Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman länsimaissa.

In vitro

ja

in vivo

kokeet osoittivat, että omega-3 monityydyttymättömiä rasvahappoja (n-3 PUFA) voidaan vaimentaa leviämisen syöpäsolujen, kuten paksusuolen syöpä, ja tehokkuuden lisäämiseksi eri syöpälääkkeiden. Kuitenkin nämä tutkimukset tartutaan n-3-PUFA: irto- kasvainsolujen eikä erilaistumattoman paksusuolen syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja (CSLCs), jotka ovat vastuussa kasvaimen muodostumisen ja ylläpitoon. CSLCs on myös yhdistetty hankintaan kemoterapian resistenssin ja kasvaimen uusiutumisen. Colon CSLCs on immunophenotyped useilla vasta-aineita solujen markkereita kuten CD133, CD44, EpCAM, ja ALDH. Anti-CD133 on käytetty eristämään populaation koolonkarsinoomasoluissa joka säilyttää kantasoluja ominaisuudet (CSLCs) sekä pysyvien solulinjojen ja ensisijainen soluviljelmissä. Olemme osoittaneet, että n-3-PUFA, eikosapentaeenihappo (EPA), aktiivisesti sisällytetty kalvolipidien COLO 320 DM-soluja. 25 uM EPA vähensi solujen määrä koko väestöstä syöpäsolujen, muttei CD133 (+) CSLCs. Lisäksi havaitsimme, että EPA aiheuttama säätely alaspäin CD133 ilmaisun ja säätely ylöspäin paksusuolen epiteelin Differentiaatiomarkkerien, sytokeratiinivasta 20 (CK20) ja Mucin 2 (MUC2). Lopuksi osoitimme, että EPA lisääntynyt herkkyys COLO 320 DM soluja (koko väestö) sekä standardin-of-care kemoterapian (5-fluorourasiilin ja oksaliplatiini), kun taas EPA lisäsi herkkyyttä CD133 (+) CSLCs vain 5- Fluorouracil.

Citation: De Carlo F, Witte TR, Hardman WE, Claudio PP (2013) Omega-3 eikosapentaeenihappo Vähennykset CD133 Colon Cancer Stem-Like Cell Marker Expression samalla kasvattaa herkkyys kemoterapia. PLoS ONE 8 (7): e69760. doi: 10,1371 /journal.pone.0069760

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 14 helmikuu 2013; Hyväksytty: 12 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 16 heinäkuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitollisena tunnustavat Marshall yliopiston biokemian ja mikrobiologian Leikkaus Osastot heidän tuestaan. Esillä olevissa tutkimuksissa tukivat avustus Bean Foundation, ja osittain NIH avustukset CA131395, CA140024, ja WV-INBRE 5P20RR016477 (PPC) ja osittain NIH myöntää R01CA114018 ja DOD apurahan W81XWH-10-1-0697 ( ja WEH). Sisältö on ainoastaan ​​vastuulla kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä National Cancer Institute tai National Institute of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin kuolinsyy syöpään länsimaissa ja vuosittain on vastuussa puoli miljoonaa kuolemantapausta maailmanlaajuisesti [1], [2]. Huolimatta kirurgisesti resektion ja kemoterapia, lähes 50% potilaista kehittää resistenssin, kasvaimen uusiutumisen tai metastaattisen sairauksia [2], [3]. Viimeaikaiset löydöt ovat osoittaneet, että tämä saattaa johtua ainakin osittain siitä, että on olemassa syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja [4], mikä korostaa tarvetta parantaa hoitoja, jotka voivat kohdistaa niihin.

Yhä useammat tutkimus tukee ajatusta, että ihmisen syövän voidaan pitää kantasolujen sairaus. Syövän kantasoluja malli ehdottaa, että vain murto-osa solujen kasvaimen hallussaan syövän aloittamista mahdollisia ja että nämä syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja (CSLCs) kykenevät aloittamaan ja ylläpitämään kasvaimen kasvu [5], [6]. Ricci-Vitiani [4] ja O’Brian [7] olivat ensimmäiset tarjota riippumatonta todiste paksusuolen CSLCs. Ne eristänyt CD133 (+) populaatio solujen kasvain, joka kykeni kasvaa erilaistumaton paksunsuolen-aloilla on seerumittomassa alustassa, joka voitaisiin eriyttää osaksi heterogeeninen tuumorisolupopulaatioon. Ne osoittivat, että ainoastaan ​​CD133 (+) subpopulaatio oli aiheuttanut tuumoreita sarja- ksenograftin määritys immuunivajaissa NOD /SCID-hiiriin. Viime aikoina on osoitettu, että CD133 voidaan myös käyttää tunnistamaan CSLCs on vakiintuneet solulinjat. CD133 (+) jotka on eristetty syövän solulinjat on todettu olevan tuumorigeenisemmiksi kuin CD133 (-) solun osa sekä

in vitro

ja

in vivo

[8]. Lisäksi CD133 (+) soluja, kasvatettu aloilla, säilyttää ilmaus tämän markkerin edes pitkäaikaisen alalla kulttuuri [9]. Viimeaikaiset Kliinisten tutkimusten mukaan CD133 ilmentyminen korreloi negatiivisesti potilaan ennusteeseen kehittyneen paksusuolisyövän [10], [11].

Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet lisääntynyttä esiintymistä paksusuolensyöpä populaatioissa kuluttaa Länsi ruokavalio, runsaasti punaista lihaa, eläinrasvaa ja alhainen jyvät. Tämä esiintyvyys vähenee henkilöillä, jotka kuluttavat suurempia määriä hedelmiä, vihanneksia, kuituja, ja, mikä tärkeintä, n-3 monityydyttymättömiä rasvahappoja (PUFA) peräisin merestä [12], [13]. Vanhemman n-3 PUFA α-linoleenihappo (ALA) löytyy kasviöljyssä, mutta sen aineenvaihduntatuotteet eikosapentaeenihappo (EPA) ja decosahexaenoic happoa (DHA) on saatu pääosin kylmän veden rasvaisista kaloista. Paljon tietoja on julkaistu noin kyky n-3-PUFA: vähentää proliferaatiota, kohdistamaan pro-apoptoottisen vaikutuksen, ja inhiboivat angiogeneesiä useilla

in vitro

malleja paksusuolisyövän [14] – [17] . Omega-3-PUFA: t on myös osoitettu lisäävän herkkyyttä kemoterapian useiden ihmisen peräisin syövän soluviljelmissä

in vitro

kuten rinta- [18], aivojen ja keuhkojen [19], lymfosyyttinen [20], ja paksusuolen [15]. Samalla tavoin, n-3 PUFA: herkistyneet

in vivo

malleja rintasyövän [21], sarkooma [22], ja leukemia [23] ja syövän hoitoon. Kuitenkin kaikki nämä tutkimukset osoitettu vaikutuksia PUFA hoitojen suurin kasvainsolujen, ei sen CSLCs.

antituumorivaikutuksen n-3 PUFA: ei ole ainoastaan ​​liity niiden vaikutuksia proliferaation ja apoptoosiin vaan myös erilaistumista eri solumalleissa. Välinen yhteys omega-3 PUFA ja edistäminen solujen erilaistumisen on jo kuvattu normaaleissa ja pahanlaatuisten solujen [24] – [28]. Omega-3-PUFA: t on osoitettu erottamaan myeloidi- esisolujen luuytimessä hiirten muuttamatta valkoisten verisolujen liikkeeseen [24]. Samalla tavoin, on osoitettu, että pitkän aikavälin hoitoja EPA: n ja DHA: n, joka ei muuta morfologian tai keskimääräinen lukumäärä soluja crypt osassa on normaalia koolonin limakalvoa rotan, ei vähentää solujen lisääntymistä, parantaa erilaistumista ja apoptoosia [29].

lisäksi hoito ihmisen rinta- syöpäsolujen n-3 PUFA johtanut niiden kasvun estäminen, joka oli verrannollinen maitorauhasen eriyttämisen [27], ja pro-erottaa vaikutus havaittiin myös DHA käsitelty ihmisen melanoomasolujen

in vitro

[26].

Opinnäytetyön tarkoituksena oli selvittää, jos

in vitro

pitoisuuksia EPA vastaa plasmassa saavutettavissa ihmiskehon seuraavat ruokavalion ravintolisää 2,4 g n-3 /vrk [30], pystyivät vaikuttamaan erilaistumista asemaan ja kemosensitiivisyys yleistä populaation koolonkarsinoomasoluissa ja erityisesti, että CD133 (+) CLSCs.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

ihmisen kolorektaalisen adenokarsinooman solulinjaa COLO 320 DM (CCL-220, Duken C) saatiin America Type Culture Collection (Rockville, MA). Colo320DM-soluja viljeltiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, penisilliini 100 U /ml ja streptomysiiniä 100 ug /ml: lla (HyClone, South Logan, UT). Solut jatkoviljeltiin tiheydellä 1 x 10

5 /ml kahdesti viikossa kostutetussa ilmakehässä 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Kemikaalit ja lääkkeet

Eikosapentaeenihappo, EPA (omega-3-monityydyttymättömien rasvahappojen, 20:5) hankittiin Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI) ja steariinihappoa (SA, tyydyttyneiden rasvahappojen, 18:0) yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis , MO). 100 mM kantaliuokset EPA ja SA absoluuttiseen etanoliin tehtiin ja laimennettiin lopulliseen pitoisuuteen kanssa elatusaineet.

