Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa skannaus lähialue-optisella mikroskoopilla (SNOM) on hyödynnetty yhdessä kvanttipiste merkintöjä kysellä biomolekyylitason koostumus solukalvojen. Tekniikka voittaa rajoja optisen diffraktion löytää tavallisista fluoresenssimikroskopia ja myös tuottaa elintärkeää topografisia tietoja. Tekniikkaa on sovellettu tutkia solu-solu-adheesion ihmisen epiteelisoluissa. Tämä on toteutunut kautta immunofluoresenssimenetelmällä merkintöjä solun soluadheesiota proteiini E-kadheriinin. Lisäksi kaksi merkintää protokolla on optimoitu helpottamaan vertailevan tutkimuksen tarttumista mekanismeja ja vaikutusta poikkeava Adhesion Protein ilmentymistä sekä terveillä ja syöpä- epiteelisolujen. Tämä tutkimus raportoi selviä eroja morfologia ja fenotyypin terveiden ja syöpäsoluja. Terveillä eturauhasen epiteelisolujen (PNT2), E-kadheriinin oli pääasiassa eri puolilla solun reuna ja sisällä filopodial laajennuksia. Läsnäolo E-kadheriinin näyttivät parantaa, kun solu-solu-kontakti on perustettu. Sen sijaan tutkittaessa metastaattisen eturauhassyövän adenokarsinoomasoluja (PC-3) ei paljastanut mitään E-kadheriinin merkintöjä kehän ympäri soluihin. Tämä puute toiminnallinen E-kadheriinin PC-3-solujen kanssa samanaikaisesti selvästi erilainen morfologia ja PC-3-soluja ei havaittu muodostavan lähellä solu-yhdistysten naapureidensa kanssa. Olemme osoittaneet, että on täysin optimoitu näytteenvalmistus menetelmät, multipleksoitu kvanttipiste merkintöjä yhdessä SNOM kuvantaminen voidaan onnistuneesti soveltaa kuulustella biomolekyylitason paikannuksen herkkä solukalvon.

Citation: Walker K-AD, Morgan C, Doak SH, Dunstan PR (2012) Quantum Dots varten Multipleksoidut havaitseminen ja luonnehdinta eturauhassyöpäsolujen käyttäminen Skannaus Near-Field optinen mikroskooppi. PLoS ONE 7 (2): e31592. doi: 10,1371 /journal.pone.0031592

Toimittaja: Joel M. Schnur’in George Mason University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 elokuu 2011; Hyväksytty: 11 tammikuu 2012; Julkaistu: 09 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Walker et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: HEFCW ovat tunnustettu laiteinvestoinnit (www.hefcw.ac.uk). EPSRC tunnustetaan tarjota väitöskirjatutkimuksen opiskelija rahoitus (www.EPSRC.ac.uk). Kiitos St David Medical Foundation Eturauhasen UK (lupanumeroon: G2009 /27) tukemiseksi tämän työn näkökohdat (www.prostateaction.org.uk). SH Doak tukena on RCUK Academic Fellowship (www.rcuk.ac.uk). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cellular tarttuvuus on tärkeä rooli ylläpitää arkkitehtuurin kudosten ja elinten ja on ratkaisevan tärkeää niiden oikean toiminnan. Epänormaali solu-solu-adheesio on vaikutuksia puhkeamista monien sairauksien ja tautien. Yhteinen on pyritty monet tutkijat voivat määrittää suhdetta soluadheesiota ja metastaattisen kapasiteetti moniin syöpiin [1], [2].

E-kadheriinin on yksi pääasiallisista välittäjien solu-solu- tarttuvuus epiteelikudoksissa ja on laajasti tutkittu määrittää sen rooli syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. On osoitettu, että menetys E-kadheriinin ilmentyminen tai toiminta liittyy lisääntynyt invasiivisia mahdollisia [3], metastaattisen potentiaalin [4], ja huonompi prognoosi potilaalle [5], [6]. Tämä suhde on erityisen merkityksellistä eturauhasen syöpiä, joilla on taipumus lähettää metastaaseja ja muodostavat sekundaarikasvaimia (lähinnä luuston), jolloin huono potilaan ennusteeseen [7], [8]. Vaikka merkittäviä ponnisteluja on tehty kohti ymmärrystä rooli E-kadheriinin etenemisen eturauhassyöpä, tutkijat eivät ole päässeet [9], [10]. Yksityiskohtaisempi käsitys tarttuvuus mekanismeilla päästään kehittää uusia syöpälääkkeitä kuten osoitetaan alustavat suorittaman Zhou

et al.

[11] ja Mao

et al.

[ ,,,0],12].

