Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aim

p16

Metylointi tapahtuu usein karsinogeneesissä. Vaikka on oletettu, että

p16

metylaation valtiot ovat dynaamisesti yllä syöpäsoluissa, suora todiste tukee tätä hypoteesia ei ole ollut saatavilla tähän asti.

Methods

fuusio solumallin perustettiin joka ohjelmoida uudelleen natiivin DNA metylaatio soluihin. Metylaatiostatuksen

p16

alleelien oli sitten toistuvasti analysoitiin kvantitatiivisesti fuusio monoklonaalinen, vanhempien syöpäsolun linjat (

p16

-Täysin metyloitu-AGS ja metyloitumaton-MGC803), ja HCT116 ei- fuusiosolu käyttämällä DHPLC ja bisulfiitti sekvensointi. Histoni metylaatio analysoitiin chromatin immunosaostuksella (chip) -PCR. P16 ilmentymisen tila määritettiin käyttäen immuno-värjäystä ja RT-PCR: llä.

Tulokset

metylaatiostatuksen, että suurin osa

p16

alleelien säilyy pysyvästi fuusio monoklonaalinen solut jälkeen jopa 60 kohtia. Tärkeintä on, polttoväli de novo metylaatio, demetylaatio, ja hydroxymethylation olivat johdonmukaisesti havaittu noin 27%

p16

alleelit fuusio monoclones, mutta ei homozygously metyloituja tai metyloitumattomien vanhempien soluja. Lisäksi subkloonit monoclones johdonmukaisesti pitänyt kiinni

p16

metylaatiokuvion. Samanlainen ilmiö havaittiin myös käyttämällä

p16

hemi-metyloitu HCT116 ei-fuusio tasyöpäsolulinja. Mielenkiintoista, transkriptio ei havaittu

p16

alleelien, jotka hydroksimetyloitu antisense-juosteen-tietty kuvio. Myös tasot H3K9 ja H3K4 trimethylation fuusio solujen havaittiin olevan hieman pienempi kuin vanhempien AGS ja MGC803 soluja, tässä järjestyksessä.

Johtopäätös

Esillä oleva tutkimus on ensimmäinen suora todiste vahvistetaan, että metylaatio valtiot

p16

CpG saaria ei ole vain homeostatically säilyy, mutta myös liittyy dynaaminen prosessi ohimenevä polttoväli metylaation, demetylaatio, ja hydroxymethylation syöpäsoluissa.

Citation: Qin S, Li Q, Zhou J, Liu Zj, Su N, Wilson J, et al. (2014) homeostaattiseen huolto Alleelispesifisiä

p16

Metylointi syöpäsoluissa Mukana Dynamic Focal Metylointi ja Hydroxymethylation. PLoS ONE 9 (5): e97785. doi: 10,1371 /journal.pone.0097785

Editor: Jindan Yu, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 helmikuu 2014; Hyväksytty: 22 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 14, 2014

Copyright: © 2014 Qin et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat National Natural Science Foundation of China [Grant 31261140372 ja 81171900], National Basic Research Program of China [Grant 2011CB504201 ja 2010CB529303], ja Beijing Natural Science Foundation of China [Grant 7122033]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dajun Deng on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

DNA: n metylaatio pidetään yhtenä vakaimmista epigeneettiset muutoksia nisäkkäillä. Metylointi valtiot solujen erilaistumisen liittyvien geenien on osoitettu olevan erittäin dynaaminen aikana sukusolujen ja preimplantaation kehittämiseen, mutta tullut melko staattinen kehittämisen aikana somaattisten kudosten [1] – [3]. Sen sijaan metylointi valtiot isäntä sopeutumista liittyvien geenien pysyvän vahvoina somaattisten kudosten jotta oikea vastaus ympäristötekijä altistumisen ja myöhemmät synnyssä [4] – [6]. Hydroxymethylation DNA on kiinteästi mukana muuttamalla geenin metylaatiostatuksen ja on todettu paitsi avainasemassa DNA demetylaation, mutta myös palvella useita omia toimintoja [7], [8].

