluoresenssi solulajittelutekniikkaa High seulontaan (FACS-HTS) B

FACSCalibur-HTS järjestelmä (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) käytettiin seulomaan valikoivaa hybridoomat suurista määristä fuusio solua /pesäkkeitä fuusio levyt. Jopa 200 seulonta ja laskuri seulonta (syöpäsoluja vastaan ​​normaalit solut) levyjä voitaisiin käyttää niin seulonta-analyysissä. Solut kaikki neljä GC riviä otettiin talteen, sekoitettiin, ja jaettiin eriin (noin 1×10

6 solua /kuoppa) 96-kuoppaisille U-pohjaisille levyille (67 levyt) .Sama määrä ihmisen perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC: t) alkaen Terveillä vapaaehtoisilla erotettiin käyttämällä ihmisen lymfosyytti-Strippausliuos Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, USA) ja jaettiin 96 kuopan U-pohjalevyt (toinen 67 levyt vastaseulomalla). Supernatantti (80 ui /kuoppa) kunkin 67 fuusio levyt siirrettiin GC solulevyille merkitty 1-67 sen jälkeen, kun nämä solut oli estetty 2,0% naudan seerumin albumiinia (BSA) /PBS estopuskuria levyissä. Supernatantti samasta fuusio levyt samalla siirrettiin PBMC-levyille. Sen jälkeen, kun GC solun ja PBMC-levyt pestiin kolme kertaa blokkauspuskurilla, sekundaarinen vasta-aine [vuohen anti-hiiri-immunoglobuliini G (IgG) Fc-konjugoitu fluoreseiini-isotiosyanaatti] jaettiin sekä GC solulevyille ja PBMC-levyille (100 ul /kuoppa) ja inkuboitiin jäällä tai jääkaapissa 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ja pestiin jälleen kolme kertaa blokkauspuskurilla. Fluoresoiva värjätään solut kiinnitettiin 1,5% paraformaldehydillä /PBS. Prosenttiosuus värjätty solu huipun siirtymä ja fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI) on jatkuvasti seurattava FACS-HTS järjestelmä 134 seulontaan ja vasta-seulonta 96-U-pohjalevyt. Hybridoomapesäkkeitä esillä vahva sitoutuminen ja spesifisyys GC soluja (eikä sitoutumisen PBMC) valittiin laaja kasvun, vieroitettu kunnostettua alustaa, ja subkloonattiin.

mAb Generation

Supernatantit kerättiin valitaan hybridooman kloonien ja puhdistettiin käyttäen proteiini-A-Sepharose-kolonnit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Valitsimme puhdistettu MS17-57 mAb lisäanalyysi, joka suodatettiin läpi 0,2 um: n kalvon läpi, steriloidaan ja jaettiin kryoputkiin pidettiin 4 ° C: ssa käyttöön soluviljelmissä tai

in vivo

tutkimuksissa (kuvattu alla). Seos mAb PBS: ssä ja 50% glyserolia, jäädytettiin -20 ° C: ssa pitkäaikaiseen varastointiin.

hiiri-lgG Isotyping

käytetään hiiren mAb isotyypitysvälineistöä (IsoStrip, RochePharma AG , Reinach, Sveitsi) karakterisoimiseksi isotyypin hiiren MS17-57 mAb (IgG).

cDNA sekvensointi Vaihteleva alue on MS17-57

käytetään RNeasy-kittiä (Qiagen, Valencia, CA, USA) eristää kokonais-RNA: MS17-57 hybridoomasoluja. MS17-57 cDNA-kirjasto luotiin mRNA: käänteistranskriptio reaktioiden kanssa SuperScript III ensimmäisen juosteen (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). MS17-57 IgG Fab-fragmentti Ag-sitoutumisen vaihtelevat alueet monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR), jossa 21 paria raskaan ketjun ja kevyen ketjun alukkeita, jotka on saatu hiiren IgG Library alukejoukolla (Progen Biotechnik, Heidelberg, Saksa). PCR-tuotteet, joita käytetään DNA: n sekvensointi, joka suoritettiin Lee Lu lab MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA. Komplementaarisuuden määräävät alueet (CDR: t) ja kehyksen alueilla (FWRs) on MS17-57 tunnistettiin käyttämällä resursseja saatavilla National Center for Biotechnology Information sivustot ja määrittämällä linjaukset cDNA ja aminohapposekvenssit [15-18].

