Krooninen sairaus

tiivistelmä

rooli mesothelial kerroksen vatsakalvon syöpäsolujen leviämistä on vain osittain selvitetty. Tässä yritimme määritellä paremmin mesothelial osuus kasvaimen soluadheesiota suoralla tarttuvuus testiä sovelletaan ihmisen ensisijainen viljelmät mesoteelisolujen (HPMC) johdettu vatsakalvon pesut potilaiden mahalaukun ja peräsuolen syöpiä. Mahalaukun ja paksusuolen karsinooman solut ympättiin eri mesothelial yksisolukerrosten ja kvantitatiivinen fluoresenssin analyysi suoritettiin analysoida niiden kasvua ja adheesio-ominaisuudet. Adheesiota syöpäsolujen ei vaikuttanut alkuperää HPMC saatua potilailla, joilla on eri syöpiä tai hyvänlaatuinen sairaus. Sitä vastoin korkeita ICAM1 ilmaisun ja ROS, jotka luonnehtivat näiden senescent mesoteelisolujen, parantaa kasvaimen soluadheesiota. Nämä tulokset viittaavat siihen, että mesothelial liima ominaisuudet riippuvat solun vanhenemista, kun taas ei vaikuta kasvain ympäristössä. Käyttö vatsakalvon pesuja lähteenä eristämiseksi HPMC tarjoaa käytännöllisen ja luotettava työkalu in vitro analyysi mesothelial vaikuttavissa olosuhteissa vatsakalvon carcinomatosis.

Citation: Ranieri D, Raffa S, Parente A, Rossi Del Monte S, Ziparo V, Torrisi MR (2013) hyvä tarttuvuus kasvainsolujen mesothelial Yksikerrokset Saatu Peritoneaalisille Wash laajalle levinneestä Mahalaukun Syövät. PLoS ONE 8 (2): e57659. doi: 10,1371 /journal.pone.0057659

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 09 lokakuu 2012; Hyväksytty: 24 tammikuu 2013; Julkaistu: 25 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Ranieri et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu avustuksia MIUR ja AIRC – Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 10272), Italia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

vatsakalvon leviämistä maha- ja peräsuolen syöpien edustaa usein jälkeiseen tapahtumaan parantava resektio [1] – [3]. Kriittinen vatsakalvon toistuminen on tarttuvuutta vapaan levittää syöpäsolujen mesothelial kerros ja monet eri molekyylitason mekanismeja suoraan mukana tässä prosessissa on tunnistettu [4]. Sillä vatsakalvon carcinomatosis, syöpäsolut on pystyttävä selviämään vatsaonteloon, kun irrotettu primaarikasvaimen, ja täytyy näyttää proliferatiivista ja invasiivisia käyttäytymistä, kun kiinni mesothelium. Vaikka monet tutkimukset ovat osoitettu analyysin ekspression ja aktivaation molekyylitason, jotka ovat vastuussa peräkkäisen biologiset muutokset eri syöpäsolujen [5] – [7], vain rajoitettu määrä raportteja on keskittynyt panos mesothelial kerroksen tarttuvuus ja vatsakalvon leviäminen syövän [8] – [10].

yksityiskohtaisen analyysin molekyylitason mekanismeja, jotka vaikuttavat liiman vaiheessa eri in vitro tai ex vivo on kehitetty [11] – [13] ja primääriviljelmät mesoteelisolujen on saatu testata syöpäsolujen tarttumista läsnä ollessa edistää tai häiritseviä aineita [8], [12]. Useimmat näistä malleista hyödyntävät joko vakiintuneet solulinjat tai ihmisten ensisijainen viljelmiä mesoteelisolujen eristetty omental fragmentit [10], [14] – [15]. Kuitenkin on ehdotettu, että myös vatsakalvon pesuja, että kultainen standardi läsnäolon arvioimiseksi vatsakalvon levittämistä mahalaukun ja peräsuolen syöpä [16] – [18], ovat hyvä ja käytännöllinen lähde mesoteelisolujen sitä voidaan lisätä in vitro [19], vaikka niiden käyttö yhteistyössä kulttuuri malleja ei ole tutkittu.

