Krooninen sairaus

tiivistelmä

Telomerase on merkittäviä rooleja kehittämisessä ja etenemistä pahanlaatuisia kasvaimia, ja sen toiminta määräytyy ensisijaisesti transkription säätelyyn ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT). Useat mRNA vaihtoehtoisen silmukoinnin variantteja (ASVs) ja hTERT on tunnistettu, mutta on epäselvää, telomeraasiaktiivisuutta liittyy suoraan hTERT liittämiseen selostukset. Tässä tutkimuksessa kehitimme uusia reaaliaikaisia ​​PCR käyttäen molekyylimajakoissa ja levitetään keuhkojen sinoomasolulinjoja ja syöpäkudokset kvantifiointiin telomeraasiaktiivisuuden ja kolme olennaista hTERT poisto selostukset vastaavasti. Tulokset osoittivat, että keuhkosyövän solulinjat osoittivat johdonmukaisesti telomeraasiaktiivisuuden (14,22-31,43 TPG yksikköä per 100 solua) ja eri hTERT vaihtoehtoisen silmukoinnin selostukset. 165 keuhkosyöpää, telomeraasiaktiivisuutta osoitti merkittävää korrelaatiota kasvaimen erilaistumiseen (poorly- moderately- hyvin erilaistunut, P 0,01) ja histotypes (Yhdistetyssä pienisoluisen ja okasolusyöpä okasolusyöpä adenosquamous karsinooma adenokarsinooma, P 0,05). Vaikka yleinen hTERT transkriptit havaittiin kaikissa näytteissä, ne eivät liittyneet telomeraasiaktiivisuuden (r = 0,092, P = 0,24). Telomeraasiaktiivisuus korreloi merkitsevästi transkription osatekijän suhde α-t (r = -0,267, p = 0,026), β-deleetio (r = -0,693, p = 0,0001) ja γ-t (r = -0,614, p = 0,001). Positiivinen nopeus ja keskimääräinen osatekijän suhde β-poisto transkriptien (92,12%, 0,23) olivat korkeammat kuin α-poisto (41,82%, 0,12) tai γ-poisto (16,36%, 0,18) selostukset. Yhdistetty pienisoluinen ja okasolusyöpää ilmaistuna vähemmän poisto selostukset, erityisesti β-poisto, kuin muut histotypes, mikä saattaa selittää niiden korkeamman telomeraasiaktiivisuutta. Lopuksi molekyylimajakka-pohjainen reaaliaikainen PCR protokollat ​​ovat nopeita, herkkiä ja erityisiä menetelmiä määrällisesti telomeraasiaktiivisuudelle ja hTERT ASVs. Telomeraasiaktiivisuus voi toimia luotettavasti ja tehokkaasti molekulaarinen merkkiaine arvioinnin helpottamiseksi histologisten alatyypin ja erilaistumisen keuhkosyövän. Lisätutkimukset hTERT poistetaan silmukoinnin selostukset, pikemminkin kuin yleinen hTERT selostukset, saattaa parantaa ymmärrystämme telomerase sääntelyn.

Citation: Liu Y, Wu Bq, Zhong Hh, Tian Xx, Fang Wg (2012) kvantifiointi Vaihtoehtoinen silmukointi variantteja ihmisen Telomerase käänteiskopioijaentsyymi- ja korrelaatiot telomeraasiaktiivisuus Lung Cancer. PLoS ONE 7 (6): e38868. doi: 10,1371 /journal.pone.0038868

Editor: Chi Zhang, University of Texas Southwestern Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 helmikuu 2012; Hyväksytty: 15 toukokuu 2012; Julkaistu: 18 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahoja WG Fang alkaen 973 Program (2010CB529402) The Ministry of Science and Technology of China. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Normaalit somaattisten solujen läpikäyvät solun vanhenemisen takia etenevä telomere lyhenemistä jokaisen solunjakautumisen. Aktivointi telomeraasi uskotaan olevan vastuussa siitä, että riittävän telomeerisesti pituus kasvain tai kantasoluja. Nämä solut ovat voittaa tämän proliferatiivisia lohko ilmaisemalla entsyymiä telomeraasin, joka tarjoaa soluja, joilla on kyky jakaa jatkuvasti. Siten sääntely telomeraasiaktiivisuuden on merkittävä vaikutus moniin kehitysprosesseja myös solujen jakautumista, erilaistumista ja ikääntymistä sekä kasvaimien syntyyn. Telomeraasiaktiivisuus on havaittu lähes 90% kaikista ihmisen maligniteettien, joten se ilmeinen kohde syövän diagnostisia ja terapeuttisia strategioita.

Ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT) on olennainen osa holoentsyymikompleksi joka lisää telomeerisesti toistaa päihin kromosomeja. Ilmaisu normaalin täyspitkän hTERT korreloi hyvin telomeraasiaktiivisuus ja näyttää olevan nopeutta rajoittava tekijä telomeraasiaktiivisuus ihmisen soluissa. HTERT-geeni koostuu 16 eksonista ja ulottuu ~37 kb genomista DNA: ta, joista ~ 33 kb on intronisekvensseihin ja loput ~ 4 kb vastaa hTERT mRNA transkriptin. Viime aikoina kolme vaihtoehtoista silmukointivariantit (ASVs) käänteistranskriptaasisegmentissä motiiveja hTERT havaittiin valvontaan osallistuvien telomeraasiaktiivisuuden: i) α-poisto: puuttuu 36 bp eksonista 6 lukien motiivi A; ii) β-poisto: puuttuu 182 emäsparin eksonit 7 ja 8, mikä johtaa nonsense-mutaation ja lyhennetty proteiini ennen konservoituneen RT motiivit; iii) γ-poisto: puuttuu 189 emäsparin eksonista 11 sisällä motiiveja D ja E [1]. On olemassa useita mahdollisia yhdistelmiä näistä vaihtoehtoisen silmukoinnin sivustoja, jotka johtavat suuri määrä potentiaalisia liitos transkriptien, mutta ne, joilla on enemmän kuin kaksi silmukointipaikoista ovat epävakaita ja hajoavat liian nopeasti havaita. Koska α, β ja γ poisto selostukset johtaa lyhentymisiä tai mutaatioita käänteiskopioijaentsyymin verkkotunnuksen olennainen katalyyttisen aktiivisuuden, ne ovat joko funktionaalinen (β-poisto tai γ-t) tai jopa hallitseva-negatiivisia vaikutuksia (α-t) [1 ] – [4]. Näin ollen korrelaatio hTERT-geenin ilmentyminen ja telomeraasiaktiivisuus on monimutkainen.

telomeraasiaktiivisuus ja hTERT-ekspressio havaittiin 67-85% ja 48-95% keuhkotuumoreiden vastaavasti [5], [6], ja molemmat olivat merkitsevästi yhteydessä huonoon kokonaiselossaoloaika ja tautivapaan elinajan potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [6], [7]. Kuitenkin väliset suhteet telomeraasiaktiivisuudelle tai hTERT ja kliinis muuttujat olivat kiistanalaisia. Lantuejoul S ja työtovereille raportoitu, että hTERT ilmentyminen oli merkitsevästi alhaisempi adenokarsinooma (ADC) kuin levyepiteelisyöpä (SCC), basaloid karsinooma ja pienisoluinen keuhkosyöpä, ja telomeraasiaktiivisuuden oli alhaisempi I vaiheessa keuhkosyövän kuin muissa vaiheissa (II IV) [5]. Wu TC ja työtoverit osoittivat, ettei telomeraasiaktiivisuus eikä hTERT ilmentyminen NSCLCs korreloi kliinis ominaisuudet, kuten luokan, kasvain vaiheissa, kasvaintyypeille tai TNM arvoja [8]. Huomattavaa on, että suurin osa aiempien tutkimusten testataan vain telomeraasiaktiivisuutta tai yleistä hTERT selostukset, eikä erottamaan eri silmukoivat selostukset. Esillä olevassa tutkimuksessa, reaaliaikainen telomere toista vahvistusta protokolla (TRAP) ja reverse-aluketta, jotka liittyvät koetin (RPP), eräänlainen koetinta kampaus reverse-aluketta ja fluoresenssi-leimatun koettimen yhdessä molekyylissä, on kehitetty telomeraasi aktiivisuuden kvantifiointiin keuhkotuumorisolulinjoissa linjat ja kudoksissa. Toinen reaaliaikainen PCR-määrityksessä molekyylimajakat on kehitetty analysoimaan ekspressiotasoja hTERT ASVs samoissa näytteissä. Siten tutkimme luonnehdinta telomeraasiaktiivisuudelle ja hTERT poisto liitoksen transkription keuhkosyöpä, joka voi antaa tärkeää tietoa ymmärtämiseksi telomerase sääntelyn kasvainten synnyssä.

Methods

Kasvain Materiaali ja solulinjoissa

Tuumorinäytteet saatu 165 keuhkosyöpäpotilaita (115 miestä, 50 naista, keski-ikä 60 vuotta alueella, 31-79 vuotta). 10 minuutin kuluessa leikkauksen jälkeen, kudosten ilman nekroosia ja verenvuoto leikeltiin kasvain, jota seurasi flash-jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -70 ° C: ssa. Yksi osa kustakin näytteestä alistettiin tavanomaisen histologinen tutkimus varmistaa, että näytteet sisälsivät vähintään 80% kasvainsoluja. Diagnoosi, lajittelu- ja patologinen TNM (Kasvain, Node, etäpesäke) pysähdyspaikan määritettiin itsenäisesti kaksi kokenutta patologit WHO ja UICC luokitus.

