Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

ilmaantuvuus papillaarisen kilpirauhaskarsinoomaa (PTC) on noussut tasaisesti viime vuosikymmeninä sekä uusiutuminen. On ehdotettu, että kohdennettu ablaatiohoitojen fysioterapiaa voisi olla mahdollinen hoitomuoto kilpirauhassyövän hoitoon. Kohdennettu bio-affiniteetti funktionalisoidun moniseinäisiä hiilinanoputkia (BioNanofluid) toimivat paikallisesti, tehokkaasti muuntaa ulkoisen valon energiaa lämmittämiseen siten nimenomaan tappaa syöpäsoluja. Tämä voi edustaa lupaavaa uutta syöpää hoitomuoto, ylittämästä tavanomainen laserablaatio- ja muut nanohiukkasten lähestymistavat.

Methods

kilpirauhasta stimuloivan hormonin -reseptorin (TSHR) valittiin tavoitteeksi PTC soluja, mikä johtuu sen laaja ilme. Joko TSHR vasta-aineita tai Thyrogen tai puhdistettuja TSH (Tyreotropiini) on konjugoida kemiallisesti meidän funktionalisoitu Bionanofluid. Diodi Laserjärjestelmä (532 nm) käytettiin valaisemaan PTC solulinja valotus kertaa. Solukuolemaa arvioitiin käyttäen trypaanisineä värjäystä.

Tulokset

TSHR kohdistetut BioNanofluids kykenivät valikoivasti ablatoimiseksi BCPAP, joka on TSHR-positiivinen PTC solulinjan, vaikka ei TSHR-null NSC-34-solujen . Olemme todenneet, että 2: 1 BCPAP cell: α-TSHR-BioNanofluid konjugaatin suhteen ja 30 sekunnin laservalotuksen tappoi noin 60% BCPAP solujen, kun taas 65% ja 70% soluja ablatoitu käyttäen Thyrotropin- ja Thyrogen- BioNanofluid konjugaatteja, vastaavasti. Lisäksi minimaalinen ei-kohdennettu tappaminen havaittiin käyttäen valikoivaa valvontaa.

Johtopäätös

BioNanofluid-ympäristöön mahdollisia terapeuttisia polku papillaarinen kilpirauhassyövän on tutkittu, meidän

in vitro

tulokset viittaa kehittää tehokas ja nopea menetelmä selektiivisen syöpäsolujen tappaminen. Siksi BioNanofluid hoito korostaa, että tarvitaan uutta tekniikkaa potilaiden hoitoon paikallisen uusiutumisen ja etäpesäkkeitä, jotka parhaillaan suorittavat joko uudelleen operative kaula selvittämään, toistuva anto radioaktiivisen jodin ja viimeisenä keinona sädehoito tai kemoterapia, joilla on vähemmän sivuvaikutuksia ja elämänlaadun parantaminen.

Citation: Dotan I, Roche PJR, Paliouras M, Mitmaker EJ, Trifiro MA (2016) Engineering Moniseinämäiset hiilinanoputken terapeuttinen Bionanofluids valikoivasti tavoite papillaarinen kilpirauhassyövän Cells. PLoS ONE 11 (2): e0149723. doi: 10,1371 /journal.pone.0149723

Editor: Valentin Cena, Universidad de Castilla-La Mancha, ESPANJA

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2015; Hyväksytty 4 helmikuuta 2016 Julkaistu: 22 helmikuu 2016

Copyright: © 2016 Dotan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: ID sai palkkaa tukea Israel Cancer Research Fund (ICRF).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat (ID, PJRR, MP, EJM, ja MAT) haluaisi paljastaa editorin ja arvioijat, että ne ovat myös keksijät seuraaviin patenttihakemus: BIONANOFLUID käytettäväksi CONTRAST, IMAGING, desinfiointiin ja /tai terapeuttinen aine-US Patent office PCT- CA2014 /051094 työstä esitetään tässä ja muissa kehitys kun terapeuttinen kehitystä. Tämä patenttihakemus ei ole ristiriidassa lehden avoimen datan politiikkaa koskevat tiedot läsnä tässä käsikirjoitus tai patenttihakemuksen. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen, tai markkinoille tuotteita julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Viimeisten kymmenen vuoden aikana on ollut merkittävä nousu ilmaantuvuus kilpirauhassyövän [1]. Tämä malli selittyy osittain kasvu havaita pieniä kyhmyjä löytyi sattumalta kaulassa kuvantaminen, mutta hieman pahaenteinen trendi on lisääntynyt esiintyvyys suurempien kilpirauhasen ( 4 cm) kasvaimet yhdessä okkulttisten imusolmukemetastaaseja [2]. Papillaarinen kilpirauhassyövän (PTC) tarjoaa itsessään ~ 80% kilpirauhasen karsinoomien [3, 4]. Huolimatta erittäin 10 vuoden pysyvyys on yli 90% [3], paikallisen uusiutumisen esiintyy jopa 20%: ssa tapauksista, mikä johtaa diagnosoinnin ja hoidon haasteisiin [4]. Lisäksi aggressiivinen variantteja PTC, kuten pitkä-solu, columnar-solu, saaristo-, trabekulaarisen ja hajanainen sklerosoiva variantteja, vaikka harvinaisia, ovat kasvattaneet esiintymistä. Tämäntyyppiset vaativat usein aggressiivinen hoitojen liittyy lukuisia haittavaikutuksia [5, 6].

