Krooninen sairaus

tiivistelmä

virtsarakon syövän synnyn arvellaan noudattaa kahta vaihtoehtoista tietä ohjaavat menetys kromosomin 9 ja voitto kromosomissa 7, vaikkakin muut sattumanvaraisen kopioluvun muutokset (CNAs) tunnistettiin. Kuitenkin vahvistus tutkimuksia tarvitaan, koska monia näkökohtia tämän mallin edelleen epäselviä ja huomattava heterogeenisuus tapauksissa on syntynyt. Yksi tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida suorituskykyä testimarkkinointi (UroVysion määritys) käytetään laajasti havaitsemiseksi Siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) virtsarakon, kahdessa eri materiaaleille peräisin samasta kasvain. Vertasimme tuloksia UroVysion testi suoritettiin juuri eristettyjä faasien Nuclei (FIN) ja Formaliini Kiinteä parafiiniin (FFPE) kudoksiin 22 TCC: t ja emme löytäneet merkittäviä eroja. Toisena tavoitteena oli arvioida välistä yhdenmukaisuutta array-CGH profiilit ja kohdennettua kromosomi profiilit UroVysion assay ylimääräinen 10 TCC: t, jotta voidaan arvioida, onko UroVysion on riittävän herkkä menetelmä tunnistamiseksi valittujen aneuploidioiden ja sattumanvaraisen CNAs vuonna TCC: t. Tuloksemme vahvistivat, että on tärkeää maailmanlaajuisen genomi- seulontamenetelmiä, että on joukko perustuva CGH, kattavasti määrittää genomisen profiilien suuren joukon TCC: t kasvaimia. Kuitenkin tämä tekniikka on vielä joitakin rajoituksia, kuten ei pysty havaitsemaan alhainen mosaicism tai ei havaita mitään muutosta kopioiden määrä eräänlainen kompensoiva vaikutus johtuu läsnäolo korkean solujen heterogeenisyys. Näin ollen on edelleen suositeltavaa käyttää täydentäviä tekniikoita, kuten array-CGH ja FISH, kuten entinen pystyy havaitsemaan muutoksia genomin tasolla ei kuitenkaan mitään kromosomi, mutta se pystyy säilyttämään yksittäisten tietojen tasolla single solut, vaikka se keskittyy muutaman genomialuetta.

Citation: Panzeri E, Conconi D, Antolini L, Redaelli S, Valsecchi MG, Bovo G, et ai. (2011) kromosomipoikkeavuuksia virtsarakon syövän: Tuore versus Formaliini parafiiniin upotetun Tissue ja Kohdennettu FISH versus Wide Microarray-Based CGH analyysi. PLoS ONE 6 (9): e24237. doi: 10,1371 /journal.pone.0024237

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 8. kesäkuuta, 2011; Hyväksytty: 03 elokuu 2011; Julkaistu: 1. syyskuuta 2011

Copyright: © 2011 Panzeri et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Associazione Gianluca Strada Onlus ja Lombardian alueella, soita kohti progetti indipendenti vuonna Ambito Oncologico 2009. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on seitsemänneksi yleisin syöpä maailmassa [1] ja neljänneksi yleisin syöpä diagnosoidaan miesten USA ja Euroopan maat [2]. Siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) käsittää enemmistön virtsarakon syöpien osuus on yli 90%. Esittelystä, suurin osa (~ 70%) ovat pinnallisia, exophytic, papillaarinen kasvaimia, jotka ovat hyvin eriytetty (low-grade, LG) ja eivät läpäise epiteelin tyvikalvon (vaihe Ta) [1], [3]; loput ovat lihas invasiivisia (T2-T4) tai microinvasive kasvaimet (T1), jotka ovat tunkeutuneet lamina proprian mutta eivät valtaavat lihas. Tässä vähemmistö, kasvain epiteelin huonosti eriytetty (high-grade, HG) ja liittyy usein kohdunkaulan

in situ

(CIS), joka huolimatta pinnallisuudellaan koostuu huonosti eriytetty epiteelin. Tämän on ajateltu olevan edustaa esiasteleesio [1]. Ennuste LG Ta kasvaimia on yleensä hyvä, koska tällaiset kasvaimet harvoin edetä, mutta seuranta on tarpeen, koska tarkasteltavana uusiutumisen riskiä (jopa 70%) [4]; Tämä on tarpeen myös HG Ta (TAG3) ja T1 kasvaimia, jotka edustavat suuri vaara eteneminen lihasten hyökkäystä. Potilaille lihasten invasiivisia kasvaimia (≥T2), etäpesäke on merkittävä kliininen ongelma, ja cystectomies yleensä merkitty. Ennuste on melko huono ja vain 50% 5 vuoden kohdalla, koska diagnoosi [4].