Ihmisen ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat A549, H1299, SPC-A1 ja Paa käytettiin positiivisina kontrolleina telomeraasiaktiivisuudelle ja hTERT-geenin ilmentymistä. Paa on perustettu peräisin kiinalaisen potilaan keuhkojen adenokarsinooma ja pidetään laboratoriossamme, kun taas muut solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), johon oli lisätty 100 ml /l lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Solut 80-90% konfluenssiin kerättiin 0,25% trypsiini-EDTA: lla ja pestiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, pH 7,4). Sen jälkeen, kun solujen laskenta, noin 10

6 solut pestiin kahdesti PBS: llä ja pelletoitiin sentrifugoimalla 2000 g: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solupelletit säilytettiin -70 ° C: ssa telome- määrityksen kuuden kuukauden kuluessa.

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyi Pekingin yliopiston Institutional Review Board suostumuksella nro IRB00001052- 10004. Kaikki osallistujat tässä tutkimuksessa ovat antaneet kirjallisen suostumuksensa, joka on ollut tarkastelun menettely eettisen komitean.

pohja- ja Probe suunnittelu

Perinteinen TRAP on kaksivaiheinen määritys, jossa telome- lisää telomeerisiä toistot päälle 3′-päähän substraatin oligonukleotidin, ja sitten laajennettu tuotteet monistetaan polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttäen TS ja reverse-aluke on komplementaarinen telomeerisesti toistoja. Tässä tutkimuksessa, reaaliaikainen TRAP-määritys kehitettiin käyttäen reverse-aluketta sidottu koetin (RPP), joka yhdistää käänteinen aluke ja fluoresenssi-leimatun koettimen yhdessä molekyylissä. Periaatteena RPP-pohjainen reaaliaikainen TRAP määritys esitetään kaavamaisesti kuvassa. 1. Käänteinen aluke-sidottu koetin syntetisoitiin Biosearch Technologies (Novato, CA, USA). Kvantifiointi telomeraasiaktiivisuuden suoritettiin tarkkailemalla fluoresoivat signaalit emittoidaan suojeluohjelmia, jotka oli sisällytetty TRAP tuotteet (kuvio S1). Molekyylimajakoita kvantifiointiin hTERT yleistä tai poistamisesta selostukset kesti ei-silmukoinnin eksonit tai deleetiokohdat vastaavasti mukaan GenBank NM_198253 (kuva S2). Alukkeiden ja koettimien suunniteltiin käyttäen Primer PREMIER 5.0 ja OLIGO 6.0 -ohjelmisto vastaavasti. Niiden sekvenssit on esitetty taulukossa S1. Delta entropia toisen rakenteen kunkin koetin laskettiin Mfold ohjelmisto (https://www.idtdna.com/Scitools/Applications/mFold/) tarkistaa vakaus varsi-silmukka. Beacon-koettimet hTERT: ille ja Taqman-koetinta ohjaus GAPDH (glyceraldehydes-3-fosfaattidehydrogenaasi geeni) syntetisoitiin Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA). Kaikki Alukesarjat syntetisoitiin ja puhdistettiin AuGCT Biotechnology (Peking, Kiina). Spesifisyys PCR-monistukset arvioitiin 10% ei-denaturoivalla polyakryyliamidigeelielektroforeesilla.

Solu-uutteet vastaa ilmoitettua määrää A549-solut testattiin telomeraasiaktiivisuuden. Tulokset geelielektroforeesi (vasemmalla), vahvistus juoni (yllä) ja standardi käyrät (alla) osoittivat johdonmukaisesti lineaarista suhdetta telomeraasiaktiivisuudelle ja A549 solujen määrä, kun taas 5 edustaa negatiivinen kontrolli.

Real -aika kvantifiointi määritys telomeraasiaktiivisuuden

CHAPS lyysipuskuria valmistettiin, kuten on kuvattu aiemmin [9]. Solupelletit suspendoitiin uudelleen jääkylmään lyysipuskuriin (5000 solua /ui) ja inkuboitiin 30 minuuttia jäillä. Sentrifugoinnin jälkeen (12 000 g, 30 min, 4 ° C), supernatantit kerättiin huolellisesti, ja jäädytettiin nopeasti -70 ° C: ssa. Tallennetut kudosnäytteet osittain sulatettiin ja noin 30 mg kudosta hienonnettiin steriileissä olosuhteissa kunnes tasainen johdonmukaisuus saatiin. Sitten näyte siirrettiin steriiliin 1,5 ml: n mikro- sentrifugiputkeen, ja sekoitettiin 200 ul: CHAPS lyysipuskuria. RNaasi-inhibiittori (Takara Biotechnology, Dalian, Kiina, 100 yksikköä /ml) lisättiin CHAPS hajotuspuskuria ennen uuttamista. Proteiinipitoisuus mitattiin Bradfordin menetelmällä [10]. Lopullinen uutteet laimennettiin pitoisuuteen 2 ug /ul proteiinia hajotuspuskurilla ja välittömästi säilytettiin alikvootteina -70 ° C: ssa.

