Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tässä edelläkävijä tutkimuksessa biologinen aktiivisuus organometalliyhdisteen Rauta (III) -salophene (Fe-SP) konkreettisia vaikutuksia Fe-SP elinkelpoisuuteen, morfologia, proliferaation ja solusyklin etenemisen platinaa kestävä munasarjasyövän solulinjoissa tutkittiin.

Menetelmät /Principal havainnot

Fe-SP näkyy selektiivinen sytotoksisuus SKOV-3 ja OVCAR-3 (munasarjan epiteelin adenokarsinooma) solulinjoissa pitoisuuksina 100 nM ja 1 uM, kun taas elinkelpoisuutta HeLa-solujen ( epiteelin kohdunkaulan adenokarsinooma) tai ensisijainen keuhkojen tai ihon fibroblastit ei vaikuttanut. SKOV-3-solujen vastakohtana fibroblastien käsittelyn jälkeen Fe-SP paljasti näennäinen apoptoosin tuntomerkkejä kuten voimakkaasti värjätty ydin- rakeista elimet hajanainen ytimet, erittäin kondensoidaan chromatin ja chromatin pirstoutumista. Fe-SP hoito johti aktivoinnin markkereita

ulkoisen

(kaspaasi-8) ja

luontainen

(kaspaasi-9) reitti apoptoosin sekä executioner kaspaasi-3, kun taas PARP -1 oli deaktivoitu. Fe-SP aiheutti vaikutuksia antiproliferatiivinen aine, IC

50 arvoon 300 nM ja aiheutti viivästynyttä etenemistä solujen kautta S-vaihe vaihe solusyklin tuloksena täydellinen S-vaiheen pysähtymisen. Kun vatsakalvonsisäisesti soveltaa rotille Fe-SP ei osoittanut mitään systeemistä toksisuutta pitoisuuksilla, jotka alustavissa kokeissa määritettiin olevan kemoterapeuttinen annoksilla rotan munasarjasyöpäsolu malli.

Päätelmä /merkitys

Tässä raportissa ehdotetaan, että Fe-SP on voimakas kasvu alentava aine

in vitro

varten johdetut solulinjat munasarjasyöpä ja mahdollinen terapeuttinen lääke käsitellä tällaisia ​​kasvaimia

in vivo

.

Citation: Lange TS, Kim KK, Singh RK, Strongin RM, McCourt CK, Brard L (2008) Rauta (III) -Salophene: organometalliyhdisteen kanssa Selective Sytotoksinen ja antiproliferatiivisia Properties in Platinum hylkivät munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 3 (5): e2303. doi: 10,1371 /journal.pone.0002303

Editor: Anja-Katrin Bielinsky, University of Minnesota, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 helmikuu 2008; Hyväksytty: 11 huhtikuu 2008; Julkaistu: toukokuu 28, 2008

Copyright: © 2008 Lange et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Brown University Seed Grant ja NICHD, K12 HD043447 BIRCWH Scholar Grant Dr. Brard.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Minerals ja metallit on käytetty erilaisten sairaanhoidon useita tuhansia vuosia. Muinaisessa Egyptissä ja Kreikassa, ayurvedic medicine, aasialainen lääketiede tai atsteekit metallit Alkeismuodossaan, kuten suoloja tai farmaseuttisesti aktiivisia yhdisteitä kasveista käytettiin lähinnä tulehdusta vaikutukset, jotka liittyvät sovelluksen [1], [2 ]. Metallit löysivät herätystä farmakologisen pyrkimyksissä renessanssin aikana [2], mutta usein myrkyllisiä sivuvaikutuksia johtuvat raskasmetallien käyttöä. Varhaisin raportti terapeuttiseen käyttöön metalli- tai sisältäviä yhdisteitä paitsi aikaisemmin haavainen olosuhteissa, mutta syövän ja leukemian juontavat kuudennentoista vuosisadan [3], [4]. Useat viimeaikaiset arviot ovat kuvanneet ominaisuudet monipuolinen metallin yhdisteitä ja niiden käyttöä ja /tai otaksuttu toimintatapa modernin syövän hoidossa prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa [4], [5], [6].

nykyinen hoidettaessa erilaisia ​​kasvaimia, mukaan lukien munasarjasyöpä, perustuu organometallisia platinayhdisteet. Yhdysvalloissa, epiteelin munasarjasyöpä (EOC) on johtava kuolinsyy peräisin gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia ja neljänneksi yleisin kuolinsyy johtuu syövästä naisten [7]. Arviolta kaksikymmentäkaksituhatta uutta tapausta ja arviolta viidentoista tuhat kuolemaa toissijainen munasarjasyöpään tapahtui vuonna 2007 [8]. Vaikka useimmat potilaat aluksi vastata sytoreduktiivisen kirurgian ja adjuvanttia paklitakselin ja platinapohjaisen kemoterapian, valtaosa kokee tauti uusiutuu. Vaikka uudelleen hoito platinaa perustuva lääke on mahdollista joillekin naisille vaste nykyisiin toisen linjan kemoterapia 15-30% nousun vuoksi vastustuskyvyn tällaisia ​​lääkkeitä vaaditaan uusien lääkkeiden kehittämiseen käsitellä tällaisia ​​kasvaimia [6] [9].

