Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

On osoitettu, että seleeni sitovan proteiinin 1 (SBP1) on merkittävästi vaimentua eri ihmisen syövissä. Sen sääntely ja toiminta ei ole vielä vahvistettu.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

Osoitamme, että SBP1 promoottoria hypermetyloitunut paksusuolen syövän kudoksissa ja ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Hoidon 5′-atsa-2′-deoksisytidiinin johtaa demetylaation SBP1 promoottorin ja kasvua SBP1 promoottorin aktiivisuuden, pelastaa SBP1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Lisäksi yli-ilmentyminen SBP1 herkistää koolonkarsinoomasoluissa H

2O

2 indusoiman apoptoosin, estää syöpäsolun muuttoliikkeen in vitro ja estää kasvaimen kasvua nude-hiirissä.

Johtopäätös ja merkitys

Nämä tiedot osoittavat, että SBP1 on tuumorisuppressoriproteiinia toimintoja, joita esti peräsuolen syöpä epigenetic hiljentäminen.

Citation: Pohl NM, Tong C, Fang W, Bi X, Li T, Yang W (2009) Transkription asetus ja biologinen toiminnot Seleeni-sitova proteiini 1 kolorektaalisyövässä in vitro ja in Nude Mouse ksenoqraftit. PLoS ONE 4 (11): e7774. doi: 10,1371 /journal.pone.0007774

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 21 heinäkuu 2009; Hyväksytty 16. lokakuuta 2009; Julkaistu: 16 marraskuu 2009

Copyright: © 2009 Pohl et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Cancer Institute avustus (CA112081) ja American Institute for Cancer Research apurahan (05A121). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Seleeni sitova proteiini 1 (SBP1) on 56 kDa: n proteiini, joka ekspressoituu useissa erilaisissa solutyypeissä, mukaan lukien sydän, maksa, munuaiset, keuhkot ja suolistossa. Ihmisen SBP1 kloonattiin ensin 1997 [1], ja on ehdotettu välittävän solunsisäisiä kuljetuksen seleenin [2]. SBP1 on myös ehdotettu toimia markkerina paksusuolen solujen erilaistumista ja viime aikoina, SBP1 on osoitettu olevan tavoite hypoksia-indusoituva tekijä-1 alfan (HIF1α) [3], ja suoraan vuorovaikutuksessa von Hippel-Lindaun proteiinin (pVHL), joka voi olla rooli proteasomaalisten hajoamisreitit on seleeniä riippuvaisella tavalla [4]. SBP1 on osoitettu olevan pienennetään eri epiteelisyöpien, mukaan lukien eturauhas- [5], vatsa [6], munasarjat [7], keuhkot [8] ja paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [9], [10]. Lisäksi alhainen ilmentymistaso SBP1 kolorektaalisyövässä liittyi huonoon ennusteeseen [9], [10]. Samanlaisia ​​tuloksia on havaittu keuhkon adenokarsinooman [8] ja keuhkopussin mesotelioomatapausten [11]. Näiden tutkimusten perusteella on ehdotettu, että SBP1 voi olla kriittinen rooli säätelyssä syövän kasvua ja etenemistä. Kuitenkin rooli SBP1 näiden reittien ei ole selvitetty.

Epigeneettiset muutokset aiheuttavat geenien, mikä johtaa geenin ilmentymistä ja toimintaa. Kaksi yleisesti mekanismeja on havaittu: histonimodifikaation ja DNA: n metylaatio. Jälkimmäinen tapahtuu sytosiinijäännöksiä sytosiini-guaniini (CpG) sekvenssit. Metylaation CpG saaria promoottori on usein varhainen tapahtuma kasvaimen etenemiseen ja on yhteinen mekanismi geenien syövissä, esiintyy yli 60% tuumorisuppressoreilla [12] – [14].