kokonaistilavuus reaktioseosta oli 20 ui ja se sisälsi 1 x GoTaq flex-puskuria , 1,8 mM MgCl

2, 50 uM kutakin dNTP: tä, 160 nM modifioitu substraattispesifisyys oligonukleotidialuketta (MTS), 140 nM käänteisaluketta sidottu koetin, 1unit on GoTaq DNA-polymeraasia (Promega Corporation, Madison, WI, USA), ja 1 ui telomeraasia otteita. PCR suoritettiin käyttäen ABI StepOne Real-Time Cycler (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA). 30 min inkuboinnin jälkeen 30 ° C: ssa telomeraasin venymä, reaktioseosta kuumennettiin 95 ° C: ssa 3 min inaktivoimiseksi telomerase, jonka jälkeen 40 syklin monistusta (94 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 60 sekuntia kuten 10- sekuntia levyn käsittely). Kymmenen mikrolitraa kutakin näytettä uutetta inkuboitiin 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan ja sitten sen yksi kymmenesosa tilavuudesta, lisättiin toiseen rinnakkain reaktiot kuin kuumainaktivoimista ohjaus. Jokaisessa kokeessa, 1 ui CHAPS lyysipuskuria substituoitu proteiini-uutetta käytettiin negatiivisena kontrollina.

TSR8 on oligonukleotidi identtinen MTS aluketta pidennetään kahdeksan telomeerisesti toistoja AG (GGTTAG)

7, jota voidaan käyttää standardina määrän arviointiprosessi MTS alukkeiden kanssa telomeerisesti toistojen pidennetään telomerase tietyllä otteen. Lisäksi havaitseminen TSR8 osoittaa, että vahvistus vaihe TRAP määritys suoritettiin tehokkaasti [11]. Suorittaa TRAP määrityksessä, 1 ui kutakin TSR8 laimennosta (0,2 amol /ui, 0,04 amol /ui, 0,008 amol /ul ja 0,0016 amol /l, vastaavasti) käytettiin, jolloin saatiin standardikäyrä, jossa 0,001 amol TSR8 vastaa kutakin yksikkö TPG (Total Production Generated). Saat pätevä analyysi, asianmukainen valvonta on sisällytetty jokaiseen määrityksessä:

i) kuumainaktivoimista ohjaus: uutteen näyte kuumennettiin 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan; ii) negatiivinen kontrolli: lyysipuskuria korvata proteiinia ote ja iii) positiivinen kontrolli: telomeraasia positiivinen solu-uutteiden. Joskus positiivinen telomeraasiaktiivisuutta voitiin havaita vain in laimennetun uutteen eikä niitä voi havaita enemmän uutetiivisteet koska kudosuutteen voi sisältää Taq estäjiä. Joten jokaisen kudosnäytteessä, vähintään kolme proteiinia pitoisuuksina (2 ug /ul, 0,2 ug /ul, 0,02 ug /ul) testattiin kahtena kappaleena, jossa on korkein TPG arvo pidettiin lopullisessa telomeraasiaktiivisuudelle.

RNA uuttaminen ja Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi hTERT ASVs

Yhteensä RNA uutettiin jäädytetyistä näytteistä kanssa TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA laatu arvioitiin denaturoivalla agaroosigeelielektroforeesilla. Vain näytteet terävillä 18 S ja 28 S rRNA bändejä ja heikentymättä käytettiin lisäanalyysiä. Kaksi mikrogrammaa RNA: ta kustakin näytteestä käytettiin cDNA tuotantoon käyttämällä M-MLV-käänteistranskriptaasia ja sattumanvaraisia ​​heksameerejä (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Laimennettu cDNA (1:10 laimennos) käytettiin monistamiseen ohjaus GAPDH arvioida käänteistranskriptio tehokkuutta sekä RNA eheys.