tukipilari ensisijainen PTC hoito on yhteensä kilpirauhanen [3, 7, 8], yleensä seuraa radiojodiannoksen ablaatio (RAI) väli- ja korkean riskin potilailla [3, 7-10], ja elinikäinen levotyroksiini hoito. Vaikka ennalta ehkäisevää keskeinen kaula imusolmuke leikkelyn (PCND) on edelleen kiistanalainen, terapeuttinen imusolmuke dissections suoritetaan rutiininomaisesti [2, 11]. Toistuvien /kehittynyt PTC, kirurginen extirpation on paras vaihtoehto. Kuitenkin täydellinen biokemiallinen remissio negatiivinen tyreoglobuliinipitoisuuksien tasot saavutetaan vain 27%: lla potilaista (usein toistuvassa interventiot) [12], jossa on 20 vuoden pysyvyys niinkin alhainen kuin 36% [13]. Merkittävä määrä potilaita, jotka eivät ole kirurgisia ehdokkaita voidaan asettaa adjuvantti hoitovaihtoehtoja, kuten ulkoista sädehoitoa (EBRT), jotka altistavat peruuttamattomia sairauksia [7, 14-18]. Siksi on tarpeen löytää tarkempi ja kohdennettuja hoitovaihtoehtoja, joka saavuttaa samanlaisia ​​tuloksia ensisijainen sairaus, ja parantaa kliinistä hyötyä uusiutuva sairaus, samalla minimoiden sairastuvuuteen.

Valitettavasti on luontaisia ​​rajoituksia nykyisen armamentarium strategioiden hävittää kasvaimen uusiutumisen ja on tarvetta löytää uusia tekniikoita, kun se tulee uusiutuva sairaus. Nanolääketieteessä viittaa nanoteknologian terveydenhuollon domain, ja se yleensä käyttää materiaaleja kehitetään nanomittakaavan mitat ja on jo osoittautunut erittäin tehokas alustana toimittamiseen joko fyysistä energiaa tai huumeita, ja myös kuvantamissovelluksia [19] . Siksi käsite nanohiukkasten perustuva syöpähoitojen on kiertää ongelmia tavanomaisten lääkkeen farmakokinetiikkaa ja kestävyys samalla rajoittaa vahinkoa, systeemisesti tai normaaliin viereiseen kudokseen. Se kattaa myös sisällyttää potilaille, jotka käyttökelvottoman perustuvat perinteisiin menetelmiin. Tämänhetkisen kemoterapeuttiset, lisääntynyt selektiivinen paine soveltamalla solunsalpaajalääkeaineiden johtaa korotuksiin kasvaimen vastus [20-22]. Lisäksi, tavanomaisia ​​fyysisiä hoitoja käytetään kudoksen poistamiseksi, kuten säteilyn tai korkean intensiteetin laser hoitoja, myös vahingoittaa tervettä kudosta. Nanohiukkasia käytetään fyysisten aineet, jotka kykenevät monistamaan tai muuntaa tulo energiaa, aiheuttaa soluvaurioita valikoivasti mittakaavassa. Tämä on niiden ainutlaatuinen fotoni ominaisuudet ja plasmonic käyttäytyminen, varsinkin hiilinanoputkien, jos hiukkaset absorboivat valoa erittäin tehokkaasti ja läpi plasmonic resonanssin muuntaa sen energian absorptio liiallinen lämmön sitä pinta [23, 24].

Bio-affiniteetti nanohiukkasia, tässä kuvattu BioNanofluid, pitäisi pystyä: 1) tehokkaasti muuntaa valon lämpöenergiaksi, 2) ovat helposti modifioida ligandien ja /tai biomolekyylien antaa spesifisyys, 3) ehkäistä epäspesifinen solukuolemaa, ja 4) kokojakauma on alle 1 mikronin, jotta kudoksen perfuusiota. Nanomateriaalin joka parhaiten sopii tähän kuvaukseen on monikerroksinen hiilinanoputket (MWCNTs), jotka ovat sylinterimäisiä rakenteita samankeskisten [25, 26] grafeenitasojen. Kerrostumista grafeenin putken pituus ja suuri sivusuhde antaa merkittävän ala useille biomolekyylitason liitteitä, luoden monihampaiset hiukkasia, joissa vasta-aineita tai muut ligandit voidaan tunnistaa useita solun pinnan reseptoreihin. Multiwall hiilinanoputkien tarjoavat erinomaisen lokalisoitu lämpötila voitot nojalla niiden korkea kyky absorboida valoa ja muuntaa sen lämmöksi, kun taas loput ehjät [27-29]. Lämpö yli nanometrin asteikoita nanomateriaaleja kiinnitetty soluihin, aiheuttavat riittävästi paikallista kuumotusta ilman irtotavarana lämmitys ei-syöpäkudoksen [30]. Kun lisäksi otetaan huomioon, että ihmisen keho on läpinäkyvä lähes infrapuna (NIR), tällaiset hiukkaset, joiden kohdistaminen käsivarsi, voivat antaa valtavan määrän lämpöä paikallisesti altistuessaan NIR valoa. NIR jo on erinomaiset ihmisen syvyys levinneisyys, mutta voidaan edelleen pidentää kuitu /endoskooppinen edistysaskeleet lääketieteellisen kuvantamisen alalla, joka voi tuoda NIR valonlähde lähes missä tahansa kehon [31].