Kasvain vaimennin P16 koodaa ink4 /ARF lokuksesta ihmisen kromosomissa 9p21 on solusyklin säädin mukana eston G1 → S faasimuutoksen kautta P16-CDK4 /6-RB-reitin [9]. Paikka on kopiointia ajatellen vaiennetaan alkion kantasoluja, ja sillä on nopeutta rajoittava asema uudelleenohjelmointi aiheuttama pluripotenttien solujen [10]. Vaikka 9p21 fragmentti poisto on yleisin geneettinen muutos löytyy kaikista syövistä [11], hypermetylaatiota CpG-saarekkeiden on edelleen tärkein mekanismi p16 inaktivaatiomenetelmät useita ihmisen syövistä [12] – [14]. Itse asiassa, useita kohortin tutkimukset ovat osoittaneet, että p16-metylaatio tapahtuu varhaisessa vaiheessa karsinogeneesissä ja sen on osoitettu lisäävän merkittävästi riskiä malignin transformaation epiteelisolujen dysplasia [15] – [21]. Vaikka kausaalinen rooli p16 metylaation karsinogeneesis- ei ole osoitettu, todisteet viittaa vahvasti siihen, että p16-metylaatio saattaa edistää merkittävästi syövän kehitystä ja voitaisiin kehittää mahdollisesti biomarkkereiden [4]. Vaikka p16-metylaatio on yksi erittäin tutkittu epigeneettisiä muutoksia, sen vakaus syöpäsoluja ja mekanismi, jolla se pidetään ei ole vielä selvitetty [22] – [26]. Yksityiskohtainen ymmärtäminen kunnossapitokoneet mukana DNA: n metylaatio on kriittinen vaihe kehittämiseen metylaation biomarkkereiden ja epigeneettiset interventio terapia.

esiintyvyys p16 metylaation ihmisen krooninen gastriitti kudosten korreloi voimakkaasti helikobakteeri-infektio, ja dramaattisesti vähentynyt jälkeen helikobakteeri eradiation, mikä viittaa siihen, että suurin osa metyloituja-p16 alleelien ei ehkä vakaa [27], [28]. Sen sijaan, p16-metylaation viljeltiin normaaleissa ja syöpäsolujen on todennäköisesti hyvin stabiili, kun se on tehokkaasti talteen sen jälkeen, kun DNA: n metylaation inhibiittorin (5-atsa-CDR) poistettiin [29]. Kuitenkin aktivoituminen metylaatiospe- vaiennettu geenien havaittiin tietty osuus DNA metyylitransferaasi inhibiittori käsiteltyjä soluja. On vaikea sulkea pois sitä mahdollisuutta, että havaittu elpyminen p16 metylointituloksia valikoimasta etua soluihin ei suoriteta p16 uudelleen aktivoituminen /demetylaation aikana estäjä hoidon. Lisäksi äskettäin on raportoitu, että metyloitu CpG sivustojen p16-CpG-saarekkeiden sijaitsevat pääasiassa p16 eksoni-1 koodaavan nukleosomaalisten alueen ihmisen gastriitti vaurioita ja ulottuvat 5’UTR- ja promoottori nukleosomaalisten alueiden kehittämisen aikana mahakarsinoomat [26]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että täysin metyloitu-p16-alleelien saattaa olla vakaampi kuin fokaalisesti metyloitua alleelit; mutta tämä hypoteesi olisi edelleen testata käyttämällä monoklonaalisia soluja sisältäviä p16-alleelit monipuolisia metylaation, kuten polttoväli metylointi.

Solujen yhdistäminen on käytetty tutkimaan mekanismeja geenin transkription säätelyyn, ja DNA: n metylaatio muutos [24], [30]. Jotta voidaan vahvistaa soluun malli, joka sisältää erilaisia ​​p16 metylaation, mahalaukun syövän solulinja täysin metyloitu P16 (AGS) yhdistettiin p16-aktiivisen mahasyövän solulinja (MGC803) kautta solufuusio. Seuraavaksi nämä fuusiota solut kloonattiin ja alakloonattiin ennen jakelua metyloitu ja hydroksimetyloituun CpG sivustojen p16-CpG-saarekkeiden leimasi. Metylaatiostatuksen useimpien p16-alleelien fuusio solut pysyivät samoina kuin vanhempien soluja. Alhainen painopiste de novo metylaatio, demetylaatio, ja hydroxymethylation havaittiin myös fuusio soluissa; kuitenkin, nämä muutokset havaittiin olevan epästabiili tapahtumiin. Samanlainen ilmiö havaittiin myös käyttämällä p16 hemi-metyloitu solulinja HCT116. Nämä havainnot osoittavat, että metylaatio valtiot p16-CpG-saarekkeiden ovat homeostatically ylläpidetään syöpäsoluja. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen raportti siitä, että metylaatiostatuksen CpG-saarekkeiden on homeostatically ylläpidetään syöpäsolut eivät parhaillaan erilaistumista.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen mahalaukun syövän solulinja MGC803 viljeltiin RPMI 1640-väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää. AGS viljeltiin F12 -alustassa, jossa oli 10% FBS: ää. MGC803 [31] ja AGS (ATCC CRL-1739) solulinjat ystävällisesti professori Yang Ke Pekingin yliopisto Cancer sairaalan ja Institute. HCT116-solut ystävällisesti toimitti Dr. Yuanjia Chen, Peking Union Hospital (ATCC CCL-247), ja viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jossa oli 10% FBS: ää.

