Krooninen sairaus

tiivistelmä

TP53 on yleisimmin mutatoitunut geeni pään ja kaulan alueen syöpä (HNSCC), jossa mutaatiot on assosioitu vastus tavanomaista hoitoa. Palauttamaan normaali p53-funktio on aiemmin tutkittu käytön kautta RITA (aktivoituminen p53 ja induktio tuumorisolujen apoptoosin), pieni molekyyli, joka indusoi konformaatiomuutoksen p53, aktivoitumiseen johtavat sen loppupään tavoitteet. Nykyisessä tutkimuksessa havaittiin, että RITA käyttää todellakin merkittäviä vaikutuksia HNSCC soluissa. Kuitenkin tässä mallissa, huomasimme, että merkittävä tulos RITA hoidon kiihtyi vanhenemista. RITA aiheuttama vanhenemista eri p53 taustat, mukaan lukien p53-null-soluissa. Myös esto p53 ilmaisua ei näyttänyt merkitsevästi estävän RITA aiheuttamaa vanhenemista. Siten tämä ilmiö näyttää olevan osittain p53-riippumatonta. Lisäksi RITA aiheuttama vanhenemista näyttää osittain välittävät aktivoituminen DNA-vaurioita vaste ja SIRT1 (Silent tiedot säädin T1) inhibition, jossa synergistinen vaikutus nähdään yhdistämällä joko ionisoivan säteilyn tai SIRT1 inhibitio RITA hoitoon. Nämä tiedot osoittavat kohti uutta mekanismi RITA toimi niin hyvin kuin vihje sen mahdollista terapeuttista hyötyä HNSCC.

Citation: Chuang HC, Yang LP, Fitzgerald AL, Osman A, Woo SH, Myers JN, et al . (2014) p53-reaktivoiville pienimolekyylisiä RITA indusoi Vanheneminen pään ja kaulan syövän solut. PLoS ONE 9 (8): e104821. doi: 10,1371 /journal.pone.0104821

Editor: Arianna L. Kim, Columbia University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2014; Julkaistu: 13 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Chuang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Teksasin yliopiston MD Anderson Head and Neck Cancer SPORE Urakehitys Award (HS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mutaatiot

TP53

ovat yhteinen geneettinen muutos läsnä monenlaisia ​​kiinteän kasvaimen, kuten pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [1], [2]. Ryhmämme ja muut ovat osoittaneet, että

TP53

mutaatiot liittyy lisääntynyt Säteilynsietotestin ja kemoterapian HNSCC solulinjoissa

in vitro

ja huono tuloksia potilailla, joilla HNSCC [3] – [5 ]. Valitettavasti hoitostrategioita uudelleen käyttöön villityypin (wt) p53 kasvaimiin ollut logistisesti haastava [6], ja näin strategioita tutkitaan terapeuttista uudelleenaktivointimaksu sisäsyntyisen p53 sijaan [7] – [10]. Yksi kiinnostava yhdiste, RITA (aktivoituminen p53 ja induktio tuumorisolujen apoptoosin), on pieni molekyyli, joka sitoutuu N-terminaaliseen päähän p53-proteiinin ja indusoi konformationaalisen muutoksen, joka voi johtaa normalisointi p53-toiminto [11] , [12]. RITA voi aktivoida p53 loppupään tavoitteita sekä p53 p- [13], [14] ja p53-mutantin (mt) soluihin [15] erilaisia ​​malleja.

RITA ajatellaan vaikuttavan pääasiassa kautta apoptoosin , ja todellakin RITA, yksin tai yhdessä sisplatiinin kanssa, voivat aiheuttaa apoptoosin monissa HNSCC solulinjoissa [16], [17]. Kuitenkin tämä vaikutus ei ole universaali. Solulinjoja, jotka ilmentävät villityypin p53, mutta ei apoptoosiin vasteena RITA hoitoon kuuluvat HNSCC solulinja JHU-028 [17], ihmisen luusarkoomasolulinja SJSA ja ihmisen koolonkarsinoomasolulinja RKO [18].

