Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvutekijän reseptorin (EGFR) on laajasti ilmaistaan ​​pään ja kaulan alueen syöpä. Kuitenkin EGFR-täsmähoitoihin on vain vaatimaton tehoa pään ja kaulan syöpä, mekanismien kautta, joita ei ole täysin ymmärretty. Täällä, huomasimme, että EGFR mukaan erlotinibin stimuloi fosforylaation ja aktivaation STAT3 mikä lisää Bcl2 /Bcl-XL ilmentymistä pään ja kaulan alueen syöpäsoluja, jotka voivat vaimentaa terapeuttista tehoa erlotinibin vastaan ​​pään ja kaulan alueen syöpä. Erlotinibi tehostettu STAT3 fosforylaation tuloksia, ainakin osittain, mistä tukahduttaminen sen fysiologisten fosfataasin, PTPMeg2. Erityisiä knockdovvn STAT3 RNA interferenssin merkittävästi herkistyneet pään ja kaulan syöpäsolut erlotinibille hoitoon. Farmakologinen esto STAT3 mukaan niclosamide paitsi tukossa erlotinibi stimuloiman STAT3 fosforylaation mutta myös synergistisesti tukahdutettu pään ja kaulan syövän kasvua

in vitro

ja

in vivo

. Yhdistetty EGFR ja STAT3 mukaan erlotinibin ja niclosamide tehokkaammin aiheuttaman apoptoosin kasvainkudoksissa ilman toksisuutta normaaleissa kudoksissa. Perustuu havaintojen käsittely erlotinibi yhdistetään niclosamide voivat tarjota tehokas terapeuttinen lähestymistapa parantaa ennustetta pään ja kaulan alueen syöpä.

Citation: Li R, You S, Hu Z, Chen ZG, Sica GL, Khuri FR, et al. (2013) esto STAT3 mukaan Niclosamide synergoi Erlotinibi vastaan ​​pään ja kaulan alueen syöpä. PLoS ONE 8 (9): e74670. doi: 10,1371 /journal.pone.0074670

Editor: Xiaolin Zi, University of California Irvine, Yhdysvallat

vastaanotettu: May 1, 2013 Hyväksytty: 05 elokuu 2013; Julkaistu: 03 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat R01CA136534 (XD), NCI P50 CA128613 (DMS) ja R33 CA161873 (ZGC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan syövät johdonmukaisesti joukossa kuusi useimmin diagnosoitu syövistä maailmassa [1]. Yli 90% pään ja kaulan syövät okasolusyöpää ylemmän aerodigestive suolikanavan, mukaan lukien suuontelon, nielun, kurkunpään, ja nenän sivuonteloiden (1). Levyepiteelisyövän pään ja kaulan (SCCHN) induktiohoitoon muodostaa arviolta 2,5% syövän diagnoosit Yhdysvalloissa, jossa 41380 uutta tapausta diagnosoidaan ja arviolta 7890 kuolemantapausta vuonna 2013 [2]. Edistysaskelista huolimatta hoitomuotojen, kuten leikkaus, säteily ja kemoterapiaa, yleinen eloonjäämisaste SCCHN ei ole merkittävästi parantunut viime vuosikymmeninä. Epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ilmentyy laajalti SCCHN ja on käytetty kriittinen kohde tämän taudin hoitamiseksi [3]. Erlotinibin, EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittorilla (TKI), on käytetty hoidettaessa SCCHN, mutta sen teho on vaatimaton [5]. Mekanismi mikä vastaa rajoitettu tehoa erlotinibin pään ja kaulan syövän hoidossa ei ole täysin ymmärretty. On mahdollista, että EGFR mukaan erlotinibin voi aiheuttaa aktivoitumisen joidenkin eloonjäämisen signalointireitin (t), joka vaimentaa tehoa erlotinibin vastaan ​​SCCHN.