Reaaliaikainen PCR suoritettiin kokonaistilavuudessa 15 ui, joka sisälsi 1 x GoTaq flexi puskuria, 5 mM MgCl

2, 200 uM kutakin dNTP: tä, 1 yksikkö GoTaq DNA-polymeraasia, 800 nM alukkeita (eteenpäin ja taaksepäin), 400 nM antureista ja 1 ui laimennettua cDNA (1:10 laimennus). Hehkutus lämpötila oli erilainen eri ASV. Pyöräilykomponenttien protokolla koostui 3 min alkudenaturaatio 95 ° C ja 40 syklin monistusta (94 ° C 15 s, hehkutus lämpötilassa 60 sekunnin myös levyn käsittely). Kun testataan jokaisen ASV transkriptio erityisten alukesettiä, kaksi transkription tuotteita, tai ilman poisto olisi täydennetty samanaikaisesti, mutta Beacon koetin vain hybridisoitui poistamisen kanssa transkription tuote ja pääsee fluoresenssi [12]. Ct-arvo kunkin hTERT silmukoivat normalisoitiin Ct-arvo GAPDH vähentämällä GAPDH Ct-arvo kohde Ct-arvo. Suhteellinen ekspressiotaso kohde PCR laskettiin käyttäen yhtälöä [13]: Suhteellinen lauseke = 2

– [Ct (kohde) -Ct (GAPDH)] x 10000. HTERT ASV osatekijän suhde (lasketaan jakamalla suhteellisen ilmentymisen arvo koko transkriptien kuin ASVs) määritettiin myös kullekin kudosnäytteen.

Tilastollinen analyysi

Basic kuvailevan tilastotiedot olivat saatu SPSS 11.0 ohjelmistolla. Spearmanin korrelaatiokertoimet (r) laskettiin arvioimaan järjestöjen keskuudessa telomeraasiaktiivisuutta, hTERT ASV ilmaisun ja kliinis tiedot. Erot telomeraasiaktiivisuutta tai määrällinen hTERT ilmaisun välillä analysoitiin alaryhmää arvioi parittomalla t-testillä tai yksisuuntaista ANOVA. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

kvantifiointi telomeraasiaktiivisuuden ja hTERT ASVs kasvainsolulinjoissa

herkkyys ja lineaarisuus RPP-pohjainen real -Aika TRAP määritys arvioitiin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549. Solupelletit, joka sisälsi noin 10

6 solut suspendoitiin uudelleen 200 ui CHAPS lyysipuskuria, joten uutteet vastasi telomeraasiaktiivisuuden 5000 solua per mikrolitra. Telomeraasin uutteet sarja- laimennettiin 1000-1 solun mikrolitraa kohti, ja 1 ui uutetta käytettiin kvantifiointia telomeraasiaktiivisuuden kolmena rinnakkaisena. Telome- otteita lisäisi telomeerisiä toistojen kiinni 3′-päähän alustan oligonukleotidin (MTS) ensimmäisessä inkubaatiovaiheen ja tuotteet monistettiin templaattina myöhemmässä PCR-prosessin. Kuten kuviossa 1 on esitetty, käyttäen TRAP-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (TRAP-PAGE) määrityksessä, telomeraasiaktiivisuuden voitiin havaita vähintään kymmenen A549-soluja, osoittaa, että läsnä on näkyvissä heksanukleotidialuk- tikkaita PCR-tuotteiden polyakryyliamidigeelissä. Kuitenkin käyttämällä RPP-pohjainen reaaliaikainen TRAP määritys, telomeraasiaktiivisuutta voitiin havaita niin vähän kuin yksi A549. Lineaarinen suhde havaittiin myös välillä telomeraasiaktiivisuus ja logaritmi solujen lukumäärä vaihtelee 1-1000 soluja. Korrelaatiokerroin laskettiin lineaariregressiomallin oli jopa 96,4%. Sisältää telomeraasin Uuton RPP-pohjainen reaaliaikainen TRAP määritys voisi olla valmis kolmen tunnin, kun taas TRAP-PAGE veisi vähintään 5 tuntia. Tärkeää on, että RPP-pohjainen reaaliaikainen TRAP määrityksessä oli tarkasti kvantitatiivinen ja toistettavissa. Kuten on esitetty taulukossa 1, solulinjat A549, H1299, SPC-A1 ja PAA osoittivat johdonmukaisesti telomeraasiaktiivisuuden 14,22-31,43 TPG yksikköä 100 solua.