Oksaliplatiini ja 5-fluorourasiili ostettiin Alexis Biochemicals (Farmingdale, NY). 12.6 mM varastoliuokset oksaliplatiiniannosten ja 384,3 mM 5-fluorourasiili DMSO tehtiin ja laimennettiin lopulliseen pitoisuuteen kanssa elatusaineet.

Ohjaus solut käsiteltiin samalla määrällä ajoneuvon, etanolia tai DMSO (CTRL VH). Lopullinen Ajoneuvon pitoisuudet koskaan ylittänyt 0,1% v /v.

Kaasukromatografia

COLO 320 DM maljattiin 100 mm: n petrimaljoille (1 x 10

6 solua) ja käsiteltiin sen jälkeen 4 tuntia ajoneuvon hallinnan tai erilaisia ​​pitoisuuksia EPA ja SA (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM). Rasvahappokoostumukset COLO 320 DM arvioitiin käyttäen kaasukromatografiaa. CTRL VH ja käsiteltiin solut otettiin talteen 96 tunnin kuluttua, pestiin PBS1X poistamiseksi pinnan lipidien, homogenisoidaan sitten tislattua vettä, 0,1% BHT (3,5-di

tert

-butyyli-4-hydroksi-tolueenia ) metanolissa estämään rasvahappojen hapettumista. Lipidit uutettiin kloroformi /metanoli, ja sitten transmethylated. Metyloidut lipidit erotettiin ja tunnistettiin kaasukromatografiaa, kuten aiemmin julkaistu [31]. Rasvahapon metyyliesteriä standardeihin (Nu-Chek Prep, Elysian, MN) käytettiin piikin tunnistamiseen.

Yksittäiset rasvahappojen metyyliestereitä EPA, DPA (decosapentaenoic happo), DHA ja, SA ilmoitettiin prosentuaalinen summa koko metyloitu rasvahappojen (käyrän alla).

Metabolinen aktiivisuus määritys (MTT-määritys) ajankulku

COLO 320 DM solua maljattiin 96-kuoppalevyille (3000 solua /kuoppa). 4 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin eri pitoisuuksia EPA ja SA (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM) tai ajoneuvon hallinnan (CTRL VH) 0-4 päivän ajan. Solut analysoitiin sitten päivittäin aineenvaihdunta MTT: llä. Lyhyesti, 10 ui 5 mg /ml MTT: tä (3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 2 tunnin ajan kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Tämän ajan kuluttua elatusaine poistettiin, formatsaanipitoisuus muodostunut suola liuotettiin DMSO ja absorbanssi luettiin 570 nm: ssä, jossa on mikro-levylukijalla.

Cell count ja fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS)

COLO 320 DM maljattiin 24-kuoppalevylle (2,5 x 10

4 /kuoppa) ja käsiteltiin 4 tunnin joiden valikoima pitoisuuksia EPA tai SA (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM) 96 tunnin ajan. Elävät solut laskettiin käyttämällä trypaanisiniekskluusiolla menetelmällä. Sen jälkeen solut suspendoitiin kylmään FACS-puskurissa (PBS1X, 2 mM EDTA, 0,1% BSA) ja alikvootit solujen, 2 x 10

5 solua /50 ul, leimattiin sopivan pitoisuuden monoklonaalista vasta-ainetta CD133 /2 ( 293C3), phycoerytrin konjugoitu (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Saksa). Isotyyppiä vasta-ainetta käytettiin kontrollina vasta-aineen tausta normalisointi. Analyysi suoritettiin kanssa Accuri-C6 -virtaussytometrillä (BD Accuri Solumittauslaitteet, Ann Arbor, MI). Kun prosenttiosuus positiivisuus ja CD133 määritettiin määrä CD133 (+) ja CD133 (-) negatiivinen solujen sisällä koko väestöstä laskettiin.