STAT3, jäsen STAT perheen transkriptiotekijöiden, aktivoidaan useita syöpiä, ja on hiljattain vahvistanut houkuttelevana terapeuttinen kohde syövän hoidossa, kuten pään ja kaulan alueen syöpä [6-10]. Lisäksi, SCCHN yksilöt on myös korkeampi STAT3 kuin normaaliin kudokseen [11]. Piilevä sytoplasminen STAT3 aktivoituu fosforylaation kautta tähteen Tyr705 Janus liittyvän kinaasin (JAK) tai kasvutekijän reseptoriin liittyvän tyrosiinikinaasin (Src) [12]. Fosforyloitua STAT3 dimerisoituu läpi vastavuoroisesti Src homologia 2-fosfo-tyrosiini vuorovaikutus ja kerääntyy tumaan, jossa se aktivoi transkriptiota laaja valikoima geenejä, mukaan lukien Bcl2 /Bcl-XL, sykliini D1, c-Myc, jne [13, 14]. Lisäksi STAT3 kinaasit (eli JAK), STAT3 fosforylaatio on myös tiukasti säädeltyä menetelmällä defosforylaatioentsyymien, joka välittyy proteiinityrosiinifosfataasi PTPMeg2 [15]. PTPMeg2 on äskettäin tunnistettu uusi fysiologinen STAT3 fosfataasi, että suoraan defosforyloi STAT3 on Tyr705 jäännös [15]. Kasvaimensisäistä anto STAT3 houkutuslintuna esti kasvua SCCHN ksenograftikasvaimissa

in vivo

[16], mikä viittaa siihen, että STST3 on potentiaalinen terapeuttinen kohde SCCHN. Huolimatta lupaus useita järkevä lähestymistapoja kohdistaa STAT3 toiminto, ei pieni molekyyli STST3 estäjä näyttäisi olevan valmis kliinisen kehityksen niin pitkälle [17].

Niclosamide on viime aikoina raportoitu voimakkaaksi STST3 estäjän syöpää vastaan soluihin [18]. Tässä raportissa, osoitamme, että erlotinibin parantaa STST3 fosforylaation downregulation sen fosfataasin PTPMeg2 johtaa kohonneet Bcl2 /Bcl-XL, mikä vähentää herkkyyttä SCCHN erlotinibille hoitoon. Niclosamide, kuten STAT3 estäjä, voi estää erlotinibi indusoimaa fosforylaatiota STAT3 johtaa synergistiseen tukahduttaminen pään ja kaulan alueen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Niclosamide ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Erlotinibin saatiin LC Laboratories (Woburn, MA). Fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfo-STAT3 (Tyr705), fosfo-JAK2 (Tyr1007 /1008), aktiivinen kaspaasi 3 ja surviviini-vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). β-aktiini ja Mcl-1-vasta-aineita, PTPMeg2 shRNA ja sen valvontaa shRNA ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). PTPMeg2-vasta-aine saatiin R ihmisen Bcl-XL: eteenpäin, 5′- ATA GTT CCA CAA AGG CAT CC -3 ’ja kääntää, 5′- TGG GAT GTC AGG TCA CTG AA-3′; ja β-aktiini: eteenpäin, 5’- TCA GGA TCC ACG TGC TTG TCA -3 ’; käänteinen, 5’- TAC CCT TGG ACC CAG AGG TTC TTT GA -3 ’. Suhteellinen geenin ilmentymisen kvantitatiivinen suoritettiin mukainen vertaileva Ct-menetelmällä käyttäen β-aktiini sisäisenä standardina. Kvantifiointi geenin ilmentyminen analysoitiin 7500 v 2.0.5 ohjelma ja kvantifioidaan 2-ΔΔCt menetelmällä. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

RNA Interference

Lentivirusvektorikonstruktit pSIH1-puro-STAT3 shRNA ja pSIH1-puro-ohjaus shRNA saatiin Addgene (Cambridge, MA). Ohjaus- shRNA plasmidi-A koodaa sekoitetun shRNA sekvenssi, joka ei johda erityiseen hajoaminen tahansa solun viestin. Ohjaus shRNA hiusneula järjestyksessä: CCT AAG GTT AAG TCG CCC TCG CTC GAG CGA GGG CGA CTT AAC CTT AGG. STAT3 shRNA hiusneula järjestyksessä: GAT CCG CAT CTG CCT AGA TCG GCT ATT CAA GAG ATA GCC GAT CTA GGC AGA TGT TTT TTG. PTPMeg2 shRNA ja sen valvontaa shRNA ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Sillä pseudovirus tuotanto, STST3 shRNA tai PTPMeg2 shRNA kotransfektoitiin 293FT solut lentivector pakkaus plasmidi seosta (System Biosciences, CA) käyttäen NanoJuice transfek- Kit (EMD Chemical, Inc.) kuvatulla [23]. 48 tunnin kuluttua viruksen sisältävät media kerättiin sentrifugoimalla 20000 x g. Solut infektoitiin viruksella, joka sisältää median polybreenin (8μg /ml) 24 h, jonka jälkeen stabiileja positiiviset kloonit valittiin käyttäen 1 ug /ml puromysiiniä.

