Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on tappava tauti, ja uusia terapeuttisia tavoitteita tarvitaan kiireesti. Olemme aiemmin tunnistettu DNA monistaminen 7q21-q22 haimasyövän solulinjoissa. Nyt korkean resoluution genomisen profiloinnin ihmisen haimasyövän solulinjoissa ja ihmisen kasvaimissa (Siirto tehty immuunivajaissa hiirillä rikastuttaa syövän epiteelin jae), määritellään 325 Kb minimaalinen amplikoni virittävä

SMURF1

, E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla ja tunnettu negatiivinen säätelijä transformoivan kasvutekijän β (TGFli) kasvua estävän signalointi.

SMURF1

monistaminen vahvistettiin ensisijainen ihmisen haimasyöpä fluoresenssilla

in situ

-hybridisaatio (FISH), jossa 4 95 tapauksessa (4,2%) oli vahvistusta. RNA häiriöitä (RNAi), knockdovvn SMURF1 ihmisen haimasyövän linjassa polttoväli vahvistus (AsPC-1) ei muuttanut solujen kasvua, mutta vähentänyt solujen invaasiota ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Kiinnostavaa kyllä, tämä vaikutus ei välittyvät muuttunut TGFli signaloinnin, analysoitiin transkription toimittaja. Lopuksi, yliekspressio SMURF1 (mutta ei katalyyttisen mutantti) johti kontakti-inhibition menetys NIH-3T3-hiiren alkion fibroblastisoluissa. Yhdessä nämä havainnot tunnistamaan

SMURF1

kuin monistettu onkogeenin ajo useita tuumorigeenisia fenotyyppien haimasyöpä, sekä antaa uuden druggable tavoite molekyylirakennetta terapiasta.

Citation: Kwei KA, Shain AH, Bair R, Montgomery K, Karikari CA, van de Rijn M, et al. (2011)

SMURF1

Amplification Edistää invasiivisuus in Haimasyöpä. PLoS ONE 6 (8): e23924. doi: 10,1371 /journal.pone.0023924

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 14 joulukuu 2010; Hyväksytty: 01 elokuu 2011; Julkaistu: 22 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Kwei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta NIH: CA112016 (JRP), CA09151 (KAK), GI Cancer SPORE CA62924 (AM); NIH /NCRR CTSA myöntää UL1 RR025744 Stanfordin Spectrum; ja Lustgarten Foundation (J.R.P.). M.D.B. tuettiin osittain jota Biotechnology ulkomailla associateship päässä Department of Biotechnology, Ministry of Science and Technology, Intian hallitukselle. Kirjoittajat myös kiittää perheen Margaret Lee ja Sol Goldman Haimasyöpä Research Center tukemiseksi ksenografti ponnisteluja Johns Hopkins. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

haiman adenokarsinooma (jäljempänä, haimasyöpä) on lähes aina kuolemaan, on viiden vuoden pysyvyys on alle 5% [1]. Usein levitetään diagnoosin, ja voi etäispesäkkeitä laajalti. Varhainen havaitseminen voi parantaa selviytymistä, mutta kirurginen resektio on harvoin parantava [2]. Haimasyöpä on myös pitkälti vastustuskykyinen tavanomaisille kemoterapiaa. Siksi uusien hoitomuotojen tarvitaan kiireesti. Erityisen, on tärkeää löytää ja vahvistaa uusia päämääriä molekyylirakennetta terapiasta.

Molekyyligenetiikan haimasyövän ovat osittain tunnettuja [3], [4]. Somaattisten aktivoivat mutaatiot

KRAS

(joskus esiintyy geenien monistuminen) löytyy 90% haiman syövät. Yleisiä ovat myös inaktivoivat mutaatiot /deleetioita tuumorisuppressoreilla

CDKN2A

( 95% syövistä),

TP53

(50-75%), ja

Smad4

(myös tunnettu

DPC4

) (55%), joka on efektori TGFp-välitteisen kasvun esto. Muut geenimutaatioita, kukin esiintyy alle 5% syövistä, vaikutukset nämä ja muut keskeiset syövän signaalinvälitysreittien [5].

Perimän profilointi tutkimuksilla, array-pohjainen vertaileva genominen hybridisaatio (array CGH), ovat alkaneet kuvastoon DNA monistuksia ja poistot, paikallistaa ja paljastavan romaanin haimasyöpä geenejä (esim [6], [7]). Joukossa muuttunut loci, me ja muut aikaisemmin tunnistettu 7q21-q22 alueeksi toistuvasti monistettiin haimasyövän [8] – [13]. Täällä kapea että lokus, ja luonnehtia SMURF1 kuin onkogeenituotetta edistää solujen invaasiota ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua.

