Krooninen sairaus

tiivistelmä

Erittäin aneuploidi kasvaimet ovat yleisiä epiteelin munasarjasyöpiä (EOC). Me tutkimme, NuMA ilmentyminen liittyi tähän ilmiöön.

NuMA proteiinin tasot normaaleissa ja tuumorikudoksissa, munasarjojen solulinjoissa ja primaariviljelmiä pahanlaatuisten solujen peräisin munasarjojen Askitesneste analysoitiin Affymetrix mikrosiruanalyysillä, immunoblottauksella, immunohistokemia (IHC) ja immunofluoresenssilla (IF), ja tulokset korreloivat siihen liittyvät kliiniset tiedot. Aneuploidia tila primaariviljelmissä määritettiin FACS-analyysillä.

Affymetrix microarray tiedot osoittivat, että NuMA yliekspressoitiin kasvainkudoksessa, primaariviljelmiä ja solulinjat verrattuna normaaliin munasarjakudoksessa. IHC paljasti alhainen heikko NuMA ilmentymistä normaaleissa kudoksissa. Ekspressio yläreguloituja kasvaimissa, joissa on merkittävää yhteyttä sairauden vaiheessa mucinous EOC alatyyppeihin (p = 0,009), imusolmuke osallistuminen (p = 0,03) ja potilaan iän (p = 0,04). Muita epäjatkuva data-analyysi paljasti, että korkeat NuMA tasoja kasvaimissa väheni arvosana (p = 0,02), mutta kasvoi tauti vaiheessa (p = 0,04) in vakavasta EOC. NuMA ilmaisu laski myöhäisessä taudin vaiheessa 4 endomet- EOCs. Korkea NuMA laskivat lisääntyneeseen kasvaimen invaasion kaikki alalajit (p = 0,03). IF primääriviljelmien paljasti, että korkean NuMA tasoilla sukkularihmaston napojen liittyi merkittävästi alentunut suhteessa solujen sytokineesin (p = 0,05), lisääntynyt binucleation (p = 0,021) ja multinucleation (p = 0,007), ja aneuploidiaa (p = 0,008).

NuMA ilmentyy vahvasti EOC kasvaimia ja korkeat NuMA tasot korreloivat nousu mitoosi vikoja ja aneuploidiaan primaariviljelmissä.

Citation: Brüning-Richardson A, Bond J, Alsiary R Richardson J, Cairns DA, McCormac L, et ai. (2012) NuMA yli-ilmentyminen in epiteelikasvaimet munasarjasyöpä. PLoS ONE 7 (6): e38945. doi: 10,1371 /journal.pone.0038945

Editor: J.Christopher States, University of Louisville, Yhdysvallat

vastaanotettu 26. tammikuuta 2012 Hyväksytty: 14 toukokuu 2012; Julkaistu: 14 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Brüning-Richardson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ ja Dr. Brüning-Richardson rahoitti Yorkshire Cancer Research [L328]. Leedsin yliopiston tukee Dr. Bond, tri Burns, Dr. Hall ja Dr. Morrison. Tohtori Bell tukee Breast Cancer kampanja [2007NovPR53], tohtori Alsiary jonka apurahan Saudi Arabian opetusministeriön korkeakoulu, tohtori Cairns Yhdistyneen kuningaskunnan Medical Research Council [G0802416], tohtori McCormac jonka onkolyyteille Biotech Inc, (Calgary, Kanada) ja tri Wilkinson ja Dr. Hutson Leeds opetussairaaloissa NHS Trust. Dr. Bond, tri Burns, tohtori Wilkinson, Dr. Morrison ja Dr. Bell pidä rahoituksen Yorkshire Cancer Research, GDH Cancer Research UK, ja Dr. Burns ja Dr. Wilkinson alkaen hyvinvointi naiset. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

238 kDa ydin- mitoosilaitteen (NuMA) proteiini on osa interphase tumaan ja sukkularihmaston napa matriisi [1]. NuMA on toimintoja kehräkokoonpanon kautta yhteydessä mikrotubulusten moottorit [2], [3] ja kara paikannus aikana epäsymmetrinen solunjakautumisen [4]. Ylimääräinen interphase roolia ydinvoiman rakennustelineet proteiini on ehdotettu [4] – [6]. NuMA ilmentyy kaikkialla [6], [7]. Ydin- ja kara napa lokalisoinneissa NuMA ovat hyvin tunnettu normaalia kudosta [8], [9] ja kasvainkudoksissa immunohistokemiallisesti (IHC) Human Protein Atlas. Rooli että mitoosi proteiineja, kuten NuMA voisi olla syöpä on viime aikoina tullut aihe uutta kiinnostusta, koska se on käynyt ilmeiseksi, että aneuploidia- on yhteistä kasvaimia, jotka saattavat ajaa niiden etenemistä [10], [11].