SBP1 on todettu sisältävän 2-CpG-saarekkeiden sen 5′-transloitumattoman alueen, joista yksi on tarpeeksi lähellä olla vaikutusta SBP1 promoottori asetuksen (-402–613). Näin ollen on mahdollista, että SBP1 promoottori, kasvaimissa, joilla on alhainen ekspressiotasot SBP1, voidaan metyloituja. Itse asiassa, meidän tiedot osoittavat, että SBP1 promoottori on hypermetyloitunut ihmisen paksusuolen syövän kudosten ja ihmisen paksusuolen syövän solulinja HCT116, mutta yleisesti demetyloivan aineen 5′-atsa-2′-Deoksisytidiini (tai 5′-atsa-desitabiini, DAC) palauttaa SBP1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen demetyloimalla SBP1 promoottorialue ja lisäämällä SBP1 promoottorin aktiivisuutta. Me lisäksi säätää ensimmäisessä näyttöä siitä, että SBP1 on anti-cancer toiminnot – yliekspressio SBP1 vuonna HCT116-soluissa indusoi H

2O

2 -välitteisen apoptoosin, estää solujen vaeltamiseen

in vitro

ja estää kasvaimen kasvu nude-hiirissä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture, Human Colon Cancer kudokset ja reagenssit

Ihmisen koolonisyöpäsolulinja HCT116 viljeltiin McCoyn 5A-alusta täydennettynä 10 % FBS, 1% anitbiotic-antimyocytic (GIBCO), ja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa LS174T, Caco2, HT29 ja SW480 pidettiin Minimal Essential Medium (MEM) ja pidettiin samoissa olosuhteissa kuin HCT116-soluissa. Ihmisen paksusuolen syöpä kudoksiin ja vastaaviin normaaleihin kudoksia käytetty meidän laboratorion äskettäin [10]. Sillä H

2O

2 hoitoa, solujen 80% yhtymäkohdassa käsiteltiin 0,3 mM H

2O

2 24 tuntia. Sillä demetylaation-tutkimuksia varten solut käsiteltiin 10 ja 30 uM 5′-atsa-2′-Deoksisytidiini (DAC) 72 tai 96 h (Sigma, St. Louis, MO).

Plasmidit rakentaminen

Ihmisen SBP1 cDNA monistettiin ja subkloonattiin pIRES2 vektoreihin (Clontech, Mountain View, CA) (pIRES2-SBP1) käyttämällä Xhol- ja BamHI restriktioentsyymikohtien. Seuraavia alukkeita käytettiin: eteenpäin: 5′-ATCTCGAGCTATGGCTACGAAATGTGGGAAT-3 ’ja reverse: 5′-ATGGATCCTCAAATCCAGATGTCAGAGCTAC-3’. Tuottaa HA-SBP1 plasmidi, ihmisen SBP1 cDNA monistettiin ja subkloonattiin HA-merkitty pcDNA3.1-vektoriin (PHA) (Invitrogen, Carlsbad, CA) käyttäen Xbal ja Xhol-restriktiokohdat. Seuraavia alukkeita käytettiin: eteenpäin: 5′-ATCTCGAGATGGCTAC GAAATGTGGGAATT-3 ’ja reverse: 5′-ATTCTAGATCAAATCCA GATGTCAGAGCTAC-3’. Lusiferaasin määrityksissä koko pituudelta SBP1 promoottorin (-2572-1) (pGL4-SBP1) kloonattiin pGL4 vektoriin (Promega Corporation, Madison, WI) käyttämällä XhoI- ja Hindlll-restriktiokohdat. Seuraavia alukkeita käytettiin: eteenpäin 5′-ATCTCGAGCCCATACATACCA AGCAA -3 ’ja reverse 5’-TCAAGCTTCGGGTTTGCTGTGCTGGTGTC-3. Tarkkuus kaikki plasmidit varmistettiin kautta sekvensoinnilla.

Transfektio

Ohimenevä transfektio HCT116-solujen PHA-SBP1 tai PHA vektorisäätö suoritettiin kautta Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). 24-48 h transfektion jälkeen, solut käsiteltiin eri määrityksiä. Stabiilia transfektiota, HCT116-solut transfektoitiin pIRES2-SBP1 tai pIRES2 (tyhjä vektori) yksin kautta Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stabiilisti transfektoidut solut valittiin G418: lla.

immunoblottauksella

Immunoblottausta, solut kerättiin 72 tuntia käsittelyn jälkeen. Solut hajotettiin käyttäen 1xRIPA puskuria (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseoksen (Sigma, St. Louis, MO). Solujen hajoamisen jälkeen, 30 ug proteiinia ladattiin 10% SDS-geelille, jota seuraa siirto PVDF-kalvolle. Monoklonaalinen vasta-aine SBP1 ostettiin MBL.

