Krooninen sairaus

tiivistelmä

Fanconin anemia (FA) potilaat ovat erittäin herkkiä kiinteitä kasvaimia, useita anatomisia kohteita kuten pään ja kaulan alueella. Osajoukko pään ja kaulan syöpien (HNCs) liittyy ”korkean riskin” HPV, erityisesti HPV16. Kuitenkin korrelaatio HPV onkogeenien ja syöpien FA potilailla on vielä epäselvä. Olemme aikaisemmin oppineet, että FA puute hiirillä altistaa HPV16 E7 siirtogeenisiä hiiriä HNCs. Käsitellä HPV16 E6: n onkogeeninen alle FA puute HNCs, käytimme HPV16 E6-siirtogeenisiä hiiriä (

K14E6

) ja HPV16 E6 /E7-bi-transgeenisiä hiiriä (

K14E6E7

) geneettistä taustat riittävä tai puutteellinen yhdelle

fanc

geenejä,

fancD2

ja seurataan niiden alttiutta HNCs.

K14E6

hiiriä ei kehittynyt kasvain. Kuitenkin E6 ja

fancD2

-puutos kiihtyi E7-ajettu kasvainten kehittymistä

K14E6E7

hiirillä. Lisääntynyt kasvaimen esiintymistiheys oli korreloi E7-ajettu DNA-vaurioita kuin lisääntymistä. Huomasimme myös, että puute taskussa proteiineja, pRb, p107 ja p130, jotka ovat vakiintuneita tavoitteita E7, voisi kerrata E7: n induktioon DNA-vaurioita. Meidän tulokset tukevat hypoteesia, että E7 indusoi HPV: hen liittyvän HNCs edistämällä DNA-vaurioita kautta inaktivaation taskun proteiineja, mikä selittää puute DNA-vaurioiden korjaus lisäisi alttiutta E7-odotuksiin syöpä. Tuloksemme osoittavat lisäksi odottamattomaan havaintoon, että FA puute ei altistaa E6 siirtogeenisiä hiiriä HNCs, osoittaa spesifisyyttä synergiaa FA puutteen ja HPV onkogeenien aiheuttaa HNCs.

Citation: Park JW, Shin MK, Pitot HC, Lambert PF (2013) korkea HPV-Associated pään ja kaulan syöpien FA hiirissä liittyy E7: n induktio DNA-vaurio kautta inaktivointi Pocket proteiinit. PLoS ONE 8 (9): e75056. doi: 10,1371 /journal.pone.0075056

Editor: Joseph S Pagano, University of North Carolina at Chapel Hill, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 06 elokuu 2013; Julkaistu 23 syyskuuta 2013

Copyright: © 2013 Park et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: lähde rahoituksen tälle työlle oli National Institutes of Health (NIH) (CA098428, CA022443). NIH ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Fanconin anemia (FA), joka on harvinainen heterogeeninen ja peittyvästi geneettinen sairaus, näyttöön kehityshäiriöitä viat ja poikkeavuudet Veren kantasolut, kuten luuytimen vajaatoiminta ja akuutti myelooinen leukemia, suuret fenotyyppejä näkyvät varhaislapsuudessa potilaista . Tähän mennessä 15 solun geenit (

SLL

geenejä) on tunnistettu, joille homotsygoottinen mutaatiot liittyvät FA tauti.

fanc

geenituotteet (Fanc) rakentavat DNA korjaukseen liittyvä reitti nimeltään FA polku useiden muiden solun proteiinien kanssa auttaa korjata vaurioitunut DNA, erityisesti DNA säikeiden- ristisidosten (ICLs) vahingot. Kahdeksan Fanc proteiinien (FancA, B, C, E, F, G, L ja M) toimivat vuorovaikutuksessa toistensa kanssa ja muodostavat proteiini monimutkainen kutsutaan FA ydin monimutkainen. FancL monimutkainen, joka on