EOC on monimutkainen sairaus, joka on vaikea hoitaa esitetään kovin myöhään, uusiutunut hoidon jälkeen ja korkeat chemo-vastus. Biologiaan EOC ymmärretään huonosti ja parannuksia diagnosointiin ja hoidon ovat erittäin toivottavia [12]. Munasarjakarsinoomat usein ominaista karyotyyppejä Vaikeaa aneuploidia- takia kromosomi epävakaudesta (CIN) ja triploidization [13]. On ehdotettu, että aneuploidia- on ominaista varhaisen poikkeavuuksia EOC [14]. Aneuploidi kasvaimet reagoivat huonommin hoitoon kuin diploidinen kasvaimia, mikä vähentää eloonjäämisaste [15].

NuMA1

geeni karttoja kromosomi 11q13 [16], alueella yleisesti monistettiin munasarjasyöpä [17]. Kuitenkin, meidän tietääksemme ole julkaisuja ovat yhdistäneet NuMA ilmaus aneuploidiaan EOC. Analysoimme NuMA tasoilla primääriviljelmissä pahanlaatuisten solujen peräisin munasarjojen ascitic nesteissä, niihin liittyviä tuumorikudoksissa, kudoksiin ulkopuoliselta primääri munasarjojen kasvaimia ja normaalissa munasarjakudoksen käyttäen Affymetrix erilaisia ​​analyysi, slot-blottaus, IHC ja immunofluoresenssilla (IF). NuMA ilmentyminen havaittiin voimistuvan tuumorinäytteissä verrattuna normaaleihin kontrolleihin. IF analyysi primääriviljelmien tunnistettu yhdistyksen välillä suurempia määriä NuMA karan navat ja hinnat binucleation ja multinucleation, vaikka FACS-analyysi paljasti positiivinen korrelaatio lisääntynyt NuMA ilmaisun ja aneuploidia-. Tämä tutkimus osoittaa ensimmäistä kertaa, että NuMA ilmentyminen on yliaktiivista EOC ja että tämä liittyy aneuploidiaa nähdään tämä syöpä.

Tulokset

Affymetrix Microarray Analysis

Examination of Affymetrix microarray tietojen paneelin munasarjasyövän solulinjoissa, primääriviljelmissä ja tuumorikudoksia osoitti NuMA oli johdonmukaisesti yli-ilmentyy transkription tasolla verrattuna normaalin munasarjan kudoksessa. Vain kaksi askites näytteillä oli pienempi ekspressiotasoja verrattuna sisäisen normaalin valvonnan (N) (kuvio 1A). Tämä alustava työ ehdotti, että lisätutkimukset NuMA ilmaisun EOCs oli perusteltua.

. Affymetrix tiedot osoittavat NuMA yli-ilmentyminen 6 munasarjojen solulinjoissa (JAMA-2, IOVE (ylimääräinen kuolemattomaksi munasarjojen epiteelin solulinja), SKOV-3, TR175, OVCA-433 (lisäksi) ja 1847 (kaikki harmaat palkit, nimetyt CL) , 38 näytteitä ensisijaisen viljeltyjen solujen askiittinesteestä (mustat palkit, nimetty – A, mukaan lukien joitakin näytteitä peräkkäisillä kokoelmia tai kohdat) ja 4 primaariviljelmiä perustetaan kasvainkudoksen (nimetty T1 ja – T4). A1, A2 ja A4 ovat kasvainkudoksessa (T1, T2, T4), joka liittyy askites näytteitä. intensiteetti arvot, jotka on saatu näytteistä normalisoitiin sisäinen kontrolli (normaali munasarjan epiteelin kudosten (N)), ja geeni-ilmentymisen tasot esitetään suhde intensiteetin taso /valvoa intensiteetin taso kuten log 10 arvo. B. NuMA tasoilla solulysaateista. edustava esimerkki lysaatit analysoitiin NuMA ilmentyminen slot blot Musta asterix osoittaa munasarjojen solulinjoissa (1847 TR175, JAMA-2), ruskea Asterix neuroblastoomasolulinjasta SH- SY5Y, vaaleanpunainen Asterix paksusuolen adenokarsinoomasolulinjan SW480, sininen Asterix kohdunkaulan syöpäsolu HeLa, ja keltainen Asterix rintasyövän MCF7. Kaikki muut näytteet ovat lysaatit munasarjojen primääriviljelmien. C. Histogrammi verrataan NuMA tasoilla munasarjojen solulinjoissa, ensisijainen solulinja on johdettu hyvänlaatuinen gynekologinen sairaus (1153-A1) ja primaariviljelmiä jälkeen normalisointi vastaan ​​α-tubuliinin. D. § normaalin (N) munasarjojen epiteelin ja strooman kudosten ja Hyväksytty munasarjasyöpä (Ca) on x10 ja x40 suurennus jälkeen NuMA immunovärjäyksen. Nuolet osoittavat epiteelisolujen. Alempi tai keskiasteen ydinvoiman NuMA värjäys voidaan nähdä normaalissa epiteelisolujen, korkeasti ydinvoiman NuMA värjäytymistä munasarjasyöpä epiteelisolujen. E. Analyysi pienen munasarjojen TMA osoittaa NuMA värjäytymisen intensiteetti kasvaa arvosana munasarjojen kasvainkudoksessa.