sulforodamiini B (SRB) -määrityksellä

estäviä vaikutuksia erlotinibin ja niclosamide solujen kasvuun arvioitiin käyttäen sulforodamiini B (SRB) määritys kuvatulla [24]. Soluja viljeltiin kolmena rinnakkaisena käyttäen 96-kuoppaisilla levyillä. Yön yli kasvun jälkeen, soluja käsiteltiin erlotinibin, niclosamide tai yhdistelmä 48 tuntia. Elossa solufraktio määritettiin kuvatulla [24].

Pään ja kaulan alueen syöpä ksenografteissa ja hoidot

Institutional Animal Care ja käyttö komitean Emory University hyväksytty protokolla eläinkokeista. Kuusi viikkoa vanhoja Nu /Nu nude-hiiret hankittiin Harlan ja majoitettu alle patogeenivapaissa olosuhteissa mikroisolaattorihäkkeihin häkeissä. Ksenografteja nostettiin injisoimalla 5 x 10

6 Tu212 solujen tasapainotettua suolaliuosta ihonalaiskudokseen yli kylki alueella nude-hiirten. Kasvainten annettiin kasvaa keskimäärin tilavuuteen 250 mm

3 ennen hoidon aloittamista, kuten on kuvattu [25]. Kasvain hiiret satunnaistettiin neljään hoitoryhmään (n = 8 ryhmää kohti) seuraavasti: (1) ajoneuvon ohjaus (0,5% DMSO: ta, 100 ui /d i.p.); (2) erlotinibi (40 mg /kg /vrk i.p.); (3) niclosamide (20 mg /kg /d i.p.); (4) erlotinibi (40 mg /kg /d) + niclosamide (20 mg /kg /d). Kasvaimen tilavuus arvioitiin mittaharppimittauksilla kerran kahden päivän välein ja lasketaan kaavalla: V = (PxL

2) /2 (L: pituus, W: leveys) kuvatulla [26]. Sen jälkeen 14 peräkkäisen päivän hoidon jälkeen hiiret tapettiin hengitettynä CO

2. Korjattu kasvaimet käytettiin lisäanalyysiä.

immunohistokemia (IHC) analyysi

IHC värjäys kasvainkudoksen käyttäen kaniinin anti-ihmis-aktiivinen kaspaasi-3-vasta suoritettiin, kuten on kuvattu [25]. Lyhyesti, otettiin talteen kasvaimia upotettiin parafiiniin ja leikattiin 4 um: n osia. Värjäys suoritettiin käyttäen R.T.U. Vectastain kit noudattamalla valmistajan vakioprotokolla (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Kudos levyt blokattiin 2,5% normaalia hevosen seerumia 10 min. Näytteet inkuboitiin sitten kanin anti-ihmis-aktiivinen kaspaasi-3-vasta (laimennus 01:50), yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen kudosta laseja inkuboitiin anti-kani-lgG-HRP sekundaarisen vasta-aineen kanssa 10 minuutin ajan. Objektilasit värjättiin 3,3′-diaminobentsidiini (DAB) (Vector Laboratories) ja vasta- värjättiin hematoksyliinillä (Vector Laboratories), kuivattu, käsitelty ksyleenillä, ja asennettu. Kaikki objektilasit tutkittiin ja edustavia kuvia otettiin käyttäen Olympus BX41 mikroskoopilla (Olympus America, Melville, NY). Aktiivinen kaspaasi-positiivisten solujen kasvainkudoksissa pisteytettiin 400 x suurennus. Keskimäärin positiivisten solujen kohti 0,0625 mm

2-ala määritettiin kolmesta eri alojen kunkin kolmen itsenäisen kasvainnäytteestä kuvatulla [25].