Real Time PCR

COLO 320 DM olivat levytettiin 100 mm: n petrimaljoille (1 x 10

6 solua) ja vehikkeliä, EPA tai SA (25 uM). Solut kerättiin sen jälkeen, kun 48 ja 96 tuntia, ja kokonais-RNA uutettiin näytteistä käyttämällä Trizol mukaan valmistajan protokollan (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). RNA liuotettiin ddH 2O: lla ja nukleiinihapon pitoisuus mitattiin Nano Drop 2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). RNA (1 ug) altistettiin reverse polymeraasiketjureaktiolla käyttäen High Capacity cDNA transkriptio Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) ja Reaaliaikainen PCR suoritettiin RT2 SYBR Green /ROX qPCR Master Mix käyttäen ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Suhteelliset muutokset geenien ilmentyminen laskettiin käyttäen 2-ΔΔCt menetelmällä, ovat kuvanneet Livak ja Schmittgen [32]. β-Actin käytettiin taloudenhoito geeni.

β

aktiini-F

: GGT TCC GCT GCC CTG AGG;

β

aktiini-R

: GTC CAC GTC ACA CTT CAT G.

erityisiä alukeparia käytettiin monistamaan geenejä kohteisiin:

CD133-F

: TTG GCT CAG ACT GGT AAA TCC C;

CD133-R

: ATA GGA AGG ACT CGT TGC TGG T;

CK20-F

: ACC TCC CAG GCC TTG AGA T;

CK20-R

: TGG CTA ACT GGC TGC TGT AA;

MUC2-F

: GGG ACT GTG AGT GCT TCT GC;

MUC2-R

: AGT GGA TGC CGT TGA TGG T.

Western-blottaus

COLO 320 DM maljattiin 100 mm: n petrimaljoille (1 × 10

6 solua) ja vehikkeliä, EPA tai SA (25 uM) 48 ja 96 tuntia. Yhteensä proteiinit uutettiin soluista hajotuksen jälkeen kylmässä näytepuskuriin (150 mM NaCl, 50 mM Tris /HCI, pH 8, 0,5 mM EDTA, 0,1 mM EGTA: ta, 1% Triton X-100). Natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) suoritettiin Laemmlin menetelmän [33]. Yhtä suuret määrät yhteensä kunkin näytteen proteiinit tehtiin elektroforeesi siirretään sitten 0,45 um nitroselluloosakalvoille. Blokattiin 5% rasvaton maito TBS-T, kalvoja inkuboitiin seuraavilla vasta-aineilla: Anti-CD133 /1 (AC133 Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Saksa), Anti-sytokeratiinivasta 20 (EPR1622Y Abcam, Cambridge, MA ). Anti-p Actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) käytettiin latauskontrollina. Inkubaation jälkeen kanssa piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineiden immunokompleksien visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssidetektiolla (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Kuvat otettiin käyttäen Luminary /FX kuvantamisjärjestelmä (Fotodyne, Hartland, WI). Densitometria suoritettiin Image j 1,45 ohjelmisto (Image Processing and Analysis in Java) (imagej.nih.gov/ij/download/).

pisteblottauksella

Dot blot suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [34]. Lyhyesti, COLO 320 DM levytettiin, vehikkeliä, EPA tai SA (25 uM) 48 ja 96 tuntia ja proteiinit uutettiin kuvatun western blot analyysi osiossa. Yhtä suuret määrät yhteensä kunkin näytteen proteiinit täplitettiin 0,45 um nitroselluloosakalvolle. Peptidi kompetitiomäärityksin suoritettiin tarkistaa spesifisyys Muc-2-vasta-ainetta (Pierce, ThermoScientifics, Waltham, MA). 300 ug mittatilaustyönä peptidin (CPDFDPPRQENETWW, peptidi 2,0, Chantilly, VA), jolla on sama sekvenssi kuin se, jota käytetään tuottamaan Muc-2-vasta-ainetta inkuboitiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa 1 ug: muc-2-vasta-aine. Kun oli salvattu 5% rasvaton maito TBS-T, kalvoja inkuboitiin anti-Muc-2 ja anti-p Actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) kontrollina. Inkubaation jälkeen kanssa piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineiden immunokompleksien visualisoitiin ja kuvattiin, kuten on kuvattu Western blot-analyysi osiosta.

eristäminen Cancer Stem Cell väestön

CSCLs eristettiin käyttäen CD133 mikrohelmi kit (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Saksa). COLO 320 DM yhteensä solupopulaation leimattiin monoklonaalisella vasta-aineella CD133 /2 (293C3) konjugoituna mikro-helmiä ja CD133 (+) solut magneettisesti lajitellaan. Solujen alikvoottia eluoitiin pylväästä oli leimattu monoklonaalinen vasta-aine CD133 /1, phycoerytrin konjugoitu (AC133, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Saksa) ja FACS-analyysi suoritettiin arvioimaan prosenttiosuus puhtauden CD133 (+) soluja.