International Corporation (Watertown, MA, 1:1000), vasta-aine β-aktiini hankittiin (Sigma, St. Louis, MO, 1:10000). Toissijainen anti-hiiri-vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, 1:3000). Havaittujen signaalien tehtiin näkyviksi parannetun kemiluminesenssi reaktio järjestelmä, kuten valmistajan suosittelema (ECL-Plus, Amersham, Piscataway, NJ).

metylaatiospesifistä PCR (MS-PCR) B

HCT116-solut käsiteltiin tai ilman DAC 96 tuntia, minkä jälkeen DNA: n puhdistus (DNeasy, Qiagen, Valencia, CA). Puhdistettu DNA muunnettiin sitten käyttämällä EZ-DNA bisulifide muuntaminen -kittiä Zymo Research (Orange, CA), joka muuntaa sytosiinitähteiden urasiiliksi, mutta ei vaikuta 5-metyylisytosiinin, jolloin yksi tunnistaa metyloidut sekvenssien DNA myöhemmän MS -PCR. MS-PCR, metylaatio ja unmethylation spesifisiä alukkeita (suunnitellut metylaatio tunnistus ohjelmisto) [15], joka on komplementaarinen CpG-saarekkeen ulottuu -463–673 5 ’transloitumattoman alueen käytettiin. Sen jälkeen suoritettiin PCR käyttäen yhtä suuret määrät DNA: ta ja iTaq

TM DNA ploymerase (Bio-Rad, Hercules, CA) seuraavissa olosuhteissa: aluksi polymeraasi aktivointi 95 ° C: ssa 5 minuuttia, 95 ° C 45 sekuntia, 53 ° C (metyloitu tuote) tai 50 ° C (metyloitumaton tuote) 45 sekuntia, jota seuraa pidennys 72 ° C ° C: ssa 45 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun 35 sykliä, reaktio lisäksi inkuboitiin 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Koko PCR-tuote ajettiin sitten 2% agaroosigeelillä. Tarkkuus tuote määritettiin kautta sekvensoinnilla.

Luciferase Assay

HCT116-soluja transfektoitiin pGL4 tyhjällä vektorilla tai pGL4-SBP1 plasmidi, joka sisältää täyspitkän SBP1 promoottori. Renillaa oli kotransfektoitiin sisäisenä kontrollina. 24 h transfektion jälkeen, solut käsiteltiin PBS: llä tai 5′-atsa-2′-Deoksisytidiini 72 tuntia. Dual lusiferaasiaktiivisuus Kit (Promega, Madison, WI) käytettiin yhdessä luminometristä mittaamiseksi lusiferaasiaktiivisuutta käsiteltyjen solujen mukaan valmistajien protokollaa.

leviämisen, Apoptosis ja Migration Analysis

Soluproliferaatio analysoitiin MTS-määritys mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega, Madison, WI). Apoptoosin havaitsemiseen, jotka on stabiilisti transfektoitu HCT116-SBP1 tai vektorisäätö solut kerättiin ja kiinnitettiin 70% etanolilla ja sen jälkeen propidiumjodidivärjäys. Sitten solut laskettiin virtaussytometrialla (FACScan, BD Biosciences, San Jose, CA). Solumigraation havaittiin käyttämällä transwell levy (Corning, Lowell, MA) ja sen jälkeen DAPI värjäys.

ksenoqraftit

1 x 10

6 HCT116-solut jotka ilmentävät pysyvästi pIRES2-SBP1 tai pIRES2 vektori injektoitiin ihon alle kylkeen NIH-III nude-hiiriin (

NIH-Lyst

bgFoxn1

nuBtk

xid

) (Charles River Laboratory, NY) (5 hiirtä ryhmää kohti). Eläimiä pidettiin patogeenivapaassa barrieritiloissa University of Illinois at Chicago Biological Resources Laboratory, ja valvoo tarkasti eläimen henkilökunnalta. Neljä viikkoa injektion jälkeen, kasvaimet olivat yksittäisiä ja paino (gm) ja tilavuus (mm

3) kasvainten määritettiin. Kokonais-RNA eristettiin kasvaimesta, kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR suoritettiin, kuten on kuvattu tuoreessa raportissa [10], vahvistaa SBP1 konstitutiivista ilmentymistä ksenografteissa. Kaikki toimenpiteet suoritettiin mukaan Animal Care ja käyttää ohjeena ja hyväksyi University of Illinois at Chicago Animal Care komitea.