Generation vakaan fuusion solukloonien

pBabe-puro-(hygromysiiniresistenssin) ja pIRES2-EGFP (neomysiini /G418-resistenssin) vektorit transfektoitiin AGS ja MGC803 solut, vastaavasti, käyttäen LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, 11668-027), mukaisesti valmistajan ohjeiden. Puromysiinin (puromysiini

r + -AGS) ja G418 (neomysiini

r + -MGC803) valinta suoritettiin AGS ja MGC803 solulinjoissa seurasi kulttuurin F12 -alustassa, jossa oli 10% FBS ja puromysiinin (0,25 ug /ml) ja RPMI 1640-väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää ja neomysiinille (700 ug /ml), vastaavasti. Fuusio suoritettiin käyttäen PEG8000, kuten aiemmin on kuvattu [32]. Fuusion jälkeen soluja viljeltiin valinta alustalla, joka sisälsi sekä neomysiiniä (700 ug /ml) ja puromysiinin (0,25 ug /ml). Sen jälkeen valinta, yksittäiset pesäkkeet mono- kloonattu, ja sen jälkeen kolme kierrosta myöhemmin kloonauksen, viisi monoclones saatiin. Kaksi viidestä monoclones valittiin edelleen mono-kloonauksen.

Mikrosatelliitit

D9S974

ja

D9S1749

analyysi

alukeparilla

D9S974

(sense 5′-gagcc tggtc tggat cataa-3 ’; antisense 5′-aagct tacag aacca gacag-3’) ja

D9S1749

(sense 5′-aggag agggt acgct tgcaa-3 ”antisense, 5′-tacag ggtgc gggtg cagat aa-3 ’) käytettiin monistamaan

p16

alleelit (kuvio S1A). Genotyypit micorsatellites analysoitiin 80 ° C: DHPLC käyttämällä UV-detektoria (260 nm), kuten aiemmin on kuvattu [33].

Karyotyyppi analyysi

25 cm: n pulloon 60% solun yhtymäkohdassa käsiteltiin 0,2 ug /ml kolkisiinia 4 tuntia. Solut toipuivat trypsinaatiolla ja hoidon 75 mmol /l KCI ratkaisu 25 min. Solut kiinnitettiin (3:01 metanoli: etikkahappo), ja värjättiin Giemsa-värjäys.

DNA: n valmistus, bisulfiitti ja TAB hoidon

Genominen DNA uutettiin kudosnäytteistä fenoli /kloroformilla . Näytteet käsiteltiin 5 mol /l natriumbisulfiittia 16 tunnin ajan 50 ° C: ssa [34]. Sillä 5hmC analyysi, genomista DNA: ta käsiteltiin käyttäen TAB mukainen kitti valmistajan ohjeiden (WiseGene, Cat # K001) [35].

hydroksimetyloituun DNA-specific immunosaostuksella (hMeDIP) B

Genominen DNA sonikoitiin osaksi 200 emäsparin 600 emäsparin fragmentit käyttäen Bioruptor sonikaattoria (Diagenode). 100 ng sonikoitua DNA tallennettu syötönohjausmoduuli. Kukin näyte koostui 1 ug sonikoitua DNA: ta laimennettiin IP-puskuriin, ja inkuboitiin 4 ul anti-hydroxymethylcytosine (5hmC) vasta-ainetta (aktiivinen motiivi) 4 ° C: ssa yön yli. Vasta-aine-DNA-kompleksit otettiin käyttäen proteiini A /G-helmiä puhdistettiin sitten. PCR ajettiin kaikista näytteistä käyttäen 35 sykliä, joissa alukkeiden 5′-agtcct ccttc cttgc CAAC-3 ’ja 5′-tccga gcact tagcg aatgt g-3’. Metyloimattomat sytosiini, 5-metyylisytosiini, ja 5hmC DNA-fragmentteja käytettiin PCR ohjaa tarkistaa 5hmC rikastamiseen.

Kromatiini-immunosaostus (chip) määritykset

Tasot histonimodifikaation H3K9me3 ja H3K4me3 määritettiin käyttämällä ChIP määritykset, kuten on kuvattu [36].