Growth-inhibitiotesti

COLO 320 DM-soluja maljattiin 96-kuoppaisille levyille (3000 solua /kuoppa). 4 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan konsentraatioalueella oksaliplatiinia (0,005-0,1 mm) tai 5-fluorourasiili (0,05-2 mM) pitoisuuden määrittämiseksi aiheuttaen 25% ja 50% kasvun eston. Sitten soluja analysoitiin niiden metabolinen aktiivisuus MTT-määritys.

Kemosensitiivisyys määrityksessä

COLO 320 DM (3 x 10

3) solua /kuoppiin, koko väestö tai CD133 (+) , maljattiin 96-kuoppaisille levyille. 4 tunnin kuluttua, joka on täydennetty ajoneuvo, EPA tai SA lisättiin saavuttamiseksi lopulliseen pitoisuuteen 25 uM FA. 48 tunnin jälkeen elatusaine korvattiin tuoreella väliaineella, jota oli täydennetty eri oksaliplatiinin (0,005-0,1 mM) tai 5-fluoriurasiili (0,05-2 mM) pitoisuuksina. 24 tunnin kuluttua hoidon MTT-määritys suoritettiin määritellä estävä pitoisuus, joka johtaa vähenemiseen elinkelpoisuutta 25% (IC25) ja 50% (IC 50).

Tilastollinen

Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa ja esitetään keskiarvoina ± SD. Kaikki tiedot analysoitiin Prism © ohjelmistoa (Graphpad, Inc., La Jolla, CA). Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jossa Tukey monivertai- post-testiä käytettiin sen määrittämiseksi, tilastollinen merkitsevyys eroja koeryhmien:

p

-arvot olivat alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

tulokset

eikosapentaeenihapon on rekisteröitynyt ja metaboloituu COLO 320 DM solujen

arvioimiseksi sisällyttäminen rasvahappojen COLO 320 DM solujen olemme analysoineet rasvahappokoostumus kaasukromatografialla hoidon jälkeen EtOH (CTRL VH) tai konsentraatioalueella (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM) PUFA n-3, EPA tai tyydyttyneitä FA SA. Sen jälkeen, kun 96 tunnin kuluttua solut kerättiin talteen ja lipidejä uutettiin. Ensin havaitsimme, että SA on 30 kertaa enemmän edustettuna ohjaus ajoneuvon kokonaismassan lipidien solukalvon kuin EPA, DPA ja DHA. Havaitsimme (kuvio 1A) merkittävää annos reagoiva lisäystä EPA soluissa käsiteltiin tämän rasvahapon. Lisäksi osa vastaa DPA, joka on EPA metaboliitti, myös lisääntynyt jälkeen EPA hoidon. Nämä tulokset osoittivat, että COLO 320 DM solujen sisällytetty ja tehokkaasti metaboloituu EPA. Samalla tavalla me havaittu annoksesta riippuva lisäys SA sisällön lipideistä yhteensä COLO 320 DM käsiteltiin steariinihappoa (kuvio 1 B).

Yhteensä lipidit uutettiin COLO 320 DM-soluja käsiteltiin 96 tunnin ajan ohjaus ajoneuvo (CTRL VH) tai eri pitoisuuksia (A) EPA tai (B) SA, (6.25-12.5-25 uM). Kaasukromatografia suoritettiin tutkimaan rasvahappojen sisällyttäminen ja niiden aineenvaihduntatuotteiden COLO 320 DM soluja. Tulokset esitetään suhteellisina prosentteina suhteessa CTRL VH. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD vähintään kolmen kokeen.

mustat palkit

: yhdiste hoitoon havaittu GC;

Vaalea baareja

: DPA (

dokosapentaeenihaposta

, C22: 5, n-3);

tummanharmaa palkit: DHA (dokosaheksaeenihappo, C22: 6, n-3)

. (SA: steariinihappo C18: 0).

25 uM eikosapentaeenihappo hoito vähensi solujen määrä COLO 320 DM soluja vaikuttamatta CSLCs väestön

Useat todistelinjat osoittavat, olemassaolo pienen populaation syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka voivat aloittaa ja ylläpitää kasvaimia. Käytön spesifisiä markkereita, mukaan lukien CD133 paksusuolen CSLCs, on mahdollistanut tutkijat merkitä näitä soluja ja erottaa CSLCs väestöstä ja suurin kasvaimen [4], [7]. Omega-3-rasvahappoja on jo raportoitu vähentävän suurin osa kasvainsolujen [14] – [17], mutta vaikutus CSLCs ei ole määritetty.

