Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vezatin (VEZT), joka on vyöliitos transmembraaniproteiini, tunnistettiin otaksutun tuumorisuppressoriproteiinia edellisessä tutkimuksessa. Kuitenkin rooli VEZT kasvainten synnyssä on edelleen heikko. Me selvittivät sen epigeneettiset sääntelyn ja biologisia toimintoja mahasyövässä. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että ilmentymisen taso VEZT on mukana imusuonten etäpesäke, syvyys syövän invaasio ja TNM-luokitus 104 mahasyöpäpotilaista. Bisulfate sekvensointi polymeraasiketjureaktio (BSP) menetelmät osoittivat, että VEZT oli hypermetyloitunut kudoksissa ja vastaavat veren mahasyövän potilailla verrattuna terveisiin kontrolleihin.

Helicobacter pylori

(

H. Pylori

) infektio indusoi metylaatio ja vaiennettaisi VEZT in GES-1-soluissa. Palauttaminen VEZT ilmentyminen MKN-45 ja NCI-N87 mahalaukun syöpäsolujen esti kasvua, invaasio ja kasvaimen kehittymisen

in vitro ja in vivo

. Global microarray-analyysi on sovellettu analysoimaan molekyylitasolla biologisen toimintojen VEZT jälkeen VEZT transfektion yhdistettynä reaaliaikainen PCR-ja kromatiinin immuunisaostustesti. G-proteiiniin kytketty reseptori 56 (GPR56), solujen kasvua, solun jakautumisen syklin 42 (Cdc42), muuttoliike /invaasion ja transkriptiotekijä 19 (TCF19), solusyklin etenemistä, tunnistettiin suoraan VEZT kohdegeenien. TCF19, uusi tavoite VEZT, oli toiminnallisesti validoitu. N yli-ilmentyminen TCF19 in MKN-45-solujen määrä nousi solukierron etenemistä ja kykyä kasvaa. Tutkimus tarjoaa uusia käsityksen sääntelyn VEZT geenin, joka voisi edustaa potentiaalinen kohde terapeuttisten syöpälääkkeen strategioita.

Citation: Miao R, Guo X, Zhi Q, Shi Y, Li L, Mao X, et ai. (2013) VEZT, Novel Otaksuttavat kasvain vaimennin, tukahduttaa kasvun ja tuumorigeenisyystesti mahasyövän. PLoS ONE 8 (9): e74409. doi: 10,1371 /journal.pone.0074409

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 01 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 01 elokuu 2013; Julkaistu: 17 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Miao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustuksia National Nuorekas Science Foundation of China (81101858), Natural Science Foundation Shandongin maakunnassa Kiinassa (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), Key Tutkimusprojekti Shandongin Science and Technology komission (2011GGB14158, 2007H2071), nuorekas Science Foundation Shandongin provinssissa Kiinassa (BS2010YY060). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on toiseksi suurin syy miesten syöpään liittyvä kuolema ja kolmas johtava syy naisten syöpään liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Se on merkittävä kansanterveydellinen ongelma kaikkialla maailmassa [2]. Kiinassa on 400000 uutta tapausta mahasyövän ja 300000 kuolemantapausta vuosittain. Monissa tapauksissa, jotka kärsivät mahasyöpä ovat menettäneet parantava mahdollisuus on erittäin huono tulos [3]. Siksi kehittämään uusia ja tehokkaita hoitomenetelmiä on tärkeää vähentää mahasyövän kuolleisuutta. On tunnettua, että patogeneesi mahakarsinoomat on monitekijäinen, joka sisältää geneettisen alttiuden ja ympäristötekijöiden. On olemassa useita geneettisiä vuorottelujen lukien tuumorisuppressorigeeneille, onkogeenit, soluadheesiomolekyylien ja kasvutekijät [4].

Vaikka molekulaarisia mekanismeja mahasyövän ovat epäselviä, epigeneettinen vaimentaminen kasvaimeen liittyvien geenien promoottorin hypermetylaatio on viime aikoina tullut tärkeä mekanismi kasvaimen. Promoottori hypermetylaation profiili vaihtelee kussakin syöpätyypin ja kunkin geenin, joka tarjoaa kasvain tyyppi- ja geenispesifiseen hypermetylaation profiilit, johon voi liittyä vastaavassa molekyylimekanismin kasvaimen. Tunnistaminen uutta geeniä kohteena promoottori hypermetylaation voivat tarjota oivalluksia mekanismeja inaktivoimiseksi kasvaimen esti reittejä ja on tärkeää tunnistamiseksi tuumorimarkkereina mahasyövässä [5,6].