suunnitella uusia metalliin perustuvia lääkkeitä on usein haastaa fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, kuten riittämätön liukoisuus tai hydrolyyttisen epävakaus tehden ongelmallista kontrolloida niiden toimitusta, vakautta ja lopulta niiden erityiset vaikutukset

in vivo

. Yksi lähestymistapa ohjaamaan sytotoksisia vasteita uusi metalli-yhdisteet on sitoutua biologisesti olennainen siirtymämetalleja, kuten rauta (Fe), mangaani (Mn), sinkki (Zn), kupari (Cu), tai kobolttia (Co) eri hapetusasteissaan ja niiden reaktiivisia välituotteita [4], [5]. Nykyisen raportti kuvaa valikoivan sytotoksisia vaikutuksia uuden organometallisen kompleksin (Iron (III) -salophene, Fig. 1A) on platina-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja.

(A) synteesi salophene ligandin (SP; 1,2-fenyleenidiamiinin ja o-vanilliini) ja rauta (III) -salophene kompleksi (Fe-SP) (katso materiaalit ja menetelmät). (B) Rakenteelliset karakterisointi Fe-SP by röntgenkristallografia (katso taulukko 1)

Salophenes ovat luokka orgaanisia yhdisteitä, on määritelty kaksi Schiffin emäkset yhdistämällä kolme aromaattisia osia. Kaksi ulompaa aromaattiset osat tyypillisesti ominaisuus salisaldehydes ja Keski aromaattinen osa

o

fenyleeni-diamiini tai analoginen. Salophenes näyttää voimakas sidonta siirtymämetallin elementtejä ja jotka liittyvät läheisesti Sälens sisältävät Schiffin emäksiä, jotka on muodostettu alifaattisten diamiinien. Metallosalens putoavat useisiin ei-platina metalli yhdisteitä kuten tiosemikarbatsonia tai hydratsoni Farmakoforeja jossa on mahdollinen syövänvastainen toimintaan [4], [10]. Metallosalophenes ei ole tutkittu laajasti suhteen sovelluksia biologisten järjestelmien: aiemmin salophene-lantanidikompleksien kuvattiin selektiivisesti sitoutua neutraaleja sokereita ja lipidejä kuten lysofosfatidihappo, joka toimii merkki useiden patologisten tilojen kuten munasarjasyöpä [11] ja Mn -salophene (EUK178) sekä erilaiset Mn-Sälens näyttö cyto suojaavia ominaisuuksia fibroblastiviljelmät kautta vetyperoksidia puhdistusjärjestelmä [12]. Tähän liittyvä yhdiste (koboltti-3,4-diarylsalen) on osoitettu vähentävän elinkelpoisuutta eri syöpäsolulinjoissa on melko suurina pitoisuuksina (≥20 uM) ja ehdotettiin, että tila aktiivisuutta ei liity oksidatiivisen DNA-vaurioita [ ,,,0],13]. Perustuen tämän kertomuksen ja lisätutkimuksia valikoiva sytotoksisia vaikutuksia salophenes kompleksoituna siirtymämetallien, myönnettiin patentti. Tämä keksintö käsittää synteesin, biologiset arvioinnit, sovelluksia, ja farmaseuttisia koostumuksia, metalli-salophenes (MSP). Lisäksi keksintö käsittää käytön MSP, kuten lääkkeitä, joilla on terapeuttinen anti-neoplastisia, anti-angiogeeninen ja syövän toimintaa, sekä muut ominaisuudet, kuten vapaiden radikaalien puhdistusjärjestelmä. Lisäksi tämä keksintö tarjoaa menetelmiä, joita sovelletaan kemopreventatiivisesti kemiallisten syövän synnyn ja korjauksilla lääkeainemetaboliaan joihin epoksidien tai vapaita happiradikaaleja tai välituotteita.

tavoitteena tässä tutkimuksessa oli tutkia mahdollisuuksia Fe- SP biologisesti aktiivista lääkeainetta käytettäessä munasarjasyöpäsolu malli suhteen annosriippuvaisia ​​ja erityisiä vaikutuksia elinkelpoisuuden morfologia, leviämisen, ja solusyklin etenemisen. Lisäksi kuvataan selektiivisen sytotoksisuuden Fe-SP platina kestävät munasarjasyöpäsoluja teimme tutkimuksen systeemisen toksisuuden Fe-SP sovellettuna rotilla mallina järjestelmän. Tässä raportissa ehdotetaan, että tätä uutta organometalliyhdisteen näyttää ominaisuuksia mahdollisena terapeuttisena lääkkeenä ja vaihtoehto platina reagenssien hoidossa munasarjasyöpä.