Kuvio 2A ja taulukossa 1 osoittavat, että ajan myötä hoidon (0-96 tuntia) ja 25 uM EPA merkittävästi vähensi COLO 320 DM (koko väestöstä) mitattuna MTT: llä suhteessa ajoneuvon ohjaus (p 0,01 72 tuntia, ja p 0,001 96 tunnin). Hoidot 25 uM SA pienennetään vähemmässä määrin solujen määrä COLO 320 DM soluja (kuvio 2B ja taulukko 1).

COLO 320 DM-soluja käsiteltiin 0-96 tuntia ajoneuvon ohjaus (CTRL VH ) tai 6.25-12.5-25 uM (A) EPA ja (B) SA. MTT-analyysi EPA ja SA käsiteltyjä soluja vs. ajoneuvon ohjaus (CTRL VH) käsiteltyjen solujen.

p

arvot laskettiin yksisuuntainen ANOVA testi Tukeyn monivertailu testin jälkeen eri hoidoista kussakin aikapisteessä. * P≤0.05; ** P≤0.01; *** P≤0.001; n = 5. COLO 320 DM soluja käsiteltiin myös 96 tuntia ajoneuvon ohjaus (CTRL VH) tai konsentraatioalueella rasvahappojen (6.25-12.5-25 uM), (C) EPA ja (D) SA. Elävät solut laskettiin ja leimattiin monoklonaalisella vasta-aineella anti-CD133 määrittämiseksi prosenttiosuus CD133 (+) solujen käsitellyissä ryhmissä. Tulokset edustavat CD133 (+) ja CD133 (-) solujen lukumäärä ± SD vähintään kolmen kokeen.

p

arvot laskettiin Studentin t-testiä käsitellyissä näytteissä vs. CTRL VH (* p≤0.05).

Jotta voitaisiin määrittää joka solupopulaation (bulk kasvain tai CSLC) vaikutti, ensin käsitelty COLO 320 DM joiden valikoima pitoisuuksia EPA tai SA (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM) 96 tunnin ajan. EPA eri tavalla vaikuttanut kahden solun alaryhmille (CD133 (+) ja CD133 (-) solut). Trypaanisinistä solujen määrä suoritettiin sen jälkeen, kun meillä on merkitty alikvootit käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen monoklonaalista vasta-ainetta vastaan, CD133 /2 (glykosyloitu epitooppi 2). Fluoresenssin solulajittelulla analyysi suoritettiin määrittämiseksi positiivisten solujen prosenttiosuus on CD133 ja laskea määrän CD133 (+) solujen koko väestöstä jokaiselle käsitellylle näytteelle. Kuvio 2C esittää, että hoitojen EPA vähensi merkittävästi (p 0,05) määrä CD133 (-) solut (bulk of kasvain), klo fysiologinen pitoisuus 25 uM. Mielenkiintoista, CD133 (+) CSLCs väestöstä vain hädin tuskin vaikuttavat samat pitoisuus EPA (25 uM), joka alensi soluun numero CD133 (-) alaryhmästä. Hoidon SA, joka on tyydyttynyt rasvahappo, ei merkittävästi muutu myöskään CD133 (+) tai CD133 (-) solujen lukumäärä (kuvio 2D). Lopuksi osoitimme, että 25 uM EPA vähensi merkittävästi COLO 320 DM pääosa kasvainsolujen, mutta SA ei.

eikosapentaeenihappo aiheuttama lisäys paksusuolen epiteelin Differentiaatiomarkkerien, sytokeratiinivasta 20 ja Mucin 2 , mRNA: n ekspressio väheni CSLCs markkeri, CD133

välituote filamentti sytokeratiinivasta 20 ilmentyy epiteelisoluissa ruoansulatuskanavassa. CK20: n on osoitettu vaimentua tai sen ilmentymistä on täysin menetetty useissa paksusuolen syövän potilaan näytteitä verrattuna viereiseen normaaliin limakalvoon [35] – [37]. Vastaavasti, MUC2 on vähemmän ilmaistuna peräsuolen adenokarsinooma, kun taas sen ilmentyminen säilyy normaalin kudoksen vieressä maligniteetin [38] – [40].