PCR-monistukset

392 bp: n amplikoni antisense-juosteen

p16

eksoni-1 monistettiin CpG-free alukesarja (sense 5′-ttttt agagg atttg aggga Tagg-3 ’; antisense 5′-ctacc taatt CCAAT tcccc tacaa acttc-3’), kuten on kuvattu [37]. 588 bp amplikoni antisense-juosteen

p16

eksoni-1 ja promoottori monistettiin käyttämällä sMSP alukesettiä (sense 5′-ctacct aattc caatt cccct aca-3 ’; antisenses, 5’ CCAAT tcccc tacaa acttc g-3 ’, 5′-CCAAT tcccc tacaa acttc atcct ccaaa atcg-3′ ja 5’-CCAAT tcccc tacaa acttc atcct ccaaa atcac CCG-3 ’) [26]. 369 bp sense-juosteen

p16

eksoni-1 monistettiin CpG-free-alukesarja (sense 5′-gttgt agatt tttta tttat ttgga t-3 ’; antisense, 5’ tcccc ttacc taaaa aaata cc-3 ’) on hehkutus lämpötilassa 56 ° C. 284 emäsparin ja 346 emäsparin amplikoneja antisense-juosteet

p16

eksoni-2 ja introni-2 oli vastaavasti monistettiin CpG-vapaa alukesarjaa (sense, 5′-tggta ggtta tgatg atgggt maata- 3 ’; antisense 5′-aacat aatta ctacc tctaa taccc c-3′) ja (sense 5’-tttgt gggtt tgtag aagta ggtat g-3 ’; antisense 5′-cctaa tccaa caact AATCC actac c-3’) at hehkutus lämpötilassa 57 ° C.

metylointi kvantifiointiin CpG-saarekkeiden avulla DHPLC

392 emäsparin, 369 emäsparin, 284 emäsparin, 346 emäsparin PCR-tuotteita monistettiin universaali alukkeilla erotettiin käyttäen WAVE DNA fragmentti Analysis System, jossa fluoresenssi (FL) -detector (Transgenomic, Inc., OM, USA) 57,6, 55,0, 58,0, ja 57 ° C, vastaavasti [37], [38]. WAVE-HS1 FL-väriaine puskuria (Transgenomic, Inc.) käytetään parantamaan FL-intensiteetti PCR-tuotteiden (universal jälkeinen sarake merkinnät). Genomista HCT116 DNA: ta käytettiin standardina ohjaus.

Clone sekvensointi

PCR suoritettiin vetysulfiitilla muunnetulle DNA: ta. Amplikonien kloonattiin pCR-blunt -vektoriin (Invitrogen), transformoitiin

E. coli

, ja sekvensoitiin käyttäen ABI 3730 Analyzer.

p16

RT-PCR

p16

mRNA: ta havaittiin kuvatulla [12] .

P16 immunofluoresenssivärjäyksen

immunofluoresenssi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [39]. Lyhyesti, fuusio solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä /PBS: ssä 10 min ennen 5-min pesu PBS: ssä. Kiinteät näytteet blokattiin 30 min ajan 0,5% Triton X-100 /PBS: ää huoneenlämpötilassa. Soluja inkuboitiin anti-P16-vasta-aineen (Abcam, ab54210) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, sen jälkeen pestiin 0,5% Triton X-100 /PBS: llä, sitten inkuboitiin vuohen antikani-IgG-vasta-aine on leimattu rodamiinilla 1 h 37 ° C. DAPI (1:2000) käytettiin värjäämään solun tumaan. Kuvat otettiin Leica -konfokaalimikroskoopilla.

Tulokset

perustaminen ja luonnehdinta solun fuusion malli monipuolisesti metyloitu

p16

alleelien

Se on ollut raportoi, että heterokaryonit voi indusoida DNA: n metylaatio vaihtelun kautta, solufuusio kahden solulinjan [30]. Oletimme, että solufuusio malli sisältää eri metylaatio valtioiden p16-CpG-saarekkeiden voisi monistaa de novo metylaatio tai demetylaation prosesseja. Siten puromysiini

r + -AGS soluja, jotka sisälsivät täysin metyloitu-P16 alleelien ja neomysiini

r + -MGC803 soluja sisältäviä metyloitumattomien-p16 alleelien rakennettiin, vastaavasti. Nämä kaksi solulinjaa fuusioitiin sitten ja viljellään selektioelatusaineessa sisältävät sekä puromysiiniä ja neomysiini. Kolmen kierroksen jälkeen kloonauksen, fuusio monoclones leimasi kahdella mikrosatelliitteihin (D9S974 ja D9S1749) lähellä p16 lokuksen (kuvio S1A). Kaksi D9S1749 mikrosatelliitti kromatogrammi kuvioita (C7 /C9 /E10 ja D3 /E3) ja yksi D9S974 kuvio havaittiin 5 testattu monoclones poikkeavan malleja niiden vanhempien soluja. Kromosomi tila oli myös eroa edustavan kloonin E10 (lähes tetraploidiset) ja sen vanhempien soluja (lähes diploidi) (Kuva S1B).

