Krooninen sairaus

tiivistelmä

On huomattava tarve tunnistaa uusia eturauhassyövän lääkekohteita koska nykyiset hormonihoidoissa lopulta epäonnistua, johtaa lääkkeille vastustuskykyisten ja kuolemaan johtava sairaus kutsutaan kastraatio vastustuskykyisiä eturauhassyöpä. Toiminnallisesti tunnistaa geenejä, kun vaiennettu, vähentää eturauhassyövän solujen lisääntymisen tai aiheuttaa solukuoleman yhdistettynä antiandrogeenit, käytimme RNA häiriöitä perustuva lyhyt hiusneula-RNA viivakoodi ruudulla LNCaP ihmisen eturauhasen syöpäsolujen. Havaitsimme ja validoitu neljä kandidaattigeenit (

AKT1

,

PSMC1

,

STRADA

, ja

TTK

) heikentyneen kasvu kun vaiennettu vuonna androgeenireseptorin positiivinen syöpäsolujen ja parantanut antiproliferatiivisia vaikutuksia antiandrogeenit. Esto AKT joiden farmakologinen estäjän myös aiheuttaman apoptoosin yhdistettynä antiandrogeenit, viimeaikaiseen todisteita PI3K ja AR polku ylikuulumisen eturauhasen syöpäsoluja. Talteenotto hiusneulat kohdistaminen tunnetun eturauhassyöpä koulutusjakson vahvistaa hyödyllisyys shRNA kirjaston seulonnan eturauhassyövän laajan strategian tunnistaa uuden ehdokkaan lääkekohteita.

Citation: Dahlman KB, Parker JS, Shamu T, Hieronymus H, Chapinski C, Carver B, et ai. (2012) modulaattorit Eturauhassyöpä Cell Proliferation ja elinkelpoisuus Tunnistetaan Short-hiusneula-RNA-kirjasto Screening. PLoS ONE 7 (4): e34414. doi: 10,1371 /journal.pone.0034414

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 syyskuu 2011; Hyväksytty: 27 helmikuu 2012; Julkaistu: 11 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Dahlman ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat AACR-Amgen, Inc. Fellowship Kliinisen ja translaatiotutkimuksen (KBD); Eturauhassyöpä Foundation (www.pcf.org) (BSC); Howard Hughes Medical Institute (www.hhmi.org) (CLS); National Cancer Institute (www.cancer.gov) (CLS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: CLS on keksijä ja MDV3100 ja omistaa varastossa Medivation. KBD tukivat AACR-Amgen, Inc., kun tämä työ oli suoritetaan. JSP on työsuhteessa Expression Analysis. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Loput kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi yleisin kuolinsyy syöpään American men kanssa arviolta 217730 uutta tapausta ja yli 32000 kuolemantapaukset taudin vuonna 2010 [1]. Vaikka useimmat alkuvaiheen paikallinen tauti voidaan menestyksellisesti hoitaa sädehoitoa ja /tai leikkaus, miehiä, joilla esiintyy myöhäisvaiheen metastaattinen syöpä on eloonjäämismediaani 3-7 vuoden [2]. Lisäksi jopa 50%: lla potilaista, joilla oli paikallinen sairaus on paikallisen uusiutumisen eikä etäispesäkkeitä [2].

Nykyinen hoidot uusiutuvassa tai etäpesäkkeitä ovat kohdistaminen androgeenireseptorin (AR) signalointia käyttämällä antiandrogeenit , kuten bikalutamidi, ja lääkkeet, jotka estävät tuotannon androgeenien kiveksissä ja lisämunuaisten, kuten gonadotropiinia vapauttavan hormonin agonistit ja ketokonatsoli [3]. Vaikka nämä nykyiset hormonihoidoissa on aluksi vaikutuksia vähentää tuumorikuorma, monet miehet tulevat vastustuskykyisiksi näihin hoitomuotoihin ja kehittää kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC). Miesten CpRC on huono ennuste, ja ne muodostavat suurimman osan kuolemista taudista.

Miesten CpRC usein osoita nousua kasvaimen androgeenireseptoria (AR) tasot [4]. AR on 110 kDa: n ydin- hormonin reseptori, joka, vastauksena androgeenien, aktivoi kohdegeenien transkription osallistuvat solujen proliferaatiota, erilaistumista, ja selviytymistä. Vuonna eturauhasen luminaaliselle epiteelin, AR säätelee erilaistumista ja lisääntymistä, ja AR eturauhassyöpäsoluissa edistää solusyklin etenemisen [5]. Edellinen työ laboratoriossamme osoittavat, että tämä lisääntynyt AR tasolla on tarpeen ja riittävä etenemisen eturauhasen syövän CRPC ja sen toiminta on olennaisen tärkeää tukea kasvaimen kasvua [6]. Lisäksi CRPC,