Tulokset ja keskustelu

SBP1 promoottori Helposti Metyloidut in Human Colon Cancer kudokset

raportoi äskettäin, että SBP1 proteiinia ja mRNA: n ilmentymisen väheni dramaattisesti ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän [10], samoin kuin muun tyyppisissä syövissä. Valaista syy geenien ilmentymisen vähentäminen, me eristetty kohdistettu ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa ja vastaaviin normaaleihin paksusuolen epiteelisolut kolorektaalisyövän potilaalla on matala kasvaimeen SBP1 proteiini ja mRNA ilmaisun [10] SBP1 promoottori metylointianalyysi. Yllättäen huomasimme todellakin, että SBP1 promoottori oli korkeampi metyloitu näissä kasvaimissa verrattuna niiden viereiseen normaaliin limakalvo (Fig. 1A). Vaikka suuremmat näytemäärät tarvitaan merkitä nämä tulokset, nämä tiedot osoittavat selvästi, että SBP1 promoottori metylaatio voi olla yksi niistä mekanismeista, joka vastaa SBP1 downregulation ihmisen paksusuolen syövissä.

A, SBP1 promoottori erittäin metyloitua ihmisen paksusuolen syöpäkudoksissa. Genominen DNA viereisen normaalin (N) ja adenokarsinooman (T) kudos oli eristetty, muunnetaan ja vahvistetaan ihmisen SBP1 promoottori MS-PCR. # Merkitty eri potilailla. Metyloimatonta (U) ja metyloitu (M) vyöhykkeet havaittiin DNA erottamalla 2% agaroosigeeleillä etidiumbromidilla. B, Western blotting-analyysi osoitti eri ilmentymistä SBP1 ihmisen paksusuolen syövän solulinjoissa; HCT116-solujen stabiili transfektointi SBP1 yli-ilmentävät plasmidia käytettiin positiivisena kontrollina. C, SBP1 promoottori hypermetyloitunut HCT116-soluissa. Genominen DNA LS174T, HCT116, SW480, Caco-2- ja HT-29 koolonsyöpäsoluihin eristettiin, muunnetaan ja monistettu MS-PCR ihmisen SBP1 promoottori seuraa geelierotuksesta kokonais-DNA: 2% agaroosigeeleillä (U, metyloitumattoman DNA M, metyloitua DNA: ta). D, DAC käänteinen SBP1 promoottori metylaatio HCT116-soluissa. DNA HCT116 soluista käsiteltiin 30 uM DAC 96 tuntia eristettiin ja eroteltiin 2% agaroosigeeleillä muuntamisen jälkeen ja MS-PCR. E, Lusiferaasianalyysi osoittivat, että DAC: n lisääntynyt SBP1 promoottorin lusiferaasiaktiivisuus HCT116-solujen transfektio vektorilla, joka sisältää täyspitkän promoottori SBP1 ja käsittelemällä 30 uM DAC tai PBS: ää 72 tunnin ajan. pGL4 vektori ja Renilla on kotransfektoitiin kontrolleina (* p 0,01 verrattuna PBS). F, DAC palautettu SBP1 proteiinin ilmentymistä HCT116-solujen DAC hoitoa 72 tuntia, analysoitiin Western blottauksella. G. SBP1 mRNA palautettiin DAC HCT116-soluissa (* p 0,01 verrattuna PBS). Kukin koe suoritettiin vähintään 3 kertaa.

SBP1 promoottori hypermetyloitunut Human Colon Cancer Cells

validoimiseksi SBP1 promoottorin metylaation ja SBP1 geenin ilmentymistä, ihmisen paksusuolen syövän solulinjat palveluksessa. Ensimmäinen, löydettiin eri SBP1 proteiinin tasoja useissa solulinjoissa analysoitiin Western blottauksella (kuvio. 1 B). Sitten alunperin valittu kaksi solulinjaa varten metylointianalyysi: LST174T soluja, joilla on korkein SBP1 ja HCT116-solut, jotka ovat havaittavissa SBP1 proteiinin ilmentymisen. Kuten kuviossa 1C, SBP1 promoottori oli erittäin metyloitu HCT116-soluissa, kun se oli lähinnä metyloitumaton sisään LS174T soluissa. Myöhemmät sekvensointi leikattiin metyloitu ja metyloitumaton bändejä vahvistivat tarkkuuden metylaatiokuvion nähty näissä kahdessa solulinjassa ja ei havaittu ilmeistä mutaatiot promoottori alueella SBP1. Tutkimme myös SBP1 promoottori metylaatio tilaansa SW480, Caco-2- ja HT-29-solut, joilla on alhainen, kohtalainen ja korkea ekspressiotasot SBP1 proteiinia, vastaavasti (kuvio. 1 B). Yhdenmukainen SBP1 proteiinin ilmaisu, SBP1 promoottori oli erittäin metyloitu SW480-soluissa, kohtalaisen metyloitu Caco-2-soluja ja metyloidut vähemmässä määrin HT-29-solut (Fig. 1 C). Me seuraavaksi käsiteltiin HCT116-solujen kanssa yleisen demetyloiva aineen 5′-atsa-2′-Deoksisytidiini onko hypermetyloitunut SBP1 promoottori voidaan demetyloida. Olemme havainneet, että hoito HCT116-solujen kanssa 30 uM DAC 96 tuntia laski SBP1 promoottorin metylaation ja lisääntynyt SBP1 promoottorin unmethylation, verrattuna PBS hoitoon ohjaus (Fig. 1 D). Tämä viittaa siihen, että SBP1 promoottori säädellään metylaation proksimaalisen CpG-saarekkeen, ja että promoottorin hypermetylaatio vaientaa SBP1 ilmentymistä HCT116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa.