E3

ubikitiinipromoottori ligaasiaktiivisuus laittaa mono-ubikitiini päälle FancD2 /I vaste DNA-vaurioita [1]. Lisäksi pysähtynyt DNA-replikaation haarukat S-vaiheen aktivoi FA polku [2]. Mono-ubikitinoitu FancD2 /I lokalisoitu sivustoja DNA-vaurion jossa ne ovat vuorovaikutuksessa muiden proteiinien tiedetään olevan osallisena korjaamisesta vaurioitunut DNA, kuten BRCA1, FancD1 /BRCA2, FancN /palb2 ja Rad51 johtaa DNA korjaukseen [3, 4]. Häiriöt tämä FA reitin johtaa lisääntynyt herkkyys DNA ristisitojia, kromosomi epävakaus, spontaani sisarkromatidin vaihtoa, ja solusyklin häiriöitä [5,6]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että mono-ubikitinoitu FancD2 rekrytoi kriittinen efektorimolekyyleille kuten FAN1 nukleaasia (tai SLX4) kautta ubikitiinistä sitojadomeenien [7,8]. Näin ollen, mono-ubikitinaation ja FancD2 on kriittinen paitsi sen kromatiinin lokalisointi, mutta joka toimii myös tukirakenteena tietyn DNA: n korjaukseen tekijät. FA polku toimii yhdessä homologisen rekombinaation korjaus järjestelmä (HR) ylläpitää perimän epävakaisuuden [9]. Ehtyminen FancD2 estää HR vastausta, mikä osoittaa, että HR toimii alavirtaan FancD2 [10]. Lisääntynyt genomin epästabiilisuuden uskotaan myötävaikuttavan lisääntyneeseen alttiuteen FA potilaiden syövän. Luuytimensiirto (HSCT) voisi olla ratkaisu auttaa vikoja hematopoieettiset solut. Senkin jälkeen onnistunut HSCT, levyepiteelikarsinoomien (SCC) pään ja niskan alueella tullut korkean riskin potilailla [11-15].

osajoukko pään ja kaulan syöpien (HNCs) (~ 25%) pääasiassa joukossa kasvaimia nielu väestössä on positiivinen korkean riskin ihmisen papilloomavirusten (HPV), erityisesti HPV-tyypin 16 (HPV16), joka koodaa kolmea onkogeeni, E5, E6 ja E7 [16,17]. Erityisesti FA potilailla Pohjois-Amerikasta suuri osa (84%) HNC johtuvat eri sivustoja pään ja kaulan alueella (toisin sanoen ei rajoitu nielu) todettiin olevan positiivisia korkean riskin HPV [18]. Sopusoinnussa roolin HPV näiden syöpien, mutaatiot p53, tuumorisuppressori, joka inaktivoituu HPV16 E6, ei todettu HNCs näistä potilaista. Kuitenkin potilailla Euroopan maista, HNCs oli HPV-DNA negatiivisia ja yli 50% näistä kasvaimista oli p53 mutaatioita [18,19]. Koska nämä ristiriitaiset kliinisiä tietoja, jää epäselväksi, onko HPV on tärkeä rooli HNCs syntyvät FA potilailla. Useat tutkimukset viittaavat osuus FA puutos HPV: hen liittyvän sairauden molekyylitasolla. Kudosviljelmässä, HPV16 E7 ilmentyminen osoitettu stimuloivan transkriptio

fancD2

[20] ja aktivoi FA reitin [21]. Toisessa tutkimuksessa hyödyntämällä organotyyppisten Ihmisen keratinosyyttien kerrata HPV elinkaari, HPV16 ja HPV18 aiheuttamaa epiteelin liikakasvu nostettiin

fancA

vajausta soluissa tai soluissa pudotti sen ilmaisu; toteaa, palauttaminen

fancA

ilmaus vaimennetaan tätä [22]. Nämä tutkimukset osoittavat, että on olemassa vuorovaikutusta HPV ja FA kautta.

laboratoriossa kehitettiin eläinmalli HPV: hen liittyvän HNCs käyttäen HPV16 onkogeenin siirtogeenisiä hiiriä, kun käsiteltävä kemiallisesti karsinogeeni, 4NQO, joka indusoi DNA: n adduktit sukua aiheuttamat tupakkaan liittyvä karsinogeenejä synergizes HPV16 onkogeeneillä aiheuttavan HNC [23]. Syövistä johtuvat meidän eläinmallissa osuus histopatologisia ja molekyylien ominaisuuksien HPV-positiivisten HNCs ihmisillä. Sivusto, jossa kasvaimet syntyvät on vähemmän rajoittava kuin ihmisillä, oletettavasti heijastava rakenteessa HPV transgeeniekspression koko hiiri suun /ylemmän GI epiteelin. Välillä E6 ja E7, HPV16 E7 on suurempi potentiaali aiheuttaa HNC eläinmalleissa [23,24] kanssa E6 osaltaan lisääntyneestä yhdessä E7 [25]. Panos HPV16 E5 HNC tässä hiirimallissa ei ole täysin selvitetty, mutta se näyttää olevan paljon pienempi kuin E7 (Strati ja Lambert, julkaisemattomat tulokset).