AR

ilmentyy lähes kaikissa eturauhasen kasvaimia ja tarvitaan kasvaimen huolto [4], [7], [8]. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että AR signalointi on ratkaiseva rooli hormoni-herkkä ja CRPC ja on edelleen tärkeä tavoite eturauhassyövän terapeuttisten.

tunnistaminen uusia lähestymistapoja eturauhassyövän hoitoon on alue voimakkaan terapeuttisen kehityksen . Äskettäin abirateronin asetaatti hyväksyttiin perustuu merkittävää eloonjäämishyötyä potilailla, joilla CRPC, ja romaani antiandrogeenit, MDV3100 ja ARN-509, on otettu käyttöön lupaavin tuloksin; mutta useimmat kasvaimet hankittu resistenssi näille terapeuttisia [9] – [13]. Tähän mennessä joukossa kemoterapia-aineiden vain taksaanit doketakselin ja kabatsitakseli on osoitettu parantavan yleistä eloonjäämistä potilailla, joilla CRPC [14] – [16]. Seurauksena puute aineita, jotka ylläpitävät eturauhassyövän regressio, uusi eturauhassyöpä hoitotavoitteet aihetta jatkotutkimuksiin.

paljastamaan mahdollisia eturauhassyöpä terapeuttisia kohteita, teimme puolueeton multiplex shRNA näytön, joka tunnistaa modulaattorit eturauhassyövän solujen elinkelpoisuuden läsnä ollessa bikalutamidi. Neljä geenejä validoitu monistamiseen antiproliferatiivisia vaikutuksia antiandrogeenit Eturauhassyöpätutkimuksessa solulinja kun vaiennetaan. Nämä tiedot tarjoavat yleistä strategiaa tunnistaa eturauhassyövän lääkekohteita.

Tulokset

shRNA multiplex seulomaan modulaattorit bikalutamidin herkkyyden

Jotta voitaisiin tunnistaa geenejä, jotka, kun vaiennettu , vähentää solujen elävyys yksin tai yhdessä antiandrogeeni, bikalutamidi, käytimme multiplex RNA-interferenssi-pohjainen shRNA näytön avulla aiemmin validoitu kirjaston (kuvio 1A). Tämä tekniikka käyttää yksilöllisesti viivakoodilla shRNAs, ilmennetään retrovirusvektoria, jonka runsaasti sen jälkeen, kun solun manipulointi voidaan tunnistaa microarray [17]. Kirjasto koostui ~6,000 shRNAs kohdistaminen kinaasien osallistuvat geenit solukierron säätelyssä, ja muut geenit, joiden tiedetään olevan osallisena syövän [17]. Analyysi ilmentymisen tietojen 147 eturauhaskasvainnäytteissä [18] osoittivat, että 97%: n geenien kohteena shRNAs kirjastossa havaitaan vähintään 50%: n kasvaimia. Hyödynsimme androgeenireseptorin (AR) -positiivinen LNCaP solulinja ruudulla, koska ne niiden kasvu pysähtyy, kun hoidettiin AR-antagonisti bikalutamidi, kasvaa suhteellisen nopeasti, ja ovat helposti tartunnan retrovirus (kuva S1). AR-negatiivinen PC3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen toimi negatiivisena kontrollina ja antiandrogeenin herkkyys (kuvio S1). Korrelaatio biologisen rinnakkaisten kokeiden kussakin solulinjassa oli korkea eikä muutu myöhempinä ajankohtina tai bikalutamidi hoitoon (taulukko S1).

(A) Kaaviokuva shRNA näytön. Tiedot löytyvät Materiaalit ja menetelmät osassa. (B) heatmap synnytettiin ryhmittely perustuu antureista, jotka loppuivat tai rikastettu (log2 bikalutamidia /ajoneuvo ≤ +/- 0,58 ja p-value≤0.01) on bikalutamidi (0,4 uM ja 1,0 uM) hoidetun LNCaP-solujen T = 1 ja T = 2 verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen solujen samalla ajankohtina. ShRNA kohdegeenin liittyvät kukin koetin on ilmoittanut oikealle lämpökartta. Kohdegeenien jotka näyttävät enemmän kuin kerran sen heatmap osoittavat, että useampi kuin yksi anturi pisteytettiin että geeni.