Stable ylläpito täysin metyloitu ja unmethylated-

p16

alleelit syöpäsoluissa

metylaatiostatuksen p16-CpG-saarekkeiden (392 bp) analysoitiin kvantitatiivisesti näiden fuusio-kloonit käyttämällä DHPLC määritystä kuten aiemmin on raportoitu [37]. Kuten nähdään p16 hemi-metyloitu HCT116-solujen suhde methylated- metyloimatonta-p16-molekyylejä oli noin 01:01 näiden fuusio-kloonia (kuvio 1A-vasemmalla). Osuus Metyloitujen-p16 alleelien säilyy pysyvästi edustaja klooni kohdista 45, 50, 55, ja 60 (kuvio 1A-oikea). Lisäksi RT-PCR: llä havaittiin p16-mRNA: n kaikki 5 testattu kloonia (kuvio 1 B). Nucleoplasmic P16 proteiini havaittiin myös jokaisessa solussa kahdessa edustavaa monoclones (C9 ja E3) (kuvio 1 C). Tämän tiedon perusteella on selvää, että transkriptio /metylaatio valtioiden p16 alleelien fuusio solujen todennäköisesti ylläpidetään samaa kaavaa niiden vanhempien soluihin.

(A) metylaatio valtiot

p16

CpG saaria fuusio monoclones analysoitiin DHPLC (vasemmalla). Osuus methylated-

p16

vuonna monokloonausta-E10 stabiilisti yllä kohdissa 45, 50, 55, ja 60 (oikealla). (B) RT-PCR näyttää vaihtelevan mRNA ilmaus

p16

fuusio monoclones ja niiden vanhempien MGC803 ja AGS solulinjoissa. (C) konfokaali immunosolukemialliset värjäys osoittaa vaihtelevia P16 ilmentymistä eri solulinjoissa.

fokaalisesti metyloitu

p16

alleelit eivät ole stabiileja syöpäsoluissa

Mielenkiintoista, kun taas useimmissa p16 molekyylit jäänyt kokonaan metyloituja tai metyloitumattoman valtioiden edustaja fuusio klooneista sisälsi noin 27% (13/48) fokaalisesti methylated- (tai demethylated-) p16 molekyylien eksoni-1 alue (kuvio 2B). Kuitenkin homozygously metyloituja tai metyloimattomien vanhempien solut eivät näytteille samaa metylaatiomuutokset. Sen varmistamiseksi, että testattu klooni oli itse asiassa monoklonaalinen, tätä kloonia edelleen subkloonattiin. Tarkempi analyysi paljasti, että p16 metylaatiovyöhykkeiden kaksi subklooneja pysytellyt samanlainen niiden vanhempien klooneja (kuvio 2C ja kuvio S2).

(A) bisulfiittimodifiointi klooni sekvensoimalla 392 emäsparin fragmentti

p16

CpG saari AGS ja MGC803 soluja; Jokainen vihreä palkki edustaa CpG sivusto. Nukleosomaalisten paikalla eksoni-1 on merkitty myös (26). (B ja C) bisulfiittimodifiointi sekvensoinnin fuusio monokloonausta-E3 ja alakloonit. Focal metylaatiomuutokset (keltainen-varjostama); metyloitu CpG sivustoja (punainen piste); metyloimattoman CpG sivustoja (avoin piste); fokaalisesti methylated- tai demethylated-

p16

molekyylejä (mustat nuolet). (D) homeostaattisina metylaatio malli yhden CpG saari tetraploidien soluissa.

yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) (rs36228836) tunnistettiin p16 promoottorialueen. Määritettiin, että genotyypin tämän SNP poikkesi kahden kantasolulinjoista (T /A MGC803 ja T /T ja AGS), jolloin on mahdollista tunnistaa MGC803-spesifinen p16 A-alleelien fuusio-soluissa (kuvio S3). Sen selventämiseksi, onko nämä fokaalisesti metyloitu fragmentit olivat seurausta de novo metylaatio tai demetylaation, metylaatio valtioiden sisällä 588 emäsparin fragmentti, joka kattaa tämän SNP analysoitiin käyttämällä kylväminen metylaatiospesifistä PCR (sMSP). Havaittiin, että CpG-metylaation p16 alleelien metylointi ”kylvö” sivustojen introni-1 oli tehokkaasti rikastettu [26]. Tulokset bisulfiitti-sekvensointi vahvisti, että polttoväli de novo metylaatio havaittiin MGC803 tiettyjä A-alleelin monokloonausta-D3 (kuva S3).