aiemmin arvioitu vaikutus FA reitin päälle ilmaantuvuus HNCs hiirissä ilmentävät vain HPV16 E7 onkogeeni. Puute FA reitin erittäin lisääntynyt HPV16 E7-ajettu kasvaimen esiintymistiheys [26]. Kuitenkin HPV-positiivisia ihmisen syövissä, E7 on aina todettu koekspressoitu yhdessä E6. Siksi nähden kuvatuissa tutkimuksissa käsiteltävät vaikutteita FA väylän pään ja kaulan syövän syntymistä yhteydessä hiiret ilmentävät E6- yksin tai yhdessä E7. Erityisesti meidän syntyy

K14E6

ja

K14E6E7

siirtogeenisiä hiiriä

fancD2

Riittävät ja vajausta taustoja. Havaitsimme merkittävän kasvun kasvaimen esiintymistiheys ja vakavuus neoplastisen taudin

K14E6E7 Twitter /

FancD2

– /-

hiirissä verrattuna

K14E6E7 Twitter /

FancD2

+ /+

hiirillä; kuitenkin,

fancD2

-puutos ei lisännyt myöskään lukema kasvaimien synnyn

K14E6

hiiriä, jotka ekspressoivat E6 yksin. Sekä HPV16 E6- ja E7-aiheutti lisääntymisenä tukevien solujen DNA-synteesin ja tämän täydennettiin on FA-puutteellinen tausta. Itse FA puutos yksinään lisäsi soluproliferaatioon. Mutta tämä induktio soluproliferaation ei korreloi vaikutuksen FA reitin päälle kasvaimien syntyyn. Toisaalta, taajuus epiteelissä kielen ja ruokatorvi ja γ-H2AX ydin- pesäkkeet positiivisissa soluissa, merkkiaine DNA-vaurioita vastaus, ei korreloinut kasvaimen esiintymistiheys. Tämä markkeri indusoitiin kudosten, jotka ekspressoivat E7-onkogeenin; katsoo, E6 ei indusoi tämän markkeri DNA-vaurioita vastaus. Lisäksi kaksi biomarkkereita, MCM7 ja p16, joita käytetään erottamaan HPV-positiivisten HNCs HPV-negatiivinen HNCs havaittiin olevan erittäin säädellään ylöspäin

K14E6E7

hiirillä riippumatta

fancD2

geeni tila , mikä osoittaa, että ne voivat olla hyödyllisiä määritettäessä HPV aseman HNCs syntyvien FA potilailla. Lopuksi havaittiin, että puute ilmentyminen taskussa proteiinien, pRb, p107 ja p130, jotka ovat asetettujen tavoitteiden E7, voisi kerrata E7: n induktio DNA-vaurioiden vasteita pään ja kaulan epiteelin. Nykyinen tutkimus tukee oletusta, että E7 indusoi HNC edistämällä DNA-vaurioita kautta inaktivaation taskun proteiineja. Tämä data voi selittää, miksi puute FA koulutusjakson lisää alttiutta E7-ajettu syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiret

K14E6

siirtogeenisiä

hiiret

[27]

ja K14E7

siirtogeeniset hiiret [28] on FVB geneettinen tausta, risteytettiin osoitteeseen

fancD2

knockout (

fancD2

– /-

) hiirissä [29], on 129S4 geneettistä taustaa, tuottaa F

1 hiirillä,

K14E6 /FancD2

+/-

ja

K14E7 /FancD2

+/-

(FVB /129S4 sekoitettu tausta). Kaikki kokeellinen hiirillä (

NTG /FancD2

+ /+

,

NTG /FancD2

– /-,

K14E6 /FancD2

+ /+

,

K14E6 /FancD2

– /-

,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

, ja

K14E6E7 /FancD2

– /-

hiiret) oli miehiä tuottama intercrossing F

1 hiirillä.