Tulokset

SMURF1

on fokaalisesti monistetaan haimasyövän

aiemmin tunnistettu toistuva vahvistus klo 7q21-q22 haimasyövän solulinjoissa käyttäen CGH on cDNA mikrosiruja [12]. Edelleen rajata amplikonin, ja paikantaa asukas onkogeenin (s), olemme nyt suorittaa ylimääräisiä genomista profilointi kokoelma 22 haimasyövän solulinjoissa ja 58 aikaisen passage haimasyöpä ksenograftien, käyttämällä korkean resoluution 244K Agilent CGH taulukot. 7q21-q22 lokus fokaalisesti monistettiin (kasvain /normaali suhteet 3-kertainen) 1 22 (4,5%) solulinjoja (AsPC-1) ja 1 58 (2%) ksenograftit. Sisältää alemman tason voitot (suhteet 1,3-kertainen), voitto /vahvistus ulottuu 7q21-q22 löydettiin 6 22 (27%) solulinjat, ja 19 58 (33%) ksenografteissa.

neljä yksilöitä (jäljempänä AsPC-1-solulinjassa, ja kolme ksenografteissa) oli genomista profiileja, jotka olivat erityisen informatiivinen rajoittavan amplikonin rajojen sisällä 7q21-q22 (Fig. 1A). Pienin yhteinen alue voitto kesti vain 325 Kb sisällä cytoband 7q22.1, ja sisälsi vain kaksi RefSeq [14] geenejä,

SMURF1

(Smad erityinen E3 ubikitiinipromoottori proteiini ligaasia) ja

KPNA7

( karyopherin alfa 7). SMURF1 on tunnettu estäjä TGFp signalointia (edistämällä hajoaminen sen reseptorin TGFβRI, ja signalointi sovittelija Smad4 [15], [16]), polku usein häiriintynyt haimasyövän. Koska ilmeinen yhteys haiman Karsinogeneesin siksi keskittyneet myöhemmin ponnistelunsa

SMURF1

.

(A) mahdollisimman vähän amplikoni määritellään neljä haimasyöpä yksilöt (AsPC-1 ja kolme -ksenografteja). Alkaen alhaalta: chr 7 ideogrammi; Heatmap DNA kopioluvun (punaisella gain) neljälle näytteet poikki 7q21-q22 alue (91-101 Mb); Sirontakuvaajaan DNA kopioluvun log

2 suhteet eri 7q21.3-q22.1 (96-100 Mb), peitetään cghFLasso [34] kutsutaan suhteet (punainen viiva); Kuvakaappaus vastaavan lokuksen päässä UCSC genomista selain. Katkoviivat puolin tutkimuksessa 325 Kb minimaalinen amplikonin, joka ulottuu

SMURF1

. (B)

SMURF1

on yli-ilmentynyt kun saadut /täydennetty. Rasiakuvaajien osoittavat 25

th, 50

th (mediaani) ja 75

persentiilin transkriptipitoisuuksissa (määritettiin Agilent 44K array) koekappaleissa (punainen) tai ilman (harmaa) 7q21-q22 vahvistus, sillä

SMURF1

ja sen lähin geeni naapureita. Huomaa,

KPNA7

ei ollut edustettuna jono. *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001 (Mann-Whitney U-testi). (C) FISH paljastaa

SMURF1

vahvistus perusterveydenhuollossa haimasyöpä. Näytössä on kolme haiman syöpiä

SMURF1

vahvistusta (

keskus

, ja

oikea

), yhdessä ei-monistettu ohjaus (BxPC3 soluja,

jäljellä

).

SMURF1

lokuksen anturi (punainen); ohjaus chr 7 sentromeeriantigeenin (CRP7) koetin (vihreä).

Yhdenmukainen onkogeenisessä rooli,

SMURF1

transkripti (mitattuna mikrosirujen) oli merkittävästi kohonnut solulinjoissa /ksenografteja kanssa 7q22 0,1 voitto /vahvistusta (kuten oli useita yhteistyön monistetaan lähialueiden geenejä) (Fig. 1 B). Arvioidaan

SMURF1

vahvistus perusterveydenhuollossa haimatuumorien, me myös suorittaa kalastaa kudoksen microarray sisältävän 105 haimasyöpä tapauksissa. Neljä 95 (4,2%) arviointikelpoisista tapauksista ilmeni

SMURF1

vahvistusta (locus /sentromeeriantigeenin suhde 2,5) (Fig. 1 C), verrattavissa meidän CGH havainnot varhaisen läpikulun ksenografteissa. Emme voineet tunnistaa sopiva vasta ja värjäys edellytykset arvioida SMURF1 ilmaisun immunohistokemiallisesti.