Tämän tutkimuksen tavoitteena on suunnitella ja valmistaa konjugoitu BioNanofluids ablaation PTC

in vitro

, luomalla kohdennettua lähestymistapaa, jonka tarkoituksena on aiheuttaa fyysistä tuhoa syöpäsoluja solutasolla. Lisäksi tehokkuus uusi kohdennettu valokuva-lämpö terapiaa PTC käyttää näitä konjugoitu funktionalisoidun moniseinäisiä hiilinanoputkia (BioNanofluid) on kilpirauhassyöpä solulinja mallia arvioidaan.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

papillaarinen kilpirauhassyövän solulinja (BCPAP) [32-34] ostettiin DMSZ (Braunschweig, Saksa). Hybridi hiiri neuroblastooma-liikehermosolusairaudet NSC-34 [35] solulinjaa lahjoitti Dr. Neil R. Cashman.

Soluviljely

BCPAP soluja viljeltiin RPMI 1640-alusta täydennettynä 10 % FBS: ää. NSC-34-soluja viljeltiin DMEM-väliaineeseen, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 20% L-glutamiinia. Kaikkia solulinjoja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 kostutetussa ilmassa muoviin dosviljelypulloihin (VWR, Kanada). Kun solut olivat konfluentteja, kerättiin käyttämällä Versene liuosta (0,48 mM EDTA PBS: ssä), pyöritetään ja laimennetaan kasvatusliuokseen konsentraatioon 2,5 3,5 x 10

5 solua /ml.

Vasta-aineet ja kemialliset reagenssit

Anti-TSHR vasta ostettiin Novus Biologicals, Kanada, ja acris vasta Inc, USA. Tyrotropiini (Puhdistettu ihmisen TSH phTSH) hankittiin Bioworld, USA. Thyrogen (rekombinantti TSH tai rhTSH) hankittiin Genzyme Canada Inc, Kanada. Thiolyated PEG 5000 (polyetyleeniglykoli, MW 5000 kD) hankittiin Laysan Bio, USA. NHS (

N

hydroksisukkinimidin) ja EDC: tä (etyyli-dimetyyliaminopropyyli-karbodi-imidi) ostettiin Sigma-Aldrich, USA.

Western blotting

BCPAP ja NSC-34-soluja kerättiin 0,05% trypsiiniä ja hajotettiin käyttämällä 1 X Reporter Lysis-puskuria. Western blot-analyysi, 20 ug kokonais-selvitetty solulysaattia ladattiin 10% SDS-PAGE-geelissä. Ensisijainen vasta-aineet laimennettiin 1: 1000 ja sitä käytetään valmistajan ehdottaman protokollia. Proteiini ilmentyminen visualisoitiin käyttäen ECL kit ja valotettiin filmille.

Conjugated BioNanofluid valmistelu

COOH-funktionalisoitu Au-koristeltu MWCNTs saatiin McGill University, Kanada, ja laimennetaan d

2 H

2O toimivaan pitoisuuteen 18-20 mg /l ennen konjugaatio, varmistaa mono-hajaantuvuuteen. COOH functionalization saavutettiin plasmakäsittely, yleinen menetelmä lisäksi funktionaalisten ryhmien puutteita grafeenin rakenteita [36, 37]. Au koristelu suoritettiin pulssi laserablaation käyttämällä Nd: YAG laser keskittynyt MWCNT kohde klo fluence luokkaa 1 J /cm

2. Prosessi voi rutiininomaisesti koristella CdSe, Au, Ag, Si ja Sn MWCNTs. Materiaali luotu oli Au-päällystettyä saaret (Kokomuuttuja 1 nm-5 nm seurataan ja mitataan SEM kuvassa 1A) PEG kiinnitys ja altistuvat COOH ryhmiä missä Au oli poissa. Johdonmukaisuutta erä ratkaisuja arvioitiin UV-vis spektrometriaa käyttäen 260 nm: n huipun määrittämiseksi johdonmukainen keskittyminen.

. Pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM) kuvia COOH-funktionalisoidun Au-leimattua tioli-Carbon peräisin bionanofluids, kahdessa eri suurennoksilla. Au hiukkaset ovat määritelleet pallomaisia ​​rakenteita, korostettu nuolenpää. B. EDC-NHS kytkentäkemia liittää bio-affiniteetti molekyyleihin, onko vasta-aine tai proteiini /mitogeeni on tioli-PEG-CNT. PEGylointi tioli-CNT on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.