Epäsuora ELISA

Ag (proteiini) (0,2 ug /ml PBS: ssä) päällystettiin Immulon-II HB 96-kuoppaisia ​​ELISA-levyjä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja inkuboitiin kosteassa -box yön yli huoneenlämpötilassa (RT). Ag-päällystetty levyt pestiin ja blokattiin 1,0% BSA /PBS-Tween 20 (PBST) puskuria ja 100 ui primaaristen vasta-aineiden erikseen laimennettuna 1,0% BSA /PBST lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 1 tunnin ajan RT: ssä ja pestiin PBST: llä. Pesun jälkeen 100 ui laimennettua (1: 2500) piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG Fc-polyklonaalista sekundaarista vasta-ainetta (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa. Vielä pesun PBST, 150 ui peroksidaasisubstraattia (tetrametyylibentsidiinin 0,02 M [pH 6,0] sitraatti /asetaattipuskuria ja 0,003% H

2O

2) lisättiin kuhunkin kuoppaan värin kehittämiseksi sitovien signaalit; kehitys pysäytettiin lisäämällä 50 ui 0,2 M H

2SO

4 jokaiseen koloon. Absorbanssi (optinen tiheys, OD) reaktion levyt luettiin 450 nm: ssä sameus viitaten asetettu 620 nm.

Immuocytochemical Analyysi Cytospin diat

Jotta 1×10

6 GC solua 50 ul /kpl, Sytospin kammio reiät pyöritettiin päälle dioja ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä /PBS-liuosta, kuivatut 70% etanolilla ja ilmakuivattiin. Objektilasit rehydratoitiin PBST tasaisessa asennossa 5 minuutin ajan ja sitten inkuboitiin 10% vuohen seerumi /PBS. Laseja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla on sopiva laimennus 1 tunnin ajan RT: ssa tai yön yli 4 ° C: ssa, huuhdeltiin PBST kahdesti 5 minuuttia /kunkin vaaka-asennossa. Dioja inkuboitiin sitten HRP-leimatun sekundaarisen vasta-aineen (vuohen anti-hiiri IgG: n Fc-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories) 1: 500 laimennos PBS: ssä 30 minuutin ajan RT: ssä. Detection mAb värjäytymisen syöpäsolujen suoritettiin 0,125% aminoethylcarbazole kromogeenista substraattia 5-10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ja mAb värjättiin cytospin Objektilasit vastavärjättiin Gillin hematoksyliinillä (Dako, Carpinteria, CA, USA). Anti-fade kiinnitysväliaine (Vector Labs, Burlingame, CA, USA) käytettiin asentaa dioja.

Cancer Cell Proliferation inhibitiomääritys

syöpäsolujen proliferaation inhibition määritys suoritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Santa Clara, CA, USA) ja perustui havaitsemiseen dehydrogenaasin aktiivisuuden eläviin soluihin. Yhteensä 5000 solua /150 ui valittu BGC823, MKN45, tai molempia soluja 4 GC käytetyt solulinjat immunisointiin, jaettiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevyillä kullekin quadruplicated testiolosuhteissa. Levyt esi-inkuboitiin 24 tunnin ajan kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2. 50 ul /kuoppa MS17-57 (8 ja 2 ug /ml), merkityksetön (isotyyppikontrolli) mAb: itä (30 ja 8 ug /ml) ja yksi pelkästään kasvatusliuosta (tyhjä kontrolli) lisättiin testilevyille neljänä vähentämiseksi vaihtelua. Testi inkuboitiin käyttäen samoja olosuhteita kuin esi-inkubointi. CCK-8 lisättiin levyille (10 pl /kuoppa), otetaan yksi levyn kutakin testiä kunnossa päivässä päivinä 1 ja 7. Levyjä inkuboitiin 3 tunnin ajan ja absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin käyttäen VERSAmax mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Cancer Cell Migration Inhibitiomääritvs

estyminen chemotaxic syöpäsolun muuttoliikettä arvioitiin käyttäen QCM 24 kuopan kolorimetrisellä solujen migraatiokokeessa ( EMD Millipore, Billerica, MA, USA). RT, 300 ui solususpensiota (1,0 x 10

