Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Adrenomedulliini (AM) on erittäin ilmaistaan ​​haimasyövän ja stimuloi haiman syöpäsoluja mikä lisää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. Nykyinen tutkimus tutkii erityistoimien roolia AM reseptorien kasvain ja solujen muistuttavat kasvaimen microenvironment (ihmisen haiman stellate – HPSC, ihmisen napalaskimon – HUVEC ja hiiren keuhkon endoteelisolujen – MLEC).

menetelmät ja havainnot

AM reseptorit ADMR ja CRLR oli läsnä HPSC, HUVEC ja MLECs samalla PDAC solut oli vain ADMR reseptorit arvioituna RT-PCR ja western-blottauksella. Kaikki solulinjat ilmensivät ja erittyy AM kuten ELISA. Kasvu kunkin solulinjojen stimuloitiin eksogeenisen AM ja estää antagonisti AMA. AM myös kannustanut

in vitro

angiogeneesin arvioidaan monikulmio muodostumista endoteelisolujen linjat. SiRNA-välitteisen vaiennettu ADMR, mutta ei CRLR, vähentää pohjapinta kasvu kaikkien solujen tutkitaan ja vähensi monikulmio muodostumista endoteelisolujen

in vitro

. Orthotopic kasvaimet kehitetty shADMR laakerin syöpäsoluja oli vähentynyt voimakkaasti primaarisen kasvaimen tilavuus ( 90%) ja keuhkojen ja maksan etäpesäkkeiden verrattuna shControl kantavien solujen. Vahvistaa ADMR mahdollisena terapeuttisena kohteena, i

n vivo

suoritettiin käyttäen neutraalia nanoliposomes systeemisesti antaa ihmisen siRNA on ADMR hiljentää ihmisen syöpäsoluja ja hiiren siRNA on ADMR hiljentää hiiren kasvainten stroomasoluissa. Systeeminen hiljentäminen sekä ihmisen ja hiiren ADMR ollut ilmeisiä haittavaikutuksia mutta voimakkaasti vähensi kasvainten kehittymistä.

Johtopäätös

ADMR välittävä stimuloivia vaikutuksia AM syöpäsoluihin ja endoteelisolujen ja tähtisolut sisällä kasvain microenvironment. Nämä tulokset tukevat edelleen kehittämistä ADMR hyödyllisenä kohteena hoidossa haimasyöpä.

Citation: Ramachandran V, Arumugam T, Langley R, Hwang RF, Vivas-Mejia P, Sood AK, et al. (2009) ADMR reseptori välittää aiheutuvan vaikutuksen Adrenomedulliini on haimasyöpäsoluissa ja tuumoriverisuonien microenvironment. PLoS ONE 4 (10): e7502. doi: 10,1371 /journal.pone.0007502

Editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 4. kesäkuuta, 2009; Hyväksytty: 15 syyskuu 2009; Julkaistu 22 lokakuuta 2009

Copyright: © 2009 Ramachandran et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat NIH DK052067, MD Anderson Support Core avustuksen CA16672, MD Anderson Haiman Erikoistunut ohjelmat Research Excellence (SPORE) avustus P20 CA101936, ja jonka Lockton Endowment, ja tuki Ohjelman hankekehitysyksikkö avustusta Munasarjojen Cancer Research Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa ja on arvioitu, että vuonna 2008 noin 37680 amerikkalaiset diagnosoitu ja 34290 kuoli tästä taudista [1]. Vaikka merkittäviä edistysaskeleita on alettu valmistaa hallintaan taudin 5 vuoden pysyvyys ei ole parantunut viimeisten 25 vuoden aikana [1]. Korkea kuolleisuus johtuu yleisyydestä etäpesäkkeitä alkudiagnoosin, aggressiivinen kliininen kulku ja epäonnistuminen systeemiset hoidot [2]. Näin ollen on kiireellinen tarve parantaa ymmärtämisen molekyylibiologian taudin, joita voidaan käyttää kehittämään uusia hoitomuotoja haimasyöpä.

Osoitimme aikaisemmin, että adrenome- (AM) on yli-ilmaistu haimasyövän ja sillä on vahva autokriinistä rooli tässä sairaudessa [3]. AM on 52 aminohapon peptidi, joka eristettiin ihmisen feokromosytooma [4], joka toimii monitoiminen säätelypeptidi [5]. Yksi ongelma AM tavoitteeksi syövän hoito on, että AM on useita elintoimintoja joiden estäminen voi olla haitallista. AM ilmentyy normaaleissa haiman saarekesolujen, jossa hallitseva ilmentyminen F-soluissa, jotka sisältävät myös haiman polypeptidin [6]. AM vähentää insuliinin eritystä fysiologisissa olosuhteissa [6]. AM on myös merkittäviä vaikutuksia verisuonten solubiologian, jossa se säätelee verisuonitonus ja läpäisevyyttä ja edistää verisuonten laajenemista [7] – [11]. AM on myös tehokas angiogeeninen molekyylin, erityisesti hypoksian, joka indusoi AM [10]. Angiogeeninen vaikutus AM todennäköisesti välittyy suoraan endoteelisolujen lisääntymistä [12] ja suojaa endoteelisoluja apoptoosin [13]. Adrenomedulliini signalointi on tarpeen hiiren lymfaattinen verisuonten kehitystä [14]. Hiiret, joilta AM on geneettisesti poistettu kehittää ihon turvotus ja midgestational kuolleisuutta johtuen viasta imusuonien kasvun ja sydän- vika [15]. Syövän, AM näyttää olevan tärkeä rooli angiogeneesissä sekä lisäksi myrkkyjen vaikutusta suoraan syöpäsoluihin [16] – [18].