Vaikka rutiininomaisesti sovelletaan koko biotieteiden, tavanomaisia ​​fluoresenssimikroskopiaa tekniikoita rajoittavat optisen diffraktion raja. Tiedonhaun kuin diffraktio rajan monenlaisia ​​näyte tyyppejä on mahdollistanut seuraavan syntyminen skannaus anturi mikroskopia (SPM) tekniikoita. SPM mahdollistaa otoksen tarkastus n metrologian kanssa nanomittakaavan resoluutio ja skannaus lähialue-optisella mikroskoopilla (SNOM) on yksi tällainen esimerkki, joka soveltuu erityisesti kuulustella vuorovaikutusta ja tehtävät biologisten materiaalien [13] – [15]. SNOM on kyky samanaikaisesti koetin topografia ja tutkia optiset ominaisuudet vaakoja, ei yleensä voida saavuttaa käyttämällä tavanomaisia ​​fluoresenssimikroskopiaa hyödyntämällä ominaisuuksia vaimenevan aaltoja. Tyypillinen SNOM koejärjestelyistä on esitetty kuviossa 1. Vaikka on ollut nopea kehitys (katso tarkastelua Galbraith ja Galbraith [16]) alalla superresoluutiokuvien optisella mikroskoopilla kehittämisen kanssa tekniikoita, kuten emissioprosessin ehtyminen (STED), valokuva-aktivoitua lokalisointi mikroskopia (PALM) ja fluoresenssikuvantamisella yhden nanometrin tarkkuudella (FIONA) [17], optisten lähellä kenttiä pinnan tai kalvon käyttävissä yhteensä sisäisen heijastuksen fluoresenssimikroskopiaan (TIRFM) on myös yleistynyt [18], [19]. Luonteensa puolesta TIRFM rajoittaa valaistu Z-alue ja siten tarjoaa paremman resoluution kuin konfokaalimikroskopia. SNOM on hyötyä TIRFM mutta lisäksi muodostaa optisen lähes alalla, joka on myös tilallisesti rajoittuu nanometrin mitat x ja y. Lisäksi sen anturi on yhdistetty topografinen palautemekanismin, jonka avulla se samanaikaisesti paljastaa rakenteellisia muutoksia näytteen rinnalla optisen reaktion.

Seuraavassa käsitellään käytön optimoitu dual merkintöjä protokolla johtaa vertailevan tutkimuksen tarttumisen mekanismien sekä terveillä ja syöpä- epiteelisolujen. Painopiste Tutkimuksen on ollut korkean resoluution tutkimus käyttäen SNOM funktion E-kadheriinin proteiinin kahdessa solulinjassa. Sekä E-kadheriinin, tiukka liitos proteiini ZO-1 valittiin sopivan kuvantamisen ohjaus, kun se on ilmaistu solukalvon on solu-solu-rajan. Siten vasta-aineita vastaan ​​adheesioproteiineja E-kadheriinin ja ZO-1, käytettiin epäsuorasti merkitä normaalin eturauhasen epiteelisolujen PNT2 ja eturauhasen adenokarsinoomasolua PC-3. SNOM tekniikka tutkii ero Saharan sijainti solun solu-solu adheesiomolekyylien suurella tarkkuudella ja on suoritettu rinnakkain geeniekspressiotutkimuksissa antaa yleistä merkintöjen sekä toiminto ja ilme.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

eturauhasen epiteelisolujen, PNT2, ja eturauhasen adenokarsinoomasoluja, PC-3, saatiin European Collection of Cell Cultures (Salisbury, UK). Soluja ylläpidettiin RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 1% L-glutamiinia, 60 yksikköä /ml penisilliiniä ja 60 ug /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa /5% CO

2. Soluja aliviljeltiin, kun ne saavuttivat noin 80% konfluenssin.

kuvantaminen, soluja kasvatettiin steriileillä 25 mm pyöreä lasipeitinlevyille. Soluja kiinnitettiin huoneenlämpötilassa käyttämällä 3,7-4% erittäin puhdasta metanoli-vapaata formaldehydiä (Park Scientific Oy, Northampton, UK) PBS 15 minuuttia, jota seurasi kolme 5 minuutin pesua PBS /100 mM glysiini ja kuivattu läpi etanoli sarja. Näytteitä säilytettiin 4 ° C: ssa, kunnes sitä tarvitaan fluoresenssin merkintöjä.