Tulokset

Erityisiä sytotoksista vaikutusta Fe-SP ihmisen platina kestävät munasarjasyövän solulinjoissa

ensimmäinen lähestymistapa vaikutusten analysoimiseksi Rauta (III) -salophene (Fe-SP) on munasarjasyöpäsoluja teimme elinkelpoisuuden määritys käyttämällä SKOV-3 ja OVCAR- 3 (ihmisen platina kestävät munasarjan epiteelin adenokarsinooma) solulinjat verrattuna HeLa (epiteelin kohdunkaula adenokarsinooma) tai ensisijainen keuhkojen (LF) tai ihon fibroblasteja (BJ) (kohdat 10-13). Soluja käsiteltiin 24 tuntia erilaisilla pitoisuuksilla (0,1-3 pM), joko Fe-SP tai ei-kompleksoitu salophene (SP) ylimääräisenä ohjaus käsittelemättömiin soluihin. Hoidon SP ei vaikuttanut elinkelpoisuus tahansa näistä solulinjoista on välillä 100 nM 3 uM (kuvio 2) eikä pitoisuuksina yhtä suuri kuin 60 uM (julkaisematon data). Fe-SP, pitoisuuksina ≥3 uM, aiheutti erittäin sytotoksisia vaikutuksia kaikissa solulinjoissa. Huomattavaa on, vaste näiden solujen Fe-SP ei ollut ainoastaan ​​annoksesta riippuvainen, mutta Alle 3 pM pitoisuuksina solutyyppispesifisiä (Fig. 2). Vaikka Fe-SP pitoisuuksina 300 nM ja 1 uM osoittautunut erittäin sytotoksisia SKOV-3 ja OVCAR-3 soluja, hoito HeLa-solut tai ensisijainen fibroblastien 1 uM Fe-SP ei aiheuttanut muutoksia elinkelpoisuuden. Näin ollen, Fe-SP riippuen solulinjasta käsitelty, näyttää selektiivinen sytotoksisuus, ja annoksesta riippuvainen vaste tässä esitetty kaksi platina-resistenttejä munasarjasyövän solulinjoissa.

sytotoksisuus Fe-SP ihmisen munasarjasyöpä solut (SKOV-3, OVCAR-3) verrattiin vaikutus HeLa-solut tai ensisijainen fibroblastien kohtia 11- 13 (LF1, ihmisen keuhko, BJ, ihmisen esinahka). Soluja käsiteltiin yhteensä 24 h erilaisilla pitoisuuksilla (0,1-3 pM) ja Fe-SP tai ei-kompleksoitunut SP (Ctr). MTS elinkelpoisuuden määritys suoritettiin, kuten on kuvattu (materiaalit ja menetelmät). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena; Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona kolmesta määrityksestä (X ± SD) edustavan kokeen% solujen elinkelpoisuuden käsittelemättömien solujen [= 100%].

valikoiva morfologisia muutoksia ja apoptoosin induktio SKOV -3 munasarjasyöpäsoluja jälkeen Fe-SP hoito

analysoimiseksi morfologiset muutokset SKOV-3 munasarjasyövän parit ja fibroblastien (BJ), kun Fe-SP käsittely toteutimme valo- ja fluoresenssimikroskopiaan jälkeen kiinnittymistä solut ja värjäys ydinvoiman chromatin DAPI. Väestön käsittelemättömien SKOV-3 tai soluja käsiteltiin 2 uM ei-kompleksoidun SP 24 tuntia näkyy homogeeninen morfologia ytimet kevyesti ja tasaisesti värjätään DAPI (Fig. 3A) ja satunnaisia ​​esiintymisiä jakautuvien solujen mitoosin (kirkkaan sininen värjäys kromosomien rivissä pitkin metafaasivaiheen kilpi, ei esitetty tässä). Sitä vastoin käsittelyn jälkeen 2 uM Fe-SP enemmistö SKOV-3-soluja näytetään kutistuminen, erittäin kondensoidaan kromatiinin, ja usein voimakkaasti värjätty ydin- rakeista elimet ( ”apoptoottiset kappaleet”) sisällä hajanainen ytimet, (Fig. 3A). Ensisijainen fibroblasteja käsiteltiin Fe-SP tai SP samana pitoisuutena ei havaittu merkittäviä muutoksia morfologiassa eikä ilmeistä apoptoosin tuntomerkkejä osoittaa selektiivinen vaste munasarjasyövän solulinja tutkittu Fe-SP.