Viimeksi olemme havaitaan, vyöliitos transmembraaniproteiini, VEZT ehdokkaaksi kasvaimen estävä geeni. Meidän tavoitteena oli selkeyttää epigeneettiset sääntelyn ja biologisten toimintojen VEZT mahasyövän. VEZT, kaikkialla läsnä olennainen proteiini, on epäsuorasti liittyy E-kadheriinin-kateniinin monimutkainen ja aktiinisytoskeletonin [7,8]. Sen toiminnot ovat pääosin tutkittu epiteelisoluissa. Menetys VEZT on vähitellen haitallista alkionkehityksen [9,10], ja VEZT on kriittinen säilyttää eheyden solun liittymissä pitkäaikaishoidossa mekaanista rasitusta tapahtuvat tasolla sisäkorvan hiussolut äänen perusteella. Lisäksi sisäkorvan erityisiä VEZT ehdollista mitätöinti johtaa etenevä kuurous [7]. VEZT ilmentyy voimakkaasti aivoissa [8,11]. VEZT rikastuu tuojahaarakkeet hiiren hippokampuksen neuronien. Käyttämällä VEZT knock-down ja ehdollinen pudotuspelit ennen (D6cre) tai sen jälkeen (CamKIIαcre) syntymä, VEZT säätelee selkärangan morfologia. Morfologiset muutokset eivät liity heikentynyt synaptic yhteyksiä, mutta postsynaptisiin VEZT on keskeisessä asemassa morfo- funktionaalisen kypsymisen kiihottavien postsynaptisiin elementtien [12].

inaktivointi VEZT geeni on tunnistettu mahasyövän, ja metylaatio CpG-saarekkeiden sisällä promoottorialueen VEZT geenin edistää sen inaktivoitumisen määritettynä edellisessä tutkimuksessa meidän lab [13]. Mekanismi metylaation ja tarkka rooli VEZT kehittämisessä mahalaukun syöpä, on tällä hetkellä tuntematon. Kohdegeenien ja siihen liittyviä reittejä on VEZT ei ole vielä tunnistettu. Tässä tutkimuksessa olemme analysoidaan järjestelmällisesti mekanismi metylaation ja metylaatiostatuksen promoottorin VEZT geenin. Analysoimme myös sen toiminnalliset ominaisuudet saattamisen jälkeen VEZT ilmaisun

in vitro ja in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kudosnäytteiden

MKN -45, MKN-28, SGC-7901, ihmisen immortalisoitu mahalaukun limakalvon solulinjaa GES-1 (antamat instituutti ruoansulatuskanavan leikkaus Ruijin sairaalan sidoksissa Shanghai Jiao Tong University) [13,14,15,16,17] ja ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) on säilynyt meidän instituutti. Mahasyöpä solulinjoja SNU-1 ja NCI-N87-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Lyhyesti, soluja kasvatettiin RPMI1640 täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia ja 2 mM L-glutamiinia. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO

2.

Ensisijainen mahakasvaimen ja normaalin mahan limakalvon kudokset kerättiin joko rutiini terapeuttinen leikkaus tai ruoansulatuskanavan endoskopia meidän osastolla. Loppuosa oli

H. pylori

infektiotilanteesta määritettiin perustuen nopeaan ureaasin testi kuten aikaisemmin on kuvattu [18].

Ethics lausunto

kirjallinen suostumus tutkimukseen saatiin kaikille osallistujille. 4 viikkoa vanhoja BALB /c-nude-hiiriä ostettiin Experimental Animal Center of Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina) ja ylläpidetään Animal laboratoriokeskuksessa maakunnan sairaalan Affiliated Shandong University (Jinan, Kiina) on 12/12 h valo /pimeä sykli (valot pois 19: 00), jossa ruokaa ja vettä saatavilla adlibitum. Eläinkokeet hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitean Provincial sairaalan Affiliated Shandong University (Luvan numero: SHANS87492). Tutkimuksen protokolla hyväksyi eettinen komitea maakunnan sairaalan Affiliated Shandong University.