biologiset erot näiden ryhmien heijastaa todennäköisesti taustalla geneettinen heterogeenisyys, joka johtaa tiettyihin polkuja kasvaimen kehittymistä ja etenemistä. Lukemattomat tutkimukset ovat jäljittää asema tunnettujen onkogeenien ja kasvainten synnyssä ja ovat paljastaneet useita toistuvia kromosomimuutoksia liittyvät patologisen vaiheessa ja /tai tuloksesta kasvain [5], [6]. Lisäksi perustuu tunnettu geneettisiä muutoksia virtsarakon syövän, multi-kohde fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH) määritys on kehitetty [7]. UroVysion FISH tunnistusjärjestelmä, hyväksynyt Yhdysvaltain Food and Drug Administration, perustuu kolmeen sentromeerisen koettimia kromosomien 3, 7 ja 17 ja neljäs koetin on 9p21 alueelle, havaitsemiseksi kromosomi aneusomy ja /tai poistaminen 9p21-lokuksen , jotka ovat yhteisiä geneettisiä muutoksia TCC: t [8], [9]. UroVysion on alun perin käytetty viime vuosikymmenellä ainoastaan ​​valvontaa varten, mutta viime aikoina myös virtsarakon syövän seulonta väline potilaille, joilla hematuria [10] – [12]. Kuitenkin muita menetelmiä on sovellettu havaita kopioluvun muutoksia, jotka liittyvät kasvaimen kehittymistä ja etenemistä TCC. Tavanomaiset vertaileva genominen hybridisaatio (CGH) tuloksena saatiin paljon tietoa, kuten tunnistaminen useiden genomialueiden DNA vahvistus sisältää tunnettuja tai ehdokas onkogeenien [13] – [15]. Toisaalta, sijainnin tuumorisuppressorigeeneille in TCC on suurelta osin tunnistetaan heterotsygoottisuuden menetys (LOH) -analyysi [16]. Käytön kanssa korkean resoluution kartoitus array-pohjainen CGH, novel kopioluvun muutokset (CNAs) tunnistettiin monissa pienissä genomialuetta, joita ei havaittu aiemmissa tutkimuksissa [17] – [19]. Kerätyt tiedot toistaiseksi, lisäksi tunnistamiseen ainakin kahdessa sytogeneettinen väyliä varten kasvainten kehittymiseen, eli menetys kromosomissa 9 ja kromosomin 7 [20] – [22], voivat olla hyödyllisiä suunniteltaessa uusia yksilöllisiä hoitoja. Kuitenkin vahvistus tutkimuksia tarvitaan, koska monia näkökohtia tämän mallin edelleen epäselviä, erityisesti kronologisessa järjestyksessä poikkeavuuksien aikana taudin etenemistä. Järkevään geenien tunnistaminen taustalla kromosomipoikkeavuuksien, se on tärkeää käyttää luotettavia menetelmiä ja käydä läpi tiedot validointiprosessiin. Tämä ongelma oli hiljattain osoitettu eturauhassyövän ja rintasyövän, gliooma ja multippelimyelooma [23] – [27], mutta ei virtsarakon syöpään. Vaikka Formaliini Kiinteät parafiiniin (FFPE) yksilöt on useita etuja, kuten varmuutta histologista diagnoosia ja mahdollistavat retrospektiivinen tutkimukset suuri määrä näytteitä, tuore kudoksia pidetään luotettavin molekyyligenetiikan analyysiä; ne tarjoavat kattavan analyysin koepala, vaikka materiaali ei ole histologista diagnoosia.

Ensimmäinen tavoite Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida suorituskykyä kohdennetun testin kaksi erilaista materiaalia peräisin samasta kasvain. Ensimmäisessä vaiheessa vertasimme tuloksia UroVysion testi suoritettiin juuri eristettyjä faasien Nuclei (FIN) ja FFPE kudoksia 22 TCC: t (kuvio 1). Lisäksi toinen tavoite oli arvioida välistä yhdenmukaisuutta array-CGH profiilit ja kohdennettuja kromosomi profiilit, jotta voidaan arvioida, onko UroVysion on riittävän herkkä menetelmä tunnistamiseksi valittujen aneuploidioiden ja sattumanvaraisen CNAs in TCC: t. Toinen vaihe Vertailun levitettiin ylimääräinen 10 TCC: t, välillä data peräisin joko array-CGH on FIN ja UroVysion analyysin FFPE kudoksissa (kuvio 1).