Slot pyyhkinyt

Yhteensä 35 näytettä analysoitiin slot blottauksella. Tämä ryhmä koostui 7 Pysyvien solulinjojen (JAMA-2, TR175 1847, SW480, MCF-7, HeLa ja SH-SY5Y), yksi hyvänlaatuinen näyte (1153-A1) ja 25 primääriviljelmien. Lysaatit saatu 2 munasarjakasvain kudosten kasvattaa kudosviljelmässä (BE4163-T1 ja AQ70880-T1) on myös mukana. Edustava esimerkki slot blot kuva joidenkin näytteiden esitetään kuviossa 1B. Normalisointi vastaan ​​sisäinen α-tubuliinin ohjaus vahvistivat, ettei vaihtelua NuMA proteiinin tasojen testatuista näytteistä (kuvio 1 C). Niistä solulinjat 1847 oli korkein NuMA ilmentymistaso, jonka jälkeen TR175 ja JAMA-2. Hyvänlaatuinen näyte 1153-A1 oli keskipitkän NuMA tasolla vaikka oli vaihtelua joukossa ensisijainen askites viljelmien 3 (1141-A1, 1134-A1 ja AE6792-A1) ilmentävät korkeimmat NuMA tasot kaikista näytteistä. Mitään merkittävää assosiaatiota NuMA immunoblottaus tulokset ja siihen liittyvät kliiniset tiedot nähtiin. Vakuuttavan, NuMA proteiinin tasot yleensä vastasivat hyvin RNA ekspressiotasot nähty ensisijaisen kulttuurien ja munasarjojen solulinjoissa tutkittiin Affymetrix mikrosiruanalyysillä.

immunohistokemia

Immunovärjäys osoitti, että NuMA ilmaisun kokonaisia normaalin munasarjakudoksen oli vaihteleva, jotka vaihtelevat hyvin pieni heikko tasolle strooman ja epiteelin solujen ytimet (n = 7) (kuvio 1 D). Jotta 5 tapauksessa normaalin kudoksen kanssa liittyy kasvainkudoksen, selvästi kasvanut NuMA ilmentymistä 40% (2/5) kasvaimen näytteen tunnistettiin. Jopa 95% ydinten primaarikasvainten näytetään keskisuuria tai suuria NuMA värjäyksen (kuvio S1a-d). NuMA havaittiin myös karan navat mitoosi kasvainsolujen (kuvio S1B, nuoli). Analyysi pienen talon luotu munasarjasyövän TMA paljasti, että 95% tuumorisolujen tumat positiivisesti värjättiin NuMA 24 25 ydintä. Silmiinpistävän, analyysi tiedoista soveltamisen jälkeen pisteytysjärjestelmää, jossa jaetaan näytteet alhainen NuMA (kaikki negatiiviset, erittäin heikko ja heikko tulokset) ja korkea NuMA tason (medium ja huipputuloksia) osoittivat, että korkea NuMA tasot havaittiin vain aste 3 kasvaimet (33%, kuvio 1E). Värjäys suurempi munasarjojen TMA vahvistetaan matalan ja korkean NuMA ilmaisun joukossa ytimet (kuvio 2). Alustava analyysi yleisen tietojen riippumatta syövän alatyypin osoitti, että korkeat NuMA pinta nousi kanssa kasvaimen (20,3% luokan 1 kasvainten 24,1% luokan 3 kasvaimia,

p

= 0,0016) ja sairauden vaihe (an nousee 19,6% vaiheen 1-33,3% vaiheessa 4,

p

= 0,0077) (tuloksia ei ole esitetty). Analyysi jatkuvan tietojen kasvaimen ja sairauden vaihe, johon sisältyi osa-alue osaksi syövän tyypit, joita riittävästi tietoja oli saatavilla (vakavasta, mucinous ja endomet-), osoitti, että NuMA ilmaisu korreloi yhä arvosana mucinous alatyyppi (

p

= 0,009) (kuvio 3A). Merkittävä korrelaatio imusolmuke osallistuminen (

p

= 0,03) (kuvio 3B) ja ikä (

p

= 0,04) (kuvio 3C) nähtiin kaikki alalajit. Edelleen tulosten analysointi koska epäjatkuva tiedot (matala NuMA vs korkea NuMA) paljasti lisäksi tilastollisesti merkitseviä. Osuus näytteiden korkean NuMA laskivat arvosanalla (

p

= 0,02) (kuva 3D) ja nousi myöhään taudin vaiheessa vakavien EOC (

p

= 0,04) (kuvio 3E) . Vuonna mucinous EOCs, NuMA pinta nousi arvosanalla (

p

= 0,005) (kuvio 3F). Loppuvaiheen endomet- EOCs, NuMA ilmaisu vähentynyt (kuvio 3G) ja korkea NuMA laski kasvu kasvaimen invaasiota tila (

p

= 0,03) (kaikki alatyypit) (kuvio 3H). Alhainen NuMA ilmentyminen havaittiin koko otoksen väestöstä 13 selkeitä solun EOCs riippumatta taudin vaiheessa.