Microarray analyysit paljastivat, että 23 antureista, jotka liittyvät 15 geenejä, jotka ainutlaatuisesti köyhdytetty bikalutamidi saaneilla LNCaP-solut, verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen solujen (log2 bikalutamidia /ajoneuvon ≤-0,58, p≤0.01) (kuvio 1 B, taulukko 1 ja kuvio S2). Mitään eroja köyhdytettyä koettimet havaittiin kaikilla korkea ja matala bikalutamidin annosten tai aikaisin ja myöhään ajankohtina (päivä 8 tai päivä 21); Siksi tiedot yhdistettiin analyysejä varten. Niistä 15 geenit tunnistettu 11 oli kinaasit (

TTK

,

MAST3

,

CIT

,

PRKACG

,

IGF1 R

,

TSSK2

,

VEGFβ

,

MAPKAPK5

,

ABL2

,

PLK2

, ja

AKT1

) tiedossa on toimintoja solukierron säätelyssä tai solujen elinkykyä (taulukko 1). Tämä tiheä talteen kinaasin osumia voi olla merkitystä biologiaan eturauhassyövän soluissa, mutta myös heijastaa todennäköisesti harhaa valinnassa geenit shRNA kirjastoon. Loput 4 geeni osumia on erilainen toiminnot: kalmoduliini sitova (

STRN3

), GTPaasi aktivointi (

RABGAP1

), kinaasi adapterit (

STRADA

), tai mukana proteasomin (

PSMC1

). Vastaava näyttö suoritettiin myös androgeenisäädellyn riippumaton solulinja, PC3, ja erityisesti, yksikään koettimista köyhdytetyn LNCaP-solut köyhdytetty PC3-soluissa läsnä bikalutamidin käyttäen samaa cut-off, joka tarjoaa todisteita erityisyyttä antiandrogeeni herkät solut (taulukko S2).

validointi kandidaattigeenejä

jatkamaan näiden 15 kandidaattigeenit käytimme itsenäinen taintumisen tekniikka (siRNA transfektio käyttäen siRNA kohdennussekvenssiä eroavat käytetään shRNA näyttö) toisessa AR riippuvainen solulinja (Vcap), jonka on osoitettu olevan vastustuskykyisiä bikalutamidia, mutta herkkä toisen sukupolven antiandrogeeni MDV3100 [19]. Hiljentäminen geenien vahvistettiin qRT-PCR: llä (kuvio 2B). Positiivisena kontrollina, Vcap solut transfektoitiin AR siRNA: t ja, kuten odotettua, hiljentämisen AR vähentää solujen elinkelpoisuuden (kuvio 2A). Hiljentäminen

AKT1

,

STRADA

,

PSMC1

, ja

TTK

tehosti kasvua estävä vaikutus MDV3100 vuonna VCAP soluissa (kuvio 2A, vasen paneeli ), sopusoinnussa havaitut vaikutukset bikalutamidin alkuperäisessä näytön LNCaP. Mielenkiintoista, hiljentäminen

AKT1

ja

PSMC1

vuonna VCAP soluissa laski myös solujen elinkelpoisuuden puuttuessa antiandrogen (kuvio 2A, vasen paneeli).

Candidate kohde- geenejä LNCaP näytössä antureista, jotka köyhdytetty läsnä bikalutamidin valikoivasti kohdennettua käyttämällä siRNA. (A, vasen paneeli), Vcap solut transfektoitiin siRNA: illa, jotka maalin LNCaP huumeiden näyttö ja inkuboitiin 1 uM MDV3100 tai ajoneuvon, ja elävien solujen lukumäärä mitattiin 6 päivää käsittelyn jälkeen. (A, oikea paneeli), VCAP solut transfektoitiin ja käsiteltiin kuten (A, vasen paneeli), paitsi kaspaasi 3/7 aktiivisuus mitattiin 3 päivän kuluttua hoidon.

PLK1

siRNA transfektio käytettiin positiivisena kontrollina. Katkoviivat osoittavat tason kasvun estoa tai indusoiman apoptoosin MDV3100, vertailun. NT, ei-kohdistaminen siRNA. (B) geenien (10-50%) vahvistettiin RT-qPCR 6 päivää transfektion of VCAP solujen kanssa siRNA SMARTpools. Reaktiot tehtiin kolminkertaisina, ja normalisoidaan RPL27 kunkin cDNA: n ja normalisoidaan sitten vehikkelillä NT. Standard keskivirhe laskettiin. Bic, bikalutamidia.

Sitten tutkittiin, mikä vaikutus hiljentäminen

AKT1

,

STRADA

,

PSMC1

, ja

TTK

apoptoosiin, käyttäen

PLK1

siRNA positiivisena kontrollina. Hiljentäminen

AR

,

AKT

, ja

STRADA

yhdistettynä MDV3100 indusoi VCAP apoptoosin yli ohjaus siRNA (NT) käsiteltiin MDV3100 (kuvio 2A, oikea paneeli ). Lukuun ottamatta AR, yksikään siRNA: iden testattu aiheuttaman apoptoosin ilman MDV3100 (kuvio 2A, oikeanpuoleinen paneeli). Vaikka hiljentäminen on

ttk

yhdessä MDV3100 apoptoosia ei yli NT solujen MDV3100, yhdistelmää ei vähentää elävien solujen yli MDV3100 yksin NT-soluissa (kuvio 2A, vasen paneeli). Yhdessä