Apoptoosi ei ole ainoa solu kohtalo, kun p53: n aktivointi. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että aktivointi p53 vastauksena erilaisiin ärsykkeisiin syöpäsoluissa johtaa nopeutetun vanhenemista [7]. Vaikka lopputulos solun sen tultua Vanheneminen on epäselvä, useat tutkimukset ovat yhdistäneet induktion Vanheneminen kanssa vastauksena terapeuttisia aineita. Olemme havainneet, että säteily [3] ja sisplatiinin [4] estivät solukasvua aiheuttamalla Vanheneminen on villityypin p53 HNSCC soluja. Tämän mukaisesti havainnon, HNSCC solut ilmentävät mt p53 havaittiin olevan resistenttejä säteilyä tai sisplatiinin, lähinnä siksi, että ei ole olemassa vanhenemista vasteen. Olemme lisäksi havaittu, että monet näistä samat solulinjat ovat myös resistenttejä indusoiman apoptoosin [3], [4]. Niinpä ainakin tässä mallissa, induktio vanhenemisen näyttäisi kuvastavan suotuisa hoitotulokseen.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää vaikutus RITA eloonjäämiseen, leviämisen, ja induktio vanhenemisen useissa ihmisen HNSCC solulinjat. Olemme lisäksi pyrkineet ymmärtämään mekanismeja, joilla näitä vaikutuksia esiintyy.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

HNSCC solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa oli antelias lahja tri Jeffrey Myers (The University of Texas MD Anderson Cancer Center ja on aiemmin tunnettu [19]. HN30 ja HN31 solulinjat olivat peräisin primaarisen kasvaimen ja imusolmukkeiden solmukohtien etäpesäke nielun okasolusyöpä vastaavasti. koko exome näiden kahden solulinjojen on sekvensoitu erillistä hanke, ja lukuun ottamatta TP53, ei ole muita ristiriitainen mutaatioita kahdessa solulinjassa havaittiin. PCI-13-solulinja oli peräisin suuontelon levyepiteelisyöpä. Kaikkia solulinjoja ylläpidettiin Dulbecco Modified Eagle Medium, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä /streptomysiiniä, glutamiinia, natriumpyruvaattia, ei-välttämättömiä aminohappoja ja vitamiineja. tekniikoita stabiilisti kaatamalla p53 HN30 soluissa (joissa on villityypin p53) ja HN31-solut (joilla on mt p53) ovat on kuvattu muualla [3]. PCI-13-solut, joilla ei ole endogeenistä p53, oli suunniteltu ilmaisemaan

TP53

yliekspressio konstruktit (villityypin p53, A161S, G245D), joka oli tuotettu ja insertoidaan pBabe sisältävän retrovirusvektorin puromysiininresistenssigeenin lisäys ( pBabe-puro, Addgene) käyttäen standardi kloonaus- tekniikoita. HN31-solut transfektoitiin lyhyt- hiusneula-RNA (shRNA) spesifinen SIRT-1 (Silent tiedot säädin T1) tai kontrolli salattu shRNA kautta lentivirusvektorit, jotka sisältävät puromysiini-resistenssigeenin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), mukaan valmistajan ohjeita. Lentiviruksen-transfektoidut kontrollisoluja (HN31-C2), ja niiden shRNA, vakaa SIRT-1-pudotus vastine (HN31-S19) eristettiin immunoblottauksella sen jälkeen, kun seulottiin. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta.

Vasta-aineet ja immunoblottaus-

Protein ja fosforyloidun proteiinin ekspressiotasot arvioitiin immunoblottaus kokosolulysaateista soluista käsitelty tai ei ole käsitelty RITA. Seuraavat ensisijainen vasta-aineita käytettiin: p53 (DO-1) ja fosfoseriini- 15 p53 Santa Cruz Biotechnology; p21 Calbiochem; p-p53 (Ser-15), p53-upregulated modulaattori apoptoosin (PUMA), hiiren kaksinkertainen minute2 (MDM2), Checkpoint kinaasi 2 (Chk2), fosforyloitu Chk2 (p-Chk2, Thr68), SIRT1, ja β-aktiini maasta Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Vuohen anti-hiiri ja anti-kaniini-vasta-aineita konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin ostettiin Cell Signaling ja Santa Cruz Biotechnology, vastaavasti.

reagenssit

RITA hankittiin Cayman Chemical (Ann Arbor, MI ) ja proteiinikinaasi-inhibiittori staurosporiini ostettiin Sigma (St Louis, MO). SIRT1 estäjä Tenovin-6 saatiin Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX). RITA liuotettiin 100% dimetyylisulfoksidiin (DMSO), joka on varastossa pitoisuuteen 50 mM ja varastoidaan erinä käyttöön asti. Staurosporiini ja Tenovin-6 liuotettiin 100% DMSO: ta ja vettä, vastaavasti, varastossa pitoisuudet 1 M ja tallennetaan erät käyttöön asti.