käsittely Laser mikrodissektion kudoksia ja soluja

Kudokset poistettiin mahdollisimman pian sen jälkeen, kun resektion ja vahvistettu formaliinilla, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 8 um: n paksuisia leikkeitä ja hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 95% ”homogeeninen” määritettynä mikroskooppisen visualisointi kiinni soluja. Tulpat otetut solut sovitetaan 0,5 ml microcentrifage putkiin. Jälkeen mikrodissektion, DNA, RNA, tai proteiini voidaan uuttaa alikvootit mikropaloitelluista näytteitä.

metylointi analyysi

Genominen DNA saatu mikropaloitelluista solulinjat, mahasyövän kudosten ja plasma (0,2 ml ) puhdistettiin käyttäen DNAzol (Invitrogen). Puhdistettu DNA käsiteltiin natriumbisulfiitin (Sigma, Phoenix, USA) ja analysoitiin sitten BSP tai erityisiä polymeraasiketjureaktio (MSP), kuten aiemmin on kuvattu [13,15]. Monistettiin bisulfiitti PCR-tuotteet subkloonattiin TA vektoriin (Promega), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA: n sekvensointi suoritettiin kolme yksittäistä kloonia (Sangong). PCR-tuotteet varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja visualisoitiin käyttäen etidiumbromidia värjäystä. Käytetyt alukkeet on esitetty taulukossa S1.

Electron mikroskooppinen havainnointi

H. pylori

kantoja NCTC11637 (sekä CagA- ja VacApositive) toimitti professori Guo osaston lääketieteellisen mikrobiologian ja parasitologia, Institutes of Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine.

H. pylori

kantoja viljeltiin rutiininomaisesti 72 h Columbia agaralustalla (bioMérieux, Ranska), jossa 5% lampaan verta sekoitetaan ilmassa, joka sisälsi 10% CO

2, 5% O2, ja 85% N

2 at 37 ° C: ssa. Sitten muutimme

H. pylori

ja nestemäistä väliainetta, joka sisältää aivo-sydän-infuusio (BD, US), 10%: lla lampaan verta, ja sama antibiootteja, joita käytettiin Columbia agar. Nestemäinen väliaine ravisteltiin ravistelijassa (Forma Scientific, USA), jossa on vakio pyörimisnopeus 120 rpm.

H. pylori

laskettiin käyttämällä spektrofotometriä (BioSpec-min, Shimadzu Scientific Instruments, Japani) ja pestiin steriilissä PBS: ssä (pH 7,4, 5000 rpm, 10 min) ennen käyttöä. GES-1-soluja (4 x 10

5) kasvatettiin kunnes konfluentteja on lasipeitinlevyihin kuuden kuoppalevyillä, ja sitten GES-1-solut infektoitiin

H. pylori

klo infektiokertoimella (MOI) 100: 1. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, morfologiset muutokset GES-1-solujen havaittiin käyttämällä H-800 transmissioelektronimikroskoopilla.

Reaaliaikainen qRT-PCR-analyysi

Puhdistettu kokonais-RNA: ta hankittiin alkaen mikropaloitelluista solujen kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol liuosta. Käänteistranskriptio (RT) suoritettiin 20 ul: reaktion mukaisesti valmistajan suositusten (Qiagen). Reaaliaikainen qRT-PCR-analyysit suoritettiin käyttämällä alukkeita, jotka on lueteltu taulukossa S1. Transkriptioekspressiokuvio-tasot määritettiin määrällisesti intensiteetti PCR-tuotteen normalisoidaan glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ilmentyminen. Kvantitatiivinen mittaus mRNA-tasojen suoritettiin käyttäen ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Nämä tiedot analysoitiin käyttämällä vertailevaa Ct menetelmällä.

Western blotting

Yhteensä proteiini uutettiin mikropaloitelluista soluista. Signaalin proteiini uuttopuskuria 1 järjestelmän (430-7608-MSDS) ja Bio-Rad Corporation käytettiin proteiinin uutto meidän kokeita ja pitoisuus mitattiin DC-proteiini-määritys Bradfordin menetelmän (Bio-Rad). Yhteensä 100 ug proteiinia kustakin näytteestä erotettiin 10% SDS-PAGE-geelillä ja siirrettiin tasapainotettu polyvinylideenidifluoridi kalvo (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) Proteiinit havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL , USA) kanssa inkuboinnin jälkeen tiettyjä primaarisen vasta-aineen VEZT (1: 2000), IL-6 (1: 2000), AKT (1: 1000), Cag A (1: 3000), IL-8 (1: 3000), ATF3 (1: 2000), ja IRX5 (1: 2000) 4 ° C: ssa yön yli ja sitten toisen vasta-aineen. Proteiini tasot normalisoitiin yhteensä GAPDH käyttäen monoklonaalista anti-GAPDH-vasta-ainetta (Sigma), kuten aiemmin on kuvattu [15].