AKT

,

STRADA

, ja

TTK

siRNA: t synergoida MDV3100 vähentää VCAP solujen elinkykyä. Kun taas

AKT1

ja

STRADA

hiljentäminen vähentää solujen elinkelpoisuuden, ainakin osittain, mikä johtui apoptoosin yhdistettynä MDV3100,

TTK

tuntuu toimivan vaihtoehtoisesta kasvua estävä mekanismi . Vaikka

PSMC1

ei pisteet siinä PC3 soluissa alkuperäisessä shRNA kirjaston näyttö, siRNA knockdovvn

PSMC1

heikentynyt kannattavuus PC3-solujen, nostamalla mahdollisuus, että nämä antiproliferatiivisia vaikutuksia ei voi olla spesifinen AR-positiivisia eturauhassyöpäsoluja (kuvio S3). Tästä syystä emme Jatketaan luonnehdinta

PSMC1

.

yli-ilmentyminen

TTK

liittyy lisääntynyt todennäköisyys biokemiallisten uusiutuminen

Tutkitaan onko

AKT1

,

STRADA

, ja

TTK

muuttuvat ihmisen eturauhassyövän, arvioimme kopiomäärä ja ilmentymistilanne näiden geenien aikaisemmin raportoitu ihmisen eturauhasen syöpä aineisto [18]. Niistä 218 eturauhasen kasvaimia, 34,4% oli vähentänyt ilmaus

STRADA

, 18,3% näytteillä yli-ilmentyminen

TTK

, 11,7% joko yli-ilmentynyt tai oli vähentänyt ilmaus

AKT1

, ja 15,6% kasvaimista yli-ilmentynyt tai oli monistettu

AR

(taulukko 2). Yliekspressio määriteltiin z-score≥2 ja vähentää ilmentymistä määriteltiin z-pisteet 2, verrattuna ilmentymisen normaalissa eturauhasessa. Toisin kuin

AR

,

STRADA

,

TTK

, ja

AKT1

osoitti vähän näyttöä geenimonistuman tai menetystä ihmisen eturauhasen kasvaimia. Suuri määrä eturauhasen kasvainten muutokset

STRADA

,

TTK

, ja

AKT1

ilmaus johti meidät katsomaan niiden vastaavuus biokemiallisten uusiutuminen. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen

ttk

osoitti merkittävää yhteyttä biokemiallisia toistumisen (p = 0,003) (kuvio 3). TTK ilme ei merkittävästi korreloi seuraavista kliinisistä ominaisuuksista: kirurginen marginaali, imusolmuke tila, rakkularauhanen, Gleason pisteet, hoito eturauhasen antigeenin (PSA), keskimääräinen PSA, tai ekstrakapsulaarinen laajennus (taulukko S3).

Kaplan Meier käyrä riskiä biokemiallisten uusiutumisen potilailla (n = 131), jossa TTK yliekspressoivat eturauhasen kasvain (n = 20; vihreä viiva) verrattuna niihin, ilman TTK yliekspressoivat (n = 111; sininen viiva) kasvaimet (p = 0,003, log rank-testi).

esto AKT yhteistyötä bikalutamidin aiheuttavan LNCaP-solujen apoptoosin

tutkimiseksi edelleen mahdollista roolia näiden geenien terapeuttisina kohteina eturauhassyövässä, käännyimme farmakologisten estäjiä. Olemme arvioineet elinkykyisten LNCaP-soluja käyttäen AKT1 /2-inhibiittorin läsnä ollessa ja puuttuessa bikalutamidia. Hoidon bikalutamidin tai AKT-estäjällä vähensi elinkykyisten solujen 10% ja 45%, vastaavasti (kuvio 4A). Sen sijaan, yhdistämällä yhdisteet vähentää solujen lisääntymistä 100% ja indusoi apoptoosin, kuten on esitetty lisääntyminen PARP pilkkominen (kuvio 4B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että AKT voi olla terapeuttinen kohde eturauhassyövässä yhdistettynä antiandrogeeni hoidon sopusoinnussa viimeaikaiset todisteet käyttäen PI3K-estäjien [20].

(A) määrä elinkelpoisia LNCaP käsiteltiin 5 päivän aikana ajoneuvon bikalutamidin (1 uM), Akt1 /2-inhibiittorin (1 uM), tai yhdistelmä bikalutamidia ja AKT-estäjällä. (B) Apoptoosi mitattiin LNCaP-soluissa immunoblottauksella käyttäen PARP-vasta-LNCaP-soluissa, joita käsiteltiin kuten kohdassa (A). Esto fosforyloidun Akt (Pakt (Ser473)) ja fosforyloitu S6 (PS6) mitattiin myös. Aktiini käytettiin latauskontrollina.