alhainen ja korkea NuMA värjäyskuviot havaittu porausnäytteistä vakavien, mucinous, kohdun limakalvon ja selkeä solukarsinoomat suuressa mittakaavassa munasarjojen TMA. Suurennus x10.

. Tilastollinen analyysi suurten munasarjasyöpä TMA osoittaa NuMA ilmaisun kasvaa taudin vaiheessa mucinous alatyyppi. B. NuMA ilmentyminen liittyy imusolmuke osallistuminen (T3cN1MO) (kaikki alalajit). C. NuMA ilmentyminen liittyy potilaan iän (kaikki alalajit). D. Korkea NuMA vähenee kasvaimen sisään vakavien alatyyppi. E. Korkea NuMA arvot liittyvät vaihe 4 taudin vakavasta EOCs. F. Korkea NuMA tasoilla kasvaa kasvaimen sisään mucinous EOCs. G. Korkea NuMA tasojen lasku sairauden vaiheessa endomet- EOC. H. Korkea NuMA tasoilla vähenee kasvaimen invaasio asema (T1-T3) (kaikki alalajit).

Immunofluoresenssikoe Analyysit

IF analyysi paljasti olemassaolosta interphase ydinvoiman NuMA värjäyskuvion vuonna kaikki solulinjat, yksi ensisijainen kulttuurin mukautettu solulinja (GYNA0089) ja 23 primaariviljelmiä (kuvio 4A, B). Mitoosissa NuMA löydettiin karan navat (kuvio 4C) kaikissa solulinjoissa ja primääriviljelmien tutkittiin. Riittävästi mitoosi solujen tarkempaa analysointia varten havaittiin 16 ensisijainen kulttuureissa. Näiden näytteiden jakautuvia soluja tutkittiin mitoosi pysähdyspaikkojen ja spesifisten mitoottisten vikoja. Lopuksi tutkimus interphase indikaattorien Aneuploidian tehtiin kaikissa näytteissä.

. Esimerkkejä interphase ytimet alhainen (a-d) ja korkea (e-h) NuMA tasoilla, ja mitoosi karan alhainen (i-l) ja korkea (m-p) NuMA tasot karan pylväät. Green – NuMA, red – a-tubuliinia, sininen – DAPI. Asteikko bar = 5 um. B. Histogrammi vertaamalla NuMA ydin- fluoresenssin värjäytymisvoimakkuuksia neljä munasarjojen solulinjoissa, yksi solulinja perustettiin primäärisestä viljelmästä (GYNA0089) ja 23 saatuja primääriviljelmiä askiittinesteestä. C. Histogrammi verrataan NuMA värjäytymisvoimakkuuksia karan sauvojen osajoukko solulinjojen ja kulttuureissa, joissa riittävä määrä mitoosi soluja analysoitavaksi.

värjäytymisvoimakkuuksia erosivat keskuudessa näytteet (kuva 4). Todettiin, että jotkin näytteet koostuvat solujen alhainen NuMA värjäytymistä interfaasivaiheessa ytimet ja sukkularihmaston navat (kuvio 4A, a-d ja i-l, 4B, C) ja jotkut näytteet koostuvat soluista korkealla NuMA värjäys intensiteetit (kuvio 4A, e-h ja m-p; kuvio 4B ja C). Totesimme myös, että kunkin näytteen erosivat suhteen solujen osuus kussakin mitoosivaiheessa, ja että niillä oli monenlaisia ​​mitoottisten vikoja. Näitä olivat metafaasissa vikoja, kuten kolminapainen ja moninapainen karan (kuvio 5A, a-d) ja karan siirtymä (kuvio 5A, e); anafaasia vikoja, kuten jäljessä kromosomeja ja kromosomaalinen sillan (kuvio 5B, a-c); ja cytokinetic vikoja, mukaan lukien kromatidin sillan ja sukupolven epätasaisesti kokoinen tytärsolujen (kuvio 5C, a-d). Binucleation, multinucleation ja mikrotumien olivat yleisiä puutteita interfaasivaiheessa soluissa (kuvio 5D, a-c). Esimerkit kuvassa 5E olivat yleisimpiä mitoosi virheitä havaitaan.