5 solua /ml MD6), kanssa tai ilman kunkin 5, 10, ja 20 ug /ml MS17-57 plus merkitystä mAb: t, lisättiin kuhunkin insertin, lisättiin kuhunkin 24 kuoppaan siirtymisen kammion, ja 500 ui MD6 5% naudan sikiön seerumia lisättiin kuhunkin kuoppaan alemmassa kammiossa. Testin levyjä inkuboitiin kudosviljelyinkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 24 tuntia, ja ei-vaeltavat solut poistettiin varovasti sisätilojen insertit pumpulipuikolla moppi. Solujen alapinnalle kalvon värjättiin kastamalla inserttien kristallivioletilla (nukle- väriaine) värjäysliuosta (500 ul /kuoppa) 20 minuutin ajan. Insertit huuhdeltiin useita kertoja vedellä, annetaan kuivua ilmassa, ja valokuvattiin. Värjätty solut jaettiin osiin 96-kuoppalevylle ja laskettiin VERSAmax mikrolevynlukijalla (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

tuumorikasvun Balb /C Nude hiiret

antituumorivaikutus ja MS17-57 tutkittiin ksenografteja ihmisen GC Balb /c-nude-hiirissä, kuten on aiemmin kuvattu [12]. Lyhyesti, 1 x 10

6 valittu BGC823 tai MKN45 soluja MD6 kanssa tai ilman MS17-57 plus merkityksettömiä mAb ruiskutettiin i.p. kuhunkin hiiri. Tätä injektiota kasvaimia kaikissa hiirissä 6 viikkoa sen jälkeen, kun solun istutuksen, ja tuumorin paino kyhmyn kunkin oli noin 0,3-1,0 grammaa, joka riippuu siitä, kuinka monta alkuperäisen soluja siirrostettiin. Hoito MS17-57, merkityksetön mAb: t, ja PBS (kuten keskipitkän tyhjä tarkastukset) (kaikki ip) aloitti päivän jälkeen syöpäsolun injektion (ts päivänä 1) ja toistettiin päivinä 15 ja 29. Jokainen hoitoryhmä koostui at vähintään neljä eläintä. Lukumäärä kasvaimen kyhmyjä laskettiin, ja kyhmy halkaisija mitattiin kerran. Hiiret tapettiin CO2 hengitysteitse päivänä 48 ja yritettiin lievittävät eläinten kärsimyksiä.

Immunosaostaminen (IP) ja massaspektrometria (MS) analyysi

epäsuora IP, magneettinen Dynabeadsilla päällystetty proteiini-A (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) inkuboitiin 50 ug: MS17-57 30 minuutin ajan RT: ssä jatkuvasti ravistaen. Sitten helmet pestiin ja inkuboitiin lysaatin valittujen BGC823 tai MKN45 GC-solut, jotka lysaatit laimennettiin asianmukaisesti. Inkuboinnin tapahtui, kun läsnä oli 0,1% Triton X-100 radioimmunosaostuskokeella uutteet (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). mAb vastaan ​​anti-β-aktiini (noin 42 kDa natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi [SDS-PAGE] geeli) käytettiin sisäinen kalibrointi standardin. Lysaatti peräkkäin alttiiksi MS17-57-päällystettyjä helmiä 30 minuutin ajan rotaatiossa. Sitoutunut helmet pestiin 0,5% Triton X-100 ja sen jälkeen vettä. Näytteet eluoitiin kuumentamalla keitettyä vettä 50 ul /kunkin eluaatti Laemmli denaturoivissa näytepuskuria (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Sitten näytteet ladattiin ja erotettiin 10% Bis-Tris geeliä (Bio-Rad) 1 x 2 – (

N

-morfolino) etaanisulfonihappo ajopuskurilla ja SDS-PAGE. Geeli värjättiin hopeavärjäyksellä (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Värjätyt tavoite nauhat leikattiin ja analysoitiin ProteinChip järjestelmän sarja 4000 (Enterprise Edition) massaspektrometri (Bio-Rad).

Suora IP suoritettiin käyttäen Dynabeadsilla vasta-kytkin (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) suoraan pari helmien kanssa MS17-57. Jäljellä olevat vaiheet ovat samat kuin on kuvattu epäsuoran IP.

mRNA Expression by Quantitative Reverse Transcription (qRT) -PCR-analyysi

uuttaminen kokonais-RNA: 10 GI syöpäsolulinjasta suoritettiin TRIzol -reagenssia (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) [19]. RNA kvantitoitiin käyttämällä A260 /A280-nm absorption suhde. Muuntaa RNA cDNA: ksi, 1 ui kokonais-RNA-näytettä käytettiin käänteistranskriptioreaktio kanssa RNaasi-inhibiittori (Invitrogen), SuperScript III käänteistranskriptaasia (Invitrogen), ditiotreitolia, ja ensimmäisen juosteen puskuria. Seokset näytteitä inkuboitiin huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan ja sitten 42 ° C: ssa 50 minuuttia. Reaktio pois päältä 70 ° C: ssa 15 minuuttia.

eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita IALP, palp ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (5′-TCCATCTTCGGGTTGGCCCCC-3 ’ja 5′-TCCGTGGGTCTCGGACGACAG-3 ”5’-CCTGGGTGCTGCTCCTGCTGGG-3 ’ja 5′-CGTAGACACCCCCATCCCGTCAC-3′, ja 5’-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 ’ja 5′-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3’, vastaavasti) syntetisoitiin ja käytettiin reaaliaikaisessa PCR-reaktiossa SYBR vihreä reagenssit (Life Science, Hercules, CA, USA) ja ladattiin 96-kuoppalevylle. Seosta näytteiden ajettiin on CFX96 Touch reaaliaikainen PCR-tunnistusjärjestelmä (Bio-Rad), seuraavissa olosuhteissa: 93 ° C: ssa 2 minuuttia ennen denaturaatio, 93 ° C: ssa 1 min denaturoinnin, 55 ° C: ssa 1 min hehkutus, 72 ° C 1 minuutin ajan, pidennys 40 sykliä ja 72 ° C: ssa 7 min loppuinkubaatio. Aineisto analysoitiin Opticon Monitor ohjelmisto (Life Science, Hercules, CA, USA).

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS-ohjelmiston (IBM). Data ilmaistiin keskiarvoina ± keskivirhe keinoja. Erot analysoitiin Studentin t-testiä;

P

arvojen 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

MS17-57 hybridooma immunisoimalla muodostetun Liven GC Cells

periaatteita noudattaen mAb sukupolven [10], käytimme sekoitus elävien MKN45, BGC823, SGC7901, ja MKN28 GC soluja immunogeeninä immunisoimiseksi A /J-hiirissä kolme kertaa. Ennen lopullista vauhtia, seerumi hännän-bleed kunkin immunisoitujen hiiren kerättiin. SGC7901 ja BGC823 solut valittiin satunnaisesti neljään GC solulinjat, joita käytettiin elävien solujen immunisointi. Ihmisen PBMC: t eristettiin kokoverestä terveen luovuttajan käytettiin noncancer ohjaus. Ihmisen GC-solut ja PBMC: t sidottiin seerumin kanssa kustakin immunisoiduista hiiristä ja immunisoimattomista hiiren seerumissa ohjaus (kuvio 1). Kaikki kolme hiirtä kussakin solulinjassa ryhmä osoitti sitoutumisen signaaleja GC solulinjojen ja PBMC: t, vaikka PBMC: t oli suhteellisesti heikompia signaaleja.

Ihmisen PBMC-solut eristettiin kokoverestä valitun terveen luovuttajan normaalissa solun valvontaa. MKN45, BGC823, SGC7901, ja MKN28 soluja käytettiin kokeissa, mutta SGC7901 ja BGC823 solulinjat valittiin sattumanvaraisesti esimerkkeinä tässä kuviossa. MFI olivat korkeammat näissä soluissa kuin PBMC. Kaikki kolme hiirtä osoittivat vahvoja immuunivasteita ihmisen GC solulinjoissa.

pernasoluja ihmisen neljän GC solulinjoja immunisoiduista hiiristä fuusioitiin hiiren myeloomasoluihin SP2 /0-soluja tuottamaan vasta-ainetta hybridooma. FACS-HTS käytettiin seulomaan vahvempaa Ag sitova suuresta poolista sideaineiden (eli mAb: t) on hybridooman ohjelmistossa. MAb-molekyylit sitovat pääasiassa konformaatioepitoopit pinnalla elävien syöpäsoluja. Käyttämällä FACS-HTS, valitsimme hybridoomapesäkkeitä vahvojen sitovia signaaleja käyttäen yhteensä 20.000 siirtomaiden kuusikymmentäseitsemän 96-kuoppalevyillä vastaan ​​sekoitettu elävien GC solujen ja normaalin ihmisen PBMC (laskuri seulonta solut). Kun nämä hybridoomasolut vieroitettu selektioelatusaineessa, viisi hybridoomat korkein sitovien signaaleja valittiin alikloonaami- ja vasta affiniteettipuhdistusjärjestelmässä. Valitsimme MS17-57 klooni jatkotutkimuksiin. (Neljä muuta mAb: t arvioidaan myöhemmin.) B

MS17-57 Characterization

ominaista MS17-57 mAb erilaisia ​​menetelmiä. Tiedot IgG1: n raskaan ketjun ja κ kevytketjun saatiin hiiren vasta-aineen Isotyypitys [20]. Vaihtelevat alueet (kevyt ketju ja raskaan ketjun) Fab-fragmentti MS17-57 sekvensoitiin DNA ja aminohappoja (kuvio 2). Ainutlaatuinen Ag-sitovien alueiden osoitti, että CDR: t väliin FWRs raskaiden ja kevyiden ketjujen oli läsnä vaihtelevan alueen Fab-fragmentti kuin MS17-57 identiteetin.