rakentaminen ekspressiovektorin VEZT ja TCF19

VEZT ja TCF19 yliekspressio vektori pEGFP -N1-VEZT ja pEGFP-N1-TCF19 rakennettiin käyttäen päällekkäis-PCR tai PCR-menetelmällä, vastaavasti, ja alukkeet, joita käytetään kahden vektorin on esitetty taulukossa S1. PCR-tuotteet varmistettiin suoralla DNA-sekvensoinnilla ja kloonattiin nisäkkään ekspressiovektoriin pEGFP-N1, kuten aikaisemmin on kuvattu [15]. MKN-45 ja NCI-N87 mahasyövän solulinjoja käytettiin yli-ilmentymisen tutkimukset. Olemme saatu stabiilisti transfektoitujen kloonien G418-valinnan (Promega). Vakaa transfektantissa pEGFP-N1 tyhjän vektorin käytettiin kontrollina. Transfektioon, komplekseja Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, Carlsbad, USA) ja yksi plasmideista edellä mainittujen valmistettiin valmistajan ohjeiden ja nämä kompleksit sekoitetaan suoraan solujen 24-kuoppaisille soluviljelylevyille tiheydellä 4 × 10

4 solua kuoppaa kohti. Taso VEZT tai TCF19 ilmaisu transfektion jälkeen analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä.

Invasion, muuttoliike ja endoteelin putken muodostumiseen määrityksissä

Cell invaasio, muuttoliike ja endoteelin putken muodostumiseen määritykset suoritettiin käyttäen MKN -45 ja NCI-N87 soluissa. Soluviljely suoritettiin transwell kammioissa (Corning, NY, USA). Sillä invaasiomääritys, insertin kalvot päällystettiin laimennettiin matrigeelin (San Jose, CA, USA). -Soluja (1 x 10

5) lisättiin ylempään kammioon ja viljeltiin 48 tuntia. Migraatiokokeessa, insertin kalvot ei päällystetty matrigeelin mutta viljeltiin samoissa olosuhteissa. Lopuksi, insertti kalvot leikattiin ja värjättiin kristallivioletilla (0,04% vedessä; 100 ml), ja siirtynyt solut laskettiin käännettyä mikroskooppia ja valokuvattiin.

In vitro angiogeneesi arvioitiin käyttämällä endoteelin putken muodostumiseen iinianalyysikitissä (San Diego, CA, USA). Lyhyesti, kukin kuoppa on esijäähdytetty 96-kuoppaisille viljelylevyille on päällystetty ohuella kerroksella ECM geeliä. HUVEC suspendoitiin uudelleen supernatantit kerättiin transfektoiduista soluista. HUVEC-soluja (2 x 10

4 solua /kuoppa) lisättiin polymeroidun ECM geeli 300 ml: lla supernatantteja. Sen jälkeen, kun 18-tunnin inkuboinnin jälkeen putken muodostumiseen kykyä arvioitiin määrittämällä putkimaisen numero, putkimaisen pituus ja määrä putkimaisen risteävää solmujen viidellä satunnaisesti kenttiin Image Pro Plus-ohjelmisto (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD, USA) ja Mirshahi menetelmän [19].

Solun kasvua ja pehmeä agar pesäkemuodostusta

Mahalaukun syöpäsoluja (2 x 10

3-soluja) inkuboitiin 100 ul: lla elatusainetta 96 -multiwell levyjä yhden päivän ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Solut transfektoitiin plasmidilla 24, 48, 72, 96, ja 120 tuntia. Solujen määrä arvioitiin käyttäen solulaskennan Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japani). Lyhyesti, CCK-8 (10 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Kun oli kulunut 1 h inkuboinnin jälkeen 37 °, absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin käyttäen ARVO MX levynlukijaa (PerkinElmer, Massachusetts, USA). Solujen lukumäärä määritettiin suhteellinen absorbanssi 450 nm: ssä.