Growth tukahduttaminen määrityksissä

solunelinkykyisyysmäärityksen on aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, 2000 solua /kuoppa maljattiin 96-kuoppalevyille, käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla RITA enintään 72 tuntia, ja elinkelpoisuus oli arvioitu MTT-määritys. Jotta pesäkkeitä muodostumisen määritys [3], HNSCC solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 24 tunnin ajan, käsiteltiin RITA, ja viljeltiin 10-14 päivä. Solut kiinnitettiin 3% kristalliviolettia /10% formaliiniliuokseen ja pesäkkeitä, jotka sisältävät yli 50 solusta, laskettiin kanssa ImageJ ohjelmisto.

Vanheneminen-associated- β-galaktosidaasi värjäys

Vanheneminen liittyvä p-galaktosidaasi (SA-β-gal) värjäys suoritettiin valmistajan ohjeiden (Cell Signaling Technology). Lyhyesti, HNSCC solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin RITA eri pitoisuuksina eri aikoina (tavallisesti 5 päivää), minkä jälkeen solut kiinnitettiin 10 minuuttia ja värjättiin SA-β-gal-aktiivisuuden yli yön 37 ° C: ssa. Litistetty ja blue-värjäystä solut pisteytettiin senescent ja ilmoitetaan prosentteina kaikkien solujen havaittiin per suuritehoisia kenttään.

Tilastolliset analyysit

Data yhdistettiin analyysiä varten useiden riippumattomien kokeiden ja solu-pohjainen määritykset tehtiin kolmena kappaleena. Kaksisuuntainen Opiskelijan

t

testejä käytettiin arvioimaan eroja vanhenemista ja muita parittomia ryhmä vertailuja. Kaikkien vertailuissa,

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Effects of RITA p53 ja p53 liittyvien proteiinien

Käytimme pari isogeenisten HNSCC solulinjojen, yksi villikannan p53 (HN30) ja toinen mt p53 (HN31), testata vaikutusta RITA ilmenemistä ja fosforylaatiota p53 ja muut siihen liittyvät proteiinit. RITA indusoituu voimakkaasti fosforylaation p53 ja p21 jälkeen 12 tunnin HN30-soluissa ja sen jälkeen 24 tuntia HN31-soluissa (kuvio. 1A). PUMA proteiini-tasot kohonneet myös 24 tunnin kuluttua altistumisesta RITA molemmissa solulinjoissa. Korotukset p53 ilmentymistä, p53 fosforylaatio, ja PUMA ilme 24 tuntia olivat annoksesta riippuvaa (kuvio. 1 B). Nämä tulokset osoittavat, että RITA voi aktivoida alavirtaan tavoitteet p53 signalointi näillä isogeenisiin solulinjoissa paino- tai mt p53.

(A ja B) HN30 (villityyppinen p53) ja HN31 (p53) pään ja kaulan syövän soluja käsiteltiin RITA varten ilmoitettu ajat (A) ja annokset (B) ja p53: n ja sen tavoitteet arvioitiin immunoblottauksella. (C) Soluja käsiteltiin RITA (0,1 uM-20 uM) 72 tunnin ajan ja arvioitiin kautta MTT-määritys. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.E. kolmen kokeen. (D) HN30 ja HN31 solut käsiteltiin RITA osoitetussa annoksia 10-14 päivä, jonka jälkeen pesäkkeet värjäsimme, ja määrällisesti. Kuvat ovat kolmen kokeen samanlaisia ​​Tulokset esitetään. Määrälliset tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.E. kolmen kokeen. * – Osoittaa p 0,05 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