FWRs välissä sijaitsevat CDR: t.

MS17-57 Sitoutuminen lysaatit GI Syöpäsolut

määrittää joitakin biologisia ominaisuuksia MS17-57 mAb, lysaatit MKN45, BGC823, ja GES-1 solulinjoja (jälkimmäinen syntyy ja ikuisti normaaleista mahalaukun limakalvon soluissa ja muunnettu Simian virus 40) [21] yksitellen päällystettiin ELISA-levyt. Puhdistettu MS17-57 lisättiin levylle ja sekundäärinen vasta-aine-HRP-monistettiin sitova signaalit (kuvio 3). Tämä epäsuora ELISA osoitti, että MS17-57 voivat silti sitoutua spesifisesti denaturoitua kohde (t) solukalvon proteiinin syöpä solulysaateista. MKN45 solut ilmaisivat MS17-57 kohde korkeammalla tasolla kuin BGC823 tai GES-1-solujen teki, mikä osoittaa, että kohde ekspressiotasot saattavat vaihdella solulinjat.

MKN45, BGC823, SGC7901, ja MKN28 soluja käytettiin kokeissa, mutta MKN45 ja BGC823 solulinjat valittiin sattumanvaraisesti esimerkkeinä tässä kuviossa. MS17-57 ilmaisi vahvan sitoutumisen signaaleja MKN45 soluihin ja maltillinen sitova signaaleja BGC823 soluihin ja GES-1-soluissa. Solulysaatit päällystettiin 1,0 ug /ml PBS: ää päälle Immulon-II HB 96-kuoppaisia ​​ELISA-levyjä (100 ul /kuoppa). Proteiinin konsentraatiot solulysaateista olivat tasapainossa, mutta ei sitovia tavoitteita (Ag), joka voisi olla suuri vaihtelu. Merkityksetön mAb käytettiin isotyyppikontrolli.

lokalisaatio MS17-57 tavoitteet Cancer Cells

MS17-57 sidottu kaikki neljä GC solulinjoja käytettiin immunisointiin, vaikka sitova signaalit eivät ole yhtä voimakkaan (kuvio 4A). Ilmentymisen taso MS17-57 tavoite oli korkein MKN45 soluissa ja pienin SGC7901 soluissa. Samanlainen vasta-seulonta tuloksia, MS17-57 mAb ei sitoudu ihmisen PBMC. Se ei sitoudu jotkin muut lajit GC-soluja (kuvio 4B), mutta ei GI-soluja (kuvio 4C). Siten kohde (t) MS17-57 ei yleisesti ilmaistaan, vaikka ne näyttävät olevan yleisempiä GC soluja kuin GI-soluja.

A.MS17-57 sidottu kaikki neljä GC solulinjat, jotka olivat käytetään eläviä soluilla. B. MS17-57 osoitti vahvaa sitoutumista signaaleja GES-1 ja AGS soluissa, mutta ei sitovia signaalia ihmisen PBMC. C. MS17-57 ei sitoudu ihmisen PBMC: eikä viiden GI kasvainsoluja. Merkityksetön mAb käytettiin mAb isotyyppikontrolli.

tuore kasvain kudosten ja viereisten noncancerous kudosten kuudesta GC potilasta värjättiin MS17-57 ja isotyyppikontrolli mAb ja sitten määrällisesti kanssa annosriippuvainen sitoutumisen FACS-HTS. Kaiken sitova signaali MS17-57 oli vahvempi kasvaimen kudoksissa kuin noncancerous kudoksissa (

P

0,03) (taulukko 1 ja kuva 5). Tämä koe osoitti, että MS17-57 voi sitoutua tavoitteensa natiivissa muodossa pinnalle tuoretta kasvainnäytteestä.

GC Patient

Tissue

mAb

rahalaitoksen

% Mosaiikki Peak

vähennetään rahalaitos

2

Normalized rahalaitoksen

3

Patient-1TumorIsotype Ctrl6.150.5113.0611.56MS17-5719.2118.23NormalIsotype Ctrl11.620.3215.898.76MS17-5727.5111.58Patient-2TumorIsotype Ctrl10.962.836.155.78MS17- 5717.1111.94NormalIsotype Ctrl28.3110.48-12.592.06MS17-5715.728.26Patient-3 * TumorIsotype Ctrl —- MS17-57 – NormalIsotype Ctrl —- MS17-57 – Potilaan 4TumorIsotype Ctrl3.760.18.2711.83MS17-5712.0313