RNA ja Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) B

Solut kasvatettiin konfluenssiin 75 cm

3 pulloihin . Solun totaali-RNA uutettiin käyttäen RNeasy (Qiagen, Crawley, UK) ja DNA-jäännöksen poistettiin käsittelemällä DNA-free ™ (Ambion, Cambridgeshire, UK) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin 1 ug RNA käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita ja High Capacity cDNA-synteesin käänteistranskriptio Kit (Applied Biosystems, Warrington, Iso-Britannia). Reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin iCycler iQ lämpösyklilaitteeseen (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) käyttämällä SYBR Green tunnistus menetelmiä. Alukesarjat olivat suunniteltu eksonin eksonin ulottuu, jotta minimoidaan se mahdollisuus, että mikä tahansa kontaminoivan genomisen DNA: n tulisi monistaa. Alukesarjat käytetty testattiin myös varmistaa ne kaikki osoittivat yhtä suuri vahvistus tehokkuutta. Kaikki reaktiot suoritettiin kolmena rinnakkaisena 2 ui cDNA: ta, 12,5 ui iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad laboratorioista, Hemel Hempstead, UK) ja 0,2 uM eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita, lopullisessa reaktiotilavuudessa 25 ui. PCR-monistus-olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 3 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 60 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Kertainen ilmentyminen oli normalisoitiin PNT2. E-kadheriinin ja ZO-1 monistettiin käyttäen alukkeita esitetään taulukossa 1. Kuviossa on esitetty myös alukkeen sekvenssit β-aktiini ja HPRT, joita käytettiin endogeenisen valvontaa.

Western blotting

Yhteensä proteiini uutettiin käyttäen RIPA-puskuria (Sigma Aldrich, Dorset, UK). Kolmekymmentä mikrogrammaa proteiinia ajettiin 7,5% tris-glysiini-PAGE-geelit (Bio-Rad laboratorioista, Hemel Hempstead, UK). Proteiinit siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK). Membraanit blokattiin 5% rasvaton kuiva maito tween /TBS: ää (kaikki Sigma Aldrich, Dorset, UK) estämään epäspesifistä sitoutumista ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa käyttäen hiiren anti-ZO-1-vasta-ainetta (Invitrogen, Paisley, Iso-Britannia ) on 1:250 ja kanin anti-E-kadheriini-vasta-ainetta (New England Biolabs, Hertfordshire, UK) on 1:1000. β-aktiini (1:1000) käytettiin kontrollina proteiinimäärän. Membraanit pestiin vapaaksi primaarisen vasta-aineen ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitu sekundäärisen anti-hiiri /anti-kani-vasta-aineita (1:1000) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Proteiinit saatiin näkyviin käyttäen Immun-Star WesternC chemiluminescene havaitseminen kit (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Iso-Britannia) ja kvantifioidaan tiheysmittaus ja Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Iso-Britannia).

Immunofluoresenssikoe

Kaikki vaiheet suoritettiin huoneenlämpötilassa, ellei toisin mainita. Immunoleimaus oli toteutetaan yleensä 24 tunnin kuluessa kiinnityksen. Kaikki vaiheet immunofluoresenssilla merkintöjä pöytäkirjat optimoitu perus kuvatut valmistajien; kuten permeabilisation olosuhteissa estää vaiheet, keskittyminen reagenssien, inkubaatio-olosuhteet ja pesuvaihetta. Optimointi valmistui kutakin solulinjaa käytetty tässä tutkimuksessa. Negatiivinen kontrolli kokeet suoritettiin yhdessä fluoresenssi merkintöjä varmistamiseksi selektiivisyyden fluoresoivia leimoja. Negatiiviset kontrollit ei havaittu aiheuttavan erillisiä merkintöjä kuvio tai olisi merkittävää fluoresenssia tuotto. Dual etiketti PNT2 soluja vastaan ​​E-kadheriinin ja ZO-1 peitelaseja huuhdeltiin PBS, permeabilised 0,1% Triton-X 10 minuutin ajan ja inkuboitiin Image-IT FX-signaali tehostajana (Invitrogen, Paisley, UK) 30 minuuttia . Peitinlasit huuhdottiin sitten ja sen jälkeen inkuboitiin 31 ug /ml hiiren anti-ZO-1-vasta-ainetta (Invitrogen, Paisley, UK), 2 tuntia 37 ° C: ssa. Merkitä ZO-1 kvanttipisteiden, peitelasit inkuboitiin 30 nM Qdot 525 vuohen anti-hiiri-IgG-konjugaattia (Invitrogen, Paisley, UK) 1 tunnin ajan. Kanin anti-E-kadheriinin primäärinen vasta-aine (Abcam, Cambridge, UK) levitettiin sitten soluihin konsentraatiolla 18 ug /ml ja peitinlasit inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa. Merkitä E-kadheriinin kanssa kvanttipisteiden, Qdot 605 vuohen anti-kani-levitettiin pitoisuutena 20 nM ja jätettiin 1 tunti (Invitrogen, Paisley, UK). Ennen kuvantaminen, peitinlevyjä huuhdottiin PBS poistamiseksi ylimääräinen sitoutumaton kvanttipisteiden. Helpottaakseen SNOM kuvantaminen, näytteet lisäksi huuhdeltiin vedessä, kuivattu läpi etanolissa ja kuivattiin ilmassa. Kaksitoimista merkintöjä PC-3-solujen hieman eri protokollaa vaadittiin. Vähentää taustavärjäyksen, peitelaseja blokattiin PBS /100 mM glysiini ennen soveltamista vasta-aineita ja järjestystä sovelluksen oli E-kadheriinin ensisijainen vasta-aine, Qdot 605 vuohen anti-kani-vasta-aine, ZO-1 primaarisen vasta-aineen ja Qdot 525 vuohen anti -hiiri sekundaarinen vasta-aine (20 nM konsentraatio käytettiin Qdot 525, kaikki muut pitoisuudet ja inkubointia ajat olivat kuin PNT2 soluja). Näytteitä tarkkailtiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia ennen SNOM kuvantamisen tarkistaa, että merkinnät oli onnistunut. Näytteet kuvattiin 48 tunnin kuluessa valmistuksesta.