BioNanofluid on muutettu käyttäen tioloitua PEG (MW 5000) 1 tunnin -SH-ryhmän, joka muodostaa Au-S-sidoksen, joka muodostaa perusteella ei-specific absorption ehkäisemiseksi. Materiaali luotu oli sekä PEG harjat ympäröivä ohut kulta päällystetty saaria ja altistuvat COOH ryhmiä joissa Gold oli poissa. Kantaliuos 150 pM thiolyated PEG valmistettiin tislattuun veteen pH: ssa 4,5. MWCNT [500 ui kantaliuosta (1 ug)] inkuboitiin 200 ul: n tioloitua PEG5000 150 uM kantaliuos: n lopullisessa tilavuudessa 700 ui huoneenlämpötilassa yhden tunnin ajan pH: ssa 5. Sitten seosta sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 13000 RPM, supernatantti heitettiin pois ja pelletti suspendoitiin uudelleen 350 ul: PBS: ssä (pH 7,4). Tioli-PEG-CNT myöhemmin konjugoitu kohdennusmolekyyliin. Konjugointi seos sisältyy 350 ui PEG-BioNanofluid, 90 ui (36,8 mM) NHS, 90 ui (22,1 mmol) EDC: tä, ja 4 ug yksi seuraavista ligandien: a-TSHR, Tyreotropiini tai Thyrogenin, lopullisen pH: n 5.5 (katso kuva 1 B). Konjugointi annettiin edetä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Suoritettuaan konjugaatio, seosta sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 13000 rpm huoneenlämpötilassa, supernatantti poistettiin ja konjugoitu BioNanofluid pelletit pestiin (3 kertaa), PBS: llä ja suspendoitiin sitten uudelleen 300 ui PBS: ää.

Cell kohdistaminen ja laserhoito

100-200 ui juuri kerättyjen solujen (jotka sisältävät 250,000-350,000 solua per ml) sekoitettiin 100-200 ui konjugaatit, tioli-PEG-CNT /BioNanofluid tai PBS: ää, mukaan kokeen , 1,5 ml: n Eppendorf-putkeen. Sitten näytteitä inkuboitiin 37 ° C: ssa pyörivällä teline 1 tunnin ajan. Näytteet pestiin sitten 3 kertaa PBS: llä poistamaan sitoutumaton BioNanofluid ja vieraita solujäte. Pesun jälkeen solut jaettiin 25 ul: n erinä 200 ui steriiliä eppendorfs, ja käsiteltiin 532 nm 2,7 W /cm

2 sähköiset laser. Laser käsittelyt tehtiin käyttäen yksittäisiä inkubaatioita α-TSHR, Tyreotropiini tai Thyrogen konjugoituneen BioNanofluid. Kokeet toistettiin vähintään 3 rinnakkaista per pitoisuus tai laser valotusaikaa. Ohjaus kokeet suoritettiin paljain IgG-konjugoitu BioNanofluid, tioli-PEG-CNT (ei ligandit) tai PBS: llä ja soluja yksinään. Tarkoituksena valvonnan oli tutkia vaikutuksia kunkin kemiallisten ja biologisten muutoksia, ei-spesifinen absorptio ja altistusaika laser soluihin, ja myös rajoittaa tai poistaa sivuvaikutuksia, jotka voivat aiheuttaa solukuoleman siten, että se tapahtuu vain silloin, kun laser vuorovaikutuksessa hiilinanoputkia.

Heti laservalotuksen, trypaanisini, lisättiin 1: 1 tilavuussuhde solun murtuma kuhunkin mikroputkeen ja valkoinen (live) solut laskettiin hemosytometrillä. Laskee tehtiin kolmena kappaleena, ja jokainen koe suoritettiin 3 eri yhteyksissä. Prosenttiosuus solun tappamisen (elävät solut jäljellä) laskettiin kaavalla:

BioNanofluid vakauden kokeissa

4 ° C: ssa.

konjugaatit valmistettiin päivänä 1, ja säilytetään 4 ° C: ssa, kunnes päivänä 21. Kokeet suoritettiin koko viikon (päivinä 1, 2, 3, 4, 5, 6, ja 7), ja sitten jatkettiin päivinä 10, 14 ja 21. BCPAP solut altistettiin 532 nm laser 30 sekunnin ajan 2: 1 solut: BioNanofluid suhde. Pitoisuudet konjugoidun ja konjugoimattoman BioNanofluid mitattiin käyttäen UV-VIS-spektrometri, jotta vastaavuus pitoisuuden käyttämällä liuosta, jossa oli yhtä suuri absorbanssin.

-20 /-80 ° C: ssa.

konjugaatit on luotu päivänä 1 jaettiin eriin ja pidettiin -20 ° C: ssa tai -80 ° C: ssa. Kokeet suoritettiin päivinä 1, 5, 7 ja sen jälkeen viikoittain jopa 6 viikkoa. BCPAP solut altistettiin 532 nm laser 30 sekunnin ajan 2: 1 solu: konjugaatti suhde. Vastaavasti pitoisuudet konjugoidun ja konjugoimattoman BioNanofluid mitattiin käyttäen UV-VIS-spektrometri.