Molekyylimajakat ovat herkkä ja spesifinen, koska koettimet eivät hydrolysoidaan vahvistusta ja ainoastaan ​​tunnistaa täydellisesti täydentävä tavoitteita. Määrälliseen hTERT ASVs, molekyylimajakka koetin hybridisoituu vastaavaan selostukset ja valvoo synteesiä spesifisten nukleiinihappojen reaaliajassa. Esimerkiksi koetin H1810 on komplementaarinen DNA-sekvenssi yhtymäkohdassa eksonin 3 ja eksonin 4 hTERT-geenin, ja se hybridisoituu kaikkiin hTERT transkriptit ja tunnistaa siten yleistä hTERT-transkriptien, mukaan lukien normaalien ja variantti liittämiseen transkriptit. Kuitenkin koetin A2173, B2331 ja R2699 tunnistaa vain α, β tai γ poistetaan transkriptien vastaavasti. Käyttämällä äskettäin kehitetty kvantifiointiin protokollaa, SPC-A1-solut, kaikki kolme poistetaan silmukoinnin transkriptit havaittiin, jossa suhde 0,21, 0,26 ja 0,04 α, β tai γ poistetaan transkriptien (taulukko 1 ja kuvio 2), joka aiheuttaisivat osittainen funktionaalinen selostukset ja saattaa selittää sen alhaisen telomeraasiaktiivisuutta. Muissa solulinjoissa γ-t-transkripti ei havaittu ja ekspressiotasot α-t-transkriptien (alue, +0,25-+0,44) olivat suuremmat kuin β poistetaan transkriptit (taulukko 1).

edustaja lineaarisen vahvistuksen käyrät on esitetty havaitsemiseksi kvantitatiivisesti yleisen hTERT (A), α-t (B), β-t (C) ja γ-t (D) transkriptien osalta. GAPDH toimi sisäisenä kontrollina. NC: negatiivinen kontrolli.

kvantifiointi telomeraasiaktiivisuuden ja hTERT ASVs Lung Tuumorinäytteissä

ansaan määrityksessä kasvainkudoksen näytteen tulokset molemmissa polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja monistuskäyriä ja RPP-pohjainen reaaliaikainen TRAP osoitti lineaarinen suhde telomeraasiaktiivisuus ja logaritmi proteiinipitoisuus (kuvio 3). Yhdessä tapauksessa okasolusyöpä, telomeraasiaktiivisuuden voitiin havaita proteiinin konsentraatio oli niin alhainen kuin lähes 0,002 ug /ul. Saada luotettavaa määrällistä TRAP tulos, vähintään kolme proteiinikonsentraatioilla (0,02, 0,2 ja 2 ug /ul) kahtena kunkin kasvaimen näytteen analysoitiin kahdella erillistä koetta.

Serial laimennetun proteiiniextraktien 2 ug 0,0002 ug testattiin telomeraasiaktiivisuutta yhdessä tapauksessa okasolusyöpä. Tulokset geelielektroforeesi (vasemmalla), vahvistus juoni (yllä) ja standardi käyrät (alla) osoittivat johdonmukaisesti lineaarista suhdetta telomeraasiaktiivisuudelle ja proteiinipitoisuus, kun taas 6 edustaa negatiivinen kontrolli.

Kaikissa 165 yksilöitä keuhkojen kasvain kudosten, telomeraasiaktiivisuuden vaihteli 0,39-482,46 TPG yksikköä (taulukko 2). Keskimääräinen telomeraasiaktiivisuutta miehillä oli merkittävästi suurempi kuin naispuolisilla potilailla (P = 0,006). Telomeraasiaktiivisuus negatiivisesti yhteydessä kasvaimen erilaistumiseen (r = 0,022, P = 0,005), jossa heikosti eriytetty kasvaimia osoitti korkeimman telomeraasiaktiivisuuden. Telomeraasiaktiivisuus oli merkitsevästi erilainen eri neljä histologista fenotyypit keuhkosyövän (P = 0,001), joka arvioitiin myös pareittain. Yhdistetyssä pienisoluisen ja okasolusyöpä (CSS) osoitti korkeimman telomeraasiaktiivisuudelle (vs. muut kolme histotypes, P = 0,001), minkä jälkeen Scc ja adenosquamous karsinooma (ASC) (vs. muut kolme histotypes, P = 0,025 vastaavasti), kun ADC osoitti alimman telomeraasiaktiivisuudelle (vs. muut kolme histotypes, P = 0,001). Ei assosiaatio telomeraasiaktiivisuudelle ja TNM havaittiin tässä tutkimuksessa (P 0,05).