munasarjasyöpäsoluja (SKOV-3) tai ensisijainen fibroblasteissa (BJ) käsiteltiin 24 h Fe-SP tai ei-kompleksoitunut SP (Ctr.), jonka pitoisuus on 2 uM ennen mikroskooppitutkimusta faasikontrastimikro- (PC) tai fluoresenssi-analyysi sen jälkeen, kun chromatin värjäyksen (DAPI), kuten on kuvattu (materiaalit ja menetelmät). Kuvat saatu edustavasta kokeesta on esitetty. Bar = 10 um. (B) analyysi DNA hajanaisuus on TUNEL Assay. SKOV-3-soluja käsiteltiin Fe-SP (0, 0,7, 2 uM) 24 tuntia. TUNEL määritys suoritettiin yhteistyössä värjäys fluoreseiini-12-dUTP (merkitseminen DNA lovia apoptoottisia soluja) ja kromatiinin propidiumjodidilla (materiaalit ja menetelmät). Co-värjäys käsittelemättömän SKOV-3-soluissa ennen kiinnitystä ja läpäiseväksi toimi negatiivisena kontrollina (aseta yläpaneeli). Aikana fluoresenssimikroskopialla, edustavat kuvat on otettu, apoptoottiset tahra (vihreä) ja tumaväriä (punainen) päälle. TUNEL positiivinen ytimet johtuen DNA: n fragmentoituminen näkyvät keltaisina alueilla. Bar = 10 uM. (C) Western blot -analyysi kaspaasi aktivoinnin. SKOV-3-soluja käsiteltiin Fe-SP (0, 1,25 uM, 2,5 uM) 24 tuntia. PAGE ja Western blot-analyysi solulysaateista suoritettiin. Aktivoitu Caspase-3, -8, -9, ja inaktivoitu PARP-1 visualisoitiin immunoblottauksella käyttämällä primaaristen vasta-aineiden pelkästään tunnustaa katkaistun fragmentit, ei ole täyspitkä pro-muodossa, näiden proteiinien yhdessä kemiluminesenssidetektiojärjestelmää, kuten on kuvattu (Materiaalit ja menetelmät). Edustava koe on esitetty. Sisäiseksi standardiksi yhtäläistä lastaus (50 ug solun kokonaisproteiinista /kaista) blotit anti-β-Actin vasta-aine.

Yleinen menetelmä havaitsemiseksi DNA pirstoutuminen valossa solujen apoptoottisen tapahtumia on TUNEL määritys, joka käytimme käsittelyn jälkeen SKOV-3 Fe-SP. Määritys perustuu läsnä lovia DNA apoptoottisten ja joitakin nekroottisia soluja, jotka voidaan tunnistaa terminaalin transferaasin, jotka katalysoivat lisäämällä leimatun dUTP: tä (tässä: fluoreseiini). SKOV-3-soluja käsiteltiin joko 0,7 tai 2 uM Fe-SP 24 tuntia. Tunnistaa solutumien counterstaining propidiumjodidilla (Pi), joka interkalatoituu DNA: n, suoritettiin. TUNEL-positiivisia tumat tunnistettiin keltaisia ​​pisteitä johtuvat päällekkäin kuvan apoptoottinen tahra (FL-dUTP) ja tumaväriä (Pi). Kuten on esitetty (Fig. 3B) ei soluja ennen käsittelyä (yläpaneeli), 60% väestöstä käsiteltyjen solujen 0,7 uM (keskimmäinen paneeli) ja kaikki solut 2 uM Fe-SP (alapaneeli) olivat TUNEL-positiivisten solujen ilmaisee fragmentoitunutta DNA: ta.

määrittää soluvaste on SKOV-3-soluja, kun Fe-SP hoidon olemme analysoineet kaspaasien aktivaatio ominaisuus apoptoosin induktion sekä inaktivaatio PARP-1 immunoblottauksella. Hoito SKOV-3-solujen kanssa 2,5 uM Fe-SP 24 tuntia johti voimakkaaseen aktivointi /pilkkominen kaspaasi-9, -8, ja -3, kun taas PARP-1 oli inaktivoitu /lohkaistaan ​​jälkeen lääkehoitoa (Fig. 3C). Hoito 1,25 uM Fe-SP paljasti samanlaisen tuloksen, joidenkin kaspaasi-9, ja -3, ja inaktivoituminen PARP-1, kun taas kaspaasi-8 oli niin vahva kuin havaittiin 2,5 uM Fe-SP. Ilmeisesti puhkeamista kaspaasin aktivaatio ja PARP-1 inaktivaatiota in SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja Fe-SP johti morfologiset apoptoosin tuntomerkkejä havaittu (Fig. 3A).

Anti-proliferatiivinen vaikutus ja solusyklin pidätyksen jälkeen hoito SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja Fe-SP

Kuten edellisissä osissa Fe-SP on selektiivinen sytotoksinen lääke (Fig. 2), joka aktivoi apoptoottinen prosesseja (Fig. 3) in SKOV -3 munasarjasyöpä soluja. Tutkia, Fe-SP kykenee antiproliferatiivisia vaikutuksia ja häiriöitä solusyklin etenemisen teimme BrdU. Fe-SP hoitoa 24 h vähensi annosriippuvaisesti soluproliferaatiota (Fig. 4), jossa IC

50-arvo 300 nM. Sitä vastoin ei-kompleksoitu SP ei vähentänyt SKOV-3 proliferaatiota merkitsevästi edes pitoisuuksina, jotka ovat 3 uM. Sub-sytotoksinen lääke 100 nM: Fe-SP (katso elinkelpoisuus, kuvio 2) BrdU DNA: han väheni 40% (Fig. 4).