kaksivaiheisen strategian analyysin sovellettu tässä tutkimuksessa.

tulokset

First Step analyysi: vertailu UroVysion tietoja FIN ja FFPE

TCC voidaan erottaa korkea tai huono laatu (HG tai LG) ja lihasten invasiivisia tai ei (iN tai NI). Ensimmäisessä vaiheessa analyysi 22 TCC: t (9 LGNI, 1 LGIN, 3 HGNI, 9 HGIN) analysoitiin UroVysion joka tehdään kahtena kappaleena samasta biopsia FFPE ja FIN näytteet (kuvio 1).

analyysin perusteella multinomial mallista, FIN tiedot olivat yleensä verrattavissa uutettu FFPE vastine LGNI ryhmässä, mitattuna prosentteina menetys, disomia ja vahvistus (taulukko 1 on yksityiskohtainen luettelo taulukko S2). Sitä vastoin HGNI ryhmässä kahden analyysin syntyy yhtäpitävät tulokset vain CEP 3 (Kromosomi Enumeration Probe 3). Todellakin CEP 7 ja CEP17, FIN yleensä havaita alhaisempi molempien tappiota (1,7 vs. 10 CEP 7; 6 vs 11,3 varten CEP17) ja disomia (42,7 vs. 62,3 varten CEP7; 48, 3 vs 60,7 for CEP17); Näin ollen suurempi osuus voitto oli raportoitu (55,7 vs. 27,7 varten CEP7; 45,7 vs 28 CEP 17). Lopuksi, Locus tunniste (LSI) 9p21 FIN taipumus havaita suurempi prosenttiosuus kummankin disomia (58,3 vs. 20,0) ja voitto (10,3 vs 8,7), mutta alhaisempi tappio (31,3 vs 71,3). Toisaalta, vuonna HGIN ryhmässä kahden analyysin syntyy ristiriitainen tulos ainoastaan ​​CEP 3: FIN taipumus havaita suurempi osuus tappio (14,9 vs. 2,2) ja pienempi prosenttiosuus voitto (48,1 vs 62,5) kuin FFPE.

Nämä tulokset vahvistettiin tarkemman analyysin Poisson malli (kuva 2). Vuonna LGNI ryhmässä keskimäärin signaalien CEP3, CEP7, CEP17 sekä 9p21 alueella oli 2,3, 1,8, 2,0, 0,5 (FIN näytettä) ja 2,4, 2,1, 2,2, 0,9 (vuonna FFPE) ilman merkittävää eroa kahden testin (kuva 2 A). Toisaalta, vuonna HGNI ryhmässä keskimäärin signaalit CEP3, CEP7, CEP17 sekä 9p21 alueella oli 2,5, 2,9, 2,7, 1,8 (FIN näytettä) ja 2,3, 2,3, 2,3, 1,2 (vuonna FFPE) kanssa tilastollisesti merkitseviä eroja kahden testin välillä, lukuun ottamatta CEP3 (kuvio 2, B). Sitä vastoin HGIN ryhmässä keskimäärin signaalien CEP3, CEP7, CEP17 sekä 9p21 alueella oli 2,5, 2,7, 2,3, 1,2 (FIN) ja 3,0, 2,7, 2,7, 1,2 (vuonna FFPE näytettä), joilla on merkittäviä ero CEP3 (kuvio 2, C).

Arvioitu määrä signaaleja havaittiin kukin koetin (95% luottamusväli) saatu kunkin kasvaimen osuus klusterointi. Raportoitiin p-arvot viittaavat vertailun FFPE ja FIN menetelmiä. Paneeli A = LGNI (9 pistettä); paneeli B = HGNI (3 pts); paneeli C = HGIN (9 pistettä).