SNOM kuvantamisen

SNOM kuvat saatiin käyttämällä Aurora 3 (Veeco Instruments, Cambridge, UK), käyttäen alumiini päällystetty valokuitu antureilla resonanssitaajuuden 80-110 kHz ja aukko on noin 50-100 nm, joka on määritelty valmistajan (Veeco Instruments, Cambridge, UK). 488 nm Ar

+ laser käytettiin viritykseen ja lähetyssignaalien kerättiin 40 ×, 0,65 NA kokoelma tavoite. Signaalit vietiin läpi 488 nm Raman reuna (ylipäästösuodin) optinen suodatin poistaa valon laser. Jotta kuva sijainnin ZO-1-proteiineja (merkitty vihreällä lähettävä kvanttipisteiden), jäljellä oleva valo johdettiin 525 nm: n optista kaistanpäästösuodin, poistaa punaisen fluoresenssin, ja keskittynyt päälle vyöryvalodiodin (APD). Jotta kuva sijainnin E-kadheriinin proteiinit (merkitty punaisella säteilevät kvanttipisteiden), joka on 609 nm optinen kaistanpäästösuodatin hyödynnettiin. Tässä artikkelissa APD signaalit, jotka johtuvat fluoresenssin esittelyyn ja tyypillisiä APD integraatio ajat olivat 20 ms /pikselin kuvan resoluutio on 300 x 300 kuvapistettä.

Tilastollinen

Testaa oletetaan, että tietoja normaalijakaumaa, normaali tonttien tehtiin kullekin ryhmälle. Yksi näyte Kolmogorov-Smirnov tilastojen johti p-arvot 0,05 osoittaen Aineisto normaalisti jakautunut. Analyysi siis suoritettiin käyttäen parametrisen ANOVA testi. Dunnettin post hoc analyysi tehtiin vertailua syöpäsolun linjat kanssa ei-syöpä solulinjassa ohjaus ja Tukey post hoc analyysi tehtiin useita ryhmä vertailuja.

p

-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Expression Analysis

Geenien ilmentyminen Tiedot kerättiin reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) ja E-kadheriinin, paljasti tilastollisesti merkitsevä vähennys (-7,25 kertaisesti) ilmentymistä PC-3 (

p

= 0,001) verrattuna PNT2. Jotta ZO-1, vaikka ilmentyminen säädeltiin PC3 verrattuna PNT2 (-1,20 kertainen) tämä ei katsottu merkittäviä (kuva 2).

Ilmentymistasoja on normalisoitu kahta housekeeping geenejä ja muuttaa ilmaisun suhteessa PNT2 havainnollistetaan. * Tarkoittaa merkitsevää eroa (P 0,05) verrattuna PNT2.

Western blot-analyysi osoitti, että säätelyä alaspäin E-kadheriinin näkyi myös proteiinitasolla. Densitometria paljasti 2,6 taitettava sääntely E-kadheriinin PC-3 solulinja verrattuna PNT2. Proteiini tasot ZO-1 myös säädeltiin (-1,05 kertainen) suhteessa PNT2, tukemalla geenien ilmentyminen tietojen (kuva 3).