Tutkiakseen, onko ohimenevä fokaalisesti metyloitu-p16-alleelien olemassa ei-fuusio-solut, metylaatio p16 hemi-metyloitu HCT116-solulinjaa analysoitiin myös. Vastaavasti, 16% (8/49) ja p16-molekyylit osoittivat polttoväli metylaatio HCT116-soluissa (kuvio 3). Lisäksi käyttämällä del /ins lukeminen heistusmutaation löytyy eksoni-1 koodaavan alueen geenimerkkinä, todettiin, että sekä kansallisen de novo metylaatio mutantti G-insertion alleelien (lähinnä metyloitumaton) ja demetylointi villityypin alleelit (pääasiassa metyloitu) esiintyy myös satunnaisesti, että HCT116-solujen (4/26 ja 4/23, vastaavasti). Tämä osoittaa, että polttoväli metylaatio ja demetylaation p16-alleelien on todella olemassa ei-fuusio syöpäsoluja. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikka polttoväli metylaatio ja demetylaatio ovat suhteellisen yleisiä tapahtumia, useimmat täysin methylated- ja metyloitumattomat-p16-alleelien on ylläpitää stabiilisti syöpäsoluja.

(A) bisulfiittimodifiointi klooni sekvensoimalla 392 emäsparin fragmentti

p16

CpG saari HCT116-soluissa. Villityypin (

poisto

) /mutantti (G-

lisäys

)

p16

alleelit; fokaalisesti demethylated-

p16

molekyylejä (mustat nuolet); fokaalisesti

de novo

metyloitu molekyylejä (punaiset nuolet). (B) homeostaattisina metylaatio malli yhden CpG saari diploidisoluissa.

Jotta tutkia, polttopiste metylaatio /demetylaatio esiintyy geenin rungon olemme analysoineet metylaatio valtioiden CpG saarten p16 eksoni-2 ja introni-2. DHPLC-analyysi paljasti, että nämä kaksi CpG-saarekkeiden oli täysin metyloitu AGS, MGC803, ja HCT116-solut (kuvio S4A B), ja bisulfiitti-sekvensointi introni-2-CpG-saarekkeen vahvisti DHPLC tulokset (kuvio S4C), mikä viittaa siihen, geeni kehon on homogeenisesti ja stabiilisti metyloitu näissä soluissa eikä siihen polttoväli metylaatio /demetylaation.

samanaikainen 5-hydroxymethylation tapahtuu

p16

alleelin fuusio solujen

DNA: n metylaation ja hydroxymethylation voida helposti derivoiduksi säännöllisiä bisulfiitti-pohjainen metylaatio määrityksissä. Rooli hydroxymethylation polttopisteessä p16 metylaatio tai demetylaatio tutkittiin käyttäen hMeDIP-PCR (kuvio 4A, vasemmalla kaavio). Tulokset Tämän määrityksen osoittivat, että määrä hydroksimetyloituun-p16-DNA: n kahden fuusion klooneista oli merkittävästi korkeampi kuin niiden kantasolujen (kuvio 4A, oikealla kaavio).

(A) Immuno-saostus ja PCR-analyysi synteettiset ja solujen 5hmC sisältävien

p16

sekvenssit. AGS ja fuusio monokloonausta-D3 ja E3 soluissa näkyy merkittäviä määriä 5hmC. (B) TAB-seuraavissa analyysi osoittaa täysin hydroxymethylated-

p16

alleelit fuusio alaklooneja, mutta ei vanhempien soluja. (C) TAB-seuraavissa analyysi HCT116-solujen osoittaa useimpien villityypin

p16

alleelit ovat täysin hydroksimetyloituun.

Tet-assistentti bisulfiitti sekvensointi (TAB-kohdat) pystyy erityisesti havaitaan 5-hydroksi metyylisytosiinin (5hmC) in DNA yhden emäksen resoluutio [35]. Käyttämällä tätä määritystä analysoida 5hmC pitoisuus p16-CpG-saarekkeiden yksityiskohtaisesti, havaittiin, että AGS soluilla satunnaista hydroksimetyloituun CpG: t on hyvin matala taajuus (21/700), kun taas MGC803 solut eivät osoittaneet mitään hydroxymethylation. Kuten odotettua, sekä täydellinen ja polttoväli hydroxymethylation p16-alleelit havaittiin näiden fuusio-soluissa (kuvio 4B). Tulokset kahdesta määritysten johdonmukaisesti osoittavat, että hydroxymethylation voi olla rooli homeostaattiseen ylläpitoon p16 metylaation fuusio soluissa.

analyysi HCT116-solujen yllättäen osoitettu toistuvia ja täydellinen hydroxymethylation sisällä antisense-juosteet p16 villityyppisen (del) alleelit (11/14), mutta ei G-insertion mutanttialleelit (kuvio 4C). Vaikka metylaatio havaittiin 369 emäsparin fragmentti sense-juosteen p16 eksoni-1 in HCT116-soluissa odotetusti (kuvio 5A-C), erityisesti, täydellinen hydroxymethylation ei havaittu siinä mielessä-säikeiden sekä TAB-DHPLC analyysi ja TAB-sekvensointi (kuvio 5C ja D), mikä viittaa antisense juostespesifisen hydroxymethylation.