Keskustelu

Nykyinen hoitomuotoja eturauhasen syöpä ovat antiandrogeenit kuten bikalutamidia ja MDV3100. Vaikka lähes kaikilla potilailla on alustava vastauksia näitä lääkkeitä, monet kasvaimet tulevat vastustuskykyisiksi näiden hoitojen, johtaen CRPC. Johtuen tärkeää roolia, AR pelaa ensisijainen eturauhassyövän ja CRPC, AR edelleen merkityksellinen terapeuttinen kohde. Tunnistaminen uusia lähestymistapoja eturauhassyövän hoitoon, kuten uusien yhdistelmäterapioihin kanssa antiandrogeenit, on alue terapeuttisen kehittämisen. Siksi toteutimme puolueeton multiplex shRNA seulomaan modulaattorit eturauhasen syöpäsolun elinkelpoisuuden. Tavoitteena oli löytää geenejä, jotka saattavat käyttää hyväksi uusia täsmähoitoihin.

Valitse shRNA näytössä ja

in vitro

siRNA validointi kokeita riippumattoman solulinjassa tunnistimme ja validoitu

AKT1

,

STRADA

, ja

ttk

ehdokkaaksi geenit, jotka synergisesti antiandrogeenit (kuva 1 ja kuva 2). Vaikka

AKT1

,

STRADA

, ja

TTK

teki estäjinä LNCaP soluproliferaation yhteydessä bikalutamidin, validointi siRNA samassa solulinjassa paljasti, että he voivat vähentää solujen elinkelpoisuus puuttuessa bikalutamidin (kuva S4A). Tämä vaikutus oli spesifinen LNCaP ja ei havaittu AR-negatiivinen PC3-soluissa. Yksi selitys tälle ero fenotyypin on vahvuus shRNA Knockdown näytössä verrattuna siRNA validoinnissa kokeissa koska siRNA yleensä saavuttaa suurempaa Knockdown kuin shRNAs klo MOI≤0.5. Todellakin, siRNA: t tekivät osoittavat korkeaa geenien validoinnissa kokeissa (kuvio S4b).

On kiinnostavaa ymmärtää mekanismia, jolla esto

AKT1

,

STRADA

tai

TTK

parantaa antiandrogeeni toimintaa. Yksi mahdollisuus on kautta säännellä AR-riippuvaisen transkription mutta emme onnistuneet tarkkailla lasku mRNA tasoilla

AR

tai AR-kohdegeenien (

TMPRSS2

,

FKBP5

,

NKX3.1

, tai

KLK3

), kun nämä geenit vaiennettu LNCaP-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Toinen mahdollisuus on häiriöitä signalointireitin ylikuulumisen, mistä on osoituksena viimeaikainen todiste vastavuoroinen negatiivista palautetta kuin selityksen synergiaa havaittiin yhdistetyn PI3K /AR-reitin estäminen [20].

TTK, joka tunnetaan myös monopolar kara 1 (Mps1), on seriini /treoniini ja tyrosiinikinaasi, joka on ollut mukana ylläpitoon karan kokoonpano tarkistuspisteen ja tarvitaan riittävään kromosomi eriytymistä mitoosin aikana [21], [22]. TTK on erityisen kiinnostava, koska muut ovat ilmoittaneet, että määrän vähentäminen

TTK

säteilyherkälle ihmisen syöpäsolujen subletaalisia annokset taksolin, kun taas ei aiheuttanut kasvaimia soluja ei voitu herkistyä taksoli [23]. Tässä näemme, että hiljentäminen

TTK

johti herkistymiseen VCAP solujen voimakas antiandrogeeni. Se, että 18% ihmisen eturauhasen kasvaimia yli-ilmentää TTK ja että nämä kasvaimet ovat eri kliininen tulos viittaa siihen, että TTK-inhibiittorit yhdessä antiandrogens saattavat kiinnostaa.

STE20 liittyvä kinaasi sovitin alfa- tai STRADA, on pseudokinase, joka raportoidaan tarvitaan asianmukaisen toiminnan tuumorisuppressorin, maksan kinaasi B1 (LKB1) [24].

STRADA

tarvitaan toiminto LKB1 kasvain vaimennin; Näin ollen, hiljentämisen

STRADA

voidaan odottaa edistää tuumorigeneesiä. Meidän havainto, että

STRADA

esillä pienentää ilmentymisen suuri prosenttia ihmisen eturauhasen syöpien on yhdenmukainen kasvaimia estävä rooli (taulukko 2). On kuitenkin mahdollista, että STRADA on toimintoja riippumaton LKB1 /AMPK signalointi, jotka edistävät kasvua inhibitio tiettyjen solujen yhteyksissä. Mahdollinen rooli STRADA eturauhasen syövän etenemisessä ja mahdollisuus LKB1 /AMPK-riippumaton toiminnot takaa enemmän huomiota.