Huomattava säätelyä alaspäin E-kadheriinin havaitaan taas eroja ZO-1-proteiinin ilmentymisen välillä solulinjojen on vähemmän merkittävä. Huomaa, β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Dual merkitty PNT2-soluissa

Jotta suodatin erottamisen fluoresenssin tuottamien signaalien kahden merkitty näytteitä, oli tärkeää hyödyntämään kvanttipisteiden jotka emittoivat selvästi erillään aallonpituuksilla, joten valinta kvanttipisteiden päästöjä aallonpituuksilla 605 nm ja 525 nm. PNT2 Näytteet tutkittiin käyttämällä SNOM ja kuvat esitetään kuviossa 4 oli tuotettu. Topografia tiedot voidaan nähdä kuviosta 4A, joka hankittiin sen osoittamiseksi, että laaja kaksoisleimausta protokolla ei aiheuttanut muutoksia rakenteeseen näytteen. Kuten voidaan nähdä kuviosta 4A, solurakenne pysyi hyvin säilynyt ja ominaisuuksia voidaan selvästi erottaa.

Kuvat paljastavat topografia (A ja E) ja fluoresenssi- (B, C ja D) vasteen. Kuvat (B) ja (C) saatiin erilaisia ​​suodattimia spektrisesti erottaa punaisen ja vihreän fluoresenssin tunnistaminen ZO-1 ja E-kadheriinin paikoissa vastaavasti. Boxed alue (A) tutkittiin aallonpituudella Tarkempaa tuottaa yksityiskohtaisia ​​E-kadheriinin fluoresenssikuvan (D) ja siihen liittyvän topografia on esitetty (E). Ympyröity alueilla (C) ja nuoli /nuolenkärki (D) korosta E-kadheriinin klustereita.

Vastaavat optiset kuvat hankittiin topografia kuvan kuvassa 4A paljastaa sijainnin ZO- 1 ja E-kadheriinin (esitetty kuvioissa 4B ja 4C vastaavasti). Geenin ilmentymisen analyysi paljasti ZO-1 ilmentyy molemmissa solulinjoissa ja siten varten tässä tutkimuksessa sitä käytettiin positiivisena kontrollina. Huolimatta suhteellisen alhainen signaali-taustakohina-suhde ~5.6, kuvio 4B osoittaa, että ZO-1-proteiinit ovat asianmukaisesti sijoitetut solun kehän PNT2-soluissa.

Kun tutkitaan E-kadheriinin (kuvio 4C), huomattavasti parannettu signaali-kohina tason yli ~ 33 saavutetaan. Ensiluokkaisten saatujen kuvien johtuu todennäköisesti kirkkaampi luonne punaisia ​​kvanttipistei- verrattuna vihreitä. Kuva 4C paljastaa E-kadheriinin esiintyy lähinnä pitkin PNT2 solurajat erityisen korkeita fluoresenssin keskittynyt tietyille alueille (ympyröity kuviossa 4C).

Jotta voidaan tutkia alueita, joilla on korkea loisteputki toimintaa tarkemmin, boxed alue kuviossa 4A myöhemmin skannattu korkeammalla resoluutiolla. Tuloksena topografia kuva (kuvio 4E) paljastaa verkoston filopodia viereisistä soluista, jotka ovat ottaneet yhteyttä. Ja että samanaikaisesti hankitut fluoresenssikuva on esitetty kuvassa 4D. Rivi fluoresenssi vastaa E-kadheriinin sijainti voidaan nähdä käynnissä reunan suuntaisesti yhden solun (katso nuoli kuvassa 4D). Rivejä fluoresenssi on myös läsnä pituudelta suuri filopodium keskellä kuvaa (tunnistetaan nuolenkärki). Nämä tulokset vahvistavat, että lokalisoinnin E-kadheriinin voidaan menestyksellisesti tutkitaan näytteistä, jotka ovat olleet kahden värjätään.

Lujuusanalyysi PC-3-solujen

Jos haluat vertailla morfologia terveiden ja syöpäsoluja , kirkas mikroskopia kuvat alun perin saatu. Konfluentit PNT2-soluissa on esitetty kuviossa 5A, samalla kun PC-3-solut on esitetty kuvassa 5B. PC-3-solujen näyttää selvästi erilainen ulkonäkö: jotkut PC-3-solujen näyttää pallomainen morfologia, kun taas toiset näyttävät enemmän pitkänomainen ja fibroblastien kaltaiset, usein jolla pitkänomainen lamellipodioihin.