Perimän kopioluvun muutokset (CNAs) vasta eristetyssä ytimet (FIN) by array-CGH

Toisessa vaiheessa meidän analyysin meidän kantaesitti array-CGH on ylimääräinen 10 TCC: t (6 HGIN, 1 HGNI, 3 LGNI), jotta voidaan havaita CNAs välillä kasvain ja viite DNA. Yleisimmät CNAs esitetään yhteenvetona taulukossa 2 (esitetty yksityiskohtaisesti muodossa taulukossa S3). Olemme luokitellaan näytteet kahteen luokkaan: infiltroivien kasvaimia (IN-TCC: t: 70CR09, 81CR09, 04CR10, 09CR10, 10CR10, 26CR10) ja ei tunkeutumisatmosfäärin kasvaimia (NI-TCC: t: 28CR09, 75CR09, 80CR09, 82CR09) (kuvio 3). Yleensä odotetusti, IN-TCC: t on paljon enemmän CNAs kuin NI-TCC: t. 20q voitto jakoivat 4/6 IN-TCC kasvaimia, kun taas 2/4 NI-TCC: t; 3p25.2 ja 17q21 voitot 4/6 IN-TCC kasvaimia ja 1/4 NI-TCC: t; 5p ja 20p vahvistusta 3/6 IN-TCC ja 2/4 NI-TCC: t; 6p22.3 ja 11q13 jakoivat vain IN-TCC (3/6 ja 2/6 vastaavasti); vihdoin 3Q ja 8q olivat 1/6 IN-TCC: t ja 1/4 NI-TCC: t. Tappiot: 9p ja 9p21 olivat 4/6 ja 3/6 IN-TCC: t, kun taas 2/4 ja 3/4 NI-TCC: t; 9q32-q34 oli 3/6 IN-TCC: t ja 2/4 NI-TCC: t; 2q tappio oli 3/6 IN-TCC: t ja 1/4 NI-TCC: t; 8p menetys vain 2/6 IN-TCC: t.

CNAs 10 TCC: t näytteet: 6 soluttautua kasvaimet (IN-TCC: t: 70CR09, 81CR09, 04CR10, 09CR10, 10CR10, 26CR10) vasemmalla, ja 4 non – soluttautuminen kasvaimet (NI-TCC: t: 28CR09, 75CR09, 80CR09, 82CR09) oikealla. Jokainen piste /pylväs vastaa yhden näytteen. Tappiot osoituksena vihreänä, kun voittoja punaisella.

Tunnistaa mahdollinen rikastuminen funktionaalisten ryhmien geenejä alueille voitto ja tappio HGIN ja LGNI kasvaimia, geeni ontologian merkintä analyysi oli suoritettiin käyttäen GOstat ohjelmistoa. Saat HGIN syntynyt tilastollisesti merkitsevä aliedustus (p 0,05) liittyvien geenien solujen erilaistumista, solusyklin ja positiivisessa apoptoosin säätelyyn ja ohjelmoidun solukuoleman; lisäksi tilastollisesti merkitsevä yliedustettuina geenien solujen lisääntymisen ja apoptoosin säätelyyn. Toisaalta analyysi osoitti varten LGNI kasvainten tilastollisesti merkitsevä aliedustus geenien apoptoosin ja ohjelmoidun solukuoleman (taulukko S4).

analyysin toisessa vaiheessa: vertailu array-CGH profiilit FIN ja UroVysion tietoja FFPE

seuraava suorittaa FISH analyysin avulla Urovysion testin ylimääräinen 10 TCC: t analysoitiin array-CGH; jos mahdollista, kaksi kasvaimen alueella samassa jaksossa pisteytettiin lisäämiseksi määrää solun analysoitu ja saada tietoa mahdollisimman edustavia, kun otetaan huomioon tunnetut heterogeenisyys tämä syöpä. Jokaisesta koetin tilastollinen analyysi suoritettiin sen varmistamiseksi, että signaali luottaa 100-soluja eri harkitsee kaksi aluetta erikseen tai ne sekoitetaan yhteen. Yhtäpitäviä tuloksia kahden kasvainten alueilla on raportoitu kahdessa HGIN tapauksissa (070CR09 ja 081CR09) (kuvio 4, A); päinvastoin, tilastollisesti merkitsevä erottuvan tulokset (p 0,05) on raportoitu kahdessa HGIN tapauksissa (009CR10 ja 026CR10) (kuvio 4, B); lopuissa kuudessa tapauksessa tilastollisesti merkitseviä eroja kahden kasvainten alueet osoituksena yhden (010CR10), kaksi (028CR09 ja 080CR09) tai kolmeen koettimeen (004CR10) (katso myös taulukko S5). Nämä tiedot korosti sitä yleistä korkea sisäinen kasvain heterogeenisuus näistä näytteistä.

Vertailu tuloksia kahden valitun kasvainten alueilla samassa osassa FFPE: (A): kaksi eniten yhtäpitävän kasvaimia (070CR09 ja 081CR09); (B): kaksi eniten discordant kasvaimia (009CR10 ja 026CR10).