Tulokset

BioNanofluid ominaisuudet

optinen fysiikka hiilinanoputkien on tutkittu ja muualla on kuvattu [38]. Lyhyesti, niillä on suurin absorbanssi yhteistyötä tehokkaasti nanohiukkasten lajien ja laajakaista absorbanssi, joka sopii suunnittelun sääntöjä. Kerrostumista grafeenin putken pituus on mikrometrialueella, annetaan hyvin suuri sivusuhde useita biomolekyylitason liitteitä, luoden monihampaiset hiukkasia, jossa useat solun pinnan reseptorit voidaan tunnistaa vasta-aineita tai muita ligandeja. Monikerroksinen hiilinanoputket (MWCNTs) tarjoavat erinomaisen menetelmän erittäin paikallista lämmöntuotanto nojalla niiden korkea kyky absorboida valoa ja muuntaa sen lämmöksi, kun taas loput ehjät [27-29]. Tämä on ominaisuus, grafeenin perustuvat materiaalit, kuten niillä laajakaista valon absorbanssi, joka kykenee absorboimaan hyvin suuri valon spektrin värejä ja voi muuntaa tämän energian korkea hyötysuhde. Tästä on osoituksena musta väri, että hiilinanoputket näytteille. Jossa valon absorbanssi, energian fotonin edistää elektronin korkeammalle energiataso maasta valtion, menetys, joka energia voi tapahtua joko heikko valokuva-luminescent päästöt ja pieni järjestelmien välisen prosesseja, mutta perustavaa laatua energian siirto ympäröivään hiilimateriaalit on lämpöenergian muodossa. Siten lämpö yli nanometrin asteikot bio-funktionalisoimatonta MWCNTs kiinnitetty selektiivisen /kohdennettuja soluja, aiheuttaa nopean ja riittävän paikallista kuumotusta ilman ”bulk lämmitys” läheisten mahdollisesti herkkien kudosten. Aiemmin kultananopartikkeleilla niiden plasmonic absorptio-ominaisuuksia on käytetty muuntamaan valoa lämpöä ja aiheuttaa solukuoleman kasvaimissa [25]. Suuri valovirran tai erittäin lyhyt valopulssin modulaatiot saavuttaminen edellyttää korkeita lämpötiloja [39] tarvitsevat pitkäaikaista altistamista 5 minuutista 15 minuuttiin [40] ja aiheuttaa haitallisia vaurioita ympäröivään ei-syöpäsoluja.

perusmateriaali ja BioNanofluid on COOH funktionalisoitu moniseinäisiä hiilinanoputket (pituus vaihtelee 0,25 um 10 um, joiden halkaisija on 25-50 nm) kulta (Au), joka on harvaan päällystetty ylimääräisenä muutos, syntyi kautta amidi tioli yhteyksiä kemiallisten ja biologisten ligandeja. Kuvia COOH-funktionalisoidun Au-koristeltu MWCNTs tehtiin käyttämällä skannaus elektronimikroskoopilla (kuvio 1A).

TSHR kohdentamista BioNanofluid PTC solulinjojen

Kilpirauhasen stimuloivan hormonin reseptorin (TSHR) valittiin sen vankka ilmentymistä sekä normaaleissa sekä kilpirauhassyöpäpotilailla soluissa [41-44] osoituksena tutkimukset osoittavat no alas-säätely TSH-R kilpirauhassyöpäpotilailla soluihin [45], kun taas toiset osoittivat TSHR liiallisen ilmaistuna kilpirauhasen karsinoomat ja hyvänlaatuisia adenoomia verrattuna normaaliin kilpirauhaskudokseen [43]. Kiinnitys TSH sen reseptorin stimuloi solujen kasvua ja lisääntymistä, mikä auttaa PTC etenemistä [46]. Tämä tarjoaa selityksen sille, miksi levotyroksiini on määrätty annoksina että tukahduttaa TSH, eli estääkseen kasvun mikro-etäpesäkkeet ja /tai jäljellä kilpirauhaskudokseen seuraavat tavanomaista hoitoa varten kilpirauhassyöpä. Lisäksi vankka ilmaus TSHR, ollessa läsnä on thyrocyte, silti toimii tärkeänä ja pysyviä säädin ja fysiologiset markkeri ala- ja etäpesäkkeitä kyky kohdistaa BioNanofluid konjugaatteja varten aineen tehosta.

voidaan arvioida kohdistaminen TSHR, joka on TSHR-positiivisten ilmentävät PTC-solulinja (BCPAP) havaittiin, ja inkuboitiin kaksi eri α-TSHR-BioNanofluid käyttäen TSHR vasta-aineita eri toimittajilta (kuvio 2). Molemmat toimittaja vasta osoittivat samanlaisia ​​ja merkittävä solun tappaminen hinnat 62 ± 5,6% (Ab # 1 -Acris vasta-aineita) ja 62 ± 5,1% (Ab # 2 -Novus biologisten), jossa p-arvot 0,000148 (Ab # 1); ja 5,74 x10

-5 (Ab # 2) verrattuna IgG-BioNanofluids. Vasta-aineet yksin, IgG-BioNanofluid tai konjugoimattoman tioli-PEG-CNTs oli minimaaliset solujen tappaminen potentiaali.