munasarjasyöpä soluja (SKOV-3) käsiteltiin eri pitoisuuksilla (0,1-10 uM) Fe-SP tai ei-kompleksoitu SP (Ctr.) 24 tuntia. Kolorimetrinen määritys (perustuen BrdU havaitaan BrdU-vasta-aine peroksidaasi-konjugaatti) suoritettiin, kuten on kuvattu (materiaalit ja menetelmät). Värin intensiteetti 450 nm korreloi suoraan määrän BrdU osaksi DNA, joka puolestaan ​​edustaa leviämisen. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena; Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona kolmesta määrityksestä (X ± SD)%: na absorbanssin kolmesta näytteestä käsittelemättömiä soluja [= 100%].

Lisäksi solulisäkasvumääritykselle, solu- syklin analyysi propidiumjodidilla värjättiin SKOV-3-soluja virtaussytometrialla tehtiin. Fe-SP, toisin kuin ei-kompleksoidun yhdiste, paljasti kasvu määrä osa-diploidal /2n-solujen (ala-G0 /G1, Fig. 5A), on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla (taulukko 1) . Mitä tulee pyöräily soluihin, Fe-SP aiheuttaa ajasta ja annoksesta riippuvaa pidätys SKOV-3 S-vaiheessa ja siten laskua soluja G0 /G1 vaihe: Käsittelemättömät solut tai SKOV-3 hoidettu non -complexed SP tässä ei-synkroninen väestö taas viljelty

in vitro

ovat ~71-75% vuonna G0 /G1 ja ~21-24% S-vaiheessa (Fig. 5B, taulukko 1). Hoidon Fe-SP on kasvavia konsentraatioita (0,4, 0,8, 1,6 uM), 24 tai 48 h aiheuttanut lisäystä solujen S-vaiheessa oli suurimmillaan 75% (1,6 uM /24 h) ja 87% (1,6 uM /48 h ) koko väestöstä (Fig. 5B, taulukko 1). Näin ollen solujen määrä G0 /G1 laskee 25%: iin (1,6 uM /24 h) ja 13% (1,6 uM /48 h) koko väestöstä, kun taas tämä Fe-SP pitoisuus ei enää soluja G2 /M voidaan havaita. Pitoisuutena 0,8 uM Fe-SP 24 h ja 48 h lisäystä solut G2 /M (23% /24 h, 16% /48 h) yli perustason (3% /24 h, 9% /48 h) voidaan havaita joka osoittaa viiveen tämän vaiheen yhdessä kehittää pidätys soluja S-vaiheessa.

munasarjasyöpäsoluja (SKOV-3) käsiteltiin 0, 0,4, 0,8 ja 1,6 uM Fe-SP tai SP (Ctr.) 24 tai 48 tuntia. Solusyklin analyysi FACS perustuu propidium–jodidi tunkeutumista solun kromatiinin suoritettiin, kuten on kuvattu (materiaalit ja menetelmät). Tiedot esitetään (A) suhteellinen fluoresenssin voimakkuus on 2-ulotteinen FACS profiilin (ModFit LT ohjelmistot; mustat viivat = tietojen linja ja malli sovi linja koko väestön; tummennetut alueet = malli osat /alaryhmien G0 /G1, S, G2 /M, apoptoottiset solut), esimerkissä 48 h hoito 0,8 uM yhdiste, tai (B) kattavat pylväsdiagrammi, kaikki tiedot. Standardoitu gating käytettiin kaikissa näytteissä. Kymmenentuhatta tapahtumia analysoitiin jokaisesta näytteestä.

sytotoksisuus Fe-SP rotilla mallina järjestelmän

Sen tutkimiseksi, jos Fe-SP aiheuttaa systeemistä toksisuutta

in vivo

päätimme rottia mallina järjestelmän. Alustavissa kemoterapeuttisen annokset Fe-SP eläimessä munasarjasyöpäsolujen malli määritettiin olevan ≤1 mg /kg kehon paino (Lange et ai., Valmisteilla). Näissä tutkimuksessa tutkimuksissa rotan munasarjasyöpäsoluja (Nuţu-19) olivat intraperitoneaalisesti (IP) injektoitiin rottiin ja 3 viikkoa sen jälkeen, kun kasvaimia (matkia tilanne seuraavat sytoreduktiivisen leikkauksen) eläimet käsiteltiin päivittäin Fe-SP kautta IP-injektiot . Hoidon kesto kesti 12 päivää ja perustui tuumoritaakka valvonnassa eläimillä. Eläimiä tarkkailtiin epämukavuutta ja kipua per IACUC protokollia. Kun taas kontrollieläimillä ilmeni johdonmukaisesti kohonnut määrä hemorraginen askites, Fe-SP (1 mg /ml) hoidetuista eläimistä näkyy huomattavasti vähemmän hemorraginen askites tilavuus, ja vähemmän omental tuumorin paino. Lisäksi tässä alustavassa hoitotukimuksessa havaitsimme täydellinen vaste 40%: lla hoidetuista eläimistä (10 käsitellyillä rotilla).