CD133 on raportoitu erikseen merkitä pieni erilaistumattoman väestön kasvaimen aloittamista solut paksusuolensyöpä [4], [7] ja on yhteydessä huonoon ennusteeseen kehittyneen paksusuolisyövän [10], [11]. Ymmärtää, jos EPA muunneltu geeni ilmentymistä CK20, MUC2, ja CD133, käsittelimme COLO 320 DM 48 ja 96 tuntia 25 uM EPA, SA, tai ajoneuvon ohjaus. Havaitsimme, että EPA indusoi kasvua suhteellinen mRNA-tasojen ja CK20, löytyy sekä suoliston ja pikarisoluissa (kuva 3A), ja pikarisolujen markkeri MUC2 (kuvio 3B), verrattuna vehikkelillä hoidettuihin soluihin. Havaitut vaikutukset olivat tilastollisesti merkitseviä sekä 48 ja 96 tuntia CK20 ja 96 tuntia MUC2. Havaitsimme myös, että EPA aiheuttama lasku ilmaus CD133 CSLCs markkeri 48 ja 96 tuntia (kuvio 3C) (p 0,05 ja 0,01). SA (kuvio 3A, 3B) laski merkittävästi CK20 48 tunnin hoidon vaikuttamatta MUC2 ilmaisua. Havaitsimme myös, että SA, toisaalta, lisääntynyt CD133 RNA ilmaisu (kuvio 3C) 96 tunnin hoidon jälkeen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että omega-3 on pro-eriyttäminen vaikutus COLO 320 DM soluja.

COLO 320 DM soluja käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (CTRL VH) ja 25 uM EPA tai SA 48 ja 96 tuntia . Kokonais-RNA uutettiin ja Real-Time RT-PCR suoritettiin tutkimaan suhteellinen muutos geenin ilmentymisen spesifisiä markkereita verrattuna p-Actin. Ilmentyminen erilaistumisen markkereita (A) sytokeratiini-20 (CK20), joka on enterosyyttien ja pikarisoluissa markkeri, (B) Mucin-2 (MUC2) pikarin solujen markkeri, ja (C) paksusuolen syövän kantasoluja kaltaisten solujen merkkilankaan CD133 olivat tutkittu käsittelyjen jälkeen ajoneuvon ohjaus (CTRL VH), EPA tai SA. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD vähintään kolmen kokeen.

p

arvot laskettiin Studentin t-testiä käsitellyissä näytteissä vs. CTRL VH (* p≤0.05, ** p≤0.01).

25 uM eikosapentaeenihappo kasvaa sytokeratiinivasta 20 proteiinisynteesiä ja vähentää CD133 in Colo320 DM soluissa

Voit selvittää muutoksen mRNA ilmaisun korreloivat vaikutusta CK20, Mucin 2, ja CD133 proteiinisynteesiä, poimimamme kokonaisproteiinipitoisuus COLO 320 DM seuraavia hoitoa 48 ja 96 tuntia ajoneuvon, EPA ja SA 25 uM. Kuten ennusti Real Time PCR analyysi, CD133 proteiini oli merkittävästi vähentynyt 96 tunnin kuluttua EPA hoito (kuvio 4A ja B). Havaitsimme, että 48 ja 96 tuntia sytokeratiinivasta 20 proteiinin tasot olivat merkittävästi korkeammat 25 uM EPA käsitellyissä soluissa verrattuna ohjata ajoneuvon tai SA hoitoon (kuvio 4A ja C) ovat osoituksena western blot-analyysi. Havaitsimme myös, että liman 2-proteiinin tasot eivät muuttuneet 48 ja 96 tuntia dot blot analyysissä 25 uM EPA käsitellyissä soluissa verrattuna ohjata ajoneuvon tai SA hoitoon (kuvio 4A ja D). Tarkistaa spesifisyys muc-2-vasta-ainetta, jota käytettiin dot blot-analyysi, teimme peptidin kilpailun määritys ja ovat osoittaneet, että 300-kertainen ylimäärä peptidin kilpaili tehokkaasti sitoutumisesta vasta-aineen muc-2 on läsnä solu- lysaatin .

(A) Yhteensä lysaattia saatiin COLO 320 DM soluja käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (CTRL VH), 25 uM EPA tai SA 48 ja 96 tuntia. Western blot suoritettiin ekspression tutkimiseksi sytokeratiini-20 (CK20) ja CD133 käsittelyn jälkeen rasvahapot. Dot blot suoritettiin ekspression tutkimiseksi Mucin 2 (MUC2) käsittelyn jälkeen rasvahapot. Peptidi sama kuin se, jota käytetään generoimaan Muc-2-vasta-ainetta käytettiin peptidin kilpailun sen määrittämiseksi MUC2-vasta-aineen spesifisyyden. Muutokset (B) CD 133, (C) CK20, ja (D) MUC2 proteiinin ilmentymisen suhteen p-Actin edustavat kolmea erillistä koetta. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD vähintään kolmen kokeen.

p

arvot laskettiin Studentin t-testiä käsitellyissä näytteissä vs. CTRL VH (* p≤0.05, ** p≤0.01).