Ennen immunoleimaus PC -3 solut, niiden morfologiaa tutkittiin lisää käyttämällä korkean resoluution SNOM topografia yritysostoja. Kuvat on esitetty kuviossa 6 suoraan vahvistavat havaintoja Kuva 5. Jotkut solut näyttävät pallomaiseksi muotoillun kuten on osoitettu kuvassa 6A, kun taas toiset näytteille enemmän fibroblastien kaltainen morfologia pitkät, haarautuva sytoplasman ulokkeita (kuten nuolilla kuvioissa 6C ja 6D) . Nämä ulokkeet ovat merkittävästi pidempiä kuin filopodia tyypillisesti havaittu terveiden solujen ja oli usein laajentaa pituudet yli 25-30 um, eli yli kokoluokassa topografia skannaa. Lisäksi mittaukset osoittavat, niiden läpimitta on paljon laajempi kuin hienompaa filopodia, joista voidaan erottaa työntyy esiin lamellipodioihin kuten nuolenpäin kuvioissa 6C ja 6D. Nämä suuremmat kohoumat taipumus kaventua niiden pituus kasvaa kuitenkin niiden levein kohta niiden todettiin mitata jopa 2,1 um ja päästä korkeus enintään noin 300 nm. Mittaukset on hienompaa ulokkeet havaittu näitä kuvia paljasti leveydet vaihtelevat välillä 120-340 nm. Solujen tumat (merkitty N) voidaan selvästi erottaa kuvissa 6A ja 6B. Boxed alueet kuvioissa 6A ja 6B ovat alueita, jotka sittemmin zoomata. Tämä mahdollisti erinomaisen kontrastin välillä piirteitä vastaavia korkeus ja altistuvat paljon yksityiskohtaisemmin.

Image (A) on tyypillinen esimerkki ei-konfluentteja PC-3 näyte. Katkoviivaa neliö osoittaa alueen, joka on tutkittu tarkemmin, mikä näkyy kuva (C). Näiden kuvia PC-3-soluilla sytoplasmista ulokkeita, nuolella kuvan (C). Kuvat (B) ja (D) esittävät enemmän konfluentti jakautuminen PC-3-soluja. Suurennetussa alue on hahmoteltu kuvaa (B) ja kuva (D) on tuloksena zoom. Korkeampi resoluutio paljastaa selvästi löysä solu-solu yhdistysten välistä rajaa pitkin solujen; tämä raja on merkitty etiketti M. kuva (D) sytoplasmisen ulokkeet jälleen merkitty nuolella. Muut merkinnät, joita käytetään luvut sisältävät nuolenpäät ilmaisemaan filopodia sijainnit ja etiketti N esiin solun tumassa.

Toisin yhtenäisiksi PNT2-soluissa, PC-3-solut eivät näytä muodostaa hyvin lähellä yhdistysten naapurisoluilla. Tästä on osoituksena kuvat kuvassa 6B ja 6D. Aukot enintään 2,1 um kehän ympäri solut ovat havaittu eikä tiiviste rajaa pitkin vierekkäisten solujen välillä on todettu (solu-solu-raja on merkitty etiketti M kuvassa). Lukuisat hieno filopodial laajennuksia voidaan nähdä työntymään esille nämä puutteet; kuitenkin harvat näyttävät vuorovaikutuksessa niille vastakkaisista soluista. Tämä on huomattavan erilainen PNT2 soluihin, joissa filopodia vierekkäisten solujen havaittiin lomittain koko solujen väliseen alueeseen. Kun PNT2 solut saavutettu korkea konfluenssiin, solut täysin sinetöity yhteen ja ole aukkoja voitaisiin erottaa.

Dual leimattu PC-3-solujen

Jotta voidaan arvioida solukomponenttien lokalisoinnin E- kadheriinin proteiinin PC-3-solut, dual merkintöjä oli jälleen toteutettu. Tyypillisiä SNOM hankinnat dual leimattu PC-3-solut on esitetty kuvassa 7. topografinen kuva kuvassa 7A ja paljastaa yhden solun, jonka ydin (merkitty N) on selvästi erotettavissa. Mittaukset osoittavat, että maksimikorkeus tämä solu on saavuttanut yli ydinvoiman alueella, joka vastaa noin 890 nm. Lamellipodium (merkitty L) voidaan nähdä ja sen havaittiin span ala on noin 90 pm

2. Suuri solu uloke näkyy solu ja tunnistetaan tarra P kuvaan. Mittaukset osoittavat leveys 6,2 ± 0,1 um sen lähtöpisteessä.

Kuvat paljastavat solun topografia (A) ja fluoresenssi (B, C, D ja E). Tuma tunnistetaan N, lamellipodium L ja kohouman P. ZO-1 lokalisointi on esitetty kuvien (B ja D), kun taas E-kadheriinin merkinnät on esitetty (C ja E). Boxed alueet (B ja C) vastaavat yksityiskohtaiset zoom alueet näkyvät (D ja E) vastaavasti. Nuolen (D) korostetaan ylivoimainen kehän merkintöjä ZO-1.