RITA inhiboi pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja

Useat tutkimukset ovat joka RITA voi aiheuttaa kasvainsolun kuoleman [15], [ ,,,0],18]. Aluksi, testasimme onko RITA voi estää kasvua HN30 ja HN31 soluja. Käyttämällä lyhyen aikavälin soluproleferaatiomäärityksessä, olemme havainneet, että RITA, pitoisuuksina yli 5 uM, indusoi vaatimattomia kasvun hidastuminen sekä HN30 ja HN31 soluja 72 tunnin jälkeen jatkuvan hoidon (Fig. 1 C). Pidemmällä aikavälillä pesäkemuodostusta, RITA havaittiin vähentävän merkittävästi muodostuneiden pesäkkeiden määrästä sekä solulinjoissa kaikilla tutkituilla annoksilla (p 0,05) (Fig. 1 D).

RITA indusoi vanhenemista pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja

Osoitimme aikaisemmin, että hallitseva muoto vasteena joko fysiologisesti merkityksellisiä sisplatiinin [4] tai standardin säteilyannosten [3] p53 villityypin HNSCC solulinjoja ei apoptoosia. Vastaavasti nykyinen malli, minimaalinen kaspaasi ja PARP pilkkominen havaittiin seuraava altistuminen RITA (Fig. 2A). Näin ollen testata hypoteesia, että havaittu anti-proliferatiivista vastetta HN30 ja HN31 solujen RITA oli ainakin osittain johtuen induktion vanhenemisen, analysoimme SA-β-gal-aktiivisuuden, markkeri solun vanhenemista. Olemme havainneet, että RITA vaikuttaa solujen morfologia ja huomattavasti SA-β-gal-värjäytymisen annoksesta riippuvalla tavalla molemmissa solulinjoissa (p 0,05, Fig. 2B), mikä osoittaa, että RITA hoito johti nopeutetun vanhenemisen näissä isogeenisiin solulinjoissa.

(A) PARP ja kaspaasi 3 pilkkominen tutkittiin kautta western blotting altistuksen jälkeen solujen RITA 1 uM ilmoitettu aikoja. P, staurosporiini (1 uM 8 tuntia) käytettiin positiivisena kontrollina. (B) HN30 ja HN31-solut ympättiin 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla RITA varten 5 päivää, minkä jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin vanhenemista liittyvän -β-galaktosidaasi (SA-β-gal) aktiivisuus . Kuvat ovat kolmen kokeen samanlaisia ​​Tulokset esitetään. Kussakin käsiteltyä tai käsittelemätöntä hyvin, viisi satunnaiskentän valinnat tehtiin ja solujen määrä, joissa senescent morfologia ja sininen värjäys laskettiin alle 20X suurennus (Olympus IX71). * – Osoittaa p 0,05 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

p53 tila ja RITA-välitteistä kasvun estäminen in HNSCC solulinjoissa

Seuraavaksi tutkia RITA aiheuttamaa vanhenemista riippuu p53: , käsittelimme vakaa-p53-knockdown solulinjoissa HN30-shp53 ja HN31-shp53 RITA ja totesi, että knockdown p53-proteiinin ilmentymisen merkittävästi pienentää sekä ilmaisun ja fosforylaatiota p53 (Fig. 3). Kuitenkin lähtötilanteen p21 ilmaus oli muuttumattomana HN30 (villityypin p53) soluja (Kuva. 3A). Olemme lisäksi havainneet, että p53 esto oli vain osittainen pelastus vaikutus RITA aiheuttama kasvun esto ja pesäkkeiden muodostumista HN30 soluissa, ja se ei ollut merkittävää pelastus vaikutusta HN31 soluihin (Fig. 3B). Lisäksi p53 pudotus ei vaikuttanut RITA aiheuttaman vanhenemisen joko tyypin p53-knockdown-soluja (Fig. 3C).