Mahasyöpää solut trypsinoitiin yhden solun suspensiot 3 x 10

3-soluja, ja sitten maljattiin kuuden kuopan levyille täydelliseen viljelyväliaineeseen, joka sisälsi 0,3% agaria kerrokseksi 0,6% agaria. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO

2 16 päivää. Pesäkkeet, jotka sisältävät vähintään 50 solua, pisteytettiin. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta viidestä satunnaisesti sijoitettiin kentät.

Kasvaimen kasvu nude-hiirissä

Solut (1 x 10

6 solua 100 ml) syöpäsolujen linjat transfektoitu tyhjällä vektorilla tai VEZT ekspressiovektorin kerättiin ja istutettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen alueet 4 viikkoa vanhoja BALB /c-nude-hiiriin (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kiina). Kasvaimen kyhmyt mitattiin 4 päivän välein jarrusatulat. Hiiret tapettiin 1 kuukausi. Kasvaimen kasvukäyrät ja kasvun estäminen laskettiin. Kaksi hiirtä käytettiin koe- ja kontrolliryhmissä, ja kolmen erillisen kokeen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15,16].

Global cDNA microarray-analyysi ja kohdegeenin todentaminen

Puhdistettu kokonais-RNA oli saatu mikropaloitelluista soluja. Ihmisen koko genomin oligo microarray (Agilent, Santa Clara, CA, USA) käytettiin. Hybridisaation jälkeen ja pesun, mikrosirulla objektilasit skannattiin Agilent DNA-siru skanneri. Tuloksena tekstitiedostot uutettu Agilent Feature Extraction Software (versio 9.5.3) tuotiin Agilent GeneSpring GX -ohjelma (versio 7.3) lisäanalyysiä. Ilmentyvät eri geenit tunnistettiin kertamuutosta seulonta. Sillä kohdegeenin tarkastusta käytimme reaaliaikainen PCR ja kromatiinin immuunisaostustesti. Alukkeet kohdegeenien on lueteltu taulukossa S1.

virtaussytometrinen analyysi solusyklin

Yksi päivä ennen transfektiota, 1 x 10

6 solua MKN-45-solut ympättiin otetaan 6-kuoppaisille viljelylevyille ilman antibiootteja. Solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla tai TCF19 ekspressiovektoriin. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin ja kiinnitettiin 70% etanolilla -20 ° C: ssa yön yli, ja sitten värjättiin 250 ug /ml propidiumjodidia (Sigma-Aldrich), 5 ug /ml RNaasi A: ta (Sigma-Aldrich) ja 5 mmol /l EDTA: a PBS: ssä (pH 7,4) 30 minuutin ajan. Solusyklin analyysi tehtiin FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen SPSS15.0 ohjelmistoa (SPSS Inc., USA). Data on ilmaistu keskiarvo ± keskihajonta vähintään kolmesta erillisestä kokeesta. Korrelaatio VEZT ilmentyminen kasvaimissa ja ennusteeseen viittaavia muuttujat laskettiin Kruskal-Wallisin rank testi ja U-testi. Erot ryhmien analysoitiin Studentin t-testiä ja Chi-neliö testi. Arvo

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

suhde VEZT ekspressiotasot ja kliinis tekijät potilailla mahalaukun syövän

Tutkimme suhdetta VEZT ekspressiotasot 104 pariksi mahalaukun syöpä kudoksiin ja kliinis tekijät potilailla, joilla on mahalaukun syöpä. Huomasimme, että ekspressiotaso VEZT liittyi merkittävästi imusuonten etäpesäke, syvyys syövän invaasio ja TNM-luokitus (taulukko 1,

P

0,05). Kuitenkin VEZT ekspressiotasoja eivät liittyneet sukupuoleen, ikään, kasvaimen koon, solujen erilaistuminen, brutto ulkonäkö, Kasvainimplan- ja etäpesäkkeiden.

Tekijät

No. potilaista

tarkoittaa ilmaus VEZT（mean±SD)

P

-value

GenderMale5714.87±2.031.382Female4715.47±3.15Age(year) 654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor koko 5cm5117.16 ± 3.052.682≥5cm5311.26 ± 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site of tumorCardia2119 0,34 ± 2.530.692Body3611.24 ± 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth syövän invasionT22518.35 ± 7.820.041 * T36322.12 ± 4.21T41624.78 ± 5,41 distaalinen metastasisPositive249.34 ± 6.091.032Negative8012.35 ± 8.62TNM # StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. väliset VEZT ekspressiotasot syöpäkudoksiin ja kliinis tekijät potilailla, joilla on mahalaukun syövän.