Näin ollen suoritimme 28 vuorokauden kroonisen myrkyllisyyden tutkimukset (OECD: n kemikaalien testaukseen (jakso-4, nro-407)) albinorotilla Fe-SP pitoisuuksina 0,25 mg /kg ja 4 mg /kg kehon paino. Tämä tutkimus suunniteltiin tutkimaan myrkyllisiä vaikutuksia toistuvan IP annon Fe-SP (DMSO: tislattua vettä suhteessa 1:04 5 päivää /viikossa 28 päivän ajan). Animals in pienen annoksen ryhmä (0,25 mg /painokilo), väli- annosryhmässä (1,0 mg /painokilo), ja suuren annoksen ryhmän (4,0 mg /painokilo) ei havaittu patologisia muutoksia verrattuna kontrolliin eläinryhmälle. Ei kuolleisuutta tai myrkytysoireita havaittiin testissä ja kontrolliryhmissä eläinten paitsi pörröiseksi suuren annoksen ryhmässä. Merkittäviä eroja ei havaittu painonnousun /tappio kuvio, elinten painossa, hematologiset tai biokemialliset parametrit (katso materiaalit ja menetelmät) kaikista testiryhmässä verrattuna kontrolliryhmään. Kaikki parametrit kuuluivat hyväksyttävät rajat normaalia vaihtelut albinorotilla. Mikroskooppinen tarkastelu histopatologisia diat matala-, keski-, ja suuren annoksen ryhmissä ei havaittu merkittäviä muutoksia lukuun ottamatta lievää rappeutumista maksasolujen kolmessa eläimillä (suurilla annoksilla) ja keuhkojen mononukleaaristen soluinfiltraat- kaksi eläimillä (korkea annos).

keskustelu

matala 5 vuoden eloonjäämisaste oli ainoastaan ​​53% nainen kärsii munasarjasyöpä liittyy resistenssin kehittymiseen kasvainsolujen standardin kemoterapia-aineiden, erityisesti platina-analogit ja siksi uudet syöpälääkkeet kehitettävä [6], [7], [8]. Toistaiseksi raportin päätimme tutkia mahdollisuuksia uusi organometallisen kompleksin, rauta (III) -salophene (Fe-SP) ehdokkaaksi aineena munasarjasyövän hoitoon. Selvyyden mainitaan, että termi salophene, yli sata vuotta sitten, on sovellettu 4-asetamidofenyyli salisylaatti, analgeettinen ja antipyreettinen lääke valmistettu vuodesta 1900-luvun alun Bayer Pharmaceutical Products (Leverkusen, Saksa) [14 ] ja ei liity ”Salophen” löysi kuin superoksidi raadonsyöjä E. coli kompleksoituna mangaani (III) [15], joka muistuttaa organometalliyhdisteen tutkittu tässä raportissa.

Tähän mennessä mitään tutkimusta konkreettisia vaikutuksia salophenes elinkelpoisuudesta syöpäsolujen on julkaistu. Aikaisemmassa tutkimuksessa sytotoksisia vaikutuksia bisyklinen aryyli- tiatsoliineja eri ihmisen syöpäsolulinjoissa, määritimme alue kolorimetrisen solun elinkyvyn käyttää käyttämällä rauta (III) -salophene (ei liity tiatsoliineja) 60 uM kuin negatiivinen kontrolli [16]. Myöhemmät vertailevia tutkimuksia vaikutuksesta siirtymämetallin salophenes (Zn (II) -, Mn (II) -, Cu (II) -, Co (III), Fe (III) -SP) ja ei-kompleksoitu salophene (SP) pienemmillä pitoisuuksilla paljasti, että alle 10 uM vain Fe (III) -SP näkyy merkittäviä sytotoksisia vaikutuksia erilaisissa syöpäsolulinjoissa (Lange et ai., valmisteilla). Testata selektiivisen sytotoksisen potentiaalin Fe-SP munasarjasyöpäsoluja, me valitsimme kaksi solulinjaa, jotka ovat monilääkeresistenttejä ohella ensisijaisesti keuhkojen tai ihon fibroblastien solu- linjat. OVCAR-3-solut (munasarjan epiteelin adenokarsinooma) ovat resistenttejä kliinisesti merkittäviä pitoisuuksia adriamysiini, melfalaanin ja sisplatiinin. Skov-3-solut (munasarjan adenokarsinooma) ovat resistenttejä useille sytotoksisten lääkkeiden kuten Sisplatiini ja adriamysiini (ks ATCC, Manassas, VA, www.atcc.org). Samanlainen nämä kaksi munasarjasyövän solulinjoissa, ohjaus soluja käytetään esillä olevassa raportissa, primaarifibroblastin varhaisessa kohtia ja HeLa-solut, joilla on hyvä aineenvaihdunta ja kasvu. Osoitamme tässä, että Fe-SP näytetään valikoiva ja annoksesta riippuvaa sytotoksisuutta SKOV-3 ja OVCAR-3 solujen pitoisuuksina 100 nM ja 1 uM, kun taas elinkelpoisuutta HeLa-solujen (epiteelin kohdunkaulan adenokarsinooma) tai ensisijaisen lung- tai iho- fibroblasteja (at kohdat 10-13) näissä pitoisuuksissa ei vaikuttanut. Suhteellinen vastus kolme ohjaus solulinjat Fe-SP kannatti ajatusta testata tätä yhdistettä