(A) tasot kokonais- ja fosforyloitu p53 ja p21 mitattiin HN30 ja HN31 lentiviral- transfektoidut ohjaus solut ja niiden lyhyen hiusneula-RNA, p53-vakaa-pudotus kollegansa hoidon jälkeen 1 uM RITA: ssa 72 tuntia. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. (B) HN30 ja HN31 lentiviruksen transfektoitiin kontrolli-solujen ja niiden p53-vakaa-pudotus kollegansa käsiteltiin RITA osoitetussa annoksia 10-14 päivä, jonka jälkeen pesäkkeet värjäsimme, ja määrällisesti. Kuvat ovat kolmen kokeen samanlaisia ​​Tulokset esitetään. Määrälliset tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.E. kolmen kokeen. Kaikissa solulinjoissa (ohjaus ja sh53), RITA käsittely johti merkitsevästi (p 0,05) vähentynyt pesäkkeen muodostumisen kaikilla tutkituilla annoksilla. (C) HN30 ja HN31 lentiviruksen transfektoitiin kontrolli-solujen ja niiden p53-vakaa-pudotus kollegansa ympättiin 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille ja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla RITA varten 5 päivää, minkä jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin senescence- liittyvä -β-galaktosidaasi (SA-β-gal). Kuvat ovat kolmen kokeen samanlaisia ​​Tulokset esitetään. Lukuun ottamatta 0,1 uM HN30-shp53, kaikki annokset RITA kaikissa solulinjoissa johti merkittävästi (p 0,05) lisääntyi SA-β-gal-käsittelemättömään kontrolliin verrattuna. Merkittäviä eroja ei havaittu ohjaus ja shp53 kummassakaan solulinjassa.

Seuraavaksi testasimme käyttökuntoon villityypin p53 ja mt p53 p53-null PCI-13 solujen antaisi alttiutta RITA. Näitä kokeita varten, pBabe (vektorisäätö), villityypin p53, ja A161S ja G245D mutantti p53-konstruktit uudelleen tuotu PCI-13-solut tuottamaan PCI-13-pBabe, PCI-13-WT, PCI-13-A161S ja PCI-13-G245D solulinjoissa. Toisin kuin p53-positiivisten solujen, p53 ja fosforyloitu p53 ei havaittu PCI-13 pBabe kontrollisoluja (Fig. 4A). Myös p21 ilmaistiin ainoastaan ​​paino- ilmentäviä soluja ja yksi mt p53-ilmentävät solut (PCI-13-A161S).

(A) PCI-13 (p53-tyhjä) soluja, jotka ilmentävät vektoria valvontaa tai ilmoitettu p53 konstruktit hoidettiin RITA 2,5 uM 72 tuntia, jonka jälkeen proteiini lysaatit valmistettiin ja veren kokonaiskolesterolia ja fosforyloidun p53 ja p21 arvioitiin western blottauksella. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. (B) PCI-13-solut ilmensivät mainittuja konstrukteja ympättiin 6-kuoppalevyille, käsiteltiin RITA ilmoitettuina pitoisuuksina, ja laskettiin klonogeenisten määrityksessä. Lukuun ottamatta pBabe soluja käsiteltiin 0,25 uM, kaikki solulinjat kaikilla testatuilla pitoisuuksilla RITA osoitti merkittävästi vähentynyt pesäkkeiden muodostumisen käsittelemättömään kontrolliin verrattuna (p 0,05). (C) PCI-13-solut ilmensivät mainittuja konstrukteja ympättiin 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille ja käsiteltiin 0,25 uM RITA, minkä jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin vanhenemista liittyvän -β-galaktosidaasi (SA-β-gal) aktiivisuus . Kuvat ovat kolmen kokeen samanlaisia ​​Tulokset esitetään. Kaikki solulinjat osoittivat huomattavasti SA-β-gal-värjäyksen verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (p 0,05).

pitkän aikavälin pesäkemuodostusta (Fig. 4B) ja SA-β-gal-värjäyksellä (Fig. 4C) osoittivat, että RITA esti merkitsevästi solujen kasvua ja indusoi vanhenemista kaikissa PCI-13-solulinjojen riippumatta p53 tila, mukaan lukien p53-null emolinjan (p 0,05). Näin ollen, kun läsnä on p53-proteiini ei näytä olevan vaaditaan RITA käyttämään sen vaikutuksia.