K14Cre /Rb

f /f

,

Rb f

/f /

p130

– /-

, ja

K14Cre /Rb

f /f /p130

– /-

tuotettiin samoilla

FVB /129 /C57

sekoitettu geneettinen tausta kuten aiemmin on kuvattu [30].

Rb f

/f /

p107

– /-

ja

K14CreER /Rb

f /f /P107

– /-

tuotettiin samoilla

CD1 /129 /C57

sekoitettu geneettistä taustaa kuten aiemmin on kuvattu [30]. Kaikki hiiret genotyypitettiin PCR: llä. -Hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti 0,3 ml bromideoksiuridiinia (BrdUrd; 12,5 mg /ml) 1 tunti ennen eutanasiaa mitata DNA-synteesin nopeus. Tongues ja esophagi otettiin talteen ja käsitellään kuten aikaisemmin on kuvattu [23]. Hiiriä pidettiin yhdistyksen arviointi Laboratory Animal Care-hyväksytty McArdle Laboratory Animal Care Unit. Kaikki menetelmät suoritettiin mukaisesti meidän eläinten protokollan hyväksymä University of Wisconsin Institutional Animal Care ja käyttö komitea.

4 -nitrokinoliini 1-oksidi (4NQO) aiheuttama pään ja kaulan syövän synnyn tutkimuksessa ja histologinen analyysi

hoito ja ohjeet histologista analyysiä kasvainten aiemmin kuvattu [26]. Lyhyesti, hiiriä käsiteltiin 4-nitrokinoliini-1-oksidi (4NQO; 10 ug /ml) niiden juomavedessä 8 viikkoa ja sitten pidetään ilman hoitoa vielä 16 viikkoa. Lopussa vaiheessa tai kun hiiret tulivat kuolemaisillaan, ne tapettiin, oireinen kasvaimia kielen ja ruokatorvi pisteytettiin, ja kudokset kerättiin histopatologista analyyseihin.

Immunofluoresenssikoe

Immunofluoresenssikoe suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [31]. Käytetyt vasta-aineet sisältyvät anti-p16 (1:50 5% rasvatonta maitoa /5% hevosen seerumia, M156, Santa Cruz Biotech.), Anti-Mcm7 (1: 200 5% hevosen seerumia, Neomarkers), anti-sytokeratiini 14 konjugoidun FITC (CK14; 1: 100 5% hevosen seerumia, CBL 197F, Millipore), anti-bromodeoksiuridiini (BrdUrd; 1:50 5% hevosen seerumia, Calbiochem), ja anti-γ-H2AX (1: 100 5 % hevosen seerumia, Millipore) B

kvantifiointi BrdUrd myönteisiä ytimet ja γ-H2AX pesäkkeitä positiivisten solujen

vähintään kolme hiirtä kustakin genotyypistä,

NTG /FancD2

+ /+

,

NTG /FancD2

– /-

,

K14E6 /FancD2

+ /+

,

K14E6 /FancD2

– /-

,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

, ja

K14E6E7 /FancD2

– /-

hiiret, valittiin ja -8 10 kuvaa (400x) solujen sisällä suprabasaalisissa (sytokeratiinivasta 14 negatiivinen) ja pohjapinta (sytokeratiinivasta 14 positiivinen) kerroksia kielen ja ruokatorven epiteeli kvantitoitiin kullekin hiirelle.

tilastollinen

yksipuolinen Barnard tarkkaa testiä käytettiin määrittämään merkitystä erojen avoin kasvaimen esiintymistiheys kunkin ryhmän hiirillä. Kaksipuolinen Wilcoxonin summa testiä käytettiin määrittämään merkitystä erojen vakavuuden avoin vaurio eläimen kielen ja ruokatorvi. Määrittämään merkitystä BrdUrd positiiviset ytimet ja γ-H2AX ydin- pesäkkeitä positiivisten solujen välillä kunkin ryhmän hiiret, kaksipuolinen Wilcoxonin-sum testillä.