(A) sijainti 369 emäsparin amplikoni sense-juosteen

p16

eksoni-1. (B) toteaminen 369 emäsparin PCR-tuotteita käyttämällä DHPLC (mitoitus muoto) 48 ° C: ssa. (C) havaitseminen hydroksimetyloituun molekyylien monistettiin

p16

sense-juosteen jälkeen TAB muutoksen avulla DHPLC (FL ilmaisin) on osittainen denaturointi 55 ° C: ssa. Tässä kunnossa, hydroxymethylated- ja unhydroxymethylated-

p16

molekyylit ovat osittain ja kokonaan denaturoitua, vastaavasti. Säännöllinen bisulfiitti saaneista malleja käytetään viitteenä valvontaa. (D) tulokset TAB-sekvensointi varten 369 emäsparin PCR-tuotteita monistettiin HCT116 soluista.

Sen määrittämiseksi, jos täysin hydroksimetyloituun villityypin p16-alleelit ovat kopioinnin suhteen aktiivisia, alleelin-alkuperä p16 selostukset leimasi klooni sekvensoimalla. Tulokset sekvensointi paljasti, että yksikään 48 p16 mRNA-molekyylit transkriboidaan villityypin p16-alleelit, jotka olivat epäsymmetrisesti metyloitu ja hydroksimetyloituun (M:H) (kuvio 6). Tämä tieto osoittaa, että hydroxymethylation antisense säikeen p16 alleelien ei saa johtaa transkriptionaalisen aktivaation geenin.

(A) RT-PCR-klooni sekvensoimalla kontrolli 293T solulinja (del) esittää villityyppisen

p16

mRNA. HCT116 (G-ins) solulinjassa havaittiin vain mutantti

p16

mRNA klooneja. (B) Klooni sekvensoinnin tulokset osoittavat sekä villityypin ja mutantti p16 mRNA.

samanaikainen histoni H3K4 ja H3K9 trimethylation klo

p16

alleelien fuusio soluissa

ChIP -PCR käytettiin määritetään kvantitatiivisesti tasot aktiivisen H3K4me3 ja tukahduttavia H3K9me3 fuusio-soluissa (kuvio 7). H3K4me3 tasolla heterogeenisesti metyloituneiden p16-alleelien fuusio Subkloonien havaittiin olevan merkittävästi pienempi kuin havaittiin täysin metyloitumattomien alleelien MGC803 soluja. Lisäksi taso H3K4me3 eksonissa-1 kromatiinin oli määritetty olevan suurempi kuin havaittiin promoottori kromatiinin. Vaikka H3K4me3 ei havaittu AGS soluissa H3K9me3 taso oli huomattavasti suurempi tässä solulinjassa kuin muut solulinjat. H3K9me3 taso osoitti käänteinen korrelaatio H3K4me3 tasolla näistä solulinjoista.

(A) Aktiivinen H3K4me3 tasolla

p16

CpG saaria fuusio alaklooneja ja MGC803 soluja oli huomattavasti korkeampi kuin AGS soluja, etenkin eksoni-1 alue (monoclones vs. AGS, P 0,01). (B) toinen tukahduttava H3K9me3 tasolla fuusio alaklooneja ja AGS soluja oli huomattavasti korkeampi kuin MGC803 soluja, etenkin promoottorialueen (monoclones vs. MGC803, P 0,01).

Keskustelu

DNA metylaatio on tunnettua muuttaa dynaamisesti erilaistumisen aikana alkion kantasoluja ja kehittäminen kudosten selkärankaisissa. On kuitenkin edelleen arvoitus, miten metylaatio valtioiden genomin säilyvät soluissa enää käynnissä erilaistumista. Esillä olevassa tutkimuksessa todettiin, että metylaatio valtioiden täysin methylated- ja unmethylated-

p16

alleelien pysyivät vakaina solujen lisääntymistä. Lisäksi alhainen polttoväli demetylaatio, hydroxymethylation, ja

de novo

metylaatio esiintyi suhteellisen usein kahdenlaisia ​​

p16

hemi-metyloitu syöpäsolun malleja, mutta ei yhdenmukaisesti metyloituja tai metyloitumattomien soluja. Nämä havainnot merkitsevät sitä, että homogeeninen metylaatio voidaan kohdistaa tukahduttaminen painetta

p16

geeni, joka voidaan ainakin osittain vaikuttaa aiemmin metyloimattoman CpG saaria. Sitä vastoin transkription aiheuttama paine täydellinen demetylaation geenin kykenee indusoimaan ja ylläpitää demetylaation

p16

-CpG-saarekkeiden. Hydroxymethylation on

p16

CpG alleelit havaittiin myös pelata rooli homeostaattiseen ylläpitoon genomin metyloinnin. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti osoittaa, että metylaatiostatuksen kasvainsuppressorigeenin on homeostatically ylläpidetään syöpäsoluissa.