kvantifiointi yleistä ja poisto liitos hTERT selostukset tehtiin kaikissa kasvaimen näytteitä. Vuonna Spearman analyysi, ei ollut merkitsevää korrelaatiota ilmentymisen hTERT yleisen selostukset ja telomeraasiaktiivisuus (r = 0,092, P = 0,241), ja välillä ilmaus hTERT yleisen selostukset ja kaikki ennusteeseen viittaavia parametrien (P 0,05). Α, β ja γ poistetaan transkriptit havaittiin 41,82%, 92,12% ja 16,36%: lla potilaista, ja niiden keskimääräinen ainesosan suhde oli 0,12, 0,23 ja 0,18 vastaavasti. Vain 16 potilasta ilmaisi kaikki kolme poistetaan transkriptien samanaikaisesti. Oli merkittävää, että kaikki kolme poistamisesta selostukset Osatekijän suhdelukuja korreloi merkitsevästi telomeraasiaktiivisuus, kun korrelaatiokerroin oli -0,267 varten α-poisto transkripti (P ​​= 0,026), -0,693 varten β-poisto transkripti (P ​​= 0,0001) ja -0,614 varten γ-poisto transkripti (P ​​= 0,001), tässä järjestyksessä. Miehillä keskimäärin osatekijän suhteet kolmen poistot olivat alhaisemmat kuin naispuolisilla potilailla, sopusoinnussa korkeamman telomeraasiaktiivisuudelle joukossa. Kuitenkin vain β-poisto ja γ-poisto osoittivat merkitsevää eroa mies- ja naispotilaiden (P = 0,006, P = 0,027, tässä järjestyksessä). Kuten pareittain vertailuja histologisen alatyyppejä ja kolme poisto transkription osatekijän suhteet, CSS osoittivat huomattavasti alemman osatekijän suhde β-poisto (P = 0,011) ja γ-poisto (P = 0,015) kuin ADC. SCC esitti ainoastaan ​​alempi osatekijän suhde γ-poisto (P = 0,006) kuin ADC. Ei ollut merkittävää yhdistyksen välillä poistoista transkription ainesosan suhteen ja kasvaimen erilaistumiseen, vaihe tai imusolmuke etäpesäke. Lisäksi potilailla, joilla on keuhkopussin etäpesäkkeitä osoitti merkittäviä suurempi transkription osatekijän suhde β-poisto (P = 0,041), mutta ei muissa kaksi deleetioita (P = 0,227 ja P = 0,735 vastaavasti).

Keskustelu

Koska telomerase ilmentyy lähes 90% kaikista ihmisen syövistä, on ollut suurta kiinnostusta kehittää telomeraasiestäjä määritys soveltuu kliiniseen testaukseen [14]. Koska päätepiste ja semi-kvantitatiivisen analyysin, perinteinen TRAP on alhainen suoritusteho, rajoitettu tarkka kvantifiointi ja todennäköisesti vääriä negatiivisia, koska PCR-monistuksen tehokkuus voi estyä proteiinia solu-uutetta. Kvantifiointi telomeraasiaktiivisuuden käyttäen reaaliaikaista analyysi on tarkempi, koska se perustuu Ct määritettyjen aikana eksponentiaalisen vaiheen PCR suhteellisen pienillä pitoisuuksilla PCR-tuotteen ennen kylläisyyttä tai tasanne. Edellinen reaaliaikainen kvantitatiivinen TRAP fluoresoivilla väreillä tai Taqman koetinta on epätarkempi ja rajoitetumpia sen määrällinen potentiaalia, koska ei yksi-yhteen vastaavuus välillä fluoresenssin ja PCR-tuotteen [15], [16]. Täällä on kuvattu uusi kvantitatiivinen TRAP määritys käyttämällä käänteinen aluke sidottu koetin (RPP). RPP on molekyyli kytkin havaita DNA monistaminen hyödyntämällä energian kuljetus fluorofori (FAM) ja sammuttaja (DABSYL). OFF ON siirtyminen tapahtuu, kun konformaation RPP muuttuu ”suljettu” molekyylin sisäinen varsi-silmukka-rakenteen ”avoin” laajennettu rakenne. Tämä rakenteellinen muutos saavutetaan, kun yksi RPP on sisällytetty kaksijuosteinen DNA-molekyyli, PCR: llä. Vahvistus voidaan seurata suoraan mittaamalla fluoresenssi reaktioseoksen. Tässä tutkimuksessa telomeraasiaktiivisuutta osoitti tyydyttävää lineaarisen suhteita logaritmin viljeltyjen solujen määrä tai proteiinipitoisuus oikealla alueella. Telomeraasiaktiivisuus voitiin havaita niin vähän kuin yksi viljellään kasvainsolun tai niin alhainen kuin 0,002 ug proteiinia kasvainkudoksessa. Yhdenmukainen edellisen raportin fluoreseiini-koetin-pohjainen reaaliaikainen TRAP määritys antoi nopeampaa, tarkkoja tuloksia telomeraasiaktiivisuutta kvantifiointiin kuin perinteiset TRAP kanssa geelielektroforeesilla [17]. Aiemmissa tutkimuksessa selvitimme telomeraasiaktiivisuudelle 60 keuhkosyöpään kudoksia käyttäen SYBR Green reaaliaikaisia ​​TRAP, suhteellinen kvantitatiivinen analyysi, ja vain löysi ero telomeraasiaktiivisuudelle välillä NSCLC ja CSS [9]. Tässä tutkimuksessa olemme soveltaneet RPP-pohjainen reaaliaikainen TRAP suurempi määrä keuhkojen kasvain kudosnäytteitä (165 tapausta) ja käytettiin standardikäyrää analyysiä. Merkittävä ero telomeraasiaktiivisuutta neljälle histologista tyyppiä todettiin: CSS Scc ASC ADC, mikä oli sopusoinnussa Fujiwara raportissa [18]. Ohmura ja Maniwa ovat raportoineet korkeampi telomeraasiaktiivisuus NSCLC (42,3 ja 75,24 TPG yksikköä vastaavasti), jossa arvioidaan 60 ja 40 tapausta vastaavasti, ja käytettiin puolikvantitatiivinen menetelmillä [19], [20]. Katsomme, että tällaisia ​​ristiriitoja voitaisiin katsoa monimuotoisuuden populaatioissa ja otoskoko, ja erityisesti eri tekniikoita käytetään havaitsemaan telomeraasiaktiivisuutta. Se oli myös ristiriitaisia ​​kirjallisuudessa, vastaako telomeraasiaktiivisuuteen korreloi aggressiivinen kliinis-, kuten kasvain erilaistuminen ja TNM-luokitus [6], [19] – [21]. Käyttämällä RPP-pohjainen reaaliaikainen TRAP, havaitsimme vahva korrelaatio telomeraasiaktiivisuudelle ja kasvaimen erilaistumista. Oli mielenkiintoista, että ero telomeraasiaktiivisuus mies- ja naispotilaiden havaittiin tässä tutkimuksessa. Tämä naispotilaiden pääasiassa kärsi Adc, joka oli pienempi telomeraasiaktiivisuutta kuin muihin alatyyppeihin, voivat edistää niiden pienempi telomeraasiaktiivisuutta kuin miespotilailla. Näin ollen, telomeraasiaktiivisuuden näyttää olevan käyttökelpoinen markkeri määritettäessä histologinen tyyppi ja erilaistumista keuhkokarsinoomia.