. Mitoosi viat havaittiin metafaasivaiheeseen mukana (a) epäsymmetrinen bipolaarinen karat (b) useiden kara pylväät, (c) kolminapaisena karat, (d) kaksisuuntainen karat useita kara navat (e) solujen väärässä paikassa ja vinossa karat (solu periferia hahmoteltu). B. Mitoottisilla viat havaittiin Anaphase mukana laahaavat kromosomeja ja Anaphase sillan (-C). C. Mitoottisilla vioista telofaasin aikana hitaasti liikkuvista ja sytokineesiin sisältyvät (a) epänormaali karat, (b) epänormaali sytokineesiin mikrotumia muodostumiseen, (c), kromatidin sillan ja (d) muodostuminen epätasaisesti kokoinen tytär soluja. D. Esimerkkejä (a) binucleation, (b) multinucleation ja (c) mikrotumia ensisijainen kulttuureissa. Green – NuMA, red – a-tubuliinia, sininen – DAPI kaikissa paneelit. Asteikkoviiva A ja B = 5 pm. Asteikkoviiva C ja D = 10 um. E. Piirakkakuvio havainnollistaa yleistä taajuus mitoosi puutteita havaittiin ensisijaisen kulttuureissa.

vertailu NuMA värjäytymisen profiilien mitoottisiin tietojen suoritettiin. Korkea NuMA interfaasivaiheessa tumat merkitsevästi yhteydessä pieni osa soluja telophase (

p

= 0,012) ja suuri osa soluista näyttää löysä metafaasivaiheeseen levyn (

p =

0,032 ) (kuvio 6A ja B). Korkea NuMA at sukkularihmaston napojen korreloi merkitsevästi korkeat binucleation (

p =

0,021) ja multinucleation (

p =

0,007) (kuvio 6C ja D) ja jälleen löysä metafaasissa levyt (

p =

0,041) (kuvio 6E). Alhainen NuMA karan navat korreloi merkitsevästi suuri osa soluista sytokineesin (

p =

0,05) (kuvio 6F). Mielenkiintoista, väliportaan NuMA at karan navat korreloi merkitsevästi alhainen virhenopeuksia sytokineesiin. (

p =

0,01) (kuvio 6G). Edelleen todentamiseksi tiedot havaitusta immunofluoresenssianalyysillä ensisijaisen viljelmistä me immunovärjättiin kokonaisia ​​kiinteän kasvaimen kudoksen 23 potilasta, joiden askites nesteitä käytettiin tuottamaan viljelmiin. Tämä vahvisti, että kiinteiden kasvainten korkealaatuisesta NuMA värjäys syntyy ensisijaisesti askites kulttuureissa, joissa solut näytetään korkean NuMA ekspressiotasot (kuvio S1 a-d). Sen varmistamiseksi, että havaitut välivaiheen ja mitoosin vikoja oli myös yhteinen piirre liittyy kasvaimen kudokset analysoitiin 23 tuumorisektioiden käytettävissä meille NuMA immunovärjäyksellä ja H & E-IHC värjäystä. Totesimme, että sama välivaiheen ja mitoosin vikoja oli läsnä näiden kasvainten kuten askites näytteissä. Kuvat ovat ja yhteenveto vioista joukossa näytteitä kuvassa S2A-D. Lisäksi soluviljelmissä, joilla on korkea mitoosi-indeksi todettiin näyttämään korkea mitoosi aktiivisuus liittyy kasvainkudoksessa (kuva S3). Lopuksi tutkimme suhdetta NuMA ekspressiotasot primääriviljelmissä ja potilaan selviytymistä. Tämä viittaa siihen, että potilailla, joilla on kohtalaista tai voimakasta NuMA immuunivärjäystä klo karan navoista primääriviljelmissä on pienempi eloonjäämisaste kuin potilailla, joilla on heikko NuMA immunovärjäystä, vaikka tämä ennakkotieto ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä (kuva S4), ehkä johtuu alhainen otoskoko.

Strong ydin- NuMA ilmentyminen liittyi (A) alin osuus telophase solujen ja (B) eniten solujen diffuusin metafaasissa levy. Vahva NuMA sukkulan napojen merkinnät liittyi korkeat (C) binucleation, (D) multinucleation, (E) hajanaisena metafaasin levy ja (F) alin osuus solujen sytokineesiin. (G) Intermediate sukkulan napojen värjäytyminen liittyi pienin osuus solujen osoittaen sytokineesiin vika. (H) FACS-analyysi paljasti, että vain solut, joilla on korkea NuMA olivat aneuploidi.