Adheesiomolekyylit merkittävä rooli vaiheessa joihin kiinnitys vapaasti syöpäsolujen vatsakalvon pintaan [4] ja sytokiinien, kuten interleukiini 1SS (IL1ß) ja tuumorinekroositekijä α (TNFa) julkaistiin tulehduksellinen mikroympäristössä, tiedetään edistävän niiden ilmentymistä [20], [21]. Niistä adheesiomolekyylien joilla on keskeinen rooli leviämisen neoplastisten solujen mesothelial yksikerroksista useat tutkimukset viittasivat tietty toiminto solujen välisen adheesiomolekyyli 1 (ICAM1) läsnä mesoteelisolujen edistämisessä prosessissa [10], [21]; Lisäksi on osoitettu, että jopa-modulaatio sen ekspression seurauksena oksidatiivisen stressin ja vanhenemista vatsakalvon solujen, edistää tarttumista neoplastiset solut munasarjojen, mahalaukun ja paksusuolen syövissä [22] – [24], osoittaa yleistä ja keskeistä roolia ICAM1 leviämisessä.

pyrkimys määritellä paremmin mesothelial panos syöpäsolujen tarttumista ja erityisesti mahdollista roolia mesothelial aktivoinnin syöpä ympäristössä matkii in vitro mahdollisimman paljon in vivo olosuhteissa, käytimme tässä suora tarttuvuus koe suoritettiin ihmisen ensisijainen viljelmiä mesoteelisolujen (HPMC) johdettu vatsakalvon pesut potilaiden mahalaukun ja peräsuolen kasvaimia tai potilaita, joilla on hyvänlaatuinen sairauksia, jotta jäljitellä in vitro niin paljon kuin mahdollista in vivo olosuhteissa. Kun tavoitteena minimoida mahdolliset vaihtelut johtuvat kasvaimen vastine, me Hyväksytty eri eristetty HPMC, kasvatetaan myös eri tasoilla Vanheneminen, kaksi tunnetaan hyvin syöpäsolun linjat. Tuloksemme osoittavat, että liima käyttäytyminen syöpäsolujen ei vaikuta alkuperä HPMC potilaista, joilla on eri kasvaimia. Kuitenkin meidän havainnot vahvistavat rooli vatsakalvon vanhenemista, parannetulla reaktiivisten hapen lajien ja ICAM1 ilmaisun, joka edistää kasvainsolujen tarttumista [22] – [24], ja viittaavat siihen, että käyttö vatsakalvon pesee lähteenä eristää ja levittää HPMC voidaan helposti soveltaa arvioida in vitro valtion mesothelium syöpäpotilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

ihmisen mesothelial Met- 5A solulinjassa [25], viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-/F12 (DMEM /F12), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) plus antibiootit ja hydrokortisonia (0,1 ug /ml), insuliinia (2,5 ng /ml), transferriiniä (2,5 ug /ml) ja seleenillä (2,5 ng /ml) (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MD, USA). Ihmisen kolorektaalisen adenokarsinooman Caco2 solulinjassa [18], [26], viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM), jota oli täydennetty 10% FBS: ää plus antibiootit (Sigma). Ihmisen mahalaukun adenokarsinooman AGS solulinja [18] viljeltiin Hamin F12 Medium (Sigma) täydennettynä 10% FBS plus antibiootit (Sigma).

Primääriviljelmät ja yhteistyö kulttuureissa

Primääriviljelmät Ihmisen peritoneaalisille mesoteelisolujen (HPMC) saatiin leikkauksen vatsakalvon pesuja [18] kärsivien potilaiden vatsakalvon carcinomatosis peräisin kolorektaalisyövän (# 062) tai mahasyövän (# 219) sekä sairastuneiden potilaiden ei-syöpä tauti (# 002), joille tehtiin leikkaus A yksikkö kirurgian Sant’Andrean Hospital. Luovuttaja kliinis ominaisuudet on kuvattu taulukossa 1. Kaikki potilaat olivat laajasti tietoa ja kirjallisen suostumuksensa tutkinnassa. Protokolla Tutkimuksen hyväksyi eettinen hallituksen Sant’Andrea Hospital, Rooma.

Jotta mahdollinen aktivoituminen vatsakalvon solujen kirurgisen prosessin vatsakalvon pesuja saatu lähtö- vaiheet leikkauksen. Kunkin potilaan, 40 ml vatsakalvon pesu kerättiin EDTA (50 pM). Vatsakalvon pesut sentrifugoitiin 1100 rpm 5 minuuttia RT: ssä ja pelletoitiin. Näytteet uudelleensuspendoitiin magneettisten merkintöjä 80 ui Mac® erottaminen puskurin (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa). Jos haluat poistaa epiteelisolujen komponentin vatsakalvon pesun ja näin rikastuttaa mesothelial osa immu- ehtyminen käyttäen anti-CD326 /EpCAM mikrohelmiä (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa) suoritettiin valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, MS erotuspylväät (Mac®, Miltenyi Biotec) oli tasapainotettu 0,5 ml Mac® erottaminen puskurin ja mikrohelmiä leimatut solut altistettiin magneettikentän läpi pylvään kulkua. CD326-negatiiviset solut pestiin pois pylväästä, ja maljattiin DMEM /F12, kuten edellä.

tarttumista kokeissa, Met-5A tai HPMC kasvatettiin konfluenssiin ja sen jälkeen 24 Caco2 tai AGS-soluja ympättiin on yksikerroksista.

morfologinen analyysi HPMC

HPMC morfologinen analyysi, kulttuuri näytteitä tarkkailtiin Zeiss Axiovert 200 -käänteismikroskoopissa varustettu vaihekontrasti (DIC) optiikka (Zeiss, Oberkochen , Saksa). Kvantitatiivinen analyysi monitumaisia ​​ja multivacuolated solujen suoritettiin laskenta kunkin soluviljelmässä yhteensä vähintään 250 solua havaitaan viisi mikroskooppikentäs- otetaan satunnaisesti kolme eri kokeita. Kaikki tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± SE. Merkittävyys laskettiin käyttäen Kruskal-Wallisin testiä tai pariksi Studentin t-testiä.

P

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Immunofluoresenssikoe

HPMC luonnehdinta soluja kasvatettiin peitinlaseilla ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä seuraa käsittely 0,1 M glysiiniä 20 minuutin ajan 25 ° C: ssa ja 0,1% Triton X100: ssa vielä 5 minuuttia 25 ° C: ssa, jotta läpäiseväksi. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 1 tunnin ajan 25 ° C: ssa seuraavat primaaristen vasta-aineiden: anti-sytokeratiineja (tunnustaa CK8 ja CK19 muun Cks) (1:100 PBS: ssä, klooni MNF116, Dako, Glostrup, Tanska) monoklonaalinen vasta-aine; anti-vimentiinista (1:100 PBS, klooni V9, Dako) monoklonaalinen vasta-aine; anti-calretinin (1:100 PBS; klooni DAK Calret 1; Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA, USA) monoklonaalinen vasta-aine; anti-CEA (1:100 PBS: ssä; Zymed, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) polyklonaalisia vasta-aineita; anti-EpCAM (1:10 PBS; Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Saksa) monoklonaalinen vasta-aine suoraan konjugoitu PE; anti-ICAM1 (1:10 PBS: ssä, StemCell Technologies, Vancouver, BC, Kanada) monoklonaalinen vasta-aine konjugoitiin suoraan FITC.

konjugoimattoman ensisijainen vasta-aineet visualisoitiin jälkeen tarvittaessa PBS: llä pesun, käyttämällä vuohen anti-hiiri- FITC: tä (1:50 PBS; Cappel Research Products, Durham, NC), vuohen anti-hiiri-Texas Red (1:200 PBS: ssä; Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA), vuohen anti-kani-FITC (1: 400 PBS: ssä; Cappel Research). Tunnistaa pyöräily solujen immunovärjäys suoritettiin anti-Ki67 kanin polyklonaalisia vasta-aineita (1:50 PBS; Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Tumat värjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (1:10.000 PBS, Sigma). Peitelaseja lopullisesti asennettuna 90% glyserolia PBS: ssä tarkkailtavaksi. Fluoresenssisignaalien visu- ApoTome System (Zeiss) liitetystä Axiovert 200 käännettyä mikroskooppia (Zeiss) ja kuva-analyysin suoritti Axiovision ohjelmisto (Zeiss) ja KS300 Image Analyzer-ohjelmisto (Zeiss).

Prosenttiosuus EpCAM /Ki67-positiivisten solujen yhteistyössä kulttuureissa Met-5A ja AGS tai Caco2 solut analysoitiin laskemalla yhteensä 500 solua sattumanvaraisesti havaittu 5 mikroskooppikentäs- jokaiselle eri ajankohtina (1 h, 24 h, 48 h) aikana kuluessa kokeilu. Prosenttiosuus ICAM1-positiivisten solujen HPMC analysoitiin laskenta kullekin primaariviljelmää yhteensä 300 solua sattumanvaraisesti havaittiin 10 mikroskooppikentäs- kolmesta eri kokeesta. Kvantitatiivinen analyysi ICAM1 fluoresenssi-intensiteetti suoritettiin analyysi 100 solua kutakin näytettä viidessä eri aloilla, otetaan satunnaisesti kolmesta eri kokeesta. Kaikki tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± SE. Merkittävyys laskettiin käyttäen Kruskal-Wallisin testiä tai Studentin t-testiä;

p

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi.

Adhesion määrityksessä

aliyhtyvät Caco2 tai AGS solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen DMEM seerumittomassa ja leimattiin 5 ul /ml Vybrant®DiI liuosta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) inkuboimalla 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Dil-leimattuja soluja pestiin kolme kertaa ja suspendoitiin uudelleen DMEM /F12 kuten edellä. Leimatut-solut suoraan maljattiin mesothelial yksikerroksista (25 x 10

3 /cm

2 yksikerroksisen) ja inkuboitiin 1, 24, 48 tuntia. Tarttuvuus määrityksissä anti-ICAM1 estävää vasta-ainetta (StemCell Technologies), inkubointi suoritettiin, kun läsnä oli eri laimennoksia (1:10, 1:05 ja 1:02) vasta-aineen. Liity vasta-ainetta (anti-sytokeratiineja, klooni MNF116; Dako) käytettiin negatiivisena kontrollina klo 1:02 laimennus. Ei-tarttuvat solut poistettiin runsas pesut seerumittomalla väliaineella, ja tarttuneet solut ja HPMC yksisolukerrokset kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, ja sen jälkeen käsittelemällä 0,1 M glysiiniä 20 minuutin ajan 25 ° C: ssa ja 0,1% Triton X-100 vielä 5 minuutin ajan 25 ° C: ssa, jotta läpäiseväksi. Tumat värjättiin DAPI. Tumat värjättiin DAPI (4 ’, 6-diamino-2-phenylindol) (1:10.000 PBS, Sigma). Kvantitatiivinen analyysi Dil-positiivisten solujen /mm

2 suoritettiin laskemalla positiivisten solujen 10 eri optisilla kentillä on 2,24 mm

2, otetaan satunnaisesti kolmesta eri kokeesta. Tulokset on ilmaistu keskiarvoina ± SE. P-arvot laskettiin käyttäen Kruskal-Wallisin testiä ja merkitsevyystasolla määriteltiin p 0,05.

reaktiivisia happiradikaaleja havaitseminen

reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) havaitseminen, HPMC soluja inkuboitiin 2 ’, 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCFH-DA, Fluka) (5 uM) 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa, pestiin huolellisesti PBS: llä ja heti havaittu alle Axioskop 2 mikroskooppi varustettu Pascal LSM 5 konfokaali laser skannaus (Zeiss, Oberkochen , Saksa) käyttäen argon laser, jossa on 488 nm: n virityksellä bändi. Päästöjen pitkä pass oli 505 suodatin: laserintensiteetin, pinhole halkaisija ja monistusvalo- asetukset pidettiin vakioina jokaisen kokeen [27]. Optimoinnin menetelmä, HPMC # 062 on kanava 2 käsiteltiin pro-hapetin Kumeenihydroperoksidi (Fluka Chemika, AG, Buchs, Sveitsi) erilaisilla annoksilla (100 ja 200 uM) läsnä vai ei antioksidantti E-vitamiini (15 ug /ml) ennen riippuvuuden DCFH-DA. Fluoresenssin intensiteetin (Fui, fluoresenssin intensiteetti Units) mitattiin Zeiss KS300 kuva analysaattorin (Zeiss) arvioidaan ainakin 200 solua jokaista kunnossa kolmeen eri mikroskooppikentästä. Esitetyt tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SE kolmesta eri kokeesta. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen pariksi t-testiä ja merkitys taso on määritelty

p

0,05.

sukupolvi pohjapinta solunsisäisten ROS mitattiin myös sy- tofluorimetrisillä määrityksessä. THE # 062 HPMC, käsiteltiin DCFH-DA kuten edellä, trypsinoitiin, pelletoitiin, resuspendoitiin esilämmitettyä keskipitkällä ja kerättiin MACSQuant® Analyzer virtaussytometrillä (Miltenyi Biotec GmbH). Heräte ja emissioaallonpituudet olivat 488 ja 525 nm vastaavasti (FL2-kanavalla). Vihreä fluoresenssi signaali analysoitiin MACSQuantify® ohjelmisto (Miltenyi Biotec GmbH) ja visualisoidaan kolmen vuosikymmenen log mittakaavassa. Keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti (MFI) laskettiin kolmen erillisen kokeen kanssa arvioinnin vähintään 20000 tapahtumia määrityksessä ja ilmaistiin suhteellisena fluoresenssin intensiteetti (keskiarvo ± SE). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen pariksi Studentin t-testi merkitsevyystasolla määritellään

p

0,05.

Tulokset

optimointi in vitro arvioimiseksi tarttumista syöpäsolujen mesothelial yksisolukerrokset

Yksi ensimmäisistä keskeinen vaihe vatsakalvon metastaattisen levittäminen ruoansulatuskanavan kasvaimet on syöpäsolujen tarttumista on mesothelial yksikerroksista [4]. Tutkia biologista käyttäytymistä sekä syövän ja mesoteelisolujen ja arvioida niiden ominaisuuksia tarttuvuus, ensin valittu ja sovitettu meidän olosuhteissa rinnakkaisviljelmätilanteessa järjestelmä ja in vitro testi tarttumisen (Fig. 1A), aiemmin käytetty munasarjasyöpää [12]. Ihmisen mesothelial solulinjassa MeT-5A kasvatettiin yhtymäkohdassa ja ihmisen mahalaukun adenokarsinooman soluja (AGS solulinja) tai ihmisen koolonkarsinoomasoluja (Caco2 solulinja) ympättiin yhteistyössä kulttuurin tiheys 25.000 solua /cm

2 mesothelial yksikerroksisen.

A) Kaaviokuva yhdessä viljelemisen järjestelmä ja adheesiotesti käytetään koko tutkimuksen: syöpäsolut ympättiin mesothelial yksikerroksisen arvioida soluadheesion. B) Met-5A mesothelial solulinjaa kasvatettiin yhtymäkohdassa ja AGS tai Caco2 soluja ympättiin mesothelial yksikerroksista yhteistyössä kulttuuri (25.000 solua /cm

2). 24 tunnin kuluttua siemennyksestä, yhdessä viljelemisen on vahvistettu, permeabilisoitiin ja värjättiin primaarisen vasta-aineen suunnattu vimentiinin, jonka jälkeen toissijainen Ab leimattu FITC fluorocrome (vihreä) tunnistamiseksi mesoteelisolut. Double immunofluoresenssilla α-EpCAM PE-vasta-ainetta (punainen) suoritettiin tunnistamaan syövän epiteelisolujen. Cellular tumat värjättiin DAPI (sininen). Immunofluoresenssitutkimukset analyysi paljastaa eri solutyyppejä meidän yhteistyössä kulttuuri malli. Vastaava signaali vimentiinin, että yksisolukerros on yhteensopiva, että väli lankojen, kuten perinuclear sytoplasminen nippuja, kun EpCAM värjäys liittyy solukalvon syöpäsoluja. Sekä AGS ja Caco2 solut näyttävät joko pienissä klustereissa tai eristää ja tiukasti kiinnittynyt mesoteelisolut. Bar: 10 um. C) faasikontrastimikroskopiaa käytetään tarkistaa eheyden mesothelium yksikerroksisen. 48 tunnin kuluttua kylvö, kiinnittyneet Caco2 solut näyttää mallia kasvaa kompakti saarilla, kun AGS kiinni solut osoittavat enemmän litistetty muoto ja yksittäinen kasvumallin. Bar: 100 pm. D) Proliferaatiomääritys suoritettiin immunofluoresenssivärjäyksen primaarisen anti-Ki67-vasta-aine, joka tunnistaa pyöräily solut, jonka jälkeen toissijainen FITC-leimattua Ab: n (vihreä). Kasvaimen solut leimattiin anti-EpCAM-PE Ab kuten edellä. 48 tunnin kuluttua siemennyksestä, jakelu syöpäsolujen positiivinen Ki67 ydin- signaalin paljastaa erilainen käyttäytyminen kasvaimen kasvun: eri eristetyn AGS soluja, Ki67

+ Caco2-solut sijaitsevat kehällä saaria. Bar: 100 pm.

tunnistaa eri solutyyppejä meidän yhdessä viljelemisen mallia, käytimme immunofluoresenssilla (IF) mikroskopialla. 24 tunnin kuluttua siemennyksestä, tunnistaa mesoteelisolujen muodostavat Met-5A yksikerroksista, me värjättiin co-viljelmät kanssa primäärisen vasta-aineen suunnattu vimentiinin, komponentti väliset filamentit solun tukirangan, jonka jälkeen toissijainen Ab leimattu FITC fluorocrome (vihreä): signaali oli sopusoinnussa rakenteen ja lokalisointi vimentiinista, joka ilmenee perinuclear soluliman filamenttikimppuja (Fig. 1 B). Syövän solut leimattiin α-EpCAM PE-vasta-ainetta, joka tunnistaa ihmisen epiteeli- adheesiomolekyylin ja suoraan konjugoituna fluorikromi PE (punainen): vastaava signaali, joka liittyy plasmamembraanin solujen kiinnittynyt yksikerroksista (Fig. 1 B) . Solu tumat värjättiin DAPI (sininen). Sekä AGS ja Caco2-soluissa esiintyi joko pieniä klustereita tai eristetty ja tiukasti kiinnittynyt mesoteelisolujen (Fig. 1 B).

arvioimiseksi liiman ominaisuudet syöpäsolujen, käytimme faasikontrastimikroskopiaa, joka saa tarkistaa mesothelium yksikerroksista ja poistaa epäilyksiä mahdollisuudesta syöpäsolujen kiinni lasista tai muovista tukea. Morfologiset analyysi 48 tunnin kuluttua kylvön osoitti, että kiinnittyneet Caco2-solut näytetään kuvion kasvaa kompaktin saarilla (Fig. 1 C). Sen sijaan AGS tarttunut solut ominaista litistyneempi muoto ja enemmän eristyksissä kasvumallin (Fig. 1 C).

Ymmärtääksemme paremmin biologista käyttäytymistä havaittu faasikontrastimikroskopiaa ja arvioida proliferaationopeus ja kiinnittyneet solut, käytimme IF analyysin kanssa Ki67 merkki, joka tunnistaa pyöräily soluja. 48 tunnin kuluttua siemennyksestä, co-viljelmät värjättiin primaarisen anti-Ki67-vasta-ainetta, jota seurasi sekundaarinen FITC-leimattua Ab: n (vihreä). Kasvaimen solut leimattiin anti-EpCAM-PE Ab kuten edellä. Vaikka lisääntymisnopeus kahden kiinni solutyyppejä, arvioidaan prosenttiosuus soluista positiivisia Ki67 ydin- signaali oli verrattavissa (21% ± 2 ja 23% ± 2 varten Caco2 ja AGS-soluissa, Kruskal-Wallisin testi:

p

= NS), jakelua paljasti erilainen käyttäytyminen syöpäsolujen (Fig. 1 D). Itse asiassa, toisin kuin AGS soluja, Ki67

+ Caco2-solut kehällä saaria, odotetusti niiden spontaani kyky erilaistua in vitro [26].

kvantitatiivinen arviointi tarttuvuus kaksi syövän solulinjojen MeT-5A yksikerroksista, käytimme lipofiilinen solujen merkkiaine Dil merkitä syöpäsolut ennen Adheesiokokeessa [12]. Kuvio 2A esittää saadut tulokset nykyajan käyttämällä Dil ja DAPI värjäys yhteistyössä kulttuureissa eri ajankohtina (1 h, 24 h, 48 h) alkaen kylvö. Kuvia 10 eri optisten kenttien arvottiin otetaan kuvattu materiaalit ja menetelmät. Numerot Dil

+ syöpäsoluja kohti mm

2 laskettiin sitten ja analysoitiin tilastollisesti, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Tulokset kuvassa 2B osoitti, että sekä Caco2 ja AGS solut kiinni mesothelial kerroksena yhtä suuri määrä 1 h yhteistyön kulttuuri. Kuitenkin tarttuvuus Caco2 soluilla oli taipumus kaksinkertaistaa jälkeen 24 ja 48 tuntia, kun taas AGS solut, vaikka hieman, mutta merkittävästi lisääntyvät aikana aikaväliä, olivat vähemmän lukuisat kuin Caco2 solut joko ajankohtina (

p

0,05). Koska lisääntymisnopeus kahden solutyypeissä 48 tuntia, kuten edellä on kuvattu, ei paljastanut eroja, jotka voivat selittää suurempi määrä Caco2 solujen kiinni yksikerroksista verrattuna AGS soluihin, tulokset Dil-pohjainen testi ilmestyi vastaamaan todellisia erilaisia ​​liima ominaisuuksia.

A) Met-5A mesothelial yksikerroksista kasvatettiin edellä kuvatulla tavalla. Caco2 ja AGS solut leimattiin Dil merkkiaine ja sitten ympätään yksikerroksista kuten edellä. Sen jälkeen 1, 24 ja 48 tuntia, co-viljelmät pestiin, kiinnitettiin ja tehtiin läpäiseviksi. Tumat värjättiin DAPI. Bar: 200 pm. B) kvantitatiivinen analyysi määrä tarttuneiden Dil

+ solua /mm

2 suoritettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Vaikka 1 tunnin kylvö sekä Caco2 ja AGS solut kiinnittyvät yksikerroksista vuonna yhtä paljon, klo 24 ja 48 tuntia ajankohtina lukumäärää Caco2 solujen lähes kaksinkertaistui verrattuna AGS, mikä lisää vain hieman, mutta merkittävästi vuosien ajan . Tulokset on esitetty keskiarvoina ± IC 95%. Tilastot: Studentin t-testiä:

* p

0,01 vs AGS 1 tunti;

** p

0,001 vs Caco2 1 tunti ja AGS 24 tuntia; ***

p

0,01 vs AGS 1 tunti ja

p

= NS vs AGS 24 tuntia; ****

p

0,001 vs Caco2 24 tuntia.

Adhesion syöpäsolujen ensisijainen ihmisen mesothelial yksikerroksista peräisin vatsakalvon pesuja

arvioimiseksi mahdollinen rooli mesothelium vuonna liimauksena syöpäsolujen meidän yhdessä viljelemisen järjestelmä, käytimme edellä testi ensisijainen viljelmiä mesoteelisolujen saatu vatsakalvon pestä kärsivien potilaiden vatsakalvon carcinomatosis peräisin peräsuolen tai mahasyövän ja ei- syöpä tauti. Itse asiassa, vatsakalvon huuhtelu edustaa käytännössä lähde mesoteelisolujen [19], käyttämisen sijasta omentum-fragmentteja.

karakterisoimiseksi ihmisen vatsakalvon mesoteelisolujen (HPMC), joka on saatu, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät, käytimme immunofluoresenssimikroskopialla (Fig. 3). Tunnistamaan ensisijaisen mesoteelisolujen muista solutyypeistä läsnä vatsakalvon pestä, kuten fibroblasteja, ja epiteelin syöpäsolujen, me värjättiin viljelmiä yhdistelmä vasta-aineita, jotka kohdistuvat tunnettuja mesothelial markkereita, kuten vimentiinin, sytokeratiineja (CK8 ja CK19) ja calretinin. Voit olla varma, että solut olivat mesenkymaaliset eikä epiteeli-, käytimme rinnan samassa vasta-Caco2 soluissa. Tulokset osoittivat, että HPMC olivat positiivisia sekä vimentiinista ja sytokeratiinia värjäys, joka esiintyi perinuclear soluliman kimppuja välikokoinen säie (Fig. 3, vasen paneeli). Kuten odotettua, Caco2 solut värjättiin negatiivisesti varten vimentiinista ja positiivisesti merkitty sytokeratiineja (Fig. 3, oikea paneeli). Yksiselitteisesti erottelemaan HPMC fibroblasteista mahdollisesti läsnä meidän kulttuureissa, solut leimattiin vasta-aineita calretinin, solunsisäinen kalsium sitovan proteiinin kuuluvat troponiini-C superperheen ilmaistu mesoteelisolujen: signaali oli soluliman hot-spots (Fig. 3, oikea paneeli). Jälleen epiteelin Caco2 solut olivat negatiivisia (Fig. 3, vasen paneeli). Sen sijaan, HPMC olivat negatiivisia epiteelin markkeri EpCAM, joka ilmaistiin plasmassa limakalvoja Caco2-solut (Fig. 3, pohjapaneelit, punainen signaali) ja tuumorimarkkeri karsinoembryoninen antigeeni CEA, jonka signaali oli nähtävissä joko solunsisäisen kohdetta tai solujen pinnoilla (Fig. 3, pohjapaneelit, vihreä signaali).

Ensisijainen ihmisen vatsakalvon mesoteelisolujen (HPMC) eristettiin vatsakalvon pesut, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Caco2 paksusuolen syövän soluja käytettiin kontrollina. Immunofluoresenssianalyysi käyttäen vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja mesothelial (vimentiinista, CK8 ja CK19 sytokeratiineja ja calretinin) ja epiteelin (EpCAM ja CEA) markkereita mukaan HPMC ovat positiivisia vimentiinista ja sytokeratiinia värjäys, joka näkyy perinuclear filamenttikimppuja, sekä kuuman -spotted calretinin signaali, mutta ovat negatiivisia solukalvon EpCAM värjäystä ja solun sisään ja pinta CEA signaali. Caco2 solut ovat positiivisia sytokeratiineja ja kaksinkertainen positiivinen EpCAM ja CEA epiteelin markkereita näkyvät solujen pinnalla (EpCAM, vihreä signaali) tai solukalvojen ja solunsisäisen paikkoja (CEA, punainen signaali). Tumat värjättiin DAPI. Bar: 20 pm.

määrälliseen arviointiin kyky kaksi syöpäsolun riviä (AGS ja Caco2 solut) kiinni eri HPMC yksisolukerroksiin, käytimme Dil merkkiainetta kuten edellä merkitä syöpäsolut ennen adheesiotesti. Jotta tulos käytimme kolme ensisijaista viljelmiä mesoteelisolujen johdettu vatsakalvon pesuja potilaiden ilman kohdunkaulan sairaus (Fig. 4A), jossa peräsuolen syöpä (Fig. 4B) tai mahasyövän (Fig. 4C) ja pystyimme vertailla osuus eri mesothelial yksisolukerrosten tarttumista samantyyppistä syöpäsolujen eri ajankohtina (1 h, 24 h, 48 h). Kvantitatiivinen analyysi tarttumista Dil

+ solujen HPMC monokerrokset (Fig. 4A-C) osoitti alhaisempia kiinnittymisen aikajänteellä sekä tuumorisolulinjoja verrattuna adheesiotesti suoritettiin Met-5A (ks. 2B). Näiden ensisijainen viljellyistä yksisolukerroksia, The Caco2-solut olivat kiinnittyneet kuin AGS solujen joko 24 tai 48 tuntia, riippumatta alkuperästä vatsakalvon pesee. Vaikka tarttuvuus Caco2 soluissa oli verrattavissa kaikkien mesothelial kerroksiin, riippumatta niiden lähteestä potilailta, joilla on todettu kasvaimia eikä hyvänlaatuinen sairaus, AGS solut näyttämään merkittäviä eroja niiden käyttäytymistä, joka osoittaa suurempi tarttuvuus HPMC alkaen paksusuolisyöpäpotilaalta (# 062) suhteessa HPMC joko mahalaukun syöpäpotilaasta (# 219) tai ei-syöpä tauti (# 002). Siten, vaikka adheesio ominaisuuksia mesothelial yksisolukerrosten näkyvät riipu syöpä ympäristöä, meidän co-kulttuuri malli pystyy havaitsemaan eroja HPMC.

HPMC eristettiin vatsakalvon pestä ei-syöpäpotilaan ( A, # 002), siitä on paksusuolen syövän potilaan (B, # 062) ja että mahan syöpäpotilaan (C, # 219), kasvatettiin yksisolukerros kuten edellä. Caco2 ja AGS-solut leimattiin Dil: n kanssa, ympättiin HPMC kerrokset, vasemmalle kiinnittyä eri ajankohtina (1, 24 ja 48 tuntia) ja pestiin sitten, kiinteät ja läpäiseviksi. Tumat värjättiin DAPI. Kvantitatiivinen analyysi määrä tarttuneiden Dil

+ solua /mm

2 suoritettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Itsenäisesti alkuperästä vatsakalvon pesujen Caco2 solut osoittavat korkeampia tarttumisen suhteen AGS 24 ja 48 tuntia. Vaikka adheesio Caco2-solut on samanlainen kaikille mesothelial kerrosta, AGS solut näyttää merkittäviä eroja, osoittaa suurempi tarttuvuus kerroksen # 062 osalta # 219 ja # 002. Tulokset kvantitatiivisen analyysin ilmaistaan ​​keskiarvoina ± IC 95%. Kruskal-Wallisin testi: A)

* p

0,05 vs AGS 1 tunti; **

p

0,01 vs Caco2 1 tunti,

p

0,01 vs AGS 24 tuntia; ***

p

0,05 vs AGS 1 tunti ja

p

= NS vs AGS 24 tunnin ****

p

0,01 vs Caco2 24 tuntia. B)

* p

0,01 vs AGS 1 tunti; **

p

0,01 vs Caco2 1 tunti,

p

= NS vs AGS 24 tuntia; ***

p

0,01 vs AGS 1 tunti,

p

= NS AGS 24 tuntia; ****

p

0,01 vs Caco2 24 tuntia. C)

* p

0,01 vs AGS 1 tunti; **

p

0,01 vs Caco2 1 tunti,

p

0,01 vs AGS 24 tuntia; ***

p

0,05 vs AGS 1 tunti,

p

= NS 24 AGS tuntia; ****

p

0,001 vs Caco2 24 tuntia.

rooli HPMC vanhenemista vuonna liimauksena

analysoida meidän mallin osuutta mahdolliset solu- ja molekyylitason mekanismeja, jotka voivat olla rooli eri liima ominaisuudet HPMC, me keskittäneet huomiomme mesothelial vanhenemista. Itse asiassa, joukossa fysiologisia ominaisuuksia mesothelial yksikerroksista, Vanheneminen taso HPMC uskotaan edistävän tarttumista kasvainsolujen [22] – [24]. Mielenkiintoista on, että meidän HPMC, on johdettu vatsakalvon pesun sijaan peräisin omentum näytteistä, näkyy jo ensimmäisen in vitro passage tunnettu ominaisuuksia vanhenemisen, kuten laajentuneessa morfologia, useita ytimiä ja sytoplasmista vakuolisaatiota [14].