Quantum dot-pohjainen immunohistokemiallisella fl uorescence (QD-IHF) ja sen signaalin määrän

QD-IHF mittaus proteiinin ilmentymisen kasvainkudoksissa suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [27-29]. Lyhyesti, otettiin talteen kasvaimia upotettiin parafiiniin ja leikattiin 4 um: n osia. Jälkeen deparaffinization ja nesteytys, antigeeni haku suoritettiin kuumentamalla sitraattipuskurilla (10 mmol /l, pH 6,0), mikroaalloilla 10 minuutin ajan. Kudos levyt blokattiin 2,5% normaalia hevosen seerumia ja 10 minuuttia ennen primaarisen vasta-aineen inkubaation jälkeen. Kanin anti-humaani pEGFR ja hiiren anti-humaani-p-STAT3 vasta-aineet sekoitettiin laimennos 1:50 1 x PBS: ssä, joka sisälsi 2,5% hevosen seerumia. Normaali kaniinin IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina. Kudosleikkeet inkuboitiin sekoitetulla liuoksella, jossa oli p-EGFR ja p-STAT3 vasta yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen 1 x PBS: llä kolme kertaa, QD705 vuohen anti-hiiri-IgG-konjugaattia (vihreä) ja QD605 vuohen anti-kani-lgG-konjugaattia (punainen) sekundääriset vasta-aineet lisättiin liukuu inkuboitiin edelleen 1 h 37 ° C: ssa. Levyt pestiin kolme kertaa 1 x PBS, vastavärjättiin DAPI, asennettu ja varastoitiin 4

oC: ssa pimeässä. QD kuvantaminen ja kvantifiointi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [29]. Nuance

TM fluoresenssimikroskooppia järjestelmä (CRi yhdistelty Caliper, PerkinElmer yhtiö, Hopkinton, MA) käytettiin kvantifiointiin QD-IHF signaaleja. Kaikki kuutioitu kuvatiedostot kerättiin kasvainkudoksen dioja 10 nm aallonpituudella välein 420-720 nm, jossa on automaattinen valotusajalla aallonpituus väliä kohti 200 ~ 400x suurennus. Kun kuutio on pitkä aallonpituus kaistanpäästösuodatin sallittua lähetykset kaikista emissioaallonpituuksien edellä 420 nm. Sekä erotettiin ja yhdistettiin QD kuvat saatiin unmixing kuvan kuutio perustuu perustamisesta QD spektrin kirjaston. Kutakin kudosta dia, 10 kuutiot otettiin. Taustalla signaali poistettiin tarkkaan kvantifiointiin QD signaaleja. Keskimääräinen Kunkin QD signaali saatiin valitsemalla kasvain alueilla kummallakin kuution kvantifiointiin Nuance kuvankäsittelyohjelma (Etu /PerkinElmer). Keskimääräinen lukema 10 kuutioita saatiin keskim signaalin määrä kunkin kudoksen dian sekä pEGFR ja pSTAT3 signaaleja.

Hiiri verikoe

Kokoveri (250 ui) kerättiin EDTA -päällystettyihin putket sydänpunktuurilla nukutettujen hiirien hematologian tutkimukset. Näytteet analysoitiin valkosolujen (WBC), punasolut (RBC), verihiutaleiden (PLT), alaniiniaminotransferaasin (ALAT), aspartaattiaminotransferaasi (ASAT) ja veren ureatypen (BUN) in Clinical patologian laboratoriossa yliopistossa Georgia (Athens, GA).

tilastollinen

merkittäviä eroja kahden ryhmän välillä analysoitiin käyttäen kaksipuolista parittomia Studentin t-testiä ja p-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Tilastollinen analyysi suoritettiin Graphpad InStat 3 ohjelmisto (San Diego, CA) [30].

analyysi yhdistelmän indeksi (CI) arvo

CI vastinetta lääkesynergiaa laskettiin CompuSyn ohjelmistoa (Combo-Syn, Inc., Paramus, NJ) kuvatulla [31].

tulokset

EGFR mukaan erlotinibin downregulates PTPMeg2 joka parantaa STST3 fosforylaatioon