AM toimii peptidi ligandi, joka aktivoi reseptorit solun pinnalla . Haiman beeta-solut ilmentävät reseptoreita, joiden tiedetään vastata AM lukien adrenome- reseptorin (ADMR, joka tunnetaan myös L1-R) ja kalsitoniini-reseptori-like-reseptori (CRLR) [6], [19], [20]. Edellisessä tutkimuksessa todettiin, että haimasyövän soluja ilmentävät vain ADMR, kun taas molemmat reseptorit ovat läsnä soluissa tavataan kasvaimen mikroympäristössä, kuten ihmisen haiman tähtisolut (HPSCs) ja endoteelisoluissa. Kuitenkin roolit spesifisiin reseptoreihin AM vaikutuksista haimasyöpä, HPSCs ja endoteelisolut ovat tällä hetkellä tuntemattomia.

Nykyinen tutkimus tutkii vaikutuksia AM ihmisen haiman kasvainsoluihin, HPSCs ja endoteelisolujen ja tutkii osallistuvat reseptorit näitä vaikutuksia. Me vaiennetaan kukin reseptorit

in vitro

käyttämällä siRNA ja totesi, että ADMR oli ensisijaisesti vastuussa biologisten vaikutusten AM kaikista näistä solutyyppejä. Sitten tutkittiin vaikutuksia hiljentäminen ADMR haiman syöpäsoluja ja havaittiin merkittävä vähennys kasvaimen kasvua

in vivo

. Analysoimaan mahdollisuuksia ADMR tavoitteeksi syövän hoidon, me sitten arvioitiin vaikutuksia hiljentäminen ADMR molemmissa hiiren solut, jotka muodostavat kasvain microenvironment ja ihmisen syöpäsolujen käyttämällä DOPC nanoliposomes toimittaa lajispesifinen siRNA. Tämä systeeminen vaiennettu ADMR ei ollut ilmeisiä haitallisia vaikutuksia terveillä hiirillä mutta huomattavasti vähensi kasvainten kehittymistä. Siksi ADMR pitäisi olla tärkeä tulevaisuuden tavoite kehittää myös pienimolekyylisiä terapeuttisten.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja AM Peptides

Haimasyöpä BxPC3 solujen ja HUVEC solu linjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). MPanc96 haiman adenokarsinooma solulinjat perin perustettiin tohtori Timothy J. Eberlein (St. Louis, MO) [21]. MLECs ovat mikroverisuonten endoteelisolujen primäärisistä viljelmistä saatu hiirten keuhkoissa, jonka kudosten satama lämpöherkkä SV40: n suuren T-antigeenin [22]. Kun viljellään sallivissa lämpötiloissa (33 ° C), solulinjat näytetään kaksinkertaistaa kertaa sopusoinnussa endoteelisolujen joilla angiogeenisen fenotyyppi. Siirto näiden endoteelisolujen ei-sallivassa lämpötilassa (37 ° C) johti solujen erilaistumista ja induktio lepotilassa. MLECs viljeltiin 10% FBS DMEM. BxPC3 soluja viljeltiin 10% FBS: ää RPMI-elatusaineeseen, MPanc96 soluja viljeltiin 10% FBS: ää DMEM-väliaineeseen ja ihmisen endoteelisoluja (HUVEC) viljeltiin 15% FBS MEM. Kaikki väliaine sisälsi 1% antibioottia. Ihmisen haiman tähtisolut (HPSCs) eristettiin käyttäen seuraus menetelmää haiman adenokarsinooma näytteistä potilailta, joille suoritetaan kirurginen resektio ja viljeltiin 15% FBS DMEM [3], [23]. Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. BxPC3 ja MPanc96 solulinjoja stabiilisti joissa shControl tai shADMR vektoreita ja lusiferaasigeeni kehitetty aikaisemmassa tutkimuksessa käytettiin myös [3]. Adrenomedulliini (AM 52) ja adrenome- antagonisti (AMA (AM 22-52)) ostettiin Sigma, (St. Louis, MO).