RITA-indusoidun DNA-vaurioita vasteen HNSCC solulinjoissa liittyy SIRT1 downregulation

RITA on lisäksi tiedetään aiheuttavan DNA-vaurio vastauksen [21], [22]. Checkpoint kinaasi 2 (Chk2) on tärkeä myötävirtaan kohde DNA-vaurioita vastaus ja johtaa solukierron pysähtymisen, apoptoosin, tai vanhenemista. Erityisesti aktivoitu Chk2 voi aiheuttaa p53-riippumatonta vanhenemista syöpäsoluissa [23], [24]. Nämä tulokset, meidän toteamisesta RITA estää HNSCC solujen kasvua ja voi aiheuttaa vanhenemista jopa ilman p53, johti meidät tutkimaan vaikutusta RITA on Chk2 ilmaisun ja fosforylaatio tila. Huomasimme, että Chk2 proteiini fosforyloitiin sen aktivointikohdan, Thr68, altistumisen jälkeen RITA vuonna HN30, HN31 ja PCI-13 soluissa riippumatta p53 status (Kuva. 5A).

(A) HN30 tai HN31 solut, jotka on transfektoitu lentiviruksen ohjaus- tai lyhyen hiusneula-RNA, p53-vakaa-pudotus konstruktit käsiteltiin 1 uM RITA 1 72 tuntia, minkä jälkeen proteiini lysaatit valmistettiin ja veren kokonaiskolesterolia ja fosforyloidun Chk2 arvioi immunoblottauksella. Oikea: PCI-13-soluja transfektoitiin osoitetuilla konstruktit käsiteltiin 2,5 uM RITA eri aikoja, minkä jälkeen proteiini lysaatit valmistettiin ja veren kokonaiskolesterolia ja fosforyloidun Chk2 arvioitiin. (B) HN30, HN31, ja PCI-13-solujen kanssa ilmoitetun p53 konstruktit hoidettiin RITA varten ilmoitettu aikoja, ja lysaatit arvioitiin SIRT1 proteiinin ilmentyminen western blottauksella. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. (C) HN31, jotka on vakaasti transdusoitu lentiviral kontrollivektoreihin (C) tai SIRT1 shRNA (S) alun perin määritettiin inhibitio SIRT-1 ilmentymisen. Edustaja kloonit käsiteltiin sitten 2,5 uM RITA: ssa 72 tuntia, jonka jälkeen ilmoitetaan proteiinit uutettiin ja analysoitiin western-blottauksella. (D) HN31, jotka on vakaasti transdusoitu lentiviral kontrollivektoreihin (C2) tai SIRT1 shRNA (S19) ympättiin 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille ja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla RITA varten 5 päivää, minkä jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin vanhenemista -associated -β-galaktosidaasi (SA-β-gal) aktiivisuus. Kuvat ovat kolmen kokeen samanlaisia ​​Tulokset esitetään. * – Ilmaisee merkittävästi lisääntynyt verrattuna ohjaamaan vektori osoitetussa annoksella (p 0,05). (E) HN31 solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin RITA (0,25 M) kanssa tai ilman Tenovin 6 (0,125 tai 0,25 uM) 10 päivää, minkä jälkeen pesäkkeitä värjäsimme, ja määrällisesti. * – Ilmaisee merkittävästi vähentynyt verrattuna Tenovin 6 yksin ryhmä osoitetussa annoksella. Aineisto on normalisoitu joko vain vehikkeliä tai RITA hoitoon olosuhteissa. Kuvat ovat kolmen kokeen samanlaisia ​​Tulokset esitetään. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SE kolmen kokeen.

Seuraavaksi, koska Chk2 näyttää aktivoida solun vanhenemista estämällä SIRT1 [25], ja koska pudotus tai inhibitio SIRT1 aktiivisuus voi myös aiheuttaa vanhenemista-like kasvun pysähtymistä puuttuessa toiminnallisen p53 [26] – [28], arvioimme SIRT1 ilmaisun ja totesi, että RITA vähensivät SIRT1 ilmentyminen kaikissa solulinjoissa, arvioitiin, riippumatta p53: (Fig. 5B).

tämän testaamiseksi vaikutuksen lisäksi, me arvioi ehtyminen SIRT1 mukaan shRNA lisäisi biologista vaikutusta RITA. Huomasimme, että shRNA estoa SIRT1 laski SIRT1 proteiinin tasot ja lisääntynyt fosforyloituu Chk2 tasoa altistumisen jälkeen RITA (Fig. 5C). Lisäksi RITA hoito olennaisesti parannettu SA-β-gal värjäyksellä HN31-S19 (SIRT1-Knockdown) soluihin verrattuna HN31-C2 (kontrolli-transfektoidut) solut (Fig. 5D). Lopuksi yhdistelmä RITA ja SIRT1 inhibiittorin Tenovin 6 tuotti synergistisen solun kasvun inhibitiota vaikutuksen (Fig. 5E). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että RITA voi estää SIRT1 ilmaisun ja että tämä vaikutus edistää RITA aiheuttamaa vanhenemista.