Analysoimme suhdetta VEZT ekspressiotasot syövän kudoksissa ja kliinis tekijöitä mahasyövässä näytteissä verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen (n = 104). Huomasimme, että ekspressiotaso VEZT oli merkitsevästi yhteydessä imusuonten etäpesäke, syvyys syövän invaasio ja TNM-luokitus (taulukko 1,

P

0,05). Kuitenkin VEZT ekspressiotasoja eivät liittyneet sukupuoleen, ikään, kasvaimen koon, solujen erilaistuminen, brutto ulkonäkö, Kasvainimplan- ja kaukaisten etäpesäkkeitä. #: TNM, kasvain-solmu-etäpesäke; *

p

0,05. CSV Lataa CSV

metyloituvuutta normaali mahan kudoksissa, ensisijainen mahasyövän kudoksissa ja ääreisverenkierron mahalaukun syöpä potilaiden ja terveiden verrokkien

Perustuen aikaisemmassa tutkimuksessa meidän lab, me olettaisi, että metyloinnin VEZT promoottorin oli erilainen mahakarsinoo- potilaiden ja terveiden verrokkien; käytimme verkossa Bioinformatiikkaohjelmistojen analysoida promoottorialueen ja metylaation tila VEZT geenin (kuvio 1A). Olemme tutkineet metylaation tason VEZT promoottorin 30 kudosnäytteistä DNA primaarisessa mahalaukun syövän kudoksissa, jotka vastaavat plasman DNA: n ja valvonta käyttäen BSP menetelmiä, jotka kattoivat alueet on -171bp ja -428bp (kuvio 1A). Keskimääräiset metyloitu tasot VEZT 30 ensisijainen mahasyövässä kudosten ja 30 normaali mahan kudoksissa oli 67,78 ± 25.90% ja 42.42 ± 30,30%, vastaavasti (kuvio 1 B). Ensisijainen mahasyövän kudosten osoitti korkeampia metylaatiotasoilla että VEZT promoottorialueen verrattuna normaaliin mahalaukun kudoksissa (kuvio S1A, kuviossa 1B, P 0,05). Keskimääräinen metyloidut taso plasman DNA ensisijainen mahasyöpäpotilaista ja terveillä verrokeilla tapaukset olivat 69.00 ± 23.90% ja 46.71 ± 26.31%, vastaavasti (kuvio 1 C). Metyloidut taso plasman DNA ensisijainen mahasyövässä potilailla havaittiin suurempia metylaatiotasoilla että VEZT promoottorialueen verrattuna terveisiin tapauksessa (kuvio S1B, kuviossa 1C, P 0,05). Siten merkittävä metylaatio havaittiin mahasyövän ryhmässä verrattuna terveisiin verrokkeihin. Taso Metyloitujen VEZT kudoksissa ja plasmassa voisi toimia molekulaarinen merkkiaine mahasyövän.

(A) Online Bioinformatiikkaohjelmistojen käytettiin analysoimaan promoottorialueen ja metylaation tilan VEZT geenin. (B) metylointi tilan 34 CpG sivustoja VEZT promoottori 30 normaalista mahan kudoksissa ja 30 ensisijainen mahasyövän kudoksiin. Ensisijainen tuumorikudoksista osoitti korkeampia metylaatiotasoilla että VEZT promoottorialueen verrattuna normaaliin mahalaukun kudoksiin. (C) metylointi tilan 34 CpG sivustoja VEZT promoottori ääreisverenkierron plasmasta DNA 30 mahakarsinooman potilasta ja 30 tervettä verrokkia. Perifeerisen veren mahakarsinoo- potilailla havaittiin suurempia metylaatiotasoilla in VEZT promoottorialueen verrattuna terveisiin verrokkeihin. Jokainen rivi ympyröitä, edustaa integroidun metylaation suhteen kolmesta kloonista, ja kunkin ympyrän edustaa yhtä CpG-sivuston. Avoin ympyrä edustaa metyloitumattoman sytosiinin, kun taas täytetyt ympyrät tai osittain täytetyt ympyrät edustavat metyloitu suhde CpG sivustoja.