Tulokset

Häiriöt FA polku lisää merkittävästi HPV-onkogeenin liittyviä kasvaimia E6 /E7 bi-siirtogeenisiä hiiriä, mutta ei E6 siirtogeenisiä hiiriä

Vastatakseen roolin E6 ja puutos FA väylän pään ja kaulan syövän synnyn , HPV16 E6 siirtogeenisiä (

K14E6

) ja HPV16 E7 siirtogeenisiä (

K14E7

) hiiriä risteytettiin

fancD2

-null hiirillä tuottaa neljä eri genotyyppiä;

K14E6 Twitter /

FancD2

+ /+

,

K14E6 Twitter /

FancD2

– /-

,

K14E6E7 Twitter /

FancD2

+ /+

, ja

K14E6E7 Twitter /

FancD2

– /-

hiirillä. Hiiriä käsiteltiin 4NQO, vesiliukoista kemiallinen karsinogeeni, joka toimii yhteistyössä karsinogeeni asiakkuutta HNCs meidän HPV16 siirtogeenisiä hiiriä [23], 8 viikon ajan ja sitten pidetään vielä 16 viikon ajan. 24 viikon päätepisteen, kielet ja esophagi kerättiin, pisteytettiin avoin kasvaimia, ja fiksoitiin, parafinoidut leikattuna ja histopatologisesti analyysejä arvioidakseen pahin vaihe kasvainsairaus.

fancD2

Riittävät tausta, vain kaksi 26

K14E6 /FancD2

+ /+

hiiriä (8%) kehittyi ilmeistä pään ja kaulan kasvaimet, joka ei ollut merkitsevästi erilainen kuin havaitut siirtogeenisissä (NTG) hiirillä (taulukko 1). Tämä on sopusoinnussa meidän aiemmassa tutkimuksessa [25]. Valitse

fancD2

vajausta tausta, kaksi 22

K14E6 /FancD2

– /-

hiirissä (9%) kehittyi avoin kasvaimia (taulukko 1) , joka ei ollut merkittävästi erilainen kuin havaittu

fancD2

Riittävät taustalla (

K14E6 /FancD2

+ /+

vs.

K14E6 /FancD2

– /-

,

P

= 0,52). Siten

fancD2

puute ei johtanut lisääntyneeseen alttiuteen E6 siirtogeenisiä hiiriä pään ja kaulan kasvaimet.

genotyyppi

Ryhmäkoko n

Eläinkudokset kanssa avoin kasvain, n (%)

Tongue Esophagus

Tongue

Esophagus

*

NTG/FancD2

+

/

+

240 (0) 0 (0) 0 (0)

*

NTG /FancD2

– /-

260 (0) 0 (0) 0 (0)

*

K14E7 /FancD2

+

/

+

204 (20) 2 (10) 3 (15)

*

K14E7 /FancD2

– /-

2111 (52) 5 (24) 6 (29)

K14E6 /FancD2

+

/

+

262 (8 ) 0 (0) 2 (8)

K14E6 /FancD2

– /-

222 (9) 0 (0) 2 (9)

K14E6E7 /FancD2

+

/

+

146 (43) 4

a kappale (29) 4

a kappale (29 )

K14E6E7 /FancD2

– /-

1411 (79) 9

b (64) 7

b (50) Taulukko 1. vertailu 4NQO aiheuttama avointa kasvain ilmaantuvuus hiiren kielen ja ruokatorven kudoksia.

HUOMAUTUS:

K14E6E7 /FancD2

+ /

+ hiirillä osoittavat merkittävää kasvua kasvaimen esiintymistiheys verrataan

K14E6 /FancD2

+ /

+ hiirillä (

P

= 0,01). Ero kasvaimen ilmaantuvuuden välillä

K14E6 /FancD2

+ /+

ja

K14E6 /FancD2

– /-

ryhmien osoittaa tilastollisesti merkitseviä (

P

= 0,52). Kuitenkin ero kasvaimen ilmaantuvuuden välillä

K14E6E7 /FancD2

+ /+

ja

K14E6E7 /FancD2

– /-

ryhmät on tilastollisesti merkitsevä (

P

= 0,03). Kaikki tilastolliset vertailut tehtiin käyttämällä yksipuolista Barnard tarkkaa testiä.

a Kaksi on

K14E6E7 /FancD2

+ /+

hiirillä oli kasvaimia sekä kielen ja ruokatorvi.

b Viisi

K14E6E7 /FancD2

– /-

hiirillä oli kasvaimia sekä kielen ja ruokatorvi.

* Avoin kasvain ilmaantuvuus

NTG /FancD2

+

/

NTG /FancD2

– /-

K14E7 /FancD2

+ /+

ja

K14E7 /FancD2

– /-

hiiret ovat meidän edellisen tutkimuksen [26] CSV Lataa CSV

vieressä tarkasteltiin vaikutuksesta FA-puutos pään ja kaulan kasvainten synnyssä hiirillä ilmensivät sekä E6 ja E7. Valitse

fancD2

Riittävät tausta,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

hiirille kehittyi määrän kasvuun avointa pään ja kaulan kasvaimet verrattuna

K14E7 /FancD2

+ /+

hiirillä (taulukko 1), vastaa meidän aikaisempien tutkimusten osoittavat kykyä E6 laajentaa tehokkuutta E7-ajettu pään ja kaulan kasvaimen kehittymisen [25]. Valitse

fancD2

vajausta tausta, havaitsimme merkittävää lisääntymistä on ilmeistä kasvaimien

K14E6E7

hiiriä, 43%: sta 79% (

K14E6E7 /FancD2

+ /+

vs.

K14E6E7 /FancD2

– /-

,

P

= 0.03 taulukossa 1). Suuruus kasvu taajuus avoin kasvaimia

fancD2

vajausta tausta nähty E6 /E7-bi-siirtogeenisten hiirten ei ollut suurempi kuin mitä havaittiin E7 vain siirtogeenisiä hiiriä (taulukko 1). Nämä tiedot osoittavat, että FA polku vaikuttaa kasvaimia synnyttävän potentiaalin E7 muttei E6.

puutos FA koulutusjakson johti aggressiivisempia neoplastisia HPV: hen liittyvän sairauden

Me tehdään yksityiskohtainen histopatologista analyysiä kudoksen kerättiin näistä hiiristä arvioimaan luokan syöpäsairauden näissä ikäryhmät hiirillä. Kudokset avoin kasvaimia kerättiin, kiinteä, parafinoidut ja osat altistetaan histopatologia. Erityisesti, joka kymmenes 5pm osa kielen ja ruokatorven värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H baareja, SD. Tähdellä (*) tarkoittaa, että puute

fancD2

geeni aiheutti merkittävää kasvua DNA-synteesiä välillä genotyyppien (

P

0,05). Kaikki tilastolliset vertailut suoritettiin käyttäen kaksipuolista Wilcoxonin-sum test.

fancD2

Riittävät tausta, E6 yksin tai yhdessä E7 merkittävästi lisännyt BrdUrd positiivisia soluja epiteelin kielen tai ruokatorven (

NTG /FancD2

+ /+

vs.

K14E6 /FancD2

+ /+

tai

K14E6E7 /FancD2

+ /+

,

P

0,05 kuvassa 2B). Yhdistelmä E6 ja E7 johti merkittävästi lisääntynyt määrä BrdUrd-positiivisten epiteelisolujen päälle

fancD2

Riittävät tausta kuin teki E6 yksinään (

P

0,05 kuvassa 2B). Tärkeää on, että taajuus tukevien solujen DNA-synteesi lisääntyi merkitsevästi epiteelisoluissa kielen tai ruokatorven kaikki hiiret, jotka olivat puutteelliset ja

fancD2

, riippumatta siitä, HPV16 onkogeenin aseman (

NTG /FancD2

+ /+

vs.

NTG /FancD2

– /-

,

K14E6 Twitter /

FancD2

+ /+

vs.

K14E6 Twitter /

FancD2

– /-

, ja

K14E6E7

/

FancD2

+ /+

vs.

K14E6E7 Twitter /

FancD2

– /-

; kaikki

P

0,05 kuvassa 2B). Olemme edelleen puhdistettu analyysimme vaikutuksen HPV16 onkogeenien ja FA vajauksen induktioon DNA-synteesin kahteen eri osa-osastojen epiteeli: tyvi osasto, joka on sytokeratiini 14 (CK14) positiivinen, ja suprabasaalisissa osasto, joka on CK14 negatiivinen (kuvio 2A). Edellä todettiin vaikutus molempien tekijöiden (HPV16 onkogeenit ja FA-asema) oli tasaisemmin havaittiin pohjapinta osastossa sekä kielen ja ruokatorven (kuva S1). Yhteenvetona, puutos

fancD2

johti induktion solun DNA-synteesin in kielen ja ruokatorven epiteeli riippumatta HPV16 onkogeenin tilan. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että FancD2 tärkeä rooli sääntely S-vaiheen solusyklin [6,36,37]. Kuitenkin se, että FA-puutos ei aiheuttanut lisääntynyttä alttiutta pään ja kaulan tuumorigeneesiä E6 siirtogeenisiä hiiriä mutta aiheuttaa kasvua solujen lisääntymisen näillä samoilla hiirillä osoittavat, että induktio epiteelin liikakasvu ei selitä, miten FA puute ajaa tuumorigeneesiä .

FA polku erityisesti tukahduttaa E7-driven DNA-vaurioita

sekä HPV16 E6 ja E7 oncogenes ovat väittäneet aiheuttavan DNA-vaurioita perustuu komeetta määritykset suoritettiin soluilla kudosviljelmässä [38,39 ]. Koska FA reitin osallistuu vaurioituneen DNA, se kestä syystä, että taso DNA aiheuttamia E6 ja E7 olisi korotetaan FA puutteellinen tausta. Läsnäolo DNA-vaurioita soluissa voidaan epäsuorasti tekee seuraamalla läsnäolo ydinvoiman pesäkkeitä positiivisia histoni 2AX fosforyloitiin seriini-139 (γ-H2AX) [40,41]. Olimme aikaisemmin osoittaneet, että

K14E7

hiiriä, E7 johti voimakkaaseen kasvuun taajuus γ-H2AX ydin- pesäkkeitä-positiivisten solujen epiteeli kielen ja ruokatorvi ja taajuus edelleen kasvoivat

fancD2

vajausta tausta [26]. Nykyisessä tutkimuksessa halusimme määrittää roolin HPV16 E6 DNA vaurioita vasteen

fancD2

Riittävät ja vajausta taustoja. Tätä varten immunofluoresenssivärjäyksen spesifinen γ-H2AX suoritettiin osissa kielen ja ruokatorven

NTG

,

K14E6

, ja

K14E6E7

hiiriä

fancD2-

riittävä tai

fancD2

vajausta taustat (kuvio 3A).

. Arvioida indusoidun DNA-vaurioita vastaus HPV16 E6 ja E7 puutos

fancD2

geeni, kudosten kustakin ryhmästä värjättiin anti-γ-H2AX (punainen) ja anti-sytokeratiini 14 (CK14) proteiinia (green ) vasta-aineita. DAPI käytetään ydin- counterstaining. Mittakaava, 20 gm. γ-H2AX pesäkkeitä positiivisia soluja korostettu vihreillä nuolilla kuvissa. B. Ainakin kolme hiirtä kustakin genotyypistä,

NTG /FancD2

+ /+

, NTG /FancD2

– /-

,

K14E6 /FancD2

+ /+

,

K14E6 /FancD2

– /-

,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

, ja

K14E6E7 /FancD2

– /-

hiiret, valittiin ja ~ 8 10 kehykset solujen epiteelin kerrokset kielen ja ruokatorven kvantitoitiin kunkin hiiren. Määrä solujen γ-H2AX positiivisia pesäkkeitä solujen yli, montako solujen piirrettiin kussakin tapauksessa (pylväät); baareja, SD. Tähdellä (*) tarkoittaa, että erot solujen lukumäärän γ-H2AX pesäkkeitä ryhmien välillä verrattiin tilastollisesti (

P

0,05). Kaikki tilastolliset vertailut suoritettiin käyttäen kaksipuolista Wilcoxonin-sum test. Huomautus: Valotusajat käytetään olivat samat kaikissa näytteissä analysoitiin. Jotkut solut kudoksissa

K14E6E7 /FancD2

+ /+

ja

K14E6E7 /FancD2

– /-

hiirillä oli hyvin kirkas γ-H2AX-erityisiä tumavärjäystä vastuuarvo käytetty. Lyhyemmät altistuksen vahvisti, että nämä solut säilytetään pistemäinen tumavärjäystä heijastava DNA-vaurion vasteen pesäkkeitä.

epiteelin kielen ja ruokatorven kudosta, E6 hiiret osoittivat hyvin harvat γ-H2AX pesäkkeet positiivisia soluja, samanlainen että nähdään

NTG

hiirillä. baareja, SD. baareja, SD.