Akt1 on seriini-treoniini-kinaasi, joka välittää signaaleja fosfatidyyli-3 ’kinaasi (PI3K), sen fosforylaatio loppupään tavoitteet ja vapautuminen tämän reitin tiedetään edistää eturauhassyövän etenemiseen [25], [26]. On hyvin tunnettua, että PI3K /Akt-reitillä on tärkeä rooli eturauhassyövän solujen elinkelpoisuus ja kasvaimen kehittymisen, ja se on parhaillaan tutkitaan terapeuttisena kohteena [27], [28]. Edellinen raportit ovat osoittaneet, että AKT /PI3K-reitin säätelee LNCaP solujen kasvua ja ilmentymistä konstitutiivisesti aktiivisen AKT voi estää bikalutamidi aiheuttama kasvun esto [27], [29], [30]. Lisäksi Akt1 on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa AR [31]. Lakkaa toimimasta fosfataasin ja tensin homologi (PTEN), negatiivinen säätelijä PI3K /AKT-reitin, esiintyy vähintään 50% kehittyneiden ihmisen eturauhassyövän [32] – [34]. Tämä menetys PTEN toiminta johtaa lisääntyneeseen ilmentyminen fosforyloidun Akt ja myöhemmän aktivoinnin myötävirtaan kohde-solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä [35], [36]. Esto AKT: ä käyttäen siRNA: iden tai farmakologisen estäjän aiheuttaman apoptoosin yhdistelmänä Bikalutamidin tai MDV3100 AR-riippuvaisten syöpäsolujen (kuvio 2A, oikeanpuoleinen paneeli ja kuva 4). Tämän seurauksena on raportoitu roolit Akt1 eturauhassyövän tuumorigeneesiin, PI3K /AKT-reitin on tutkittu tarkasti terapeuttisena kohteena [25]. Meidän tiedot tukevat käyttöä Akt estäjien yhdistettynä antiandrogens eturauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja antiandrogens

Ihmisen eturauhasen sinoomasolulinjoja (LNCaP, PC3, ja VCAP) ja ihmisalkion munuaissolut (293T) hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja niitä pidettiin alle 20 kohtia laboratoriossa. Soluja viljeltiin mukaisesti ATCC ohjeita. Ei poikkeavuuksia havaittu kasvua tai morfologiaan mistään solulinjan tukea niiden kasvuolosuhteissa. Bicalutamide ostettiin AstraZeneca Pharmaceuticals LP (Wilmington, DE) ja MDV3100 syntetisoitiin Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, jonka Organic Synthesis Core Facility [19].

valmistaminen lyhyen hiusneula-RNA kirjasto DNA ja virus

plasmidi kirjasto (pLMP) ilmentävät ~6,000 lyhyen hiusneula-RNA: iden (shRNAs) kohdistaminen kinaasien osallistuvat geenit solukierron säätelyssä, ja muut geenit, joiden tiedetään olevan osallisena syövän käytettiin nykyisen näytön [17]. Yhdistetyt plasmidi-kirjasto monistettiin TOP10 elektrokompe- soluissa (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja plasmidi-DNA eristettiin vähintään 1000 transformanttia per hiusneula. Virus valmistettiin 293FT soluissa kotransfektoimalla pUMVC3-Gag-Pol-ekspressiovektoriin (Addgene, Cambridge, MA), VSVG pantrofiinisen kirjekuori (Addgene), ja shRNA kirjaston DNA eristettiin yllä.

shRNA häiriöruutu

shRNA häiriöruutu on esitetty kuviossa 1A. LNCaP ja PC3-solut infektoitiin 6K shRNA yhdistettiin kirjaston virus (MOI≤0.5) kolmena kappaleena tuottaa yhteensä 6000000 tartunnan solua rinnakkaisnäytettä per solulinja. Infektion kohdesolujen MOI≤0.5 varmistettiin fluoresenssimikroskopialla ja fluoresenssiaktivoidulla solujen lajittelu (FACS) 48 h infektion jälkeen. LNCaP ja PC3-solut valitaan 3 ug /ml puromysiiniä, ja solut laskettiin ja maljattiin elatusaineeseen, joka sisälsi 0,4 uM bikalutamidia, 1,0 uM bikalutamidi, tai vehikkeliä (DMSO). Solut siirrostettiin, ja bikalutamidin ja ajoneuvojen uusiutua, 4 päivän välein ilman että yhtymäkohta. LNCaP ja PC3-solut kustakin rinnakkaisnäytettä kerättiin ja solusakat flash jäädytettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa useita ajankohtina aikana näytön. Solut kerättiin 48 h infektion jälkeen (T = 0), ja sen jälkeen 8 päivää (T = 1) ja 21 päivää (T = 2) altistuksen ajoneuvon tai bikalutamidia.