H. pylori

infektio indusoi metylaatio ja vaiennettaisi VEZT

Huomattava määrä tutkimuksia on julkaistu osoittavat tiedot

H. pylori

infektio on itsenäinen riskitekijä metylaation [20,21,22]. Siksi oletetaan, että

H. pylori

aiheuttaa VEZT metylaatio ja myöhemmin syövän synnyn. Aluksi tutkimme metylaation tason VEZT promoottorin DNA 23 kudosnäytteitä potilaalla on

H. pylori

positiivisia krooninen gastriitti ja käyttäviin BSP ja MSP menetelmiä, joka kattoi alueet -171bp jotta -428bp ja -342 bp -513 bp, vastaavasti (kuvio 1A). Keskimääräiset metylaatiotasoilla että VEZT promoottorin

H. pylori

-positiivinen ja valvonta olivat 75,74 ± 28,16% ja 31,20 ± 25,67%, vastaavasti. Siten merkittävä ero metylaatio havaittiin

H. pylori

positiivisia krooninen gastriitti ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (

P

0,01, kuvio 2A). Promoottorialueen VEZT yleisesti metyloitavaa kroonisessa gastriitti mukaan MSP-analyysi (taulukko S2); mutta löysimme neljä tapausta

H. pylori

positiivisia krooninen gastriitti, jotka olivat suhteellisen metyloimaton. Havaitsimme 19 tapausta

H. pylori

positiivisia krooninen gastriitti että näytössä hypermetylaation (taulukko S2). Sen määrittämiseksi, onko

H. pylori

infektio indusoi promoottorin metylaation VEZT geenin

in vitro

, havaitsimme, että

H. pylori

-infektiosta, joka liittyy IL-6, AKT: n, TNF-а, IL-8, ATF3 ja IRX5 proteiinia jälkeen

H. pylori

infektio ja inkuboitiin 24 h GES-1-soluihin käyttäen Western-blottauksella. Tuloksemme osoittivat

H. pylori

infektio edistänyt IL-6, AKT: n, TNF-а, IL-8, ATF3 ja IRX5 proteiinia ja

H. pylori

infektio oli onnistunut GES-1-soluissa (kuvio 2B, 2C). Edelleen vahvistaa, että

H. pylori

infektio on todellakin vastuussa metylaation tai vaiennettu VEZT, analysoimme promoottori metylaatiostatuksen VEZT in GES-1- soluissa MSP ja BSP. Kuten kuviossa 2D on esitetty, ja 2E, promoottori VEZT oli hypermetylaatiota kaupungista

H. pylori

infektoiduista GES-1-soluissa, mutta unmethylation havaittiin soluissa infektoitunut

H. pylori

(kuvio 2D, ja E). Proteiini ekspressiotaso VEZT oli pienempi

H. pylori

infektoiduista soluista kuin soluissa infektoitunut

H. pylori

(kuvio 2C).

(A)

H. pylori

positiivisia gastriitti potilailla havaittiin suurempia metylaatiotasoilla että VEZT promoottorialueen verrattuna

H. pylori

-negatiivinen gastriitti potilailla. Jokainen rivi ympyröitä, edustaa integroidun metylaation suhteen kolmesta kloonista, ja kunkin ympyrän edustaa yhtä CpG-sivuston. Avoin ympyrä edustaa metyloitumattoman sytosiinin, kun taas täytettyjä ympyröitä tai osittain täytetyt ympyrät edustavat metyloitu suhde CpG sivustoja. (B) jälkeen 24-tunnin infektion

H. pylori

, kiinnitys

H. pylori

havaittiin transmissioelektronimikroskoopilla pinnalla GES-1-soluja kokeellisessa soluissa verrattuna kontrollisoluihin. (C) VEZT ekspressiotaso GES-1-soluissa vähennettiin jälkeen 24 h

H. pylori

infektio suhteessa negatiivisen kontrollin soluihin; kuitenkin,

H. pylori

infektio indusoi IL-6, AKT: n, TNF-α, IL-8, ATF3 ja IRX5 ilmentyminen western blot -analyysillä. (D) metylaatio on VEZT promoottorin havaittiin MSP jälkeen 24 h

H. pylori

infektion GES-1-solut (merkitty M), kun taas metylaatio VEZT promoottorin GES-1-solut, joita ei infektoitu

H. pylori

ei havaittu (merkitty U). (E) Kaavamainen yhteenveto 34 CpG sivustoja promoottorialueen VEZT geenin -171–428 jonka BSP analyysi. GES-1-solut osoittivat korkeampaa metylaation jälkeen

H. pylori

infektio suhteessa kontrolliin näytteitä. Palkki edustaa 5000 nm.