in vivo

munasarjasyövän eläimen syövän malli. Ei-kompleksoitu salophene ei vaikuttanut elinkelpoisuutta joko solulinjan jopa pitoisuuksina 60 uM eivätkä 60 uM Fe (III) yksinään [ferrikloridia lisätty] tai ferrikloridia yhdessä ei-kompleksoitu salophene lisätään soluviljelmään media [Lange et al., valmisteilla] välillisesti vahvistaa vakautta monimutkainen ja siten sytotoksiset mukaisia ​​toimia soluviljelmässä olosuhteissa.

koska nykytilan tutkimuksen alalla organometallisia yhdisteitä, kuten salophenes tai Sälens (liittyvä yhdiste, katso johdanto), voimme vain arvailla alkaen rajoitettuja mahdollisesta mekanismi (t) sytotoksisen toiminnan Fe-SP. Merkittävä piirre Sälens, ei ole vielä tutkittu salophenes, on niiden affiniteetti erilaisia ​​aromaattisia neutraalien molekyylien, kuten pyridiini, pyridiini-N-oksidi, isokinoliini ja bentsyyliamiini [17], [18]. Sälens kompleksoituna siirtymämetallien toimivat keinotekoinen nukleaasien. Niiden reaktiivisuus in-DNA pilkkominen määrityksiä voidaan ohjata konjugaation tai tyyppi ja vastaa Keski-ionin ydin [18], [19], [20]. Esimerkiksi, Ni (II) – tai Mn (II) -salens havaittiin indusoivat tehokkaasti DNA-juosteen katkeamisen mutta ei Cr (II) – tai Cu (II) – [18], [20], tai Fe (II) -salens ellei muita hydroksyyliryhmiä helpottaa niiden hapettumista Cu (III) tai Fe (III) lajit [21]. On väitetty, että Fe-Salen yhteistyössä kiniinin järjestelmä helpottaa muodostumista rauta (III)

.O

2

– laji tuottaa vapaa hydroksiradikaalien vastaa DNA pilkkominen [21]. Kuitenkin DNA: n pilkkominen aktiivisuus Fe (III) -salen on korkeampi kuin Fe (II) -salen viittaa siihen, että lisääntynyt vesiliukoisuus ja vastaa Fe (III) ioni dominoi pilkkominen potentiaalia rakenteen [22] joka todennäköisesti koskee rauta (III) -salophene, samoin. Lisäksi kirjoittajat liittyy DNA pilkkominen aktiivisuutta Fe (III) -salen

in vitro

havaintoon, että tämä yhdiste aiheutti ydin- pirstoutuminen ja apoptoosin induktion kautta (mitokondrion reitin /sytokromi c release) HEK293-soluissa pitoisuutena 50 uM [22].

Vaikka mekanismi (t) toiminnan Sälens tai Fe-SP soluviljelytutkimuksista ja

in vivo

vielä tutkittava, valikoiva morfologiset muutokset syöpäsolulinjois- ja apoptoosin induktion jälkeen lääkehoidon

in vitro

ovat ensimmäinen indikaattori mahdollisten valikoivia vaikutuksia tuumorimetastaasin ja solujen fysiologian

in vivo

. Tämä tutkimus osoittaa, että Fe-SP pitoisuuksissa 2 uM SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja mutta ei ensisijainen fibroblasteissa aiheutti ydin- pirstoutuminen, kromatiinin tiivistyminen, DNA: n fragmentoituminen ovat kaikki klassisia apoptoosin tuntomerkkejä [23]. Western blotting vahvisti aktivointi efektori kaspaasi-3 ja inaktivointi PARP-1 (osallistuu DNA: n korjaukseen) [24] suorittamisen aikana apoptoosin SKOV-3-soluissa Fe-SP hoitoon. Lisäksi kävi ilmi, että Fe-SP aiheuttama molemmat suuret signalointireitteihin (

sisäinen, ulkoinen

) kuvattu ohjelmoidun solukuoleman [25], [26]. Havaitsimme vahvan pilkkominen /aktivointi initiaattorin kaspaasin 8, tyypillinen osallistuminen

ulkoista

apoptoottista koulutusjakson [27], [28], kun Fe-SP hoitoon SKOV-3-soluissa.