Vastaavat SNOM fluoresenssimittauksia esitetään kuvioissa 7B ja 7C ja saatiin käyttämällä eri optisia kaistanpäästösuodattimia erottamaan ZO- 1 ja E-kadheriinin vastaavasti. Myöhempi zoomattu alue (korostettu kuvassa 7B ja 7C) kertyi ohjelmisto mahdollistaa solun reuna on ratkaistava tarkemmin. Kuviot 7D ja 7E paljastaa suhteellinen merkintöjä ZO-1 ja E-kadheriinin vastaavasti.

Kuten aiemmin havaittiin kanssa PNT2 solujen signaali-kohina suhteet saavutetaan vihreä kvanttipistei- kuvassa 7B ovat huomattavasti vähemmän verrattuna saavutetaan punainen kvanttipistei- kuvassa 7C. Signaali-kohina-suhde kuvio 7B on ~7.2. Korreloidaan ZO-1-fluoresenssi-kuvasta (kuvio 7B) ja topografia (kuvio 7A) paljastaa fluoresenssin alueen yli solun, joka vastaa ydin. Kuitenkin fluoresenssi voidaan myös selvästi tunnistaa kehää pitkin solujen ulokkeen ja tunnistetaan nuolin kuvassa on esitetty kuviossa 7D. Vaikka ZO-1 oli pääasiassa väline ohjaus, tämä uudelleen jakamista fluoresenssi osaksi ydin- aluetta (samanlainen kuin E-kadheriinin) on havaittu aiemmissa tutkimuksissa [20], [21].

Kuvio 7C esittää SNOM hankinta saatu tutkia lokalisoinnin E-kadheriinin proteiinien PC-3-solujen kirjaamalla lähes alalla Fluoresenssivasteesta punaisen säteilevät kvanttipiste merkintöjä. Vaikka kuvassa voimakasta Fluoresenssivasteesta näytteestä, signaali-kohina tason (~14.6) on huomattavasti pienempi verrattuna havaittuun tutkittaessa E-kadheriinin in PNT2 soluissa. Lisäksi fluoresenssisignaalien ovat ilmeisiä pääasiassa kehän ympäri tumassa ja ovat myös löytäneet laajentaa jonkin verran pitkin ulkoneman. Tämä voidaan nähdä selvemmin kuviossa 7E, joka edustaa zoom suorakaiteen alueella kuviossa 7C. Tästä huolimatta vaste, ei näytä olevan mitään merkittävää E-kadheriinin merkintöjä kuvio kehän ympäri solun alueilla, jotka antavat solu-solu-kontakti, kuten nähty PNT2 solulinjassa. Tämä on selvä osoitus puutteesta asianmukaisen proteiinin lokalisointi PC-3-solut.

Keskustelu

Aiempien tutkimusten tarttuvuuden mekanismeja terveen epiteelisolujen linja PNT2 [22], joka on kaksoisleimausta metodologia on kehitetty helpottamaan tutkimuksen adheesiomolekyylien muissa solulinjoissa. Laaja optimointi protokollien oli tarpeen kehittää korkealaatuista fluoresoivia näytteitä ja varmistaa, että immunoleimaus vastaa tarkasti jakautuminen proteiineja solukalvon. Monet valmistelu näkökohdat on otettu huomioon tämän toimenpiteen aikana, jotta saavutetaan tehokas leimausta suuri signaali vastauksen ja alhainen tausta merkintöjä, kuten yksityiskohtaisesti materiaalit ja menetelmät.

Geenien ilmentyminen analyysi paljasti merkittävän alassäätöä E- kadheriiniekspressiota PC-3 solulinja kontrolliin verrattuna solulinjaan, PNT2. Tämä oli validoitu proteiinitasolla Western-blottauksella ja hyväksyy muita tutkimuksia, jotka osoittavat E-kadheriinin proteiinin lauseke alaspäin säänneltävä PC-3-solujen [23]. ZO-1-proteiinin ilmentyminen molemmissa solulinjoissa havaittiin olevan vain hieman muuttunut, ja siten voisi toimia sopivan ohjaussignaalin. Siksi kaksi merkintää lähestymistapaa pidettiin tarpeelliset tutkimukset E-kadheriinin lokalisointi käyttäen SNOM kuin ZO-1 tunnistus varmistaisi optinen havaitseminen meidän SNOM välinettä optimaalinen, varsinkin siinä tapauksessa, että E-kadheriinin signaaleja ei voitu havaita. Vastatakseen vaikeuksia aikana dual merkintöjä PC-3, E-kadheriinin proteiinit immunolabelled kirkkaammat (johtuen niiden korkeamman kvanttisaanto) punaista emittoivan kvanttipisteiden. Optimointi protokollien tehtävänä oli varmistaa, että tehokas merkinnät saavutettiin tarkalla signaalin vasteen. Tämä oli vaikeampi saavuttaa PC-3 solulinja, kuten E-kadheriinin ilmentyminen vähenee ja heikosti kehittynyt merkintöjä protokolla voitaisiin yksinkertaisesti leimaamalla E-kadheriinin huonosti. Tämä puolestaan ​​esittäytyy heijastaen muutosta ilmaisun. Tästä laaja optimointi, dual merkintöjä onnistuttiin ja siten helpotti tutkimuksen lokalisoinnin E-kadheriinin ja ZO-1-proteiinien kahdella eturauhasen epiteelisolujen solulinjoja käyttämällä korkean resoluution SNOM kuvantaminen.