RITA lisää radioherkkyyttä mutantti p53-ilmentymisen HNSCC

pohjalta meidän edelliset havainnot että radioherkkyyttä in HNSCC soluissa liittyy vahvasti niiden kyky läpikäydä vanhenemista säteilytyksen jälkeen, nimenomaan että HN31 mt p53 solut ovat säteilyresistenteille ja on alhainen säteilyn aiheuttama vanhenemista, ja nykyinen havainnot että RITA laski elinkelpoisuuden ja lisääntynyt vanhenemisen in HN31 soluissa, , tutkimme RITA voisi toimia säteilyherkiste. Olemme havainneet, että esikäsittely HN31 solujen RITA 24 tuntia, minkä jälkeen säteilytys johti synergistinen solujen kasvun esto, kun verrataan IC80 (Fig. 6A). Erityisesti, keskenään ei-yksinomaisen kombinatorinen indeksi (CI) laskettiin käyttäen menetelmää Chou Talalay [29]. Yhdistelmä RITA ja säteilyn johti CI 0,50, jossa on CI alle 1 osoittaa synergiaa.

(A) HN31 solut maljattiin 1000 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä, käsiteltiin RITA 24 tuntia, ja sitä käsiteltiin 2 Gy säteilyn. Myös pesäkkeiden lukumäärät laskettiin ja käytetään laskettaessa eloonjääntifraktio. Tulokset esitetään tavallisena isobologram-, jossa kiinteä viiva edustaa additiivinen vaikutus ja pisteiden edustaa annos johti 80%: n inhibitio (IC80) (B) Ehdotettu toimintamekanismia RITA yhteydessä eri p53-mutaation tila.

keskustelu

Löysimme esillä olevassa tutkimuksessa, joka RITA voi estää kasvua ja aiheuttaa vanhenemista in HNSCC soluissa, vaikkei p53 tai yhteydessä ehtyminen p53 ilmaisun, ja että tämä ilmiö liittyy lisääntynyt Chk2 aktivointi ja riippuu ainakin osittain SIRT1. Nämä havainnot ovat vastakohtana aikaisempien tutkijoiden esittämiä RITA toimii ensisijaisesti kautta apoptoosin aktivoimalla p53 signaloinnin; pikemminkin, meidän havainnot osoittavat, että RITA voi johtaa vanhenemista vuonna HNSCC soluissa muun vaikutuksia eikä täysin riippuvainen p53 ilme.

Vaikka monet reittejä mukana vanhenemista välittyvät p53, erityisesti yhteydessä p53 fosforylaatio, vanhenemista voi esiintyä myös ilman tätä proteiinia, viittaa siihen, että p53-riippumattomien mekanismien voi myös välittää hoidon aiheuttamaa vanhenemista kasvainsolujen [30] – [34]. Esimerkiksi doksorubisiinin osoitettiin indusoivan senescent fenotyypin p53-null Saos-2-soluissa, ja SW480 ja U251-solut, jotka ilmentävät mutantti p53, ja HeLa sekä Hep-2-solu- linjat, joissa p53-toiminto on estetty [35 ].

Muut ryhmät ovat raportoineet, että RITA voi vain aiheuttaa p53 vaan myös aiheuttaa samanaikaisen DNA-vaurioita vastaus [21], [22]. DNA vaurioita vastaus liittyy kaksi suurta signalointireiteissä, anturi kinaasien ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) sekä ataksia telangiektasian ja Rad3 liittyvien (ATR). Nämä kinaasit aktivoivat alavirtavaikuttajainhibiittorit kinaasien Chk2 ja Chk1. Chk2 voi laukaista monistus vanhenemista kautta p53 /p21 tai muita väyliä vastauksena telomeerien toimintahäiriö ja DNA-vaurioita [36]. Äskettäin Chk2 on osoitettu moduloivan soluvastetta RITA [22]. Havaintomme että RITA hoito pyydettäessä lisääntyminen Chk2 fosforylaation riippumatta p53 tila ovat sopusoinnussa tämän havainnon (Fig. 5).