ELISA AM

AM havaittiin ehdollinen mediaa HPSC, HUVEC ja MLECs käyttäen kaupallista ELISA. Keräämiseen elatusainetta, solulinjoja kasvatettiin 80% konfluenssiin ja pestiin PBS: llä ja viljeltiin sitten 24 tuntia omissa seerumittomassa alustassa. Media kerättiin ja konsentroitiin käyttäen Centricon YM-3 suodattimia (Millipore Corporation, Chicago, IL). Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttäen Bio-Rad-reagenssia (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Kilpailukykyinen ELISA suoritettiin sitten käyttäen AM havaitseminen kit (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA, cat # EK-010-01) seuraten valmistajan ehdottaman protokollan. Vastaavat konsentroitiin seerumittomassa alustassa toimi reagenssina ohjaus ja valvonta OD-arvot vähennettiin kuin kaikkien muiden näytteiden kanssa. Laskelmat AM pitoisuuden käytetään standardikäyrän pakkauksessa mukana ja tehtiin mukaan valmistajan protokollaa.

Ohimenevä transfektio siRNA

vaiennettu ADMR ja CRLR saavutettiin HPSC, HUVEC ja MLECs (2 x 10

4-solut) käyttäen lyhytaikaista transfektiota siRNA: iden. Ihmisen ja hiiren siRNA kukin vastaan ​​ohjaus, ADMR ja CRLR (siRNA ID # 4611, 46184, 42272, Ambion Inc. Austin, TX ja mittatilaustyönä hiiri siRNA ID # Control – 1129089, 1129090; ADMR – 1129085, 1129086; CRLR – 1129087, 1129088 Sigma-Aldrich (Proligo), St.Louis, MO) transfektoitiin lopulliseen konsentraatioon 5 nM per kuoppa 96-kuoppalevyille. Olemme myös analysoineet vaikutuksia siADMR on MPanc96 syöpäsoluja. SiRNA-transfektio suoritettiin Hiperfect transfektioreagenssin (Qiagen, Valencia, CA) kohti valmistajan protokollaa.

Western-blottaus

MPanc96, HPSC, HUVEC ja MLEC-solut transfektoitiin ohimenevästi ohjaus siRNA tai siRNA vastaan ​​ADMR tai CRLR ja 72 tunnin jälkeen, solujen lysaatit valmistettiin ja proteiini mitattiin BioRad-reagenssia. Proteiinia (50 ug) ladattiin 10% SDS-PAGE-geeleissä ja Western blotting suoritettiin käyttäen primaarista vasta-ainetta vastaan ​​ADMR (cat # LS-A4048 MBL International Corporation, Woburn, MA), 1: 1000 laimennus, ja käyttäen primaarista vasta-ainetta vastaan ​​CRLR (cat # sc-30028, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 1: 100 laimennus. Sama blot uudelleen tutkittiin varten β-Actin (1:200 laimennus; kissa # A2066 Sigma, St.Louis, MO), joka toimi latauskontrollina.

RT-PCR

kokonais-RNA uutettiin HPSC, HUVEC ja MLEC solujen kanssa tai ilman siRNA transfektion ja hiiren haimassa. DNaasi käytettiin poistamaan kontaminoivaa genomista DNA jälkeen RNA puhdistuksen. Eheyden RNA varmistettiin käynnissä denaturointia geeli, ja havainnoimalla selkeä 28S ja 18S rRNA bändejä. Ei-käänteistranskriptio ohjaus ajettiin sen varmistamiseksi, että ei ole genomista DNA: ta monistettiin. RT-PCR suoritettiin ihmisen ja hiiren AM /ADMR /CRLR alukkeita määrittää niiden ilmentymisen ja tasot hiljentäminen. Käänteistranskriptio seurasi 35 sykliä standardi-PCR (1-min denaturaatio 94 ° C: ssa, 1 min lämpökäsittely 63 ° C: ssa, ja 1 minuutin pidentäminen 72 ° C: ssa). Suunniteltuja alukkeita ihmisen AM (Genebankin: NM_001124) olivat: eteenpäin 5’CGG GAT CCA TGA AGC TGG TTT CCG TC 3 ’ja reverse, 5’ CGG AAT TCC TAA AGA AAG TGG GGA GC 3 ’. Suunniteltuja alukkeita ihmisen ADMR (Genebankin: NM_007264) olivat: eteenpäin 5 ’CAT CGC GGA CCT GGG CAT TGT 3’ ja reverse, 5 ’TGA GAG GGA AGG GCA GCA GGA AGC 3’. Suunniteltuja alukkeita ihmisen CRLR (Genebankin: NM_005795) olivat: eteenpäin 5’TGC TCT GTG AAG GCA TTT AC 3 ’ja reverse, 5’ CAG AAT TGC TTG AAC CTC TC 3 ’. Suunniteltuja alukkeita hiiren AM (Genebankin: NM_009627) olivat: eteenpäin 5 ’CCA GGG TTC CCG CAG CAA 3’ ja reverse, 5 ’CTA TAT CCT AAA GAG TCT GG 3’. Suunniteltuja alukkeita hiiren ADMR (Genebankin: NM_007412) olivat: eteenpäin 5 ’CCG TTA CCT TCC CAA GGA 3’ ja reverse, 5 ’TTA GCT GGC TAC AGA ATT GCA 3’. Suunniteltuja alukkeita hiiren CRLR (Genebankin: NM_018782) olivat: eteenpäin 5 ’TGG CTT TTC CCA CTC TGA T 3’ ja reverse, 5 ’TCA CAT CAC TAG ATC ATA CGT 3’. 18S alukkeita toimi lastaus kontrollina RT-PCR-reaktioissa. Monistetut tuotteet erotettiin 1,5% agaroosigeeleillä ja visualisoitiin etidiumbromidilla.