analyysi dual leimattu terveitä epiteelisolujen PNT2 soluja paljasti, että E-kadheriinin on pääasiassa sijaitsee pitkin kennon kehää ja näytti parannettu alueilla, joilla solu-solu kosketuksiin perustettiin. Tämä oli osoituksena pistemäinen klustereita E-kadheriinin, joka havaittiin kun filopodia luoneet yhteyksiä ja aloitti solu-soluadheesion kuten kuvassa 4C. PNT2-soluissa havaittiin muodostamiseksi tyypillinen cobblestone ulkonäkö, joka on tyypillisesti nähdään normaaleissa epiteelikudoksissa. Tämä oli yhdenmukainen aiempien tutkimusten, jossa vain lokalisoinnin E-kadheriinin proteiinit tutkittiin [22]. Kuten odotettua, ZO-1-proteiinit havaittiin myös olla paikallinen ympärille kehän PNT2 soluja. Tämä on selvästi osoitettu kuvassa 4B, vaikka laadun ZO-1 fluoresenssi kuvat on huonompi kuin saatiin E-kadheriinin, koska kvanttisaanto erot kvanttipisteiden käyttää.

Tutkimus laajennettiin tutkia syöpä- PC-3-solut. Aluksi morfologiaa näiden metastaattisen solujen analysoitiin hankkimalla SNOM topografia kuvia. PC-3-solujen havaittiin eroavat rakenteeltaan terveille epiteelisoluihin monin tavoin. Ensinnäkin, niiden yleinen muoto havaittiin olevan epäsäännöllinen, ja joillakin soluilla olettaen fibroblastin kaltaisen morfologia verrattuna enemmän cobblestone ulkonäkö terveitä soluja. Toiseksi PC-3-solut olivat usein vaikea kuva johtuen niiden äkillisen ominaisuuksia. PC-3-solujen yleisesti hallussaan pitkät sytoplasman ulokkeet lisäksi filopodia rutiininomaisesti havaittu terveitä soluja. Lopuksi tutkiminen enemmän confluent näytteiden paljasti, että PC-3-solut muodostavat löysä yhdistysten naapurisoluilla muutamia vastakkaisia ​​filopodia vuorovaikutuksessa. Aukot havaittiin usein kehän ympäri solujen (kuten on osoitettu kuviossa 6D), toisin kuin tiivisteiden, jotka havaittiin tutkimuksen aikana ja PNT2-soluissa. Morfologia PC-3-solujen havaittiin tässä tutkimuksessa käyttämällä SNOM vahvistaa aiemmat havainnot Lang

et al.

[24] käyttäen faasikontrastimikroskopiaa ja pyyhkäisyelektronimikroskoopilla.

Kun kuvantaminen SNOM , piirustus kvantitatiivinen vertailu ekspressiotasojen perusteella lukumäärän laskennat on vaikeaa silloin, kun eri SNOM koettimet on käytetty. Kuitenkin, käyttäen signaali-kohina-suhde sen sijaan, että absoluuttinen määrä auttaa huomioon erot, jotka voivat syntyä muutos SNOM koetin. Myöhempi analyysi solukomponenttien lokalisaatio E-kadheriinin ja ZO-1 proteiinien PC-3-solujen tehtiin. Fluoresenssi SNOM yritysostot paljasti ZO-1 reuna solujen ulokkeita sen lisäksi, että havaittu ydin- alueella. Vaikka ei ole ensisijainen tämän tutkimuksen, tämä havainto vahvistaa havainnot muissa raporteissa, joissa siirtämiseen ZO-1 nähdään [21]. Itse ZO-1 kertymistä solun tuman lisäksi solu-solu-kontakti sivustoja on havaittu aiemmin [20].