luontainen

polku välittää apoptoottisia vastauksia painottaa signaalit kuten lääkkeiden, DNA-vaurioita tai kasvutekijän puutteesta ja aloitetaan mitokondriovaurioita. Se johtaa siihen, että mitokondrion vapautumisen sytokromi C, joka aktivoi initiaattoria kaspaasi-9 [28], [29], ja sen osoitettiin edistää solukuolemaa HEK293 (ihmisen munuaissolulinja), kun Fe (III) -salen käsittely [22] ja myös esillä olevassa tutkimuksessa SKOV-3-solujen upon Fe (III) -salophene hoitoa. Tähän mennessä ei ole muita tutkimuksia kuvataan morfologian tai apoptoottisen signalointi tahansa solulinjojen käsittelyn jälkeen yhdisteitä, jotka kuuluvat luokkaan rauta-Sälens tai -salophenes on julkaistu.

Vastaavasti, ei ole julkaisuja tarkastellaan muutos solun syklin etenemisen hoidon jälkeen joko Salen tai salophene metallocomplex olemassa. Vaikka yksi julkaisu havaittu muutosta elinkelpoisuuden ja morfologian ihon fibroblastien viljelmän käsittelyllä Cr (III) -salen kompleksin korkeat pitoisuudet 50 uM, seuraavat solusyklin tutkimukset suoritetaan vasta, jossa on etyleenidiamiini-Cr (III) – kloridi korkeamman sytotoksisuuden [30]. Osoitamme tässä, että Fe-SP vähensi annosriippuvaisesti leviämisen SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja (IC

50 300 nM). Jopa osa-solumyrkyllisyyspitoisuutta (100 nM Fe-SP) BrdU DNA: han pieneni osoittaa, että Fe-SP kohdistaa vaikutus kuin anti-proliferatiivinen ja siten mahdollinen syöpälääkkeen. Muita solusyklin analyysi SKOV-3 jälkeen Fe-SP hoito, kuten jo todettiin TUNEL määrityksessä, paljasti kasvuun Saharan diploidal populaatio, joka edustaa solujen merkittävää DNA-vaurioita, mikä osoittaa myöhäisessä apoptoottiset vaiheessa. Mitä tulee pyöräily soluihin, Fe-SP 1,6 uM aiheutti täyden pidätys SKOV-3 S-vaiheessa yhdessä lasku solujen G0 /G1 ja täydellinen menetys solujen G2 /M. Ilmeisesti, Fe-SP käsittely vaikuttaa solusyklin tarkastuspisteiden S-vaiheessa aiheuttaen annoksen ja ajasta riippuva väheneminen solusyklin etenemisen. Tähän mennessä tämä on ensimmäinen raportti sääntelyä sykli tahansa solulinjan käsittelemällä joko metallosalen tai metallosalophene yhdisteitä. Lisäksi vain vähän tietoja vaikutuksesta siirtymämetallikomplekseista yleensä solun syklin olemassa, kuten pidätys neuroblastoomasolulinjasta G1-vaiheessa hoidetuilla isatiiniyhdisteen-Schiffin emäksen kupari (II) kompleksi [31].

vaikka ei tämän raportin tavoitteena, lisätutkimuksia voisi analysoida vaikutuksia Fe-SP solusyklin tarkastuspisteiden synkronoitu SKOV-3 kulttuureissa ja muu syöpä ja ei-transformoitujen solulinjojen. Kohdistaminen tällaisia ​​tarkistuspisteitä on ehdotettu vaihtoehtona syöpälääkkeiden [32], [33]. Säätelijöinä solusyklin koneet ovat usein muuttaa ihmisen syövän ja ilmeisesti transformoidut solut voivat olla herkempiä sykliiniriippuvaiset kinaasit (CDK) inhibitio [34], [35]. Suhteessa S-vaiheen tapahtumien sekä hiiren malleja ja tutkimuksia syövän peräisin olevat solut paljasti, että kertyminen sykliini D1 /CDK4: n kompleksit laukaisee DNA uudelleen replikaatio [36], ja näin ollen voitaisiin kohdennettuja syöpäsoluissa. Yhtenä esimerkkinä guggulsterone, kasviperäinen lääke aiheutti solusyklin pysähtymisen S-faasissa tukahduttaminen sykliini D1 ja cdc2 ja lisääntynyt sykliiniriippuvaisen kinaasi-inhibiittorin p21 ja p27 ilmentymistä monenlaisia ​​ihmisen kasvainsolutyypit [ ,,,0],37]. Perustuen erityisiä pidätyksestä SKOV-3-soluista Fe-SP S-vaiheessa havaittiin tässä tutkimuksessa, tulevissa tutkimuksissa analysoi vaikutuksia tätä uutta organometalliyhdisteen ja mahdollisia syöpää hoitava erityisistä solun lukiertosäätelijöistä (CDK: n, sykliinien) ja replikointi-start ja -progression signaaleja S-vaiheessa [38], [39] platina-resistenttien munasarjasyöpäsoluja.

asettaa vaiheessa lisätutkimuksen Fe-SP mahdollisena