äskettäin on raportoitu, että EGFR jonka erlotinibin aktivoi STAT3 /Bcl2 /Bcl-XL eloonjäämisen signalointireitistä ihmisen keuhkosyövän [32]. Voit testata, onko tämä vaikutus erlotinibin esiintyy pään ja kaulan alueen syöpäsoluja, Tu212 ja Tu686 soluja käsiteltiin erlotinibi (0,1 uM) eri aikoja. Tulokset osoittivat, että erlotinibin vähensi EGFR fosforylaatiota yhdessä tehostetun Tyr705 STAT3 fosforylaatio, kohonneeseen Bcl2 /Bcl-XL ja alentuneet surviviinispesifisten (kuvio 1A). STAT3 on fysiologinen transkriptiotekijä Bcl2 ja Bcl-XL [33-35]. Kohonnut Bcl2: n ja Bcl-XL-mRNA: n havaittiin myös Tu212 ja Tu686 solujen jälkeen erlotinibi hoitoon (kuvio 1 B), mikä osoittaa, että erlotinibi aktivoitu STAT3 säätelee positiivisesti Bcl2 /Bcl-XL, mutta ei surviviini transkriptionaalisella vaiheessa. Osoittaa, kuinka erlotinibin stimuloi STAT3 fosforylaatio, vaikutukset erlotinibin STAT3 kinaasia (eli JAK2) ja fosfataasi (eli PTPMeg2) arvioitiin. Kiehtovan, erlotinibi ei ainoastaan ​​inhiboi JAK2 fosforylaatio vaan myös vähensi merkitsevästi PTPMeg2 ekspressiotaso pään ja kaulan alueen syöpä soluja (kuvio 1A). Nämä havainnot osoittavat, että erlotinibin-välitteistä STAT3 fosforylaation ja aktivaation voi johtua esto STAT3 fosfataasin PTPMeg2.

, Tu212 ja Tu686 soluja käsiteltiin erlotinibin (0,1 uM) eri aikoja . Tasot eri proteiineja (pSTAT3, PTPMeg2, pEGFR, Bcl2, Bcl-XL, jne.) Analysoitiin Western blot.

B

, Tu212 ja Tu686 soluja käsiteltiin erlotinibin (0,1 uM) eri aikoja. Tasot Bcl2: n tai Bcl-XL-mRNA analysoitiin RT-PCR: llä.

Tärkeää on, erityisiä knockdovvn PTPMeg2 lisäsi myös STAT3 fosforylaation ja kohonneet Bcl2: n ja Bcl-XL-pään ja kaulan alueen syöpä -soluja (kuvio 2), mikä edelleen tukee roolia PTPMeg2 kuin fysiologinen STAT3 fosfataasi, kuten äskettäin on raportoitu [15].

PTPMeg2 shRNA tai valvontaa shRNA transfektoitiin Tu212 soluihin. Ekspressiotasot pSTAT3, Bcl-XL, Bcl2 ja Mcl-1 analysoitiin Western blot.

Häiriöt STAT3 herkistää pään ja kaulan syöpäsolut erlotinibille

Voit testata, onko erlotinibi -välitteisen STAT3 aktivointi vaikuttaa kielteisesti erlotinibin tehoaa pään ja kaulan alueen syöpä, STST3 joka pudotettiin päässä Tu212 ja Tu686 solut käyttävät STAT3 shRNA (kuvio 3A). Hiljentäminen STAT3 paitsi downregulates Bcl2 ja Bcl-XL (kuvio 3A), mutta myös merkittävästi herkistää pään ja kaulan syöpäsolujen erlotinibille (kuvio 3B), mikä viittaa siihen, että kohdentaminen STST3 saattaa olla suuret mahdollisuudet parantaa tehoa erlotinibin vastaan ​​pään ja kaulan alueen syöpä .

, STST3 shRNA tai kontrolli shRNA transfektoitiin Tu212 ja Tu686 soluja. Ekspressiotasot STAT3, Bcl-XL ja Bcl2 analysoitiin Western blot.

B

, Tu212 ja Tu686 soluja, jotka ilmentävät STST3 shRNA tai ohjaus shRNA käsiteltiin erlotinibi (1 uM) 48 tunnin ajan. Solujen kasvu määritettiin SRB määrityksiä.

Niclosamide lohkot erlotinibin aiheuttama STAT3 fosforylaatio ja synergoi erlotinibin tukahduttaminen pään ja kaulan syöpäsolujen kasvua

Niclosamide on hiljattain tunnistettu voimakas STAT3-inhibiittori [18]. Testata, onko farmakologinen häiriöitä STAT3 toiminnan herkistää pään ja kaulan alueen syöpä solujen erlotinibin, Tu212 ja Tu686 soluja käsiteltiin erlotinibin puuttuessa tai läsnä kasvavien konsentraatioiden niclosamide. Western blot-analyysi osoitti, että niclosamide esti erlotinibin aiheuttama STAT3 fosforylaation ja vaimentua Bcl2 /Bcl-XL annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4A). Tärkeää on, niclosamide yhdistettynä erlotinibin merkittävästi lisätyn kasvun estäminen pään ja kaulan alueen syöpä soluja (ts Tu212 ja Tu686) (kuvio 4B). Tarkemmin selvittääkseen, missä määrin synergiaa niclosamide ja erlotinibin, yhdistelmä indeksi (CI) arvot laskettiin kuvatulla ”Methods”. Cl-arvot olivat 0,39325 varten Tu212 ja 0,447333 varten Tu686 soluja, tässä järjestyksessä. Cl-arvot alle 1 osoittavat, että niclosamide ja erlotinibin osoittavat synergististä kasvua estämällä pään ja kaulan alueen syöpäsoluja.