Kaksi TSHR spesifisten vasta-aineiden ostettu eri toimitukset (Ab # 1, acris Antibodies; Ab # 2, Novus Biologicals ) konjugoitiin myös tioli-PEG-CNTs, sekä lgG: kanin ja hiiren-tioli-PEG-CNT-konjugaatteja, koska ei-spesifinen ehkäiseminen kohdentamiseksi solun tappamista BCPAP PTC soluja. Muita ohjaus olosuhteet sisältävät PBS, CNT hiukkaset ja vasta yksin. Tulokset esitetään% eläviä soluja, seuraavat laserhoito seurasi trypaanisineä värjäys määritellä kuolleita elävistä soluista. α-TSHR-Bionanofluid konjugaatteja merkittävästi (Ab # 1, p = 0,000148; Ab # 2, p = 5,74 x 10

-5) tappoi BCPAP soluja vs. IgG-bionanofluid konjugaatteja. Kaikki muut kontrolleilla ei ollut merkittävää solujen tappaminen hinnat vs. IgG-bionanofluids.

BioNanofluid optimointeja

Jotta olla enintään solutapon nopeudella vähintään esiintyminen epäspesifisten cell kuolema, etenimme optimoimaan olosuhteet huomioon solujen konsentraatio BioNanofluid ja aika altistumisen bionanofluid-solun monimutkainen laser.

ensin arvioitiin neljä eri suhteita (4: 1, 2 : 1, 1: 1 ja 1: 2) solujen BioNanofluid konjugaatteja. A2: 1 solu BioNanofluid suhde tuotti 58,9% (± 2,3) solujen tappaminen korkoaan α-TSHR-BioNanofluid, 65,1% (± 2,1) varten Tyreotropiini-BioNanofluid, ja 72,4% (± 3,52) ja Thyrogen-BioNanofluid (kuvio 3A ). Lisäksi Thyrogen-BioNanofluid ylitti sekä α-TSHR- ja tyrotropiinia BioNanofluid on 2: 1-suhteessa. Lisääntyvä BioNanofluid sisältö on 1: 1 tai 1: 2 (cell: BioNanofluid) suhde aiheutti 47,1% (± 7,65) ja 69,0% (± 4,52) solukuoleman vastaavasti kohdentamattomaan solukuolemaa hinnat CNT nanopartikkelit pelkästään ohjaus ryhmä. Tämä lisäys solukuoleman, suurempina pitoisuuksina konjugoitumattoman nanohiukkasten liittyy lisäys hiukkasten pitäminen solun ei-spesifistä solun pinnan yhteenliittymien, jotka ovat yleisiä kaikilla MWCNT pitoisuuksina. Sen vuoksi, suurempi pitoisuus /suhde ei-spesifisen säilyttäminen hiukkasten ryhmä on lukuisia riitä tuottamaan ei-toivotut bulk-lämmitin vaikutuksia siten solujen tappamiseksi. Lisäksi suhteellinen lisäksi solukuolema ei-spesifistä kohdentamista α-TSHR-BioNanofluid konjugaattien kanssa 1: 1 [56,2% (± 8,70), p = 0,1501], tai 1: 2 [61,8 (± 21,2), p = 0,681] suhde ryhmään ei ollut merkittävä.

näihin koeolosuhteissa ovat, α-THSR-, Thyrogen-, ja puhdistettu Tyreotropiini-tioli-PEG-CNT-konjugaatteja. Ohjaus sisältyviä ehtoja PBS ja CNT yksin. A. määritys optimaalisen solun konjugoimiseksi BioNanofluid suhde saavuttaa tietty korkein kohdennettuja BCPAP solun tappaminen. Laser valotusaika oli 30 sekuntia kaikissa olosuhteissa. Suhteet ovat edustettuina tilavuus: tilavuus-suhteet, oli siten 1: 1-suhteessa, 100 ui soluja (ja 250,000-350,000 solua per ml) sekoitettiin 100 ui konjugoidun-BioNanofluid 2 ug /ml pitoisuudessa. B. Optimaalinen valotusaika määritys kokeilu. BCPAP solut altistettiin laser-hoitoa varten 20, 30, ja 40 sekuntia, on 2: 1 solu: conjugated- tai konjugoimattoman-tioli-PEG CNT-suhde.