Microarray

genomi-DNA uutettiin soluista käyttäen vakio-olosuhteissa. Viivakoodit ja puoli-pinnit kokoelmasta plasmidi-DNA (alun perin käytetään tekemään virus) ja LNCaP ja PC3 solun genomi-DNA eristettiin yllä, monistettiin PCR: llä käyttäen seuraavia alukkeita: 5′-TAGTGAAGCCACAGATGTA-3 ’ja 5′-AAAGCGCATGCTCCAGACTGCC-3’ . PCR-tuotteet olivat kohteena geelielektroforeesi ja tuloksena 350 bp: n vyöhykkeet puhdistettiin geelillä käyttämällä QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA) .Purified DNA-fragmentit (1,5 ug) peräisin LNCaP tai PC3-solut leimattiin ja mikrosirujen hybridisaatio oli suoritetaan käyttämällä mukautettuja Agilent siruja, kuten aikaisemmin on kuvattu [17].

Microarray data-analyysi

Affymetrix eksonin joukko tietoja 147 kasvainnäytteet [18], käytettiin ilmentymistasojen määrittämiseksi shRNA kohdegeenien edustettuina kirjastossa näytössä. Koettimien tausta tarkistetaan normalisoitu voimakkuus on yli 50 pidettiin havaittu.

Agilent piirteenpoimijan ohjelmaa käytettiin skannata microarray kuvia. Piirteenpoimija normalisoitu Cy3 intensiteetin kullekin array koottiin ja kaikki jatkokäsittely suoritettiin käyttäen tilastollista ohjelmistopaketti R 2.8.1. Laatu arvioitiin koko käyttäen Pääkomponenttianalyysin ja muodollisesti vertaamalla kvartiiliväli poikki taulukot. Näytteet, joiden log2 muuttaneet kvartiiliväli alle 6 katsottiin harha eikä tarkastella tarkempaa analyysiä. Kun kaksoisnäytteillä (tekninen toistoa) pysyvät, viimeisin toisinto kutakin käytettiin. Loput näytteet joutuivat quantile normalisoitumista. Koettimet vastaavat pinnit ole läsnä kirjastossa käytettiin negatiivisina kontrolleina. 95. prosenttipiste signaali intensiteetti negatiivisia kontrolleja käytettiin tausta toimenpide ja arvioitiin esivalinta (T = 0) näytteitä. Koettimet poistettiin lisäanalyysiä, kun ne eivät ylitä otokseen erityinen tausta arvio enemmistö esivalinnan näytteitä. Tilastollinen testaus suoritettiin tunnistamiseksi pinnit joiden runsaus vaihteli eri aikoina hoitamattomien näytteissä. Aika kurssi analyysi toteutetaan louhinta ero geenien ilmentyminen (EDGE) ohjelmistoa käytettiin tässä analyysissä [37]. Tunnistaa hiusneulat jossa runsaus liittyi läsnäolo bikalutamidi lineaarisen malleja microarray kirjasto R 2.8.1 käytettiin [38]. Erityisesti lineaarinen malli rakennettiin termejä hoitoon, ajankohtana, ja jäljitellä. Tämä malli sopii kuhunkin koettimeen, ja kertamuutoksia ja p-arvot, jotka vastaavat käsittelyn vaikutus käytettiin tunnistamaan koettimien kohteisiin. Kaksi bikalutamidi annosta (0,4 uM ja 1,0 uM) ja kaksi ajankohtina kerätään post-valinta (T = 1 ja T = 2) yhdistettiin analyysiä varten lisäämiseksi tilastollinen voima. Merkittävät erot bikalutamidia annosten ja ajankohtina ei havaittu. Ehdokkaat, joilla oli runsaasti muutos, joka liittyi läsnäolo bikalutamidin valittiin joka johti log2 bikalutamidia /ajoneuvo ≤-0,58 ja p-value≤0.01. Visualisointi ehdokkaiden suoritettiin hierarkkinen klusterointi ja lämpökarttoja. Kaikki microarray data on MIAME yhteensopiva. Kaikki raaka data on talletettu GEO (series ID GSE32261).