SMURF1

vahvistus edistää solujen invaasiota ja ankkurista riippumaton kasvu

Arvioida mahdollisia onkogeenisia toiminnot SMURF1, ensin käytetään RNAi pudotus SMURF1 ilmaisua asiayhteys geenimonistuman käyttäen AsPC-1-soluissa. Transfektio neljää erilaista pientä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t), tai uima neljän yhdessä, kukin vähentänyt SMURF1 proteiinin tasot (Western blot), verrattuna ei-suunnattu siRNA allas (Fig. 2A). Knockdovvn SMURF1 ei vaikuttanut solujen lisääntymistä mitattuna WST-1-määritys (Fig. 2B, C), ja BrdU (Fig. 2D), mutta johti merkittävästi vähentynyt soluinvaasion kautta Matrigel, mitattuna Boyden kammion määrityksellä (kuvio . 2E). Vähentynyt invaasio nähtiin kunkin neljän siRNA: iden kohdistaminen erillistä

SMURF1

sekvenssit, kun taas kasvu solujen pysyi ennallaan saman ajanjakson (Fig. 2C), tukee voimakkaasti erityistä roolia SMURF1 vuonna invasiivisuus fenotyyppi.

(A) neljä erilaista siRNA kohdistaminen

SMURF1

ja allas kaikkien neljän, vähentävän SMURF1 tasolle (Western blot) verrattuna ei-kohdistuksen ohjaus siRNA allas ). Jäljellä SMURF1 tasoilla, täällä normalisoida GAPDH, on merkitty. (B) SMURF1 taintumisen (käyttäen siRNA pool) ei vähennä solujen lisääntymistä /elinkelpoisuuden mitattuna WST1 määrityksen, ja tehdään kolmena kappaleena (keskiarvo +/- 1SD esitetty). (C) SMURF1 pudotus käyttäen neljää eri siRNA ei muuta solujen lisääntymistä /elinkelpoisuuden mitattava kolme vuorokautta transfektion. Tehty kolmena kappaleena (keskiarvo +/- 1SD esitetty). (D) SMURF1 Knockdown ei vähennä solusyklin etenemisen (S-vaihe), mitattuna BrdU (1,5 ja 4 tunnin pulssi merkinnät), tehty kolmena kappaleena (keskiarvo +/- 1 SD esitetty). (E) SMURF1 taintumisen (käyttäen siRNA poolin ja yksittäisen siRNA) estää soluinvaasiota kautta Matrigel. Boyden chamber määritys tehdään kolmena kappaleena ja korjattu kolme päivää transfektion jälkeen (keskiarvo +/- 1SD esitetty); *,

P

0,05 (Studentin t-testi). (F) SMURF1 Knockdown ei paranna TGFli polku välittämän transkription. AsPC-1-solut kotransfektoitiin siRNA: t ja p3TP-Lux reportteri, tehty kolmena kappaleena, ja tulikärpäsen /Renilla lusiferaasi suhdeluvut (keskiarvo +/- 1SD esitetty). Panc1 soluja (villityyppiseen

Smad4

) +/- TGFli toimii positiivisena kontrollina.

Koska sen tiedossa, antagonistiset funktio TGFli koulutusjakson, me myös pyrkinyt arvioida vaikutuksia of SMURF1 knockdown on TGFli signalointi, käyttäen TGFli reagoiva transkription reportteri (p3TP-Lux) [17]. Knockdovvn SMURF1 ei tehostanut TGFli reitin välittämä transkription AsPC-1-soluissa (kuvio. 2F). Huomionarvoista kuitenkin AsPC-1-soluissa (kuten useimmat haimasyöpä) satama mutatoitunut

Smad4

, tässä Smad4 (R100T) [18], tunnettu olisi inaktivoimalla [19], [20]. Siksi AsPC-1-solut todennäköisesti kykene on TGFp reitin transkription vastaus. Yleisemmin nämä havainnot viittaavat siihen, että pääasiallinen vaikutus (t)

SMURF1

vahvistus /yli-ilmentymisen todennäköisesti välittyvät väyliä erillisiä TGF signalointi.

arvioimiseksi pitkällä aikavälillä fenotyyppejä, myös vakaasti transfektoidut lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) kohdistaminen

SMURF1

. Vakaa knockdovvn SMURF1 in AsPC-1-soluissa, vahvistettiin Western blot (kuvio. 3A), vähensi ankkurointi riippumatonta kasvua (pehmeä agar pesäkkeet), verrattuna ei-kohdistaminen shRNA ohjaus (Fig. 3B).