Sitten teimme yritetään verrata UroVysion tiedot FFPE juuri raportoitu array-CGH profiilit 10 TCC: t, edellä on kuvattu. Tätä tarkoitusta varten kunkin näytteen me ekstrapoloidut tulokset array-CGH analyysi vastaten neljää UroVysion suunnattu kromosomeja ja niitä verrattiin FISH (taulukko 3). Täysi vastaavuutta todettiin vain 28CR09 (HGNI) ja 09CR10 (HGIN) (harmaat alueet taulukossa 3). Kuitenkin muut tuumorit, melko hyvä korrelaatio on havaittu kahdella tekniikalla; eli kasvaimet 010CR10 ja 070CR09 (molemmat HGIN) viskositeettiluku oli osoituksena 3/4 kohdennettuja kromosomeja. Katso kuva 5 kaksi esimerkkiä useamman yhtäpitävät (D) ja vähemmän yhtäpitävät (E) data. Suurempi vastaavuutta nähtiin kromosomissa 3 (7/10), kun taas muita kohdennettuja kromosomien osoittivat kohtalaista korrelaatiota (6/10). Esimerkiksi 082CR09 (LGNI) ja 04CR10 (HGIN), 9p21 tappiot osoituksena vain FISH-analyysillä; Toisaalta vahvistus on lokuksen 3p25 ja 028CR09 (HGNI) ja 070CR09 (HGIN) syntyi vain array-CGH tietoja. Voidakseen vahvistaa array-CGH datan ja erottaa polysomy kromosomin 3 todellisesta vahvistus, FISH-analyysi suoritettiin molemmilla Urovysion testi määritys ja dual-väri split koetin PPARy (3p25), kahtena peräkkäisenä FFPE osissa 028CR09 ( kuvio 5, C). Tilastollinen analyysi signaali laskee 100 ydinten arvioi todellinen vahvistus on 3p25 suhteessa polysomy kromosomin 3 (

t test

: p 0,01).

Urovysion testiä sovelletaan: (A ): FIN näyte 032CR07 (HG NI); (B): FFPE näyte 080CR09 (LG NI). (C) FISH kanssa

PPAR

γ luotain 028CR09 (HGNI). Urovysion versus array-CGH tiedot: esimerkki yhtäpitävät tiedot (D), (näyte 080CR09); ja ei-yhtäpitävien data (E), (näyte 004CR10).

Keskustelu

Huolimatta laajan tutkimuksen geneettisiä muutoksia virtsarakon syöpään ja yksityiskohtaisia ​​malleja, jotka yhdistävät tällaiset muutokset kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen [20] – [22], on olemassa muutamia luotettavia markkereita erottaa kasvaimiin aggressiivinen ominaisuuksien aikaan varhaisen diagnoosin ja me etsivät edelleen menetelmän vaalien havaita niitä. Tässä suhteessa äskettäisen selvityksen on jopa ehdotettu, että kystoskopian yksin edelleen kaikkein kustannustehokkain strategia havaitsemiseksi toistumisen virtsarakon syöpä ei valtaavat lihaksen [28]. Kuitenkin toisin kuin aiemmin raportoitu muiden [29], useat kirjoittajat vaati saman päätelmän [30], ja rooli Urovysion epäilyttävissä virtsanäytteet pysyi kyseenalainen, etenkin kun otetaan huomioon sen korkeat kustannukset.

kehittäminen array-CGH ilmeni mahdollisuus analysoida koko genomin yhdessä kokeessa, mikä viittaa sen mahdollista soveltamista seulonta /seurantaohjelmia syöpäpotilaita. Siinä tapauksessa, virtsarakon syövän, array-CGH antaisi mahdollisuuden analysoida DNA biopsia kasvain, kun taas mukaan Urovysion virtsanäytteitä yleensä analysoidaan.

tärkeimmät haitat tämän tekniikan on, että vaikka jos se on erityistä ja herkkä, se on invasiivinen ja edelleen kallista. Lisäksi tähän mennessä ei ole riittävästi tietoa tukemaan käyttöä array-CGH tällaisissa ohjelmissa, mutta se voisi olla mielenkiintoista soveltaa tätä tekniikkaa potilaiden ryhmiin, joilla on korkea syöpäriski.

multitarget Urovysion määritys on kehitetty havaitsemiseksi TCC virtsanäytteiden [7]. Optimaalinen FISH koetinsarjaa määritettiin testaamalla erilaisia ​​koettimia TCC havaitsemiseksi virtsaa virtsarakon syöpä ja valitsemalla ne, jotka olivat joko herkin yksittäin tai että täydennetään muista antureista parantaa yleistä testin herkkyys. CEP antureista ja LSI 9p21 täydentävät toisiaan, koska CEP antureista havaita hyperdiploidy, yleinen karsinooma

in situ

ja invasiivisia TCC, kun LSI 9p21 anturi havaitsee deleetioita 9p21 bändi, yleinen ei-invasiivisia TCC [7 ]. Aiemmin on ehdotettu, että vääriä negatiivisia FISH tulos edustaa enimmäkseen matala-asteinen TCC, jotka eivät irtoa kasvainsoluja virtsaan tai eivät osoita kromosomaalisia muutoksia, jotka havaitaan määrityksessä [11]. Toinen raja, ja toinen mahdollinen selitys vääriä negatiivisia FISH tuloksia, saattaa johtua pieni määrä neoplastisten solujen läsnä yksilöiden [30].