Solukasvu tutkimukset

HPSC, HUVEC ja MLECs (1000 solua) maljattiin 96-kuoppalevyille 0,5% seerumia sisältäviä aineita tai ilman AM (0-200 nM) tai AMA (1 uM), jotka päivittyvät päivittäin, ja solumäärät arvioitiin 48 tunnin kuluttua HPSC ja HUVEC-solujen ja sen jälkeen 96 tunnin MLECs MTS-määritys. SiRNA tutkimukset, HPSC, HUVEC ja MLECs (1000 solua) maljattiin 96-kuoppalevyille ja vastaavia ihmisen ja hiiren siControl /siADMR /siCRLR transfektoitiin ja solujen lukumäärät arvioitiin 48 tunnin kuluttua HPSC ja HUVEC-soluja ja 96 tunnin jälkeen ja MLECs. Solujen kasvu analysoitiin käyttäen MTS-reagenssia lisätään yksi tunti ennen spektrofotometrinen lukeminen mukaan valmistajan ohjeiden (Promega, Madison, WI).

In vitro

angiogeneesimääritys

HUVEC ja MLEC (1 x 10

4) soluja ympättiin pinnalle polymeroidun ECMatrix valmistettu kuten valmistaja on kuvannut (Cat # ECM625; Chemicon International, Millipore Corp, Billerica, MA). Soluja käsiteltiin AM (200 nM) tai AMA (1 uM) peptidit ja 6 tunnin kuluttua putken muodostumiseen arvioitiin alle käänteisvalomikroskoopilla (Olympus, Center Valley, PA). Kuvat otettiin käyttäen jäähdytetty, CCD-kenno kamera (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) ja SmartCapture ohjelmistot (Digital Scientific, Cambridge, UK). Kuvat jatkokäsitteli Adobe Photoshop-ohjelmiston (Adobe Systems, Mountain View, CA). Määrällisesti angiogeenisten tapahtumien kuviot solujen kasvua 10 satunnaisessa kentät 100 x suurennus arvioitiin kohti valmistajan ehdotuksia ja arvostellaan: Yksittäiset solut, hyvin erillään -0; Solut muuttivat ja linjassa -1; Kapillaariputket näkyvissä, ei itäminen -2; Itäneet kapillaariputkia -3; Suljettu polygoneja muodostunut – 4; ja monimutkainen mesh kaltaisia ​​rakenteita kehitetään -5.

immunohistokemiallinen värjäys – CD31 /VEGF

unstained 4 um kudososat siControl tai siADMR käsitellyistä hiiristä poistettiin parafiini ksyleenillä ja nesteytyksestä etanolilla. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 3% vetyperoksidia metanolissa ja ei-spesifinen sitoutuminen estettiin proteiinin esto-liuoksella (5% normaalia hevosen ja 1% normaalia vuohen seerumia). Ensisijainen vasta-aine CD31 (1: 800 laimennus; kissa # 01951A, BD Pharmingen, San Diego CA) /VEGF (1:100 laimennus; cat # sc-152; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) lisättiin ja näytteitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Sekundaarinen vasta-aine lisättiin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi lasit kehitettiin 3,3-diaminobentsidiini (DAB) substraatti vasta- värjättiin hematoksyliinillä, kuivattu etanolilla, kiinteät ksyleenillä ja asennettu. Immunohistokemia analysoitiin käyttämällä käänteisvalomikroskoopilla (Olympus, Center Valley, PA). Kuvat otettiin käyttäen jäähdytetty, CCD-kenno kamera (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) ja SmartCapture ohjelmistot (Digital Scientific, Cambridge, UK). Kuvat jatkokäsitteli Adobe Photoshop-ohjelmiston (Adobe Systems, Mountain View, CA). Dioja paatuivat ja analysoitiin IHC ytimen Dept. of Cancer Biology, UT MDACC.