(A) transdusoitu stabiilisti shRNA kohdistaminen SMURF1 johtaa vähentyneeseen SMURF1 tasoilla (Western blot) verrattuna ei-kohdistuksen ohjaus shRNA. Jäljellä SMURF1 tasoilla, täällä normalisoida GAPDH, on merkitty. (B) Stable SMURF1 Knockdown vähentää ankkurista riippumaton kasvu (eli pehmeä agar pesäkkeet). Pitoisuus tehdään kolmena kappaleena (keskiarvo +/- 1SD esitetty); *,

P

0,05 (Studentin t-testi).

Pyrimme myös arvioida vaikutuksia siRNA Knockdown muissa haimasyövän solulinjoissa. Valitsimme kahta solulinjaa, BxPC-3-soluja, jotka (kuten AsPC-1-soluissa ja useimmat haiman kasvaimia) on muuntunut

Smad4

(täällä homotsygoottinen deleetio) [21], ja Hs700T soluja, jotka ovat villityyppiseen varten

Smad4

ja on ehjä TGFli kasvua estävää reitin (Fig. S1). Erityisesti kumpikaan näistä linjat satamat polttoväli monistamiseen

SMURF1

(AsPC-1-solut ovat ainoat perustettu vastaamaan polttoväli vahvistus), eikä kohonneet SMURF1 proteiinipitoisuuden (Fig. 4A). Knockdovvn SMURF1 (validoitu Western blot, Fig. 4B) johti hieman pienentää soluproliferaation BxPC-3-solut (Fig. 4C), ja lisää niin TGFli-kasvua estävä reittiin ehjät Hs700T soluja (Fig. 4D). SMURF1 Knockdown johti myös pienempi soluinvaasiota in BxPC-3-soluissa (kuvio. 4E), mutta ei merkittävästi niin. Koska kuitenkin

SMURF1

ei ole fokaalisesti monistetaan eikä yli-ilmennetään näitä rivejä, yksinkertainen selitys discordant fenotyyppien (verrattuna AsPC-1) on, että SMURF1 ehkä toimi onkogeenisessä ohjainta näistä solussa yhteyksissä.

(A) Western blot -analyysi endogeenisen SMURF1 proteiinin tasot paneeli haimasyövän solulinjoissa. Huomaa, että SMURF1 ilmentyy voimakkaasti ainoastaan ​​7q22.1-monistettu AsPC-1-solulinjassa. Kaksi eri vastuita SMURF1 blot on esitetty; GAPDH toimii latauskontrollina. (B) Western blot todentaminen SMURF1 taintumisen (by SMURF1 kohdistamisen siRNA allas, verrattuna ei-kohdistuksen ohjaus siRNA pool) BxPC-3 ja Hs700T soluja. (C) Solulisääntyminen /elinkelpoisuus määritettiin (by WST-1) in BxPC-3-soluissa SMURF1 siRNA-välitteinen taintumisen (verrattuna ei-kohdistuksen ohjaus). Pitoisuus tehdään kolmena kappaleena (keskiarvo +/- 1SD esitetty); *,

P

0,05 (Studentin t-testi). (D) Solulisääntyminen /elinkelpoisuus määritettiin Hs700T soluissa, kuten edellä. (E) Cell invaasiota analysoitiin (by Boyden kammio) in BxPC-3-soluissa SMURF1 taintumisen (verrattuna ei-kohdistuksen ohjaus). Pitoisuus tehdään kolmena kappaleena (keskiarvo +/- 1SD esitetty). Huomaa, alennettu leviämisen havaittu SMURF1 Knockdown in Hs700T soluissa esti määrityksen solujen invaasiota (jossa hyökkäsi solujen määrä 72 tunnin vaikuttaa kaksinkertaistamalla kertaa).

Lopuksi täydentävät yli-ilmentyminen tutkimukset, transfektoimme

SMURF1

cDNA (ekspressoitu CMV-promoottori) NIH-3T3-hiiren fibroblasteissa. Yliekspressio SMURF1, vahvistettiin Western blot (kuvio. 5A), johtanut merkittävään kontakti-inhibition menetys (eli lisääntynyt polttopistettä), verrattuna vektorisäädön (Fig. 5B). Erityisesti, transfektio katalyyttisesti inaktiivinen mutantti SMURF1 (C699A) [22], ei vähentänyt kontakti-inhibition (Fig. 4B), mikä osoittaa, että tämä onkogeeninen aktiivisuus on riippuvainen E3 ubikitiini-proteiinin ligaasin aktiivisuuden SMURF1.