Solun elinkelpoisuus ja apoptoosin määrityksiä

ON-TARGETplus kuin kohdistaminen (NT) siRNA ja siRNA SMARTpools kohdistaminen

ABL2

,

AKT1

,

AR

,

CIT

,

IGF1 R

,

MAPKAPK5

,

MAST3

PLK2

,

PRKACG

,

PSMC1

,

RABGAP1

,

STRADα (STRADA) B,

STRN3

,

TSSK2

,

TTK

, ja

VEGFβ

ostettiin Thermo Fisher Scientific (Lafayette, CO). siRNA kohdistaminen

PLK1

käytettiin positiivisena kontrollina apoptoosin ja saatiin MSKCC suuren tuotantotehon huumeseulonta Facility. Log vaihe LNCaP, PC3, ja VCAP solut transfektoitiin 100 nM siRNA avulla DharmaFECT (Thermo Fisher Scientific). Solujen elinkelpoisuus määritettiin 3 ja 6 päivän kuluttua inkubaation bikalutamidin (1 uM), MDV3100 (1 uM), tai ajoneuvo käyttäen Cell Titer-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega). Apoptoosi määritettiin käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 määritystä (Promega) ja arvot normalisoitiin Päivä 3 Cell Titer-Glo määrityksessä. Määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja keskivirheet keskiarvosta on raportoitu. Soluproliferaatiomääritykset suoritettiin myös inkuboimalla soluja ajoneuvon (DMSO), bikalutamidi (1 uM), AKT-estäjällä (1 uM) (MERCK, Whitehouse Station, NJ), tai yhdistelmä bikalutamidia ja AKT-estäjällä ja laskemalla solut. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja keskihajonnat raportoidaan.

Immunoblottausmääritys

Solulysaatit Western blot analyysit valmistettiin käyttämällä standardia RIPA puskuria. Vasta-aineet, joita käytetään western blot-analyysi ja immunohistokemia olivat Pakt Ser473 (Cell Signaling Technology, 1:1000 laimennus), Akt (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, 1:1000 laimennus), PS6 Ser235 /236 (Cell Signaling Technology, 1: 1000 laimennos), PARP (Cell Signaling Technology, 1:1000 laimennus), ja Actin (Cell Signaling Technology, 1:1000 laimennus).

Quantitative käänteistranskriptio-PCR

LNCaP, PC3, ja Vcap solut kohteena siRNA transfektion kerättiin 4 päivää tai 7 päivää transfektion jälkeen seurata pudotus kohdegeenin (t) kvantitatiivisella käänteistranskriptio-PCR: llä (qRT-PCR) (katso taulukko S4). Reaktiot tehtiin kolminkertaisina, ja normalisoidaan RPL27 kunkin cDNA: n ja normalisoidaan sitten vehikkelillä NT. Standard keskivirhe laskettiin.

Biokemiallinen toistumisen

geenin ilmentymisen ja kopion numero tilan

STRADA

,

TTK

,

AR

,

AKT1

,

SKT22B

,

PSMC1

, ja

PRKACG

perus- ja metastaattinen ihmisen eturauhassyöpään (n = 218) määritettiin käyttämällä MSKCC Cancer Genomics Pathway portaali [18]. Kaksikymmentä 131 kasvainten oli

TTK

yli-ilmentyminen määritellään z-score≥2. Tapaukset luokiteltiin

TTK

korkea ja

TTK

normaali /matala. Todennäköisyys vapaus biokemiallisten uusiutumista eturauhasen (BCR määritelty 0,2 ng /ml ja nousee prostataspesifisen antigeenin) raportoitiin käyttäen Kaplan-Meier-analyysi. P-arvo laskettiin käyttäen log-rank-testi.

tukeminen Information

Kuva S1.

Bicalutamide estivät LNCaP-solujen lisääntymisen. Infektoinnin jälkeen shRNA kirjasto ja puromysiiniselektion (A) LNCaP ja (B) PC3-solut laskettiin ja maljattiin elatusaineeseen, joka sisälsi 0,4 uM bikalutamidia, 1,0 uM bikalutamidi, tai vehikkeliä (0 uM). Solut laskettiin ja siirrostettiin 4 päivän välein seurata kasvun vastauksena ajoneuvojen ja bikalutamidia. Tulokset on esitetty keskimääräisenä elävien solujen (yläpaneelit) tai prosentuaalinen elinkelpoisten bikalutamidin-käsitellyissä soluissa verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen solujen (alapaneeli) kunakin ajankohtana yli 21 päivää ajan myötä kunkin lääkehoidon ± standardipoikkeama virhe 3 rinnakkaisten kokeiden.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034414.s001

(TIF) B Kuva S2.

shRNA koettimet köyhdytetty LNCaP. Boxplots suhteellisen runsaasti koettimien ajoneuvon ja bicalutamide- (lääke) käsiteltiin LNCaP-soluja. Tiedot T = 2 ja T = 3 yhdistettiin ajoneuvon tai bikalutamidi saaneista boxplots. Molemmat bikalutamidi annoksia (0,4 uM ja 1,0 uM) yhdistettiin myös, että huumeiden boxplots.