DOPC nanoliposome kytketty siRNA.

kokeiluja testata tehoa

in vivo

terapeuttinen kohdentaminen ADMR vuonna potilaalle tehdä hiirissä, neutraaleja liposomeja sisältäviä siRNA: ita valmistettiin aikaisemmin kuvatulla [24]. Lyhyesti, siRNA oligonukleotidit (ilman hiusneulat) ja ADMR kohdesekvensseihin (ihmisen siADMR (sense – 5 ’rGrCUrGrCUUrGrArCrCUrCUUrCrArArCTT 3’), hiiri siRNA sense-sekvenssin – 5 ’rCrCUUUUrGrArArArCrGUrArCrArGrCrGTT 3’) tai säätelysekvenssit (ohjaus siRNA sense-sekvenssin – 5 ’UUrCUrCrCrGrArArCrGUrGUrCrArCrGUTT 3’ ) (mittatilaustyönä ihmisen ja hiiren oligot kissa # Human siADMR – 1150080, 1150081; Mouse siADMR – 1129085-H, 1129086-H; Control – 1129089, 1129090 Sigma-Aldrich (Proligo), St.Louis, MO) sekoitettiin 1,2-dioleoyyli-sn-glysero-3-fosfatidyylikoliinin (DOPC) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) suhteessa 10:01 (w /w) DOPC /siRNA ja lyofilisoitiin. Välittömästi ennen

in vivo

hallinnon, lyofilisoituja valmisteita hydratoitiin 0,9% suolaliuokseen pitoisuutena 10 ug siRNA per 200 ui ja puhdistettiin erottamalla vapaa siRNA liposomeista suodattimella yksikköä, joiden koko on 30.000 daltonia (Millipore Corp, Billerica, MA).

glukoosirasituskoe.

glukoosinsieto, hiiriin ruiskutettiin intraperitoneaalisesti 1,5 mg glukoosia /g painoa klo 9.00, kun 16-h nopeasti. Verensokerin määritettiin osoitettuina aikoina näytteitä hännän verta saadaan käyttämällä Ascensia CONTOUR veren -glukometriä (Bayer Health Care, Tarry kaupunki, NY).

In vivo

tutkimuksissa.

kaikki eläimet käsiteltiin tiukasti mukaisesti eläinten hyvä käytäntö määrittelemien asianmukaisten kansallisten ja /tai paikallisten eläinten hyvinvoinnin elimet, ja kaikki eläinten työ hyväksyi sopiva komitea (IACUC – 09-04-08832).

Orthotopic kasvainmuoto.

MPanc96 ja BxPC3 kantavien solujen shADMR tai shControl kehitettiin mainittiin aikaisemmassa julkaisussa [3]. Nämä haimasyövän soluja edelleen muokattu vakaasti ilmentämään tulikärpäsen lusiferaasi-geenin lentivirus transfektion helpottamiseksi

in vivo

seurannassa kasvaimen kehittymisen [25]. Nämä solut kasvatettiin 80% konfluenssiin, kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin kahdesti PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen lopulliseen pitoisuuteen 1 x 10

6 solua /50 ul MPanc96 solujen ja 2 x 10

6 solua /50 ui BxPC3 solujen steriiliin PBS: ään ja injektoitiin haiman neljän viikon ikäisille uros

kateenkorvattomia nude

hiiriä (n = 5). Kasvaimen kasvu arvioitiin bioluminesenssi kuvantaminen lopussa neljä viikkoa.

Lung ja maksan etäpesäke malleja.

Vertailut tehtiin välillä keuhkojen ja maksan etäpesäkkeiden MPanc96 soluissa joissa shADMR tai shControl soluihin käyttäen vakiintuneita etäpesäke malleja. Keuhkoetäpesäkkeet kehitettiin häntälaskimoinjektiona 1 x 10

6 solua /100 ul (n = 9) ja maksametastaaseista pernan ruiskuttamalla 1 x 10

6 solua /50 ul (n = 7) ja

kateenkorvattomia nude

hiiret ja arvioidaan bioluminesenssi kuvantaminen. Kuuden viikon kuluttua hiiret tapettiin ja elimet irrotettiin ja säilytettiin Bouinin fiksatiiviin ratkaisu.

Toimitus DOPC nanoliposome kytketty siRNA: t.

Arviointia varten potentiaalista toksisuutta, suoritettiin kokeita tuottaa DOPC nanoliposome kytketty siControl tai siADMR (hiiri) ja

kateenkorvattomia nude

hiiriä (10 ug eläintä kohti ip kahdesti viikossa neljän viikon ajan). Veden ja ruoan saannin, kehon painoa ja veren glukoosipitoisuus mitattiin. Eläimet tapettiin neljän viikon kuluttua, haima eristettiin ja kokonais-RNA uutettiin. RT-PCR: ää käytettiin arvioimaan hiljentämisen ADMR, kun taas 18S-toimi sisäisenä kontrollina. Orthotopic kasvaimia kehitettiin