(A): n transfektointi SMURF1 cDNA tai katalyyttinen mutantti SMURF1 (C699A) (SMURF1

m), johtaa yliekspressio (Western blot) verrattuna tyhjän vektorin kontrolli. SMURF1 yli-ilmentyminen tasolla, normalisoitiin GAPDH, on merkitty. (B) SMURF1 (mutta ei SMURF1

m) yli-ilmentyminen NIH-3T3-soluissa johtaa kontakti-inhibition menetys (ts lisääntynyt pesäkkeitä muodostumista). Analyysit tehdään kolmena kappaleena (keskiarvo +/- 1SD esitetty); *,

P

0,05 (Studentin t-testi).

Keskustelu

Täällä ryhdyimme paikantaa ja löytää onkogeeni ajo 7q21-q22 vahvistus haimasyövän. Korkean resoluution genomista profilointi haimasyövän solulinjoissa ja varhaisen passage ksenografteissa määritteli 325 Kb minimaalinen amplikoni virittävä

SMURF1

. Transcript tasot

SMURF1

olivat koholla yksilöiden kanssa voitto /vahvistus, ja FISH varmistimme

SMURF1

vahvistus perusterveydenhuollossa haimasyöpä. Käyttämällä täydentävät lähestymistavat naistaintumisprosenttia (in fokaalisesti monistetaan AsPC-1-solut) ja yli-ilmentymisen (NIH-3T3-solut), huomasimme, että

SMURF1

vahvistus /yli-ilmentymisen ei muuta solujen lisääntymistä, mutta edistää solujen invaasiota, ankkurointi riippumattaman kasvua, ja kontakti-inhibition menetys, joista ainakin jälkimmäinen on riippuvainen sen katalyyttinen aktiivisuus.

SMURF1 oli aluksi kiehtova onkogeeni ehdokas, koska sen tiedetään olevan yhteydessä TGF signalointi. TGFp polku, ainakin alussa kasvainten kehittymiseen, on kasvu tukahduttava [23]. Normaalisti TGFp sitoutuu sen reseptoreihin (TGFβRI, TGFpRII), mikä johtaa fosforylaatioon signaalimuuntajia Smad2 /Smad3, joka sitten shuttle tumaan ja monimutkainen Smad4 välittäjänä transkription. Tärkeimmät transkription vasteiden induktio

CDKN2B

(p15Ink4b) ja

CDKN1A

(p21Cip1), ja tukahduttaminen

MYC

yhdessä johtaa G

1 solusyklin pidätys. TGFp kasvu tukahduttava polku on yleisesti häiriintyy haimasyövän, useimmiten mutaation kautta /poisto

Smad4

, mutta myös inaktivaation /tappio

TGFβRI

ja

TGFpRII

[ ,,,0],4].

SMURF1 on hect-domain E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla (E3 ubikitiinipromoottori ligaasit suorittaa kolmannessa ja substraattispesifisten askel proteiinia ubikitinaation). SMURF1 edistää tumasta TGFp estäjä Smad7 (lisäämällä sen saatavuutta), ja tuhoaminen TGFβRI ja Smad4 (kautta ubikinaa- välittämän hajoamisen) [15], [16]. Kaikki nämä toimet tulisi palvella antagonisoida TGF signalointi, ja yhdessä tarjota vahva perusta

SMURF1

vahvistus /yli-ilmentymisen haimasyöpä. Se oli huomattava silloin, että SMURF1 knockdown in AsPC-1-soluissa ei tehostanut TGFli-reitin transkriptio (joskin ehkä ole yllättävää, kun otetaan inaktivoiva mutaatio

Smad4

). Siksi kasvaimia synnyttävän toiminnan SMURF1 on toimittava ainakin osittain riippumatta sen toimintoja TGF signalointi (ainakin reitin tasolla Smad4). Tätä varten, SMURF1 on myös osoitettu liuottaa tiiviiden liitosten (hajoamisen RhoA) aikana epiteelin-mesenkymaalitransitioon [24], ja paikallisia tarttumista (hajoamisen taliini päätä) lisäävän solumigraation [25]. Lisätutkimukset tulisi selkeyttää keskeisiä SMURF1 alustoille liittyvät invasiivisuus ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua haiman syöpiä 7q22 vahvistus.

aikana edistyessä, kaksi muuta tutkimukset ominaista 7q21-q22 amplikoni haimasyövän. Suzuki

et al.