SBP1 Promoottori Demetylaatio Lisääntynyt SBP1 Promoottori Activity ja Palautettu SBP1 Expression

Tuloksemme osoittavat, että SBP1 promoottori on hypermetyloitunut ja että demetyloiva aine DAC voisi kääntää tässä tapauksessa. Siksi on tärkeää valaista onko promoottori demetylaatio voivat myöhemmin lisätä SBP1 promoottorin aktiivisuutta ja SBP1 mRNA ja proteiinin ilmentymisen. Ensin transfektoituja HCT116 solut lusiferaasiplasmidin sisälsi täyspitkän SBP1 promoottorialue (pGL4-SBP1) ja käsiteltiin solut 30pM DAC 72 h testata jos DAC hoito kasvaa promoottorin aktiivisuutta, ja totesi, että DAC todellakin lisääntynyt SBP1 promoottori aktiivisuutta 3-kertaiseksi (Fig. 1 E). Johdonmukaisesti, HCT116-solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla DAC osoitti lisääntynyttä SBP1 proteiinin ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1F). Lisäksi DAC hoito lisäsi SBP1 mRNA-tasoja 50 taittuu 72 tuntia hoitoa ja 89 taittuu 96 tuntia hoitoa HCT116-soluissa (kuvio. 1G). Vaikka muita mekanismeja sääntelyä SBP1 ei voida sulkea pois, nämä kokeet viittaavat siihen, että SBP1 ilmentymistä ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa on vaiennetaan osittain sen promoottorin metylaation ja SBP1 ilmaisua voidaan pelastaa demetyloimalla promoottorialueen.

SBP1 Estää Cell Proliferation, Lisäykset Apoptoosi ja estää Cell Migration

SBP1 on osoitettu olevan osallisena solunsisäisessä kuljetuksessa seleeniä [2] ja toimia markkerina paksusuolen solujen erilaistumista [10]. SBP1 on myös osoitettu olevan vähentynyt eri ihmisen syövissä. Kuitenkin, sen toiminnot syövissä ei ole vielä määritelty. Siksi halusimme selvittää toimintojen SBP1 voisi olla ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Yksi tunnusmerkki syöpä on hallitsematon solujen lisääntymistä. Testata, jos SBP1 voisi vaikuttaa solujen lisääntymistä, HCT116-solut yli-ilmentävät SBP1 käsiteltiin eri pitoisuuksilla H

2O

2 ja solujen proliferaatiota analysoitiin MTS-määritys (Promega, Madison, WI). Vaikka solujen käsittely 0,2 mM H

2O

2 itse esti soluproliferaation HCT116-soluissa, voidaan ymmärtää, että SBP1 yliekspressio herkistyneet HCT116-solujen H

2O

2 aiheuttama kasvun esto alemmilla pitoisuudet ( 0,2 mM), mikä osoittaa, että SBP1 voi olla rooli solukierron säätelyssä (Fig. 2A). FACS-analyysi paljasti, että SBP1 yliekspressio lisäsi apoptoottisen solukuoleman (sub-G1-fraktio), kun soluja käsiteltiin H

2O

2 (Fig. 2B). Lisäksi yliekspressio SBP1 vuonna HCT116-soluissa esti ihmisen paksusuolen syövän solujen vaeltamiseen (Fig. 2C). Nämä kokeet viittaavat siihen, että SBP1 voi olla tuumoria tukahduttavan toimintoja ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa.