Valotusaika kokeet suoritettiin kaikki konjugaatteja määrittää korkein solun tappamisen menettämättä spesifisyyden, eli nopean ei-kohdistettuja solukuolemaa (kuvio 3B). Neljäkymmentä toisen altistuksen tuotti 67,8% (± 4,4) solujen tappaminen (α-TSHR), 67,8% (± 5,6) (Tyreotropiini), ja 80,1% (± 5,1) (Thyrogenia). Kolmekymmentä toinen altistus tuotti 59,4% (± 1,3) tappaminen (α-TSHR), 64,9% (± 5,8) (Tyreotropiini), ja 75,2% (± 3,5) (Thyrogenia). Kaksikymmentä toinen altistus tuotti 48,5% (± 4,75) (α-TSHR), 52,9% (± 6,8) (Tyreotropiini), ja 65,8% (± 7,5) (Thyrogenia). Vaikka korkein solun tappaminen hinnat saavutettiin pidempi valotusajoilla (40 sek 30 s 20 s), ei-kohdennettu tappaminen BioNanofluid kontrolliryhmässä 40 toisen valotusaikaa oli 32,7% (± 11,6), jälleen heijastaa kysymystä käsitellään epäspesifisten solukuolemaa uudelleen tutkinta PEG-muutos. Siksi 30 toinen valotusaika vastasi korkeinta tietyn solun tappamisen. Kuitenkin, kun laser altistus korotettiin kymmenen sekunnin välein, se aiheutti noin 2,5 kertaa enemmän (12% solukuolema 30 sekuntia vs. 33% solukuolema 40 sekuntia laser altistuminen) ei-erityisiä solukuolemaa un konjugoitua CNT kontrolliryhmään. Tämä kuvastaa käännekohta välillä nanokokoluokan lämpötilan toimitus ja aika kuluu BioNanofluid riittävän irtotavarana lämmön solususpensio. Aikaisemmat tutkimukset ovat tutkineet vaikutusta laser-teho ja altistumista aika, joka tarvitaan siirtämään riittävästi energiaa, joka johtaa solujen tuhoutumiseen. Esimerkiksi yhdessä tutkimuksessa käsiteltiin Daudi-solujen altistus aikoina 7 minuuttia ja se tuotti yli 90% solukuolema [47]. Muut tutkimukset käsiteltiin rintasyöpä, paksusuolen syöpä, maksasyövän ja Daudi-solulinjoissa 3 minuuttia tai enemmän [48-50]. Vaikka jotkut edellä mainituista tutkimuksissa käytettiin yksiseinämäisten hiilinanoputket (SWCNT) kanssa määriteltyjen photothermal ominaisuuksia, huomasimme, että pienelläkin kasvua 10 sekuntia, käyttö MWCNT osoitti enemmän vahinkoja. Tulosten perusteella näyttää, että tekniikka ja hiukkasten valmistelu MWCNT käytettiin tähän kokeeseen osoittamaan tehostumista valokuva-lämpö lämmönsiirron soluspesifisen tavalla.

TSHR kohdistetut BioNanofluid selektiivisesti ja spesifisti

arvioimiseksi sekä selektiivisyyden ja spesifisyyden TSHR kohdistetun BioNanofluid, valitsimme suorittamaan solun ablaatio kokeiluja samanaikaisesti sekä TSHR positiivinen ja TSHR negatiivinen solulinja. Koska BCPAP on positiivinen TSHR ilmentävää solulinjaa havaitsimme, että hiiren liikehermosolusairaudet solulinja NSC-34 on nolla ja TSHR ilmentymistä (kuvio 4A). Siksi testasimme jossa α-TSHR-, Thyrotropin- ja Thyrogen-BioNanofluids vastaan ​​sekä BCPAP ja NSC-34-soluissa (kuvio 4B). Käyttämällä 2: 1 solu: BioNanofluid suhde ja 30 sekuntia, huomasimme, että meidän valikoiva kohdentaminen TSHR voi nimenomaan ja merkittävästi syrjiä TSHR ilmentävät ja ei-ilmentäviä solulinjoja.

. TSHR ilmentyminen BCPAP ja NSC-34-soluissa määritettiin Western blot -analyysillä, käyttämällä TSHR spesifistä vasta-ainetta. BCPAP olivat positiivisia TSHR ilmaisun, kun taas NSC-34 soluja null. B-ACTIN käytettiin latauskontrollina. B. BCPAP ja NSC-34 solujen inkuboitiin α-THSR-, Thyrogen-, ja puhdistettu Tyreotropiini-tioli-PEG-CNT konjugaatteja. Ohjaus sisältyviä ehtoja IgG-tioli-PEG-CNTs, PBS ja CNT yksin. Kaikki olosuhteet suoritettiin 2: 1 solu: bionanofluid suhde ja 30 toinen laseraltistumisen. BCPAP solut osoittivat ~ 60%: sta ~ 73% solukuolemaan kaikki TSHR kohdennettua bionanofluid konjugaatit, kun taas vähäinen solukuolemaa havaittiin valvontaa muita ehtoja. NSC-34 solulinja osoitti vähäistä solukuolemaa kaikissa olosuhteissa.