[26], jonka genominen profilointi solulinjojen tunnistaa amplikonin AsPC-1-soluissa, amplikonin huippu ulottuu 11 geenit. Edelleen keskityttiin kaksi geeniä,

TRRAP

ja

SMURF1

, merkittävästi koholla ilme, kun monistetaan. Kuitenkin toisin kuin tutkimuksessamme, he kertoivat, että knockdovvn SMURF1 esti AsPC-1 solujen lisääntymistä. Erityisesti vaikka ne arvioitiin vain yhden siRNA. Koska tuloksemme että neljä itsenäistä siRNA pudotti SMURF1 tasolla vertailukelpoisella ja laskivat invaasio vaikuttamatta solujen lisääntymistä, ehdotamme, että niiden havainto saattaa johtua epäspesifisestä tai erityinen off-tavoite RNAi vaikutus. Todellakin, kasvun inhibitio on yhteinen ei-spesifinen vaikutus, laukaisee tyypin I interferonin vastauksena siRNA [27]. Suzuki

et al.

Ilmeni myös, että SMURF1 yliekspressio kahdessa haimasyövän solulinjoissa parannettu pesäkkeen kasvua kudosviljelymuoviin. Siitä huolimatta meidän havainnot perustuvat Knockdown fysiologisesti-asiayhteys polttovälin

SMURF1

vahvistus esittävät, että tärkeimpiä onkogeenisiä tehtävä SMURF1 koskee edistää solujen invasiivisuus sijaan leviämisen.

Toisessa tuoreessa tutkimuksessa , Laurila

et al.

[28] FISH-analyysillä solulinjojen rajasi 7q21-q22 amplikoni 0,77 Mb ulottuen 10 geenejä (mukaan lukien

SMURF1

), mutta keskittyneet

ARPC1A

ja

ARPC1B

, alayksiköt Arp2 /3 kompleksi toimintakyky aktiini polymerointi. Käyttämällä RNAi, he huomasivat, että knockdovvn joko alentunut solun liikkuvuus, ja knockdovvn

ARPC1A

myös vähensi solujen invaasiota. Vaikka meidän minimaalinen amplikoni ulkopuolelle

ARPC1A

ja

ARPC1B

, se on kuitenkin mahdollista, että niiden vahvistus myötävaikuttaa motiliteettia /invaasion kasvaimissa, jossa ne vahvistetaan. Ei ole harvinaista löytää useita kuljettaja onkogeenien sisällä kasvaimen amplikoneihin (esim. Viite [29]). Todellakin, omat tutkimukset eivät ratkaise, onko

KPNA7

, meidän 325 Kb minimaalinen amplikonin, saattaa myös olla onkogeenisessä rooli (yhdessä

SMURF1

).

Yhteenvetona , jonka genomista profiloinnin ja toiminnallinen analyysi tunnistimme

SMURF1

kuin monistettu onkogeenin ajo solu invasiivisuus haimasyövän. Ehkä eniten merkitystä, koska entsyymi SMURF1 edustaa taipuisa huume tavoite. Muut E3 ubikitiinipromoottori ligaasit on yhdistetty syöpään, ja koska niiden substraattispesifisyys E3 ubikitiinifuu- ligaaseja uskotaan olevan houkuttelevia kohteita hoito [30]. Itse asiassa monet pienmolekyylisalpaajien (mukaan lukien vastaan ​​MDM2, säätelijänä TP53) arvioidaan parhaillaan [31]. Meidän havainnot tunnistaa SMURF1 mahdollisena uuden tavoitteen molekyylirakennetta terapiasta vastaan ​​tuhoisa sairaus haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

näytteet

Haimasyöpä solulinjoissa, on kuvattu aiemmin [12], ja NIH-3T3-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Haimasyöpä ksenografteja, joka tehokkaasti rikastuttaa kasvain epiteelin osa DNA-analyysiä varten, muodostettiin kuvatulla [32] Johns Hopkins Hospital, jossa hyväksynnän Institutional Review Board (IRB) (protokollan ID 05-04-14-02) ja animal Care ja Käytä komitea (protokolla ID MO05M466). Lyhyesti, 1 mm

3-osainen primaarikasvaimen liotettiin Matrigel (Collaborative Biomedical Research), sitten ihonalaisesti nu /nu hiiri. Siirto tehty kasvaimet kerättiin, jolloin se oli 12 cm halkaisijaltaan, ja tuumorisolujen rikastamiseen varmistettiin H 1,3 ja 3,0, tässä järjestyksessä. CGH eritellyn tässä ovat saatavilla GEO (GSE19852); täydellinen kuvaus aineisto on valmisteilla.

Expression profilointi

Expression profilointi tehtiin käyttämällä Agilent luettelo 44K Koko Human Genome taulukot. RNA: t leimattiin käyttäen pika Amp Labeling Kit (Agilent), sitten hybridisoidaan (

vs.