Ensimmäisessä vaiheessa Tässä tutkimuksessa verrattiin suorituskykyä tämän multitarget määritys havaitsemiseksi virtsarakon kasvainsolujen sekä FIN, ilman histologista diagnoosia ja vaikka pieni määrä kasvainsolujen ja FFPE kudoksessa. Analyysimme osoittaa hyvä vastaavuus Urovysion FISH dataa FIN ja FFPE varten LGNI ja HGIN kasvaimet; erityisesti, entisessä ryhmässä, FIN yleensä havaita pienempää määrää signaalin suhteen FFPE, kun taas jälkimmäisessä ryhmässä vastakkainen suuntaus oli arvostettu. Sillä HGNI TCC: t, merkittäviä eroja syntyi kolme kohdennettua antureista, mutta se voi johtua näytteiden vähäisen määrän tämän ryhmän. Suorituskyky Tämän testimarkkinointi on siis riittävän hyväksyä myös FIN näytteitä; Lisäksi sama CNAs olivat uskollisesti heijastuu analyysi FFPE. On vielä tutkia, onko se on tehokas menetelmä havaitsemaan mahdollisimman edustava ja tehokas CNAs of TCC: t. Tätä tarkoitusta varten toisessa vaiheessa tämän tutkimuksen, array-CGH suoritettiin 10 uutta TCC: t leikellä spektrin muutoksia virtsarakon syöpä ja tunnistaa toistuvia poikkeamia, jotka voivat sisältää syöpään liittyvien geenien.

havaittu lukuisia geneettisiä muutoksia by array-CGH: yleisimmät tappio mukana kromosomi 9p-arm samalla yleisimmistä vahvistuksen mukana kromosomi 20q-arm, kuten aiemmin raportoitu muiden [5], [6], [14], [18], [19]. Yllättäen emme löytäneet suuri osa kasvainten voitto 6p22.3 ja 8q raportoitu muissa tutkimuksissa [14], [18], [19]. LOH ja aliedustusta kromosomin 9 on useimmin kuvatut geneettinen muutos vuonna TCC ( 50%). Yhteinen menetys koko kopio kromosomi 9 osoittaa läsnäolon tuumorisuppressorigeeneille sekä 9p ja 9q, ja ehdokas geenit on tunnistettu useilla alueilla kuten 9p21 (

CDKN2A

), 9q12-13 (

PTCH

), 9q32-33 (

DBC1

) ja 9q34 (

TSC1

). Tässä tutkimuksessa havaitsimme täydellinen tai osittainen menetys 9p ja /tai 9q in 7/10 kasvaimissa, sekä HG ja LG. Lisäksi joissakin HG havaitsimme voittoa tässä lokuksessa, vaikka tämä voisi johtua kromosomi 9 polyploidia (koska merkki kromosomaalisten epävakautta). Yleisin voitto 20q (6 kasvaimia), tietojen mukaisesti aiemmin raportoitu monissa muissa syövissä, mukaan lukien virtsarakko-, paksusuoli-, munasarja- ja rintasyövän [31]. Association of 5p ja 20q voittoja, löytyy 3 HG kasvaimia, raportoinut Bruch [32], voisi liittyä etenemiseen. Lopuksi, voitto 17q21 on tunnistettu vain HG kasvaimissa, mikä viittaa mahdolliseen rooli syövän etenemiseen.

Mielenkiintoisin kohta tämän tutkimuksen on vertailu array-CGH data ja Urovysion FISH tiedot. Todellakin, me osoituksena paitsi korkea sisäinen ja välinen kasvain heterogeenisyys FFPE materiaalia, kuten ilmi analyysi kahden eri kasvaimen alueella samassa kasvain; Löysimme myös eroja kaksi tekniikkaa, joita voidaan osittain katsoa johtuvan mahdollisen Peittovaikutus normaaleista soluista tai korvaava vaikutus johdettu suuri kasvain heterogeenisyys. Tämä heterogeenisuus on jo kuvannut ryhmämme virtsarakon syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja, jotka ovat geneettisesti erilaisia ​​[33]. Voimme olettaa, että tämä moninaisuus tuottaa elinkelpoisia ja samasta kloonista polveutuvien -alapopulaatioiksi joka tulee heterogeeninen samassa kasvain.