FACS

FACS-analyysi osoitti, että vain solut primäärisistä viljelmistä korkea NuMA sukkulan napojen värjäytymisvoimakkuuksia olivat aneuploidi (kuvio 6H), tilastollisesti merkitsevä havainto (

p =

0,008).

keskustelu

tässä tutkimuksessa tarkasteltiin,

NuMA1

ilme in EOC ja suhteuttaa tämä aneuploidiaa löytyy tässä syöpätyypin. Ensimmäinen Oncomine haku osoitti, että NuMA ilmentyminen on yliaktiivista EOC. Pilot tuottamien tietojen Affymetrix profilointia ehdotti myös, että

NuMA1

ilmentymistä yläreguloituja munasarjasyöpä. Olemme vahvistaneet tämän havainnon proteiini tasolla IHC totesi, että ydinaseiden NuMA oli läsnä vähäisinä määrinä ytimet normaalin munasarjan strooman ja epiteelin taas munasarjan primaarikasvainten oli kohonneet NuMA tasoilla. Korkea NuMA liittyivät kasvaimen, sairauden vaiheessa ja imusolmuke osallistuminen ja käänteisesti kasvaimen invaasio. Kuitenkin NuMA ilmaisu erosivat neljän suuren EOC alatyyppiä. Kun taas NuMA laskivat jossa kasvaimen ja lisääntynyt tauti vaiheessa vakavien alatyyppi, he kasvoi kasvaimen vuonna mucinous alatyypin ja laski sairauden vaiheessa endomet- alatyyppi. Kirkkaissa solun alatyyppiä vain vähäistä NuMA havaittiin. Nämä erot heijastavat todennäköisesti molekyylitason heterogeenisyys EOCs. Äskettäin EOCs on luokiteltu uudelleen niiden molekyylitason piirteitä tyypin I (huono laatu vakavien, huono laatu endomet-, kaikki mucinous ja selkeä solu karsinoomat) ja tyypin II (high grade serous ja endomet- karsinoomat) mutaatioita pääasiassa

KRAS

ja

PTEN

tyypin I ja mutaatioita

TP53

tyypin II [25], [26]. NuMA tasot tutkimuksessamme olivat korkeimmat tyypin I EOCs (huono laatu serous ja mucinous syövät), mikä viittaa siihen, NuMA yliekspressio voi olla varhainen tapahtuma karsinogeneesissä.

pahanlaatuiset solut ovat peräisin askites nesteitä on käytetty menneisyydessä tuottaa runsaasti tietoa immunologian ja terapeuttisia EOC ja on ehdotettu, että niiden käyttö voi täydentää perinteisiä diagnostisia menettelyjä [27]. Täällä, IF tutkimus primääriviljelmien sallitut uudenlainen ja yksityiskohtainen tarkastelu todisteita aneuploidia- kautta tunnistaminen sekä yksittäisiä mitoosi vikoja ja interphase seuraukset vikoja. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että korkeat NuMA tasot karan pylväät olivat yhteydessä korkea binucleation ja multinucleation. Kehittäminen tetraploidy seurauksena ei sytokineesin on potentiaalinen varhainen tapahtuma kehittämiseen kromosomaalisen epävakauden (CIN) ja lopulta aneuploidi karyotyyppejä tuumorisoluissa [10]. Mitoosi viat, jotka havaitsimme meidän ensisijainen kulttuureissa, kuten moninapainen karat ja vikoja sytokineesi, voisi selittää ilmaantuvuus binucleated ja monitumaiset solut näistä näytteistä. Tämän mukaisesti olemme löytäneet myös tilastollisesti merkitsevä korrelaatio aneuploidian ja korkeita NuMA at karan navat meidän kulttuureissa.

Todettuaan, että NuMA proteiini tasot yläreguloituja EOC ja että tähän liittyy aneuploidia-, seuraava askel on määrittää toiminnalliset rikoskumppanuuden NuMA kehittämisessä tämän aneuploidia-. Työtä muut tutkijat ovat osoittaneet, että ehtolauseke NuMA Hiirten myeloidisolulinjassa tuloksia aneuploidian ja apoptoosin [28]. Ehdotettiin, että NuMA yliekspressio ei yksin riitä ajaa pahanlaatuisen muutoksen leukemiasoluja, mutta että se saattaa osaltaan kromosomaaliseen epävakautta, jolloin geneettisiä tapahtumia edistää solusyklin etenemisen tai suojaa apoptoosin tapahtua. Yksi tällainen tapahtuma voisi olla hankinta p53 mutaatioita, kuten havaitaan korkealaatuisesta serous karsinoomien [29]. Vaihtoehtoisesti NuMA vuorovaikutuksessa moottorin proteiini dynein mitoosin aikana ja on ehdotettu, että kyllästymistä dynein aktiivisuuden NuMA yli-ilmentyminen saattaa antagonisoida polkuja, jotka syöpäsolut käyttävät ratkaisemaan ongelmia, kuten moninapaisen karat. Nämä tyypillisesti johtuvat läsnäolosta ylimääräisistä sentrosomien, mikä johtaa kasvuun perimän epävakaisuuden vetämänä vioista mitoosin [30]. Tämä hypoteesi voidaan soveltaa EOC koska biologinen seuraukset moninapaista solunjakautumisten ovat yhdenmukaisia ​​havaitut tulokset meidän immunofluoresenssimenetelmällä työssä. Centrosomal vahvistus on myös aiemmin todettu EOC soluissa ja on yhdistetty aneuploidian ja huono potilaan lopputulokseen vakavasta EOC. Tämä ilmiö näyttää johtuvan yliekspressio Aurora-A, joka kuuluu seriini /treoniini-kinaasi perhe osallistuu mitoosi tapahtumat [31], [32].