Universaali RNA viitekorin 11 syöpäsolulinjojen [35]) seuraten valmistajan ohjeita. Kun skannaus ja tiedon louhinta (kuten yllä), ilmaus data normalisoitiin (keskiarvokeskitettiin) by array ja geeni, ja keskiarvokeskitettiin log

2 suhde raportoitu.

FISH

kudos mikrosiru, joka sisältää 105 haiman adenokarsinooma tapauksissa (arkistoitu Stanfordin yliopiston ja käyttää IRB hyväksyntä) on aiemmin kuvattu [6]. Probe merkintöjä ja FISH suoritettiin käyttämällä Vysis (Downers Grove, Illinois) reagenssit mukaan valmistajan protokollia. Lokus-erityinen BAC kartoitus

SMURF1

at 7q22.1 (RP11-62N3; BacPac Resources Centre, Oakland, CA) leimattiin SpectrumOrange, ja yhteistyö hybridisoitiin SpectrumGreen-leimatun CHR 7 sentromeeriantigeenin koetin (CEP7 ; Vysis). Objektilasit vastavärjättiin DAPI, ja kuvattiin käyttäen Olympus BX51 fluoresenssimikroskooppiin kanssa Applied Imaging (San Jose, CA) Cytovision 3.0 -ohjelmiston. Kaksikymmentäviisi kasvainsoluja pisteytettiin tapausta kohden, ja vahvistus määritellään keskimäärin

SMURF1 Twitter /CEP7 suhde 2.5.

siRNA transfektiot

On-TARGETplus siRNA: illa kohdistaminen

SMURF1

, yhdessä negatiivisen kontrollin siRNA allas (ON-TARGETplus siCONTROL Non-kohdistaminen Pool), saatiin Dharmacon (Lafayette, CO). Sekvenssit siRNA: t luetellaan taulukossa S1. AsPC-1-soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa täydellistä elatusainetta RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% FBS, 50 U /ml penisilliiniä ja 50 U /ml streptomysiiniä. Transfektioon, 150000 solua siirrostettiin 6-kuoppaiselle levylle hyvin, ja transfektoitiin käyttämällä Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Solut transfektoitiin lopulliseen pitoisuuteen 50 nM siRNA: ssa 6 tunnin ajan.

Western blot

Solut hajotettiin 1 × RIPA-puskuria, täydennettynä kuten on kuvattu [6]. Neljäkymmentä ug kokonaisproteiinia lysaattia elektroforeesi 4-15% polyakryyliamidigeelissä ja siirrettiin sitten PVDF-membraanille ja blokattiin TBST-T 5% kuivamaitoa. Vasta-aineita käytettiin seuraavasti: anti-SMURF1 kanin polyklonaalista vasta-ainetta (H-60; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) on 1:500 laimennus; anti-GAPDH kanin polyklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology) at 1:5,000 laimennus; HRP-konjugoitua anti-kani-IgG: tä (Pierce, Rockford, IL) on 1:20,000 laimennus. Detection tehtiin käyttäen ECL kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ), ja intensiivisyys määrällisesti densitometrialla käyttämällä Scion Image ohjelmisto (Scion Corporation, Fredrick, MD).

Solun kasvua ja invaasiota määritykset

solujen lisääntyminen /elinkelpoisuus määritettiin kvantitatiivisesti kolorimetrisesti perustuu metabolisen pilkkoutumisen tetratsoliumsuolan WST-1 elinkelpoisten solujen, mukaan valmistajan protokollan (Roche, Indianapolis, iN). BrdU määritettiin kolorimetrisellä ELISA: lla käyttäen BrdU Cell Proliferation Assay, mukaan valmistajan protokollan (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Invasion kvantifioitiin Boyden kammio määrityksellä (BD Biosciences, San Jose, CA). Lyhyesti, 24 tuntia transfektion jälkeen, 50000 solut maljattiin 24-kuoppaisille Matrigel-päällystetty teriä, joissa on 0,5%: sta 10% FBS: ää kaltevuus. Seitsemänkymmentä kaksi tuntia myöhemmin solut kiinnitettiin, värjättiin kristallivioletilla, ja solujen liikkumisesta kalvo laskettiin. Kaikki määritykset tehtiin, kuten kolmena kappaleena transfektioista, ja kaikki kokeet toistettiin vähintään kerran samanlaisilla tuloksilla.