Olosuhteissa solustressiä tai DNA-vaurioita, Chk2 aktivointi voi johtaa vähenemiseen SIRT1 ilmaisun ja vanhenemista [25]. SIRT1 on erittäin konservoitunut histonideasetylaasi- jonka tiedetään välittävän solujen aineenvaihduntaan, ikääntyminen, ja vastaus korostaa [37]. Yliekspressio SIRT1 on osoitettu estävän solujen vanhenemista on erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia [38]. Lisäksi, SIRT1 yliekspressoituu solunsalpaajaresistentti soluissa, ja estämällä SIRT1 voi estää kasvaimen kasvua joissakin malleissa [27], [38] – [40]. Itse asiassa nykyinen tutkimuksessa havaittiin, että RITA esti SIRT1 ilmentymistä kaikissa testatuissa solulinjoissa, riippumatta p53: (Fig. 5B). Lisäksi käsittelemällä SIRT1 estäjää tai SIRT1 erityisiä shRNA johti vähenee kasvuun ja korotukset vanhenemista yhteydessä RITA hoitoon. Vaikka esto SIRT1 uskotaan aiheuttavan vanhenemista ensisijaisesti vuorovaikutuksessa p53: n kanssa, ainakin yksi ryhmä on osoittanut, että doksorubisiini voi aiheuttaa vanhenemista SCC-soluissa, joilta puuttuu p53-eston kautta SIRT1 [26]. Lisäksi yksi ryhmä on raportoinut, että esto SIRT1 voi aiheuttaa vanhenemista in H1299 (p53 null) kautta aktiivisuuden vähenemistä Ras /MAPK signalointi. Nämä havainnot voivat tarjota linkin havaitut vaikutukset RITA, jopa HNSCC soluja, joista puuttuu p53-proteiini. Perusteella havaintomme nykyisestä tutkimuksen sekä toisten työn, ehdotamme, että RITA indusoi kasvun pysähtymisen ja vanhenemista vähintään kaksi erilaista reittiä (Fig. 6B). P53-kompetentteja soluja, RITA todennäköisesti vaikuttaa ensisijaisesti kautta kanoninen p53 tavoitteita, joka on hallitseva lääkkeen vaikutuksen. Lopputuloksena Tämän aktivaatio voi olla joko apoptoosin tai vanhenemista yhteydestä riippuen. Kääntäen, pienempi, mutta silti merkittävä vaikutus solujen elävyys nähdään p53 viallinen solulinjoissa. Kuitenkin, koska ei ole p53: n tai p53-proteiini, RITA näyttää käyttämään ainakin joitakin sen vaikutuksia kautta aktivoimalla DNA-vaurioita vasteen ja estämällä SIRT1 ilmentymistä. Tarkka luonne kaksitoiminen vaatii lisätutkimuksia.

linkitetyn vastauksena sisplatiinin ja sädehoidon kanssa induktion vanhenemisen, joka osoittaa, että solut, jotka ovat resistenttejä näiden lääkkeiden ovat myös vastustuskykyisiä vanhenemista induktion [3 ], [4]. Vaikka toivottavaa hoidon aiheuttama vanhenemista vastauksena kliinisesti käytetty hoitoja on kysymys merkittävän keskustelun [41], sillä solutyyppejä, jotka kestävät hyvin muihin solukuoleman tai pysäyttävät, vanhenemisen merkkejä voi olla vaihtoehtoinen hoitotulokseen. Meidän havainto, että pieniä annoksia RITA (0,1-0,5) voisivat selektiivisesti herkistää kestävät hyvin HNSCC solujen hoidon in vitro [3], että lisäys RITA voi osoittautua kannattava strategia herkistävät kasvaimia säteilylle, yleisimmin käytetty hoito for HNSCC.

Kiitokset

Haluamme kiittää Mei Zhao hänen arvokasta teknistä tukea.