Tuumoriantigeenia akrosiini sitoutuva proteiini (ACRBP) /OY-TES-1, on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa NuMA. Yhteistyösopimus riippuva suhde rooli paklitakselin resistenssin EOC on ehdotettu [33]. NuMA yliekspressio ehdotettiin aiheuttavan mitoottisiin häiriöitä tarvitaan plastisuus preneoplastinen genomin, jossa yhteistyössä kehittyvä yliekspressio ACRBP kuten kasvainten edistyy ajo hankinnan piirteitä normalisoimiseksi näiden varhaisten häiriöiden joka voisi muutoin olla haittaa syövän solujen lisääntymisen edistämällä mitoottisiin katastrofi. Samassa tutkimuksessa kävi myös ilmi, että useimmat aggressiivinen tauti joukossa kohortin EOC potilaista oli yhteydessä yhdistettiin korkea ACRBP ja NuMA. Mahdollisuus, että NuMA yliekspressio vaikuttaa synergistisesti Aurora-A- ja ACRBP yli-ilmentyminen edistää aneuploidian, huono selviytyminen ja chemoresistance in EOC on kiehtova ja ansaitsee lisätutkimuksia. Osana tätä, alustavien tulosten mukaan NuMA ilmaisu arvot liittyvät selviytymisen EOC tutkitaan edelleen laajemmassa Näytejoukolla onko tämä ilmiö on tilastollisesti merkitsevä.

Yhteenvetona tietomme osoittavat varten ensimmäistä kertaa NuMA yliekspressoituu EOC ja että korkeat NuMA tasot korreloivat lisääntynyt mitoosi vikoja ja aneuploidiaan askites johdetut viljelmät Munasarjasyöpäpotilaiden kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja Primary Cultures pahanlaatuisia soluja Johdettu munasarjojen Vesivatsa- Nesteet

solulinjat käytetään tässä projektissa mukana neljä munasarjasyövän solulinjoissa (JAMA-2, SKOV-3, TR175 ja 1847), yksi neuroblastoomasolulinjasta (SH-SY5Y) yksi paksusuolen adenokarsinooman solulinja (SW480), yksi kohdunkaulan syövän solulinja (HeLa) ja yksi rintasyöpäsolulinja (MCF7). Solulinjat saatiin Cancer Research UK, ECACC ja ATCC Cell Biology Collection. Ensisijainen peräisin olevien solujen viljelmiä munasarjojen askites- nesteitä (GYNA0089), munasarjojen kasvainten kudokset (BE4163-T1 ja AQ70880-T1) tai hyvänlaatuisia kasvaimia (1153-A1) määritettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [18]. Potilaan tiedot ja kliiniset tiedot munasarjojen askites nesteet on kuvattu aiemmin [18].

Normal munasarjojen ja Kasvainten Tissue

patologiset näytteet formaliinia, parafiiniin upotetut kudokset koostuvat osien normaalista munasarjan kudosten ja ensisijainen kasvaimet (mukaan lukien kasvaimia, jotka tuotti askites, josta primääriviljelmistä olivat valmiit) saatiin St Jamesin University Hospital histopatologian Archive, Leeds. Seitsemän normaaleissa kudoksissa oli saatavilla, joista 5 oli myös liittyy kasvaimen näytteitä. Yhteensä 23 tuumorikudosten Matching johdettuja primäärisiä viljelmiä pahanlaatuisten solujen saatiin. Lisäksi 25 etuyhteydetöntä primääri munasarjojen kasvaimia, joihin liittyy kliinisiä tietoja, ja näitä käytettiin luoda in-house mini kudos microarray (TMA). TMA koostuu 9 vakavien adenokarsinoomat, 6 endomet- karsinoomat, 2 mucinous, 2 sekoitettu MUllerin, 5 sekoitettu vakavasta ja endomet-, ja 1 adenokarsinooma. Korkea tiheys munasarjasyöpä TMA koostuu 280 tapausta munasarjan adenokarsinooma (vakavasta, mucinous ja endomet-), 13 kirkas cell carcinoma, yksi siirtymävaiheen karsinooma, 20 viereiseen normaaliin kudokseen ja 8 normaaleista kudoksista kahtena vaiheen ja arvosana tietoja, saatiin alkaen Tissue Array Networks (OV6161, Tissue Array Network). Oheisiin sisältämän kliinisen tiedon potilaan ikä, imusolmuke osallistuminen, kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden.

potilastietojen

Associated kliiniset tiedot potilaille, joille primaariviljelmiä pahanlaatuisten solujen peräisin munasarjojen Askitesneste perustettiin, kuvattiin aiemmin [18].