TGF transkription reportterimääritys

Solut ko-transfektoitiin 4 ug p3TP-Lux (Addgene, Cambridge, MA), joka on TGFp reagoiva tulikärpäsen lusiferaasi reportteri, joka sisältää kolme peräkkäistä TPA vaste-elementit (TREt) ja osa plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori 1 (PAI-1) promoottorialueen [17], sekä 0,4 ug: PRL-TK (Promega, Madison, WI), joka ilmaisee Renilla lusiferaasin sisäisenä normalisointia valvontaa. Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin 48 tuntia transfektion jälkeen (Lipofectamine 2000) käyttäen dual lusiferaasireportterigeenin määritys (Promega, Madison, WI). Reportteri aktiivisuus ilmaistaan ​​suhteena Firefly /Renilla. Kokeet suoritettiin kuten kolmena transfektioiden ja toistetaan ainakin kerran samanlaisin tuloksin.

Anchorage riippumattoman kasvun

pGIPZ shRNAmir konstruktio kohdistaminen

SMURF1

(V2LHS_229724) sekä ei-kohdistuksen pGIPZ shRNAmir ohjaus, saatiin Open Biosystems (Huntsville, AL). Luominen vakaasti Transdusoimattomia AsPC-1 solun altaat, lentivirus- konstruktioita (yhdessä Trans-lentiviraalinen pakkaus mix plasmidit) transfektoitiin 293TN tuottaja soluihin (System Biosciences, Mountain View, CA), ja supernatantti pakataan viruksen transduktoitiin AsPC-1-soluissa valmistajan ohjeiden (Open Biosystems laajuiset lentiviraalinen GIPZ pakkaus protokolla). Kaksi päivää infektion jälkeen, 1 ug /ml puromysiiniä (Invitrogen) lisättiin elatusaineeseen, ja solut valittiin 14 päivää. Anchorage riippumaton kasvu määritettiin pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa. Lyhyesti, 10000 solua upotettu 6-kuoppalevylle hyvin sisällä pintakerros 0,36% agaroosia täydellinen media, yli kerros 0,48% agaroosia täyteen kasvatusliuokseen. Soluja kasvatettiin 14-21 päivää, sitten näkyvissä pesäkkeiden värjäyksen jälkeen 0,015% Neutral Red liuos. Kokeet suoritettiin kuten kolmena kappaleena transductions, ja toistetaan ainakin kerran samanlaisilla tuloksilla.

NIH-3T3-focus muodostuminen määrityksessä

Täyspitkä ihmisen

SMURF1

cDNA ekspressiovektoriin pcDNA3 0,1-SMURF1 oli ystävällinen lahjoitus Di Chen (University of Rochester Medical Center, Rochester, NY), ja vanhemman pcDNA3.1 ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Katalyyttinen mutantti SMURF1 (C699A) [22], on suunniteltu käyttäen QuickChange XL II Site-Directed Mutagenesis Kit Stratagene (La Jolla, CA), jolla on seuraavat mutageenisia alukkeita: 5′-CGTGGAGGAGACCGCCGGGTTTGCTGTGG -3 ’(degeneroitunut, mutatoitu emäkset merkitty lihavoidulla tekstillä) ja 5’-CCACAGCAAACCCGGCGGTCTCCTCCACG-3 ’. Viisikymmentä tuhatta solua siirrostettiin 60 mm: n levy, ja 8 ug plasmidia transfektoitiin Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Kaksi päivää transfektion jälkeen solut kustakin 60 mm: n levy otettiin uudelleen maljattiin kahteen 10 cm: n maljoilla ja kasvatettiin konfluenssiin yli 28 päivää. Näkyvä pesäkkeitä laskettiin jälkeen metanolia kiinnitys ja Giemsa värjäys. Kokeet suoritettiin kuten kolmena transfektioiden ja toistetaan ainakin kerran samanlaisin tuloksin.

tukeminen Information

Taulukko S1.

siRNA sekvenssit kohdistaminen SMURF1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0023924.s001

(PDF) B Kuva S1.

Hs700T solut näyttää TGFli aiheuttama kasvun esto. Hs700T solut levytettiin, ja sitten 2 ng /ml TGF (tai ajoneuvon hallinnan) lisättiin ja solujen lisääntymistä /elinkelpoisuus määritettiin (by WST-1) päivittäin. Määritykset tehtiin kolmena kappaleena (keskiarvo +/- 1SD esitetty); *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001 (Studentin t-testi). Yhdenmukainen ehjä TGFli kasvun estäminen, ei poistot ulottuen

Smad4

(244K Agilent CGH array tietoja, ei esitetty) eikä pistemutaatioita

Smad4

(Illumina RNAseq analyysi; ei esitetty) tunnistettiin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0023924.s002

(EPS) B

Kiitokset

Kiitämme Ilana Galperin (Stanford sytogenetiikka Laboratory) apunaan FISH-analyysillä, ja jäsenet Pollack lab hyödyllisiä keskusteluja.