kateenkorvattomia nude

hiirillä, joilla MPanc96 solujen, joissa lusiferaasigeeni (1 x 10

6 solua /50 ul: aan steriiliä PBS: ää) ja kaksi viikkoa myöhemmin, DOPC nanoliposome kytketty siControl ja siADMRs (ihmisen ja hiiri yhdistelmänä) toimitettiin 10 ug eläintä kohti ip kahdesti viikossa kuuden viikon ajan. Bioluminesenssi kuvantaminen. Bioluminesenssi kuvantaminen suoritettiin käyttäen kryogeenisesti jäähdytettyyn kuvantamisjärjestelmä on kytketty tiedonkeruutietokonetta käynnissä LivingImage ohjelmisto (Xenogen Corp., Alameda, CA). Ennen kuvantaminen, eläimet nukutettiin akryyli kammio 1,5% isofluoraani /ilmaseoksen ja injektoidaan i.p. 40 mg /ml lusiferiini kaliumsuolaa PBS annoksella 150 mg /kg kehon paino. Digitaalinen harmaasävy eläin kuva otettiin seurasi hankinta ja peitto on pseudovärin kuva edustaa tasaisempaa jakautumista havaittu fotonien nousemassa aktiivinen lusiferaasin sisällä eläin. Signaalin voimakkuus kvantitoitiin summana kaikkien havaittujen fotonien alueella kiinnostava sekunnissa. Kun lopullinen kasvaimen kuvantamisessa, kudokset poistettiin ja eläinten annettiin uudelleen kuvaamisen visualisoida ja laskea syöpäsolun levittämisen ja etäpesäkkeitä. Kudokset myös kiinnitetty formaldehydillä ja histologia oikeellisuuden ja bioluminisenssimääri- datan.

Tilastollinen analyysi

Kaikki

in vitro

kokeet toteutettiin kolmena kappaleena ja suorittaa kolme tai useampia eri tilanteessa. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja kolmen tai useamman itsenäisen kokeen ± keskivirhe Mean (SEM). Tilastollisesti merkittäviä eroja valvontaa ja käsiteltyjen näytteiden määritettiin kaksisuuntaisella parittomalla Studentin T-testiä ja määriteltiin * p 0,05. Tuloksia verrattiin käyttämällä GraphPad Prism 4 ohjelmisto (GraphPad Software, https://www.graphpad.com).

Tulokset

AM on autokriinisella vaikutuksia HPSC, HUVEC ja MLEC solujen

Aiemmin havaittiin, että AM toimi autokriini säätelijänä lisääntymistä, eloonjääntiä ja liikkuvuusluokka haimasyöpäsoluissa [3]. Sen määrittämiseksi, ovatko AM vaikuttaa myös HPSC, HUVEC ja MLECs, ensin tutki ne ilmaisivat AM ja sen reseptorit ADMR ja CRLR mitattuna RT-PCR. Kaikki kolme solulinjat ilmensivät AM, ADMR ja CRLR (Fig. 1A). Edelleen, me arvioi näiden solujen erittämät AM osaksi soluviljelyelatusaineella käyttäen ELISA. Kaikki nämä solutyypit erittyy AM (Fig. 1 B), joka tukee rooli tämän molekyylin autokriini säädin useita solutyyppejä. Vaikutusten tutkimiseksi AM biologian näiden solujen eksogeeninen AM lisättiin HPSC (Fig. 1 C), HUVEC (Fig. 1 D) ja MLEC (Fig. 1 E) solut ja proliferaatiota arvioitiin MTS-määrityksellä. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että optimaalinen pitoisuus AM oli 50 nM HPSC ja 200 nM HUVEC ja MLEC-solut (tuloksia ei ole esitetty). Lisääminen AM optimaalisella pitoisuuksina stimuloi kasvua HPSCs 29 ± 1,8% (p 0,05), HUVEC 25 ± 3,7% (p 0,05) ja MLECs 33 ± 4,5% (p 0,05). Lisäksi lisäämällä AM antagonisti, AMA (1 uM) vähensi pohjapinta kasvua HPSCs 21 ± 5,3% (p 0,05), HUVEC: 21 ± 0,4% (p 0,05) ja MLECs 25 ± 5,1% ( p 0,05) mikä edelleen tukee autokriini roolia AM näihin soluihin. Edelleen vaikutusten tutkimiseksi AM ja teimme

in vitro

angiogeneesiä määrityksiä. AM stimuloi monikulmio muodostumista HUVEC (Fig. 1 F) ja MLECs (Fig. 1 G) 6 tuntia verrattuna hallita kulttuurien ja AMA esti AM välittämiä vaikutuksia monikulmion muodostumista.

(A) RT-PCR osoittavat ilmentymisen AM, ADMR, ja CRLR on HPSC, HUVEC ja MLECs. (B) ELISA-määritys osoittaa eritystä AM peräisin HPSC, HUVEC ja MLEC soluja. Seerumittomassa alustassa kylvyn nämä solut kerättiin ja konsentroitiin ja analysoitiin läsnäolo AM. Tasot laskettiin kohti valmistajan ohjeita. (C) HPSC, (D) HUVEC, tai (E) MLEC-solut (1000 solua) maljattiin 96-kuoppalevyille ja AM (50 nM HPSC ja 200 nM HUVEC ja MLEC) tai AMA (1 uM) lisättiin levyihin päivittäin ja solujen lukumäärät arvioitiin 48 tunnin kuluttua HPSC ja HUVEC-soluissa ja sen jälkeen 96 tunnin MLECs MTS-määrityksellä. Verrattuna WT kontrolliryhmään, AM stimuloi proliferaatiota kaikkien kolmen solutyypeissä. Samoin, AMA hoito esti pohjapinta leviämisen kaikki solut. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja +/- SEM (* p 0,05).