yleinen array-CGH data korosti jälleen läsnäolo usein muutoksia (eli 20p ja 5p voitot), jotka eivät voi havaita Urovysion määrityksessä. Lisäetuna käyttöön integroidun teknisen lähestymistavan esiin nousi 028CR09 näyte: n monistamiseen 3p osoituksena array-CGH tutkittiin FISH kanssa Urovysion määritys ja LSI 3p anturi. Integroimalla useita menetelmiä, pystyimme erottamaan todellinen vahvistus siitä kromosomista 3 polysomy. Tämä lokus sisältää peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori gamma (

PPARg

), ligandi aktivoida transkriptiotekijä osallinen sääntelyn lisääntymistä ja erilaistumista uroteeli [34], [35].

johtopäätös, paljon työtä tarvitaan vielä määritellä geenien taustalla kromosomipoikkeavuuksien paremmin ymmärtämään geneettisen mekanismeja, jotta voidaan kehittää uusia terapeuttisia strategioita. Tuloksemme vahvistivat, että on tärkeää maailmanlaajuisen genomi- seulontamenetelmiä, että on joukko perustuva CGH, kattavasti määrittää genomisen profiilien suuren joukon TCC: t kasvaimia. Kuitenkin tämä tekniikka on vielä joitakin rajoituksia, kuten ei pysty havaitsemaan alhainen mosaicism tai ei havaita mitään muutosta kopioiden määrä eräänlainen kompensoiva vaikutus johtuu läsnäolo korkean solujen heterogeenisyys. Näin ollen on edelleen suositeltavaa käyttää toisiaan täydentäviä tekniikoita, array-CGH ja FISH, kuten entinen pystyy havaitsemaan muutoksia genomin tasolla ei kuitenkaan mitään kromosomi, mutta se pystyy säilyttämään yksittäisten tietojen tasolla yksittäisiä soluja , vaikka se keskittyy muutaman genomialuetta.

Materiaalit ja menetelmät

yksityiskohtainen lomake löytyy Materiaalit ja menetelmät S1.

tutkimus hyväksyttiin ja perusti Direzione Generale Sanità Lombardian alueella ja esittämän Pääjohtaja ja etiikkaa sitoutuminen ICP sairaalan Bassini. Kirjallinen suostumus saatiin tutkimukseen osallistuneista ennen kudoksen keräämistä.

Potilaat ja näytteet

Yhteensä 32 kasvaimen näytteen (28 miestä ja 4 naista) saatiin höyläysleikkaus peräkkäinen potilaista vasta diagnosoitu TCC: t yhdellä keskus (taulukko S1). Tietoinen suostumus on saatu ennen kudoksen keräämistä. Staging ja luokittelu tehtiin mukaan Maailman terveysjärjestön konsensus luokitus [1]. Ne erottaa korkea tai huono laatu (HG tai LG) ja lihasten invasiivisia tai ei (IN tai NI).

Fluoresenssi in situ

FIN, koepalat paloitellaan ja viljeltiin RPMI-1640 (Euroclone Spa), jota oli täydennetty 20% FCS: ssa 24 tuntia. Osia saatettiin hypotoninen käsittely ja kiinnitettiin 3: 1 metanoli: etikkahappo. Single eristetyt solut koepaloja etikkahapolla 60%, täpliksi dioja ja anna kuivua. Sillä FFPE, kudos kiinnitettiin standardimenetelmien mukaisesti.

Esikäsittely ja FISH-analyysi suoritettiin sekä ytimiä eristetty FIN ja FFPE näytteitä UroVysion virtsarakon syöpä Kit (Vysis, Wiesbaden, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden .

hybridisaation jälkeen sitoutumattoman koettimet poistettiin sarjan pesuja ja tumat vastavärjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI).

vähintään 100 solua kunkin valmisteen pisteytettiin ja signaalit jaettiin mukaan tappio (signaalien lukumäärän /solu 2), disomia (signaalien määrä /solu = 2) ja vahvistus (signaalien määrä /kenno 2).

lokuksen 3p25 FISH analyysi FFPE suoritettiin käyttämällä Poseidon ™ Toista Free ™ PPARy (3p25) Tauko koetin (Kreatech Diagnostics, Amsterdam, Alankomaat). Tilastollinen merkitys eroista kromosomin 3 polisomy ja 3p25 vahvistusta arvioitiin Studentin t-testiä erillisiin laskee 100 ytimeksi. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä kanssa p 0,01.