, Tu212 ja Tu686 soluja käsiteltiin erlotinibin poissa tai läsnä kasvavia konsentraatioita niclosamide 48 tuntia. pSTAT3, Bcl2: n ja Bcl-XL analysoitiin Western Blot.

B

, Tu212 ja Tu686 soluja käsiteltiin erlonitib, niclosamide tai niiden yhdistelmä. 48 tunnin kuluttua, solujen kasvu määritettiin SRB-määrityksiä. Yhdistelmä-indeksi (CI) arvot laskettiin kuvatulla ”Methods.

Niclosamide ja erlotinibin synergisesti estää kasvun pään ja kaulan alueen syöpä eläinten ksenograftien

Koska niclosamide ja erlotinibin olla synergistinen roolia vastaan ​​pään ja kaulan alueen syöpä

in vitro

(kuva 4), on mielenkiintoista tarkastella tätä synergiavaikutuksesta

in vivo

. Ensimmäinen, pään ja kaulan alueen syöpä ksenograftit muodostettiin käyttäen Tu212 soluja. Sitten, hiirillä, joilla on Tu212 pään ja kaulan alueen syöpä -ksenografteja käsiteltiin erlotinibin (40 mg /kg /d), niclosamide (20 mg /kg /d) yksinään tai yhdistelmänä kahden viikon ajan. Tulokset osoittivat, että sekä erlotinibin ja niclosamide yksin oli vaatimaton teho vastaan ​​ksenograftikasvaimissa. Kuitenkin yhdistelmä erlotinibin ja niclosamide tukahdutettu ksenografti kasvainten muodostumista huomattavasti tehokkaammin kuin kumpikaan yksittäinen aine yksinään

in vivo

(p 0,01) (kuvio 5A). Nämä tiedot viittaavat siihen, että niclosamide ja erlotinibin on epätehokkaalla hoidossa pään ja kaulan alueen syöpä.

, hiiret laakeri Tu212 ksenografteja sai vehikkeliä ohjaus, erlotinibi (Erlo, 40 mg /kg /d), niclosamide (Niclo, 20 mg /kg /d) tai niiden yhdistelmä 14 päivää. Kukin ryhmässä 8 hiirtä. Kasvaimen tilavuus mitattiin kerran 2 päivää. 14 päivän kuluttua hiiret tapettiin ja tuumorit poistettiin ja analysoitiin. Edustavia kasvain kuvat on otettu.

B

, aktiivinen kaspaasi 3 ja Ki 67 analysoitiin tuumorikudoksissa lopussa kokeiluja IHC värjäys ja määrällisesti kuvatulla ”Methods”.

C

, Expression tasot pEGFR, pSTAT3, Bcl2: n ja Bcl-XL kasvainkudoksissa eri hoitoryhmien analysoitiin Western blot.

mitataan apoptoosin analyysillä aktiivisen kaspaasin 3 kasvainkudoksessa IHC-värjäyksellä, kuten aikaisemmin on kuvattu [25]. Yhdistelmä erlotinibin ja niclosamide huomattavasti aktiivinen kaspaasi 3-positiivisten solujen yhdessä vähentynyt Ki-67-positiivisia soluja pään ja kaulan kasvainten kudokset (kuvio 5B). Proteiini analyysi kasvainkudoksen lysaatit kolme hiirtä kussakin hoitoryhmässä osoitti, että niclosamide estää erlotinibin-stimuloidun STAT3 fosforylaation mikä alentaa Bcl2: n ja Bcl-XL tasot (kuvio 5C). Nämä tiedot viittaavat siihen molekyylitason mekanismi, jolla niclosamide ja erlotinibin näytteille synergian vastaan ​​pään ja kaulan alueen syövän kasvua

in vivo

.