Yhteenvetona havaitsimme, että EPA lisäsi proteiinin ilmentymistä merkkiaineen eriyttäminen CK20, ja vähentynyt ilmentyminen markkeri stemness CD133 vuonna COLO 320 DM soluja.

esikäsittely 25 uM eikosapentaeenihappo herkkyys kasvaa COLO 320 DM yhteensä väestö ja CSLCs 5-fluorourasiili

kyky omega-3-rasvahappoja tehokkuuden parantamiseksi syöpälääkkeiden sekä

in vitro

ja

in vivo

bulkkilääkeainees- kasvaimen solut on aikaisemmin raportoitu [15], [18], [19], [22], [23], [31]. Kuitenkin edelleen ilmoittamatta ovat kemiallis-herkistävät vaikutukset EPA irto- kasvaimen verrattuna vaikutuksia CSLCs väestössä standardi-of-care syöpähoitoihin.

Tässä työssä tutkittiin, esikäsittely EPA kasvaa kemoterapiassa vaste standardin-of-care syöpälääkkeiden molemmissa irtotavarana kasvainsolujen ja CSLCs väestön viljellään COLO 320 DM soluja.

Huomasimme, että 2,5 uM tai 10 uM oksaliplatiinin johti solujen elinkelpoisuus 75,88 ± 3,23% (IC

25) tai 53 ± 1,18% (IC

50) ohjaus (kuvio 5A). Olemme havainneet, että 100 uM ja 1,5 mM 5-fluorourasiili laski COLO 320 DM solujen elinkelpoisuuden 74,48 ± 4,85% (IC

25) ja 52.90 ± 1,09% (IC

50) ohjaus (kuvio 5B).

(A) COLO 320 DM-soluja käsiteltiin eri Oksaliplatiini (0,005-+0,1 mM) tai 5-fluoriurasiili (0,05-2 mM) pitoisuuksina määrittämiseksi inhiboiva konsentraatio 25% (IC25) ja 50% ( IC50). (B) Soluja COLO 320 DM koko väestöstä oli esikäsitellään 48 tuntia 25 uM EPA tai SA. Jälkeenpäin solut altistettiin 24 tunnin ajan Oksaliplatiini (

IC25, 2,5

uM; IC 50, 10

uM

) ja 5 Fluorouracil (

IC25, 100

uM, IC 50, 1,5

mM

). (C) CD133 (+) solut magneettisesti lajiteltuna koko väestöstä COLO 320 DM ja esikäsiteltiin 48 tuntia 25 uM EPA tai SA ja sitten altistettiin 24 tunnin IC25 ja IC50 oksaliplatiiniannosten ja 5-fluorourasiilia. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD vähintään kolmen kokeen.

p

arvot laskettiin Studentin t-testiä käsitellyissä näytteissä vs. CTRL VH (* p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001).

sen määrittämiseksi, n-3 PUFA pystyi lisäämään herkkyyttä koko väestöstä COLO 320 DM solujen kemoterapia, me pinnoitettu ja esikäsitelty soluja kuten aiemmin 25 uM EPA tai SA rasvahappo. 48 tunnin kuluttua poistimme median ja käsitelty soluja 24 tuntia aiemmin määritellyn IC25 ja IC50 pitoisuudet oksaliplatiinin ja 5-fluorourasiilin (kuvio 5 A ja B). Huomasimme, että EPA, mutta ei SA (kuvio 5C, vaaleanharmaa palkit), paransi tehokkuutta sekä kemoterapeuttisten (kuvio 5C, mustat palkit), suhteessa kontrollivehikkelillä.

määrittää, jos sama käsittely 25 uM EPA rasvahappojen samat vaikutukset CLSCs vastaus kemoterapiaa, testasimme kemosensitiivisyys magneettisesti järjestetty CD133 (+) COLO 320 DM solujen oksaliplatiinia ja 5-fluorourasiilia. CD133 (+) CSLCs esi-käsiteltiin 25 uM EPA 48 tunnin ajan, jota seurasi käsittely 24 tuntia oksaliplatiinin tai 5-fluorourasiilia. Kuten aiemmin osoitettiin muut [41], havaitsimme, että CD133 (+) CSLCs olivat resistenttejä antineoplastisia lääkkeitä testataan (kuvio 5D, tumman harmaat pylväät) verrattuna koko väestöstä (kuvio 5C, tumman harmaat pylväät). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että EPA esikäsittely (musta palkki), mutta ei SA (vaaleanharmaa bar) lisäsi merkitsevästi herkkyyttä CD133 (+) CSLCs 5-fluorourasiili, mutta ei oksaliplatiinille (kuvio 5D).

yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että EPA voimistaa 5-fluorourasiilin, joka on yksi ensimmäisistä linja standardi-of-care antineoplastisten aineiden, paksusuolen syöpä.

keskustelu

on