vakaus metyloituneiden p16 alleelien ei ole vielä selitetty. Gastriitti vaurioita, metylointi valtiot useimmat p16-alleelien ovat epävakaita ja helikobakteeri-riippuvainen [27], [28]; kuitenkin, syöpäsolulinjoissa ne ovat osoittautuneet edelleen huomattavan vakaana [29]. Viimeaikaisten kattava sekvensointi paljastivat, että metyloitu CpG sivustoja gastriitti sijaitsevat eksonin 1 alueella p16-geenin, mutta ulottuvat promoottorialueen kehittymisen jälkeen mahalaukun syöpä. Tämä merkitsee sitä, että täysin metyloidut-p16-alleeleja ovat huomattavasti stabiilimpia kuin niiden fokaalisesti metyloitu kollegansa [26]. On myös raportoitu, että heterokaryonit voi indusoida DNA: n metylaatio vaihtelut kautta solufuusio kahta solulinjaa, ja lisäksi, että jotkut vaiennettu-p16-molekyylejä hiiren syöpäsoluja voidaan aktivoida sen jälkeen, kun on fuusioitu p16-aktiivisia hiiren alkion kantasoluja [30], [39]. Esillä olevassa tutkimuksessa, fuusion, jotka sisältävät monenlaisia ​​p16 metylaatiovyöhykkeiden vakiinnutettiin homozygously metyloidut ja metyloitumattomat vanhempien solulinjoja, jotta tutkimiseksi vakautta fokaalisesti ja täysin metyloidut-p16-alleeleja samassa solussa. Kuten odotettua, p16-alleelien fuusion solut osoittivat täydellisen ja vaihteleva valikoima metylaation. P16 alleelit fuusio klooneista ja niiden subkloonit pysyi vakaasti hemi-metyloitu aikana solu kohtia, jotka osoittavat, että nämä täysin metyloidut ja metyloitumattomat p16 alleelit ovat suhteellisen vakaita. Toisaalta, hemi-metyloitu fuusio klooneista ja HCT116-solut osoittivat vähäistä fokaalisesti metyloitua /demetyloidaan-p16-alleeleja, jotka tarjoavat suoraa näyttöä siitä, että hemi-metyloitu p16-alleelit ovat vähemmän stabiileja kuin homogeenisesti metyloituneiden p16-alleeleja. Tämä dynaaminen, mutta silti homeostatic, mety- p16-CpG-saarekkeiden voi tarjota yhteinen mekanismi selittää DNA: n metylaation kunnossapidon erilaistumista staattinen soluissa. Lisäksi kaksi CpG saaret p16 eksonin 2 ja introni-2 ovat homogeenisesti metyloitu HCT116, AGS, ja MGC803 soluja, joten on todennäköistä, homeostaattiseen ylläpito p16-metylaatio oli havaittavissa ainoastaan ​​sen promoottori /eksoni-1 alue näissä soluissa. Koska on olemassa monia hemi-metyloitu alueita genomissa läsnä, kuten X-kromosomia naisten solujen ja painettu geenit, jatkotutkimuksia siitä polttoväli, ohimenevä metyloinnin ja demetylaatio ovat yleisiä ilmiöitä homeostaattiseen ylläpito DNA: n metylaatio on varmasti perusteltua.

5hmC on keskeinen rooli aktiivista DNA demetylaatio välituotteena sarja metyylisytosiiniä hapettumista. Kuitenkin tietty osuus 5hmC ei hapetetaan edelleen, mutta ei sen sijaan ylläpidetään genomissa aikuisen kudoksissa, kuten aivojen ja paksusuolen. Vaikka lisätoimintoja 5hmC genomissa ole tiedossa, se todennäköisesti olevan tärkeä tehtävä. On raportoitu, että hydroxymethylation sekä promoottorin ja geenin sisäinen paikoissa korreloi positiivisesti geenien ilmentyminen [40]. Yleensä CpG saaret eivät metyloitavaa alueilla ympäri transkription aloituspaikkoja aktiivisesti puhtaaksi geenejä, mutta metyloituvat geenin elin. Viime aikoina on raportoitu, että hydroxymethylation genomissa aivojen on TET2-riippuvainen ja hydroxymethylation havaitaan mielessä-säikeiden kuin antisense-juosteet aktiivisesti kopioitu geeni elinten [41], [42].