Mikä tärkeintä, hoidot olivat hyvin siedettyjä ilman laihtuminen hoidon aikana (kuvio 6A). Ei ollut havaittavissa muutoksia elintärkeitä elimistön toimintaan, mikä heijastuu tuloksiin maksa-, munuais-, ja luuytimen toiminnan tutkimus (ALAT, ASAT ja BUN, WBC Hb ja verihiutaleiden) (kuvio 6B). Histopatologia korjattu normaaleissa kudoksissa (aivot, sydän, keuhkot, maksa, perna, munuainen ja suolisto) paljasti ole näyttöä myrkyllisyydestä normaalissa kudoksessa (kuvio 6C).

, Body paino hiirillä, joilla Tu212 ksenografteissa mitattiin joka toinen päivä hoidon aikana ajoneuvon ohjaus, erlotinibi (Erlo, 40 mg /kg /d), niclosamide (Niclo, 20 mg /kg /d) tai niiden yhdistelmän.

B

, Blood analyysi hiirillä sen jälkeen, kun erilaisia ​​hoitoja 14 päivää. C, H E histologia eri elinten jälkeen hoitojen.

analyysi pEGFR ja pSTAT3 kasvaimen kudoksissa kvanttipiste (QD) -pohjaisen immunohistofluorescence (QD-IHF) B

QD-IHF tekniikka on merkittävä etu mahdollistaa kvantifiointiin useita biomarkkereiden samanaikaisesti samalla kudoksen dia [27-29,36]. Tasot pEGFR ja pSTAT3 lisättiin samanaikaisesti analysoitiin QD-IHF käyttämällä ensisijaista vasta-aineita ja QD-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita, joissa on kaksi erilaista emissioaallonpituudet (ts QD705 (vihreä) ja QD605 (punainen)). Sekä erotettiin ja yhdistettiin QD kuvien jälkeen saatiin määritettäessä QD spektrin kirjaston ja unmixing kuutioitu kuvan. QD kuvia kasvainkudoksista osoitti, että pEGFR oli paikallistaa solukalvon ja pSTAT3 sijaitsi tumassa (kuvio 7). Vähentynyt pEGFR ja lisääntynyt pSTAT3 tasot havaittiin pään ja kaulan ksenograftin kasvaimen kudokset jälkeen hiirten käsittely erlotinibin (kuvio 7). Lisäksi niclosamide täysin tukossa erlotinibin stimuloimaa STAT3 fosforylaatiota kasvainkudoksessa (kuva 7).

ja

B

, Tu212 ksenograftit hoidettiin auton hallinnan, erlotinibi (Erlo, 40 mg /kg /d), niclosamide (Niclo, 20 mg /kg /d) tai niiden yhdistelmä 14 päivää. pEGFR ja pSTAT3 analysoitiin tuumorikudoksissa lopussa kokeiden QD-IHF ja määrällisesti kuvatulla ”Methods”.

Keskustelu

Pään ja kaulan syövät ovat kaikkein vallalla kasvaimia maailmassa. Huolimatta edistysaskeleet hoitomuotojen (eli leikkaus, säteily ja kemoterapia), yleinen eloonjäämisaste SCCHN ei ole merkittävästi parantunut viimeisten kolmen vuosikymmenen aikana [4]. Siksi kehitettäessä toimivia uusia lähestymistapoja, jotka toimivat läpi perusmolekyylibiologiaa mekanismien on kriittinen parantaa ennustetta pään ja kaulan syövät. EGFR on laajalti yli-ilmennetään SCCHN. Huolimatta kaikkialla ilme, hoitomuodot kohdistaminen EGFR vain vaatimattomasti tehokas hoidettaessa SCCHN [5]. Resistenssimekanismi EGFR kohdistaminen aineita ei ole täysin ymmärretty. Täällä, huomasimme, että EGFR mukaan erlotinibin johtaa fosforylaatioon STAT3 klo Tyr705 mikä sen aktivointia ja kohonneeseen Bcl2 /Bcl-XL sekä mRNA ja proteiini tasoilla pään ja kaulan alueen syöpä soluja (kuvio 1). Tämä vaikutus voisi vähentää tehoa erlotinibin vastaan ​​pään ja kaulan alueen syöpä. Mielenkiintoista, erlotinibi aiheuttama STAT3 fosforylaation ja aktivaation ei johtunut sen alkupään kinaasi JAK2 koska erlotinibi ei aktivoi JAK2, mutta päinvastoin vähentää JAK2 fosforylaatiota (kuvio 1A). Lisäksi JAK2, STST3 fosforylaatio on myös tiukasti säädeltyä defosforyloimalla kautta fysiologinen fosfataasi PTPMeg2 [15]. Hoito Tu212 ja Tu686 pään ja kaulan alueen syöpä solujen erlotinibin vähensi PTPMeg2 (eli fysiologinen STST3 fosfataasi) on ajasta riippuva tavalla (kuvio 1A). Näin ollen, erlotinibi, lisäksi EGFR, voi myös tukahduttaa PTPMeg2 joka parantaa STAT3 fosforylaation. Kiehtovan erityisiä knockdovvn PTPMeg2 myös aktivoinut STAT3 /Bcl2 /Bcl-XL selviytymisreittiin (kuvio 2), mikä viittaa siihen, että PTPMeg2 voi olla tärkeä rooli säätelyssä herkkyys erlotinibin pään ja kaulan syöpäsolut.