In vitro

angiogeneesiä analyysit suoritettiin (F) HUVEC ja (G) MLEC soluja. Solut maljattiin EY matriisi yhdessä AM (200 nM) yksinään tai yhdessä AMA (1 uM). 6 tunnin kuluttua putken muodostumiseen arvioitiin mikroskoopilla kohti valmistajan ohjeita. Esitetyt tulokset edustavat micrographs. AM johdonmukaisesti stimuloi HUVEC ja MLEC-solut muodostavat putkia, kun taas AMA käänteinen vaikutuksia AM.

vaikutuksia AM on HPSC, HUVEC ja MLEC-solut välittyvät ADMR reseptorin

on kaksi mahdollista reseptoreita, jotka vastaavat AM, ADMR ja CRLR. Raportoimme aikaisemmin, että ihmisen haimasyövän soluja ilmaista yksinomaan ADMR taas HPSC ja HUVEC-solujen ilmaista sekä AM-reseptoreihin [3]. Nykyisessä tutkimuksessa havaitsimme, että MLECs myös ilmaista Molempien reseptorien. Määrittää suhteellinen merkitys näiden reseptorien me vaiennettu ne itsenäisesti seuraavilla kolmella solulinjoissa käyttämällä siRNA tekniikoilla. Transfektion siRNA vähensi merkittävästi tasot joko ADMR tai CRLR on HPSC (Fig. 2A), HUVEC (Fig. 2B) ja MLECs (Fig. 2C) verrattuna kontrollieläimiin siRNA: t. HPSC, HUVEC ja MLECs vaientaa siRNA joko ADMR tai CRLR tutkittiin kasvun määrityksissä jossa solujen määrä arvioitiin käyttäen MTS menetelmällä. Vaiennettu ADMR, mutta ei CRLR, vähensi merkitsevästi kasvu kaikissa näissä solutyypeissä. Hiljentäminen ADMR vähensi kasvua HPSC 21 ± 3,4% (p 0,05) (Fig. 2D), HUVEC 24 ± 1,8% (p 0,05) (kuvio. 2E) ja MLECs 26 ± 4,3% (p 0,05) (Fig. 2F). Hiljentäminen ADMR on HUVEC (Fig. 2G) ja MLECs (Fig. 2 H) poisti täysin AM välittämän putken muodostumiseen, kun taas hiljentäminen on CRLR osittain alentunut putken muodostumiseen. Nämä tiedot viittaavat yhdessä siihen, että autokriinisen vaikutuksia AM on HPSC, HUVEC ja MLEC-solut välittyvät pääasiassa kautta reseptorin ADMR vaikka CRLR voi olla myös joitakin vaikutuksia.

(A) HPSC ja (B) HUVEC-soluja väliaikaisesti transfektoitu ihmisen siRNA: t ja (C) MLEC-solut transfektoitiin hiiren siRNA: t (siControl, siADMR tai siCRLR). 72 tunnin kuluttua solut kerättiin talteen ja proteiinin tai RNA uutettiin. Western blottaus käyttämällä ihmisen vasta-aineita näyttää laajuudesta hiljentäminen ihmisen ADMR ja CRLR vuonna HPSC ja HUVEC-solut, ja RT-PCR: llä käyttäen hiiren alukkeita näyttää vaikutukset hiiren siADMR ja siCRLR päälle MLECs. p-Actin toimi latauskontrollina varten Western blotting ja 18S alukkeita toimi latauskontrollina RT-PCR. Täyspitkä geelejä on esitetty kuvassa S1. Vaikutukset leviämisen siRNA välittämää vaiennettu reseptorien näkyvät (D) HPSC, (E) HUVEC, ja (F) MLEC soluja. Solut transfektoitiin niiden ihmisen tai hiiren siRNA: ita (siControl, siADMR tai siCRLR) 24 tuntia ja sitten proliferaatiota arvioitiin MTS-määritys jälkeen vielä 48 tuntia HPSC ja HUVEC-soluja ja 96 tunnin MLECs. Hiljentäminen ADMR mutta ei CRLR aiheutti merkittävä väheneminen näiden solujen. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja +/- SEM (* p 0,05).