Funktionaalianalyysi palauttamisen jälkeen VEZT ilmentymistä in vitro

Usein hiljentäminen tai alisäätely VEZT mahasyövän solulinjoissa mukaan on todennäköistä, kasvain-vaimennin geeni edellisessä tutkimuksessa. Jotta testi Tässä vaiheessa meidän seulotaan VEZT ilmentymistä useissa mahasyövässä solulinjoissa reaaliaikaisella PCR ja western blot. Eri VEZT ekspressiotasoja löydettiin kuusi solulinjoissa analysoitiin (kuvio 3A). Olemme rakentaneet pEGFP-N1-VEZT ekspressiovektoriin ja transfektoitiin pEGFP-N1 vektorin osaksi mahasyövän solulinja MKN-45 ja NCI-N87, joka ei esiintynyt tai alhainen VEZT ilmaisua. Transfektion jälkeen tutkimme ilmentymistä VEZT näissä solulinjoissa reaaliaikaisella PCR, joka osoitti, että transkriptio ilmentymistason VEZT oli säädelty 41,99-kertainen (kuvio 3B, P 0,01) näissä solulinjoissa verrattuna ohjaus–transfektoiduissa soluissa. Tutkimme myös kapasiteettia mahasyövän solujen yli-ilmentävät VEZT hyökätä ja siirtyä Transvvell- hyökkäyksen ja muuttoliike määrityksissä (kuvio 3C). Invasiivista kyky MKN-45 solujen VEZT /N1 ryhmä väheni merkitsevästi verrattuna kontrolli-transfektoiduissa soluissa (78,32 ± 5,27 vs. 174,13 ± 2,45,

P

0,001). Määrä MKN-45 solujen VEZT transfektoiduissa näytteen läpi vaeltaneiden siirtokuoppaan insertin vähensi merkitsevästi myös verrattuna kontrolli-transfektoiduissa soluissa (48,28 ± 2,16 vs. 142,13 ± 7,42,

P

0,001).

(A) eri ekspressiotasoja VEZT viiden mahasyövän solulinjojen ja yksi kuolemattomaksi mahalaukun limakalvon solulinja. (B) ilmentäminen VEZT oli yläreguloituja MKN-45 ja NCI-N87 solujen upon VEZT vektorin transfektiolla suhteessa N1-ohjaimet. (C) Invasive, muuttavien ja putkimainen muodostumista valmiuksia VEZT-transfektoitujen MKN-45 ja NCI-N87-soluja tukahdutettiin määritettynä Transvvell- ja putkimainen muodostumista määrityksissä. (D) yli-ilmentyminen VEZT johtaa solujen kasvun pysähtymisen määritettynä CCK-8-määrityksessä. (E) Pesäkkeenmuodostusta hinnat olivat merkittävästi toisistaan ​​VEZT-transfektoitujen solujen ja N1-valvontaa MKN-45 ja NCI-N87 soluissa. (F) yli-ilmentyminen VEZT in MKN-45 ja NCI-N87 soluissa esti tuumorigeneesiä nude-hiirissä. Kasvain kyhmyt resekoitu päässä VEZT-transfektoituja ryhmässä olivat vähäisempiä kuin N1-ohjaimet. (G) Kasvaimen kasvu käyrät VEZT /N1 ryhmä ja N1-tarkastukset osoittavat kasvaimen nopeasta kasvusta MKN-45 tai NCI-N87 /N1control ryhmiä. *

P

0,05. Kukin pylväs edustaa keskiarvon ± keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta.

HUVEC suspendoitiin supernatantit kerätään ohjaus- ja VEZT /N1. Sen jälkeen, kun 18-tunnin inkuboinnin supernatantista VEZT /N1-solut osoittivat voimakasta estävä vaikutus muodostumista putkimaisen rakenteiden HUVEC-suhteen lukumäärä, pituus ja leikkaa solmujen verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 3C). pylori

infektio. *

P

0,05. pylori

infektio.

H.