Affymetrix Profilointi

Data munasarjojen solulinjoissa primääriviljelmissä ja liittyvät tuumorinäytteissä haetaan geeniekspressiovektoria mikrosiruanalyysi, tuotettu GeneChip- HG-U133 Plus 2.0 Arrays (Affymetrix), joka oli normalisoitu MAS 5,0, kuten aiemmin on kuvattu [18].

Vasta-aineet

NuMA monoklonaalinen vasta-aine Ab-2 (klooni 107-7, Calbiochem) käytettiin koko tämän tutkimuksen . Tämä on aikaisemmin laajalti käytetty Western-blottauksella, immunofluoresenssilla ja IHC [19], [20]. IF tutkimukset rotan anti-α-tubuliinin vasta-aineella (1/500, MCA77G, Serotec) käytettiin tunnistamaan mikrotubuluksiin ja 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI 5 ug /ml, Sigma-Aldrich), jota käytetään värjäämiseen DNA .

Slot pyyhkinyt

Slot blottaus solulysaateista suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18]. 0,01 mg näytettä laitettiin jokaiseen kuoppaan ja NuMA monoklonaalinen vasta-aine Ab-2: tä käytettiin 1/400 laimennus.

TMA Hakemisto Rakentaminen

luomista in-house munasarjojen TMA protokolla kuvataan Abd El-Rehim

et al

[21] jälkeen. Manuaalinen kudos ryhmittäjällä lyöntejä, jonka halkaisija on 0,6 mm (Beecher Instruments, Inc.) käytettiin luomaan ydintä.

immunohistokemia

Kalvot, jotka sisältävät kokonaisia ​​tai TMA ytimet blokattiin 3% H

2O

2 metanoli jälkeen de-vahaus ja nesteytys. Antigeeni haku suoritettiin painekypsentämällä diat 2 minuuttia antigeenin paljasten Solution (alhainen pH, Vector Laboratories). Kolmen 5 minuutin pesua TBS-Tween-20 (0,2%), levyt blokattiin 10 minuutin ajan 10 x kaseiinia (Vector Laboratories) laimennettuna 1:02 tislattuun veteen. Kolmen 5 minuutin pesua TBS Tween-20 kalvot sisältäviä kokonaisia ​​sijoitettiin Shandon sequenzer yksiköissä taas dioja sisältäviä TMA kohdat luotiin tasainen sisällä kosteutetussa inkubointikammiossa inkuboida ensisijaisen vasta-aineen. NuMA vasta-aine Ab-2 laimennettu vasta-liuosta (Zymed) levitettiin 1/300 varten kokonaisia ​​ja 1/100 varten TMA dioja. Leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Kolmen pesun jälkeen 5 minuutin ajan, kukin TBS-Tween-20 kalvot inkuboitiin 100 ul: ssa HRP kanin /hiiren REAL ™ EnVision ™ (DAKO) 30 minuuttia sequenzer yksiköitä tai inkubaatiokammio. Kolmen lopullisen pesun TBS 5 minuuttia, kehitinliuosta (DAB + kromogeenina /substraattipuskuria, DAKO) lisättiin jopa 10 minuuttia kunnes väri kehittyi täydellinen. Värjäys tehostettiin 0,5% CuSO 4 (0,9% suolaliuos) 5 minuutin ajan. Sen jälkeen counterstaining in hematoksyliinillä 2 minuuttia, leikkeet dehydratoitiin ja asennettu DPX (Sigma). TMA kuvat skannattiin ja analysoitiin Aperio ImageScope Viewer ohjelmalla. Dioja sisältäviä kokonaisia ​​näytettiin Olympus BX61 mikroskoopin Colourview kameralla ja CellP® ohjelmistoja. Merkintävaatimukset pisteytysjärjestelmä, jota sovellettiin kaksi pisteytys kriteerit, käytettiin [22]. Ensimmäinen määrä värjättyä tumat laskettiin ja ilmaistiin prosenttiosuutena kokonaismäärästä ytimien kudoksen sisällä osan tai ydin. Toiseksi hallitseva ydinvoiman ilmaisua intensiteetti pisteytettiin 0 – mitään värjäytymistä, 1 – jäljittää, 2- heikko, 3- keskipitkän ja 4- vahva. Lopullinen pistemäärä laskettiin prosenttiosuutena värjättyä ytimien kerrottuna hallitseva ilmaisun intensiteettiä.