Kaikki digitaaliset kuvat otettiin käyttäen Leitz mikroskooppia (Leica DM 5000B) varustettuna charge coupled device (CCD) kamerasta ja analysoitiin Chromowin ohjelmisto (Tesi Imaging, Milano, Italia).

array-CGH

array-CGH analyysi, genomi-DNA uutettiin tuoreista biopsiat jälkeen entsymaattisesti kollagenaasilla H (Roche, Mannheim, Saksa) ja proteinaasi K (Roche, Mannheim, Saksa) ja puhdistettu käyttäen fenoli /kloroformia (Carlo Erba, Milano, Italia). Näytteiden valmistelu, liukumäki hybridisaatio, ja analyysi suoritettiin käyttäen SurePrint G3 Human CGH Microarray 8x60K (Agilent, Santa Clara, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sex-Hyväksytty kaupallinen DNA-näytteet (Promega) käytettiin vertailukohtana DNA aikana array-CGH. Taulukot skannattiin 2-um resoluutio käyttäen Agilent mikrosirujen skanneri ja analysoitiin Feature Extraction v10.7 ja Agilent Perimän Workbench v5.0 ohjelmistot. Poikkeavuus Havaintomenetelmä 2 (ADM2) algoritmin taustalla Perimän Workbench ohjelmistoa käytetään laskemaan ja avustaa tunnistamisen poikkeavuuksien tietyn näytteen (kynnys = 5; log2 suhde = 0,3). Laskea arvioitu prosenttiosuus mosaikismin käytimme kaava määräytyy Cheung SW et ai. [36].

Gene ontologia analyysi

analysoimiseksi joka ontologian luokat olivat yli- ja ali- edustettuina geenit rajattu sisällä voitto ja tappio alueiden havaita array-CGH, ​​The GOstat ohjelmisto ( saatavilla https://gostat.wehi.edu.au/) käytettiin [37], joka perustuu Amigo (Gene ontologia tietokanta) versio 1.8.

tilastollinen

Tapauksia kuvannut laskettaessa osuudet menetys, disomia ja kaupasta syntynyt yhteensä vähintään 100 solua, erityisesti analyysin tyypistä (FFPE ja FIN), ja koetin UroVysion testin.

multinomi malli osuus läsnäolo klusterointi käytettiin arvioimaan kunkin kasvaimen ja analyysin tyypistä, kokonaisosuus menetys, disomia ja voitto 95%: n luottamusväli. Tätä mallia käytettiin myös vertaamaan yleistä osuudet menetys, disomia ja vahvistus havaita kahden analyysin.

Poisson mallia, joka perustuu logaritminen muutos laskee läsnäollessa klustereiden käytettiin lukumäärän arvioimiseksi signaalien havaitaan kunkin analyysin kanssa 95%: n luottamusväli. Tämä malli on käytössä myös verrata signaalien määrä poikki kahden analyysin (FFPE ja FIN).

tukeminen Information

Taulukko S1.

ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia 32 tuumorin näytteiden tutkimuksessa. Histologia /Grade ja vaiheen tutkimuksessa osoitetaan.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0024237.s001

(DOC) B Taulukko S2.

UroVysion testitulokset juuri eristettyjä faasien ytimet (FIN) ja formaliinilla parafiiniin upotettuja ytimet (FFPE).

doi: 10,1371 /journal.pone.0024237.s002

(DOC) B Taulukko S3.

Kopioi numero muutokset (CNA) yhteinen (plus-merkki) kesken 10 TCC näytettä analysoidaan array-CGH. NI-TCC: t on merkitty kursiivilla; IN-TCC: t on lihavoitu. Sillä Histologia /Grade katso taulukko S1.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0024237.s003

(DOC) B Taulukko S4.

Gene ontologia. I. Tilastollisesti merkitsevä (p 0,05) aliedustus geenin ontologian (GO) luokat HG kasvaimissa. II. Tilastollisesti merkitsevä (p 0,05) yliedustettuina geeni ontologian (GO) luokat HG kasvaimissa. III. Tilastollisesti merkitsevä (p 0,05) aliedustus geenin ontologian (GO) luokkien LG NI kasvaimissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0024237.s004

(DOC) B Taulukko S5.

Urovysion tietoja. I. Vertailu Urovysion data kahdessa eri tuumorien alueella samassa jaksossa II. Vertailu Urovysion data kahdessa eri tuumorien alueilla samassa jaksossa

doi: 10,1371 /journal.pone.0024237.s005

(DOC) B Materiaalit ja menetelmät S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0024237.s006

(DOC) B