In vitro

angiogeneesimääritys kanssa (G) HUVEC ja (H) MLEC soluja. Solut maljattiin matriisin geeli 24 tuntia transfektion jälkeen, jossa niiden ihmisen tai hiiren siRNA: ita (siControl, siADMR tai siCRLR). Soluja käsiteltiin sitten AM (200 nM) 6 tunnin ajan ja tutkittiin mikroskooppisesti. Laajuus putken muodostumiseen arvioitiin kohti valmistajan ohjeiden. Edustavia micrographs näytetään. ADMR hiljentäminen täysin tukossa putken muodostumiseen, kun taas CRLR hiljentäminen vain osittain pienentää putken muodostumiseen.

vaiennettu ADMR haiman syöpäsoluja vähensi kasvainten kasvua ja etäpesäkkeiden

in vivo

tutkimiseksi vaikutuksia ADMR hiljentäminen syöpäsolujen, havaitsimme kasvu ortotooppisten kasvainten muodostettu kahdesta eri haimasyövän solulinjoissa, jotka on transfektoitu joko shADMR tai shControl. Tuumoritilavuudet mitattiin 4 viikon kuluttua mukaan bioluminenssina kuvantaminen. Kasvaimen tilavuus pienennettiin 92 ± 0,5% ADMR vaiennetaan MPanc96 kasvaimissa verrattuna ohjaamaan vektoriin kasvaimia (p 0,05) (Fig. 3A). Samoin BxPC3 kasvaimen väheni merkittävästi 83 ± 0,6%, kun ADMR vaimentaminen verrattuna kontrolliin kasvaimet (p 0,05) (Fig. 3B). Molemmissa tapauksissa oli myös vähentää keuhkojen ja maksan etäpesäkkeiden ja vähentää vatsakalvon levittämiseen. Kuitenkin, koska ADMR hiljentäminen vähensi kasvaimen; mahdollinen väheneminen etäpesäke on saattanut johtua yleisestä väheneminen kasvaimen tilavuuden.

Orthotopic kasvaimia kehitettiin MPanc96 (A) tai BxPC3 (B), jotka on vakaasti vaiennetaan kanssa shADMR ja ilmentävät lusiferaasigeenin. Sen jälkeen, kun 4 viikkoa, tuumorin tilavuus arvioitiin bioluminenssina kuvantaminen ja osoittivat merkittävää vähenemistä välillä ADMR ja shControl vektori kasvaimia molemmista solutyypeistä. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja +/- SEM 10 eläintä ryhmää kohti. (* P 0,05) Bioluminescence kuvia edustavan hiiren tarjotaan myös.

vaiennettu ADMR haiman syöpäsoluja pienentää etäpesäke

in vivo

suoraan arvioida roolia ADMR haimasyövän keuhko- ja maksan etäpesäke teimme erillisiä tutkimuksia

nude

hiirien häntälaskimoon ja pernan injektio, vastaavasti. ADMR hiljentäminen vähensi keuhkojen etäpesäkkeiden (ShControl – 67% Vs ShADMR – 22%), mitattuna bioluminenssina kuvantaminen (Fig. 4A). Lisäksi läsnäolo etäpesäkkeitä havaittavissa käyttäen bioluminesenssi kuvantaminen siirrettiin pois 2

toisen viikon kontrollieläinten 5

th viikolla shADMR sisältävien solujen. Leikattiin keuhkoihin sen jälkeen, kun kiinnitys Bouinin liuokseen osoitti määrän väheneminen keuhko metastaasipesäkkeiden kuten on esitetty tyypillinen kuva (Fig. 4C). Vaikutukset ADMR hiljentäminen maksan etäpesäkkeitä olivat samanlaisia ​​kuin keuhkometastaasitestissä. ADMR hiljentäminen vähensi maksan etäpesäkkeiden (ShControl – 100% Vs ShADMR – 43%) (Fig. 4B). Läsnäolo havaittavissa etäpesäkkeiden lykättiin 2

nd viikko kunnes 5

th viikko. Määrän väheneminen maksan metastaasipesäkkeiden on esitetty tyypillinen kuva (Fig. 4D). Nämä tiedot osoittavat, että AM voi toimia etäpesäke indusoi haiman syöpäsoluissa, ja nämä vaikutukset AM syöpäsoluihin välittyvät reseptorin ADMR.

MPanc96 soluihin, joissa lusiferaasigeeni oli transfektoitu stabiilisti shControl tai shADMR solua injektoitiin häntälaskimoon mitata keuhkojen etäpesäke ja osaksi perna mitata maksa etäpesäke. Eläimillä ADMR vaiennetaan solut osoittivat ilmaantuvuuden väheneminen keuhkojen (A) ja maksametastaaseista (B) mitattuna bioluminenssina kuvantaminen. 6 viikon kuluttua hiiret tapettiin ja keuhkojen ja maksan myös leikattiin ja tutkittiin karkeasti ja histologisesti. Vakaa hiljentäminen ADMR vähensi metastaasipesäkkeiden keuhkojen ja maksan verrattuna shControl. Edustavia kuvissa määrän väheneminen metastaasipesäkkeiden keuhkoissa (C) ja maksa (D).

I

n vivo

kohdentamista ADMR käyttää systeemisesti siRNA: iden on erittäin tehokas vähentämään kasvaimen kasvua

tulokset tukevat rooli ADMR vuonna vaikutusten AM haiman syöpäsoluja.