STAT3 on äskettäin tunnistettu olevan mahdollinen terapeuttinen kohde hoidettaessa pään ja kaulan alueen syöpä [37]. Ehtyminen STAT3 RNAi merkittävästi herkistää pään ja kaulan syöpäsolujen erlotinibille (kuva 3). Niclosamide on äskettäin tunnistettu STST3 estäjä, joka voi tukahduttaa STST3 fosforylaation Tyr705 ja transkripti toimintaa [18]. Koska niclosamide paitsi voimakkaasti estää erlotinibin aiheuttama STAT3 fosforylaatio mutta myös synergistisesti erlotinibin vastaan ​​pään ja kaulan alueen syöpä

in vitro

ja

in vivo

(kuviot 4 ja 5), ​​ehdotamme, että erlotinibin yhdessä niclosamide on suuret mahdollisuudet kehitetään uusi ja tehokkaampi terapeuttinen lähestymistapa parantaa ennustetta pään ja kaulan alueen syöpä. Kvanttipisteet (QDS) ovat nanokokoluokan hiukkasia valmistettu epäorgaaniset puolijohteet ovat uusia optisia ominaisuuksia, jotka voivat tuottaa Fluoresenssiemission eri aallonpituuksilla riippuen niiden koosta ja koostumuksesta [38-40]. Suuri Stokes-siirtymä QDS, mitattu etäisyys herätteen ja emission huiput, voidaan käyttää parantamaan havaitsemisen herkkyyttä. Tämä on erityisen tärkeää, kun analysoidaan monimutkaisten biologisten näytteiden kuten kudosnäytteet, jotka sisältävät suuren auto-fluoresenssi tausta ja useita biomarkkereita samanaikaisesti. Lisäksi QD-pohjainen immunohistofluorescence (QD-IHF) signaali ei ole photobleachable ja signaali spektri on kapeampi kuin tuonti orgaanisten väriaineiden, mikä parantaa spesifisyyttä kvantifiointia. QD-analyysi vahvisti, että inhibitio pEGFR mukaan erlotinibin stimuloi fosforylaatio STAT3 kasvainkudoksissa, ja että niclosamide estää erityisesti erlotinibin aiheuttama STAT3 fosforylaatio vaikuttamatta pEGFR (kuvio 7). Nämä QD-IHF tietoja paitsi tuovat lisänäyttöä, että erlotinibin aktivoi STAT3, mutta myös paljastaa molekyylitason mekanismi, jolla niclosamide ja erlotinibin synergistisesti tukahduttaa pään ja kaulan alueen syöpä

in vivo

.

Yhteenvetona esillä tutkimukset ovat osoittaneet, että EGFR mukaan erlotinibin stimuloi fosforylaation ja aktivaation STAT3 johtaa kohonneeseen Bcl2 ja Bcl-XL, mikä voi heikentää tehoa erlotinibin vastaan ​​pään ja kaulan alueen syöpä. Erlotinibi aiheuttama aktivointi STAT3 voi tapahtua tukahduttamista sen fysiologisen fosfataasin PTPMeg2. Yhdistetty EGFR ja STAT3 käyttämällä erlotinibin ja niclosamide synergistisesti tukahduttaa pään ja kaulan alueen syöpä

in vitro

ja

in vivo

, joka voi edustaa uutta ja tehokas terapeuttinen strategia parantaa ennustetta potilaille, joilla on pään ja kaulan alueen syöpä.

Kiitokset

Kiitämme Anthea Hammond ammattimaiseen muokkaamiseen käsikirjoituksen.