A, HCT116-solut, jotka on transfektoitu HA-SBP1 oli lisääntynyt herkkyys H2O2 MTS lisääntymisen määrityksessä verrattuna tyhjän vektorin (HA) . Solut käsiteltiin H2O2: ssa 24 tuntia. B, HCT116-solut, jotka on transfektoitu HA-SBP1 kasvoi H2O2: n indusoiman apoptoosin virtaussytometrialla analysointia. Soluja käsiteltiin 0,3 mM H

2O

2 24 tuntia. Laatikot osoittavat apoptoottisia soluja (sub-G1). C, SBP1 esti syöpäsolun siirto: solu muuttoa SBP1 yli-ilmentävät HCT116-solut ja HA-ohjaus soluissa arvioitiin kautta Transvvell- kammioita. Siirtyneet solut havaittiin DAPI-värjäyksellä.

SBP1 Heikennettyä peräsuolen syövän Cell Growth NIH-III Nude hiiret

Voit testata SBP1 on antituumorivaikutusten

in vivo

, suoritimme vierassiirrekokeissa NIH-III nude-hiiriin käyttäen HCT116 soluja, jotka joko pysyvästi yli-ilmentävät SBP1 (pIRES2-SBP1) tai kontrollivektorille (pIRES2). Neljän viikon kuluttua syöpäsolujen injektion, kasvaimia eristettiin ja kasvaimen tilavuus ja paino määritettiin. SBP1 ilmentyminen irrotetut kasvaimissa peräisin SBP1 yli-ilmentävät HCT116-solujen ollessa vahvistettiin RT-PCR osoittaa 607-kertainen mRNA tasolla. Yhdenmukainen

in vitro

data, hiiret injektoitiin SBP1 yli-ilmentävät HCT116-solut oli huomattavasti pienempi kasvaimen tilavuus (Fig. 3A) ja kasvaimen paino (Fig. 3B) kuin hiiret injektoitiin kontrolli soluihin, mikä osoittaa, että SBP1 on tuumoria tukahduttavan toiminnot

in vivo

samoin.

NIH-III nude-hiiriin injektoitiin HCT116-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti SBP1 (pIRES2-SBP1) tai vektorin (pIRES2) kontrolli. Neljä viikkoa injektion jälkeen, kasvaimen tilavuus (A) ja kasvaimen paino (B) määritettiin.

otettu edellä, tarjoamme ensimmäinen näyttö siitä, että SBP1 promoottoria hypermetyloitunut ihmisen peräsuolen syöpä, ja että demetylaatio kautta DAC lisää SBP1 promoottorin aktiivisuutta sekä pelastamiseen mRNA ja proteiinin ilmentymisen (Fig. 1). Geenien on yleinen mekanismi monissa ihmisen syövissä estävän kasvaimia estävä lauseke. Tuloksemme osoittavat, että SBP1 promoottori on erittäin metyloitua kasvainkudoksissa paksusuolen syövän potilaille, mikä osoittaa, että SBP1 ilmentyminen paksusuolensyöpä on osittain ohjata geenien. On tärkeää tutkia, SBP1 geenien on yhteinen mekanismi vähentää SBP1 ilmentymisen muiden syöpien, jossa SBP1 on osoitettu vaimentua. Lisäksi, koska vähentynyt ilmentyminen SBP1 ihmisen syövissä, SBP1 on ehdotettu on tuumoria tukahduttavan toimintaa. Uskomme, että olemme ensimmäisinä osoittamaan, että tämä voi todellakin olla totta, suhteen, että yliekspressio SBP1 vuonna HCT116-soluissa tukahdutetaan solujen lisääntymistä, lisääntynyt apoptoottista solukuolemaa ja laski solumigraatio

in vitro

(kuvio . 2), ja se esti tuumorin kasvua

in vivo

(Fig. 3). Kuitenkin tarkka mekanismit SBP1 sääntelyn ja syövän vastaisen toiminnan ei vielä tunneta ja tarvitaan lisätutkimuksia. Itse asiassa, se on parhaillaan tutkitaan laboratoriossamme. Ymmärtäminen sääntely ja mekanismit SBP1 tuumorisuppressorin toiminnot on suuri vaikutus paljastaen molekyylimekanismin syövän synnyn ja kehittämään tehokkaampia kemopreventiossa ja chemotherapies ihmisen pahanlaatuisia sairauksia.