BioNanofluid vakautta

Kokeet suoritettiin arvioimiseksi aktiivisuuden TSHR kohdistetun BioNanofluids, arvioimalla niiden vakauteen pitkäaikainen varastointi olosuhteissa. Erä α-TSHR-BioNanofluid luotiin ja säilytetään joko 4 ° C: ssa 21 päivää, tai -20 ° C ja -80 ° C: ssa 6 viikkoa. Erän α-TSHR-BioNanofluid säilytettiin 4 ° C: ssa arvioitiin niiden aktiivisuus ablaation BCPAP solujen jokapäiväistä yli 1 viikon ajan, ja sitten toistetaan päivinä 10, 14 ja 21 (kuvio 5A). α-TSHR-BioNanofluid alkoi menettää tehoa päivällä 5, sen kyky ablate BCPAP soluihin putosi 60%: sta 40%, kun taas Thyrogen-BioNanofluid konjugaattien menetti tehoa päivänä 6. Sekä α-TSHR- ja Thyrogen-BioNanofluid ilmestyi tasanne olemaan 40% tehokas päättymiseen saakka kokeen, viitaten siihen jatkui, mutta haitannut soluselektiivisyyttä. Voidaan olettaa, että suorituskyky laskee kanssa denaturointi proteiinin ligandien yli lyhyessä ajassa, kun niitä säilytetään epävakaissa oloissa 4 ° C. Vaikka mitään ei voida suoraan päätellä, että Thyrogen tai α-TSHR rakenne, pitoisuudet BioNanofluid säilytettiin 4 ° C: ssa olivat stabiileja mitattuna UV /VIS spektrometriä ennen sekoittamista solujen kanssa. Ligandina-BioNanofluid UV /VIS-absorbanssi pysyy vakiona riippumatta mahdollisten denaturaatio, on ehdotettu, että antaa yhdistetyn rakenteen absorbanssi 260 nm (absorbanssi tällä aallonpituudella on yhteinen proteiineja ja CNTs) että vain vähän tai ei lainkaan menetystä ligandia tai CNTs takia vastuu amidin kiinnitys tai CNT hajoamisen ovat syitä laskun aktiivisuuden (katso S1 taulukko).

. α-TSHR- ja Thyrogen-tioli-PEG-CNT konjugaatteja valmistettiin päivänä 1 ja pidettiin 4 ° C: ssa korkeintaan 21 päivää. Konjugaattien aktiivisuus määritettiin soluja tappava määritys BCPAP soluja (kuten edellä on kuvattu). B. Samalla tavoin, α-TSHR- ja Thyrogen-tioli-PEG-CNT-konjugaatteja valmistettiin päivänä 1 ja pidettiin -20 ° C: ssa tai -80 ° C: ssa enintään 6 viikkoa. Konjugaattien aktiivisuus määritettiin solun tappomääritys 5. päivänä, päivänä 7, ja joka viikko jopa 6 viikkoa.

Samanlainen koe suoritettiin yli 6 viikkoa, jossa BioNanofluid säilytettiin -20 ° C tai -80 ° C: ssa (kuvio 5B). BCPAP solujen ablaation kokeet suoritettiin päivinä 1, 5, 7 ja viikoittain, jopa 6 viikkoa. Tulokset osoittavat stabiilisuutta BioNanofluid aktiivisuutta sekä -20 ° C: ssa ja -80 ° C: ssa varastoinnin olosuhteissa, kuten havaittiin solujen ablaation prosenttiosuudet α-TSHR-BioNanofluid ja silti säilyttää 60% tehoa, ja Thyrogen-BioNanofluid jolla 65% tehokkuus yli 6 viikkoa kokeen. Konjugoitu ja YK-konjugoitu MWCNT mitattiin rinnakkain kutakin koetta varten, ja kaikki näytti vakaa pitoisuuksia.

Keskustelu

On rajoituksensa hoidettaessa toistuvia kilpirauhassyöpä. Vaikka suurin osa tapauksista käsitellään kilpirauhanen, jonka jälkeen TSH-heikentävän hoidon kanssa levotyroksiinin ja radioaktiivisen jodin valikoiduissa tapauksissa; toistuvat kilpirauhassyöpä esittelee terapeuttinen haaste. Paradigma kilpirauhassyövän hoidossa ja uusiutumisen tarjoaa asianmukaiset puitteet tutkia soveltamista molekyylirakennetta kohdistettuja fysikaalisia tekijöitä. Nano-välitteisen valokuva terminen hoito on saamassa vauhtia muodossa kohdennetun fysikaalisia tekijöitä, jotka hoitaa erilaisia ​​syöpiä. Kriittinen haasteena kilpirauhassyöpä on antaa ainetta, joka ei ainoastaan ​​kohdistuu kasvainsoluja, mutta myös suunnattu normaaleja jäännöksen kilpirauhassoluja. Tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan tehokkuutta innovatiivisen kohdennettuja fysioterapia käyttämällä hiljattain suunniteltu bio-affiniteetti funktionalisoidut hiilinanoputket, tai BioNanofluid konjugaatteja, jotta voidaan osoittaa

in vitro

, tehoa kohdistaminen TSHR ja ablatoimiseksi