Jotkut kirjoittajat väittivät, että havaitseminen hTERT mRNA: RT-PCR: llä tai in situ -hybridisaatiolla voitaisiin käyttää arvioimaan telomerase aktiivisuus [5]. Kuitenkin transkription ja posttranskriptionaalisella sääntely hTERT oli monimutkainen ja ei täysin tunneta. Aiemmin alukesarjaa tai Taqman koetinta ulottuen deleetiokohdasta käytettiin useimmissa tutkimuksissa silmukoivat tutkimuksista [22] – [26]. Nämä alukesarjoista tai koettimet saattavat monistamaan sekä täyspitkä transkriptien ja poisto selostukset vuoksi porrastettu hehkutus vaihtelevia malleja. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme kehittäneet kvantitatiivinen määritys käyttäen molekyylimajakat ja havaitaan kaikki kolme deleetio-transkriptien SPC-A1-soluja. Löysimme suhteellinen korkea osatekijän suhteen (vaihteluväli 0,21-0,44) varten α-poisto transkriptien neljässä keuhkosyövän solulinjat, joka ei vastaa tietojen näkyy alhaisempia osatekijän suhteen (vaihteluväli 0,06-0,15) aiemmin [1] , [25], [27]. Tämä voi johtua myös käyttämällä täsmällisempiä molekyylimajakan, eikä semikvantitatiivista nested PCR-määrityksissä. Kuviot hTERT ASVs osoitettiin vaihdella rinta-, maksa-, maha-, koolon-, kilpirauhas- ja keuhkojen kasvainten, jossa positiivinen määrien hTERT ASVs olivat luultavasti liian suuriksi monistamalla alueella, joka kattaa sekä deleetiokohdat [1], [11] , [21] – [24], [26], [28]. Meidän kvantitatiivinen määritys kullekin poistamista transkriptin tarjoaa ratkaisun tarkasti määrällisesti ASV ilmaisun ja arvioida sen suhde klinikan-patologinen parametrit.

Tässä tutkimuksessa ei yhdistyksen välillä yleistä hTERT selostukset ilmaisun ja telomeraasiaktiivisuus havaittiin, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien muissa kasvaimissa [29], [30], jossa todettiin, että se ei ollut järkevää korvata yleistä hTERT mRNA tunnistus telomeraasiaktiivisuutta arviointia. Olemme havainneet, että yli 92%: lla potilaista ilmaisi vähintään yksi deleetio transkription, mutta vain 9,7% laskettuna kaikkien kolmen poistetaan transkriptit. Huomattavaa on, että osatekijän suhteet kolmen poistamisesta transkriptit korreloi merkitsevästi telomeraasiaktiivisuutta. Β-poisto transkriptit olivat yleisimpiä silmukointivariantit useimmissa keuhkokarsinoomia ja näytti vahvin korrelaatio telomeraasiaktiivisuutta. Tämä on samanlainen kuin edellinen havainnot muissa